KR20100068252A - 백신용 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 집 먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하기 위한 펩티드를 포함하는 조성물 및 특히 상기 알레르기를 예방하거나 치료하기 위한 펩티드의 최적 조합에 관한 것이다.

Description

백신용 펩티드{PEPTIDES FOR VACCINE}
본 발명은 집먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하기 위한 펩티드를 포함하는 조성물, 및 특히 상기 알레르기를 예방하거나 치료하기 위한 펩티드의 최적 조합에 관한 것이다.
T-세포 항원 인식은 주요 조직적합유전자 복합체(major histocompatibility complex; MHC)의 분자와 공동으로 그의 세포 표면 상에 항원 단편(펩티드)을 제공하기 위해 항원 제시 세포(antigen presenting cells; APC)를 필요로 한다. T 세포는 APC에 의해 제시되는 항원 단편을 인식하기 위해 그들의 항원 특이 T-세포 수용체(T-cell receptors; TCR)를 사용한다. 이러한 인식은 면역계에 도화선으로서 작용하여 이미 인식된 항원을 없애기 위한 일련의 반응을 생성시킨다.
인간과 같은 유기체의 면역계에 의한 외부 항원의 인식은 몇몇 경우에서 아토피성 질환으로 알려진 질병들을 야기할 수 있다. 아토피성 질환의 예는 천식, 아토피성 피부염 및 알레르기성 비염을 포함하는 알레르기성 질환이 있다. 이러한 일련의 질환에서, B 림프구는, 외부에서 유래된 항원에 결합하는 IgE 클래스(인간)의 경우 항체를 생성하며, 이들 분자가 알레르기 반응을 일으키기 때문에 본원에서는 이를 알레르겐으로 칭한다. 알레르겐-특이 IgE의 생산은 알레르겐에 의해서도 활성화되는(알레르겐에 특이적인) T 림프구에 좌우된다. 알레르겐-특이 IgE 항체는 호염기구 및 비만 세포와 같은 세포의 표면에 이들 세포로 인한 IgE 표면 수용체의 발현을 통해 결합한다.
알레르겐에 의한 표면 결합 IgE 분자의 교차는 이러한 작동 세포의 탈과립을 가져와 술피도류코트리엔(sulphidoleukotriene)과 같은 지질 매개체, 5-히드록스트립타민(5-hydroxtryptamine) 및 히스타민과 같은 염증 매개체의 방출을 야기시킨다. IgE-의존적 결과 이외에도, 천식과 같은 특정 알레르기 질환이 IgE-독립적 결과를 특징으로 한다.
알레르기성 IgE-매개 질환은 현재 증상 완화 또는 예방을 제공하는 물질로 치료된다. 이러한 물질의 예는 항-히스타민, β2 작동물질 및 글루코코르티코스테로이드이다. 게다가, 몇몇 IgE-매개 질환은 알레르겐 성분 또는 추출물의 주기적인 주입을 포함하는 탈감각 과정에 의해 치료된다. 탈감각 치료는 알레르겐에 대한 IgE와 경쟁하는 IgG 반응을 유도할 수 있거나, 알레르겐에 직접적으로 대항하는 IgE의 합성을 차단하는 특이 억제인자 T 세포를 유도할 수 있다. 이러한 형태의 치료는 항상 효과적인 것은 아니며 심각한 부작용, 특히 일반 과민성 쇼크를 유발할 위험이 제기된다. 이는 즉시 인식하여 아드레날린으로 치료하지 않는다면 치명적일 수 있다. 다른 외래 항원에 대한 면역 반응성을 바꾸거나 알레르기성 반응 자체를 촉발시키지 않으면서, 특정 알레르겐에 대한 원치않는 알레르기성-면역 반응을 감소시키거나 제거할 수 있는 치료학적 처리가 알레르기 환자들에게 매우 유효할 것이다.
집 먼지 진드기는 천식, 알레르기성 비염 및 알레르기성 피부염을 포함하는, 인간 및 동물의 알레르기성 질환의 주요 원인으로서 전세계적으로 인식된다. 밀접하게 연관된 두 종의 진드기가 전세계적인 집 먼지 진드기 알레르기의 주요 원인이다. 이들은 데르마토파고아데스 프테로니시누스(Dermatophagoides pteronyssinus)(유럽에서 우세함) 및 데르마토파고아데스 파리나에(Dermatophagoides farinae)(아메리카에서 우세함)이다. 집 먼지 진드기 알레르겐은, 배설물에 존재하며 통상적으로 Der p(D. pteronyssinus) 또는 Der f(D. farinae) 단백질로 언급되는, 진드기 소화관의 내벽으로부터의 단백질로부터 주로 유래한 것이다. 평균 진드기는 평생 하루에 대략 20 배설물 펠렛을 생산하며 이는 몸무게의 두 배이다. 먼지 1g은 통상적으로 500마리까지의 진드기를 포함할 수 있으며 매트리스는 이만마리 이상을 포함할 수 있다. 존재하는 진드기 물질의 양은 수명에 따라 증가한다. 6년된 베게의 중량의 1/10은 진드기 및 진드기 잔해로 이루어질 수 있다. 카페트에서는 통상적으로 제곱미터 당 1,000 및 10,000 마리 사이의 진드기가 존재할 것이다.
알레르기성 질환, 특히 천식은 세계의 산업국가에서 확대되고 있는 큰 문제이다. 주요 산업 국가에서 천식으로 고통받는 인구가 5-10%인 것으로 산출된다. 그들 중에서 대략 1/5이 빈번한 입원이 필요한 심각한 천식을 앓고 있다. 미국에서 천식에 드는 비용은 연간 126억 달러(79억 파운드)이다. 유럽에서의 수치는 더 높다. 캐나다 연구에 따르면 주요 산업 국가의 인구 각 한명 당 연간 평균 21파운드가 천식에 드는 비용으로 추정된다. 매년 영국에서만 2,000명이 천식으로 사망할 것이다.
천식은 호흡계 내의 알레르기성 반응 및 자극에 의해 야기되는 만성 질환이다. 공기중의 물질에 반응하는 50% 내지 90% 사이의 천식환자가 먼지 진드기 알레르겐에 민감하며, 영국 연구에 따르면 일반 인구의 10%가 먼지 진드기 알레르겐에 반응한다. 대부분의 이백만 미국인들은 집 먼지 진드기 침입에 의해 심각한 영향을 받는 지역에 살고 있다. 이러한 물질에 대한 민감화는 어린시절, 주로 3세 및 6세 사이에 주로 발생하나 천식은 평생 동안 지속된다.
치료 또는 예방 처리는 집 먼지 진드기 알레르기로 고통받고 있거나 고통받을 위험이 있는 인간에게 매우 유효할 것이다.
발명의 요약
본 발명의 발명자들은 그룹 1 먼지 진드기 알레르겐(Der p 1, Der f 1), 그룹 2 먼지 진드기 알레르겐(Der p 2, Der f 2) 및 그룹 3 먼지 진드기 알레르겐(Der p 7, Der f 7)로부터 유래한 펩티드 단편의 특정 조합이 이러한 알레르겐에 대해 환자를 탈감작시키는데 특히 유용함을 발견했다. 본 발명의 폴리펩티드 조합은 집 먼지 진드기 알레르기성 환자의 패널 중 높은 비율의 피검자에서 사이토카인 반응을 유도하는 능력에 따라 선택되었다.
본 발명의 폴리펩티드는 초기에는 펩티드-MHC 결합 특성의 인실리코(in silico) 및 생체외 평가 둘 다를 사용하여 T 세포 에피토프로서 선택되었다. 예를 들어 상기 알레르겐으로부터 유래된 펩티드가 MHC 클래스 II 결합 검정에서 다중 DR 유형에 결합하는 능력을 나타낸 표 3을 참조하라. 추가 에피토프는 상동성에 의해 확인되었다. 이러한 후보 폴리펩티드를 자기내성화(tolerisation)에서의 사용가능성에 대해 추가로 확인했다.
펩티드 면역에 기초한 탈감작에 대한 시도와 관련된 어려움은 면역에 사용되는 펩티드의 기초로서 알레르겐의 적절한 크기 및 영역을 어떻게 선택하는가이다.펩티드의 크기의 선택은 중요하다. 펩티드가 너무 작다면, 백신은 면역학적 반응을 유도하는데 효과적이지 못할 것이다. 펩티드가 너무 크거나 전체 항원이 환자내로 도입된다면, 치명적일 수 있는 과민증과 같은 부작용이 유도될 위험이 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 전체 분자의 IgE-결합 에피토프의 구조를 유지할 수 있도록 하는데 중요한 삼차 구조를 가지지 않도록 하기에 충분할 만큼 작으면서도 T 세포 특성을 유지할 수 있도록 선택되었다. 그러므로 본 발명의 폴리펩티드는 근접한 특이 IgE 분자의 비만 세포 및 호염기구와 같은 세포 상에 유의한 교차결합을 유도하지 않으며 그 결과로 유의한 히스타민 방출을 야기시키지도 않는다.
본 발명의 이점은 주요 조직적합유전자 복합체(major histocompatibility complex; MHC) 분자를 광범위하게 표적화 하는 펩티드의 능력이다. T 세포 수용체(T cell receptors; TCR) 특이성은 매우 가변적이다. 가변성은 항체분자와 마찬가지로 세포 내의 유전자 재조합 사건을 통해 생성된다. TCR은 주요 조직적합유전자 복합체(MHC)의 유전자에 의해 코드되는 분자에 결합하는 짧은 펩티드의 형태로 항원을 인식한다. 이러한 유전자 산물은 이식시 사용되는 "조직 적합 검사(tissue types)"를 야기시키는 분자와 동일한 분자이며, 또한 교체 사용될 수 있는 용어인 인간 백혈구 항원 분자(Human Leukocyte Antigen molecules; HLA)로서 칭하기로 한다. 각각의 MHC 분자는 펩티드 결합 그루브를 가지며 이들의 모양 및 전하에 기인하여 제한된 그룹의 펩티드에만 결합할 수 있다. 하나의 MHC 분자에 의해 결합되는 펩티드는 다른 MHC 분자에 의해 필연적으로 결합되지 않을 것이다.
항원 또는 알레르겐과 같은 단백질 분자가 B 림프구, 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포와 같은 항원 제시 세포에 의해 흡수될 때, 상기 분자는 상기 세포 내에서 효소적으로 분해된다. 분해 과정은 상기 분자의 펩티드 단편을 생성하고, 이들을 이어, 적절한 크기, 전하 및 모양일 경우, 특정 MHC 분자의 펩티드 결합 그루브 내에 결합된 후 항원 제시 세포의 표면 위에 나타날 수 있다. 상기 펩티드/MHC 복합체가 적절한 수로 항원 제시 세포 표면 상에 존재한다면 이들은 이어 적절한 펩티드/MHC-특이 T 세포 수용체를 보유한 T 세포를 활성화시킬 것이다.
MHC의 다형성 성질에 기인하여, 인간과 같은 이계교배된 인구에서의 환자는 세포 표면 상의 MHC 분자의 상이한 조합을 발현할 수 있다. 상이한 MHC 분자는 크기, 전하 및 모양에 기초한 동일한 분자로부터의 상이한 펩티드에 결합할 수 있기 때문에, 상이한 환자는 그들의 MHC 분자로 결합된 펩티드의 상이한 레파토리를 나타낼 것이다. 인간과 같은 이계교배된 인구에서의 보편적인 MHC-결합 펩티드 에피토프의 확인은 이계교배된 동물(특정 계통의 실험실 마우스와 같은)보다 더 어렵다. 펩티드 결합 및 이것이 야기할 제시에서 환자 및 내제된 상이함 사이에서의 상이한 MHC 발현에 기초하여, 단일 펩티드가 인간에서 탈감작 치료에 사용될 것을 확인할 수 있을 것 같지 않다.
그러나, 본 발명의 펩티드 조합은 다중의 상이한 MHC 분자를 타켓으로 하여 인간 집단에 널리 적용되는 효능을 제공한다. 따라서, 본 발명의 펩티드로 제형화된 백신은 폭넓은 유용성을 가질 것이다.
본 발명의 발명자들은 다음의 특성을 갖는 펩티드 조합을 생산했다:
- 조합은 집 먼지 진드기 알레르기 환자의 패널로부터 높은 비율의 피검자들에서 사이토카인 반응을 유도한다
- 조합의 펩티드는 가용성이다.
따라서, 본 발명은 HDM203B (서열 번호 83), HDM201 (서열 번호 80), HDM205 (서열 번호 85), HDM203A (서열 번호 82), HDM202 (서열 번호 81), 서열 번호's 1 내지 79, 84, 또는 86 내지 104 (이는 서열 번호. 1 내지 104 중 어느 하나이다) 또는 이의 변이체 중에서 선택한 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 자기내성화에 의해 집 먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 통상적으로, 조성물은 적어도 4개의 폴리펩티드를 포함하며, 여기에서 폴리펩티드는 다음 중 어느 것으로부터 독립적으로 선택된 것이다:
(i) 서열 번호 1 내지 104의 폴리펩티드; 또는
(ii) (i)에 따른 폴리펩티드의 변이체, 여기에서 상기 변이체는 다음으로 구성된 영역을 포함하는 9 내지 30개의 아미노산 길이의 폴리펩티드이다:
- (i)의 서열 중 어느 서열; 또는
- (i)의 서열 중 어느 서열으로 환자를 자기내성화시킬 수 있는 서열인 (i)의 서열 중 어느 서열과 적어도 65%의 상동성을 갖는 서열 ; 또는
(iii) (i)에 따른 폴리펩티드의 변이체, 여기에서 상기 변이체는 다음 중 하나를 나타내는 서열로 이루어진 영역을 포함하는 9 내지 30개의 아미노산 길이의 폴리펩티드이며:
- (i)의 서열 중 어느 서열의 단편; 또는
- (i)의 서열 중 어느 서열의 단편의 상동체,
(i)의 서열 중 어느 서열으로 환자를 자기내성화시킬 수 있는 서열이며 적어도 9개 아미노산 길이를 갖고, 여기에서 상기 상동체는 (i)의 서열 중 어느 서열에서 어느 9개의 연속 아미노산에 적어도 65%의 상동성을 갖는다.
본 발명은 집먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하기 위한 펩티드를 포함하는 조성물, 및 특히 상기 알레르기를 예방하거나 치료하기 위한 펩티드의 최적 조합에 관한 것이다.
도 1은 Der p 1과 Der f 1(도 1a), Der p 2와 Der f 2(도 1b), Der p 7과 Der f 7(도 1c)의 서열 비교를 나타낸 것이다. 에피토프를 포함하는 영역은 회색으로 강조했다. 본 발명의 특정한 펩티드의 위치는 서열의 위 또는 아래에 밑줄로 표시했다. Der p 1의 서열은 NCBI 수납번호 P08176을 갖는 공개적으로 입수가능한 서열이다. Der p 2 및 Der p 7(표 6)에 대한 상응 서열은 각각 NCBI 수납번호 P49278 및 P49273이다. Der f 1에 대한 서열은 NCBI 수납번호 P16311으로 입수되며, Der f 2는 NCBI 수납번호 Q00855이고 Der f 7은 NCBI 수납번호 Q26456이다.
도 2는 IL 13 또는 IFN-감마의 생성에 의해 측정되는 본 발명의 상이한 펩티드에 반응하는 환자의 백분율을 나타낸 것이다.
도 3 및 도 4는 IL 13 또는 IFN-감마의 생성에 의해 측정되는 본 발명의 상이한 펩티드 조합에 반응하는 환자의 백분율을 나타낸 것이다.
본원에 언급된 서열의 설명
SEQ IN NO. 1 내지 1044는 표 3 내지 표 8에 나타나 있는 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드 서열을 제공한다. 서열 번호 105는 추가 서열을 제공한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 자기내성화(tolersation)에 사용될 수 있는 펩티드 및 펩티드의 조합에 관한 것이다. 이러한 펩티드는 HDM203B (서열 번호 83), HDM201 (서열 번호 80), HDM205 (서열 번호 85), HDM203A (서열 번호 82), HDM202 (서열 번호 81), 서열 번호 1 내지 79, 84, 또는 86 내지 104 (서열 번호 1 내지 104 중 어느 하나임) 중 어느 서열에 나타난 서열을 포함하거나, 이루어지거나 또는 필수적으로 구성될 수 있다. 이러한 특정 펩티드의 변이체 또한 사용할 수 있다. 변이체는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열 또는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 상동체를 포함하거나 구성되거나 또는 필수적으로 구성될 수 있다.
한 실시형태에서 본 발명은 집 먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하는 용도의 조성물에 관한 것이다. 조성물은 통상적으로 적어도, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 최대 13개까지의 폴리펩티드를 포함하거나 구성될 수 있다. 다시 말해서, 조성물은 4 및 13개 사이의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 독립적으로 다음 중 어느 서열으로부터 선택된 것이다:
(i) 서열 번호 1 내지 104의 폴리펩티드; 또는
(ii) (i)에 따른 폴리펩티드의 변이체, 여기에서 상기 변이체는 다음으로 구성된 영역을 포함하는 9 내지 30개의 아미노산 길이의 폴리펩티드이다:
- (i)의 서열 중 어느 서열; 또는
- (i)의 서열 중 어느 서열으로 환자를 자기내성화시킬 수 있는 서열인 (i)의 서열 중 어느 서열과 적어도 65%의 상동성을 갖는 서열 ; 또는
(iii) (i)에 따른 폴리펩티드의 변이체, 여기에서 상기 변이체는 다음 중 하나를 나타내는 서열로 이루어진 영역을 포함하는 9 내지 30개의 아미노산 길이의 폴리펩티드이며:
- (i)의 서열 중 어느 서열의 단편; 또는
- (i)의 서열 중 어느 서열의 단편의 상동체,
(i)의 서열 중 어느 서열으로 환자를 자기내성화시킬 수 있는 서열이며 적어도 9개 아미노산 길이를 갖고, 여기에서 상기 상동체는 (i)의 서열 중 어느 서열에서 어느 9개의 근접한 아미노산에 적어도 65%의 상동성을 갖는다.
본 발명은 또한 자기내성화에 의한 집 먼지 진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 제품과 제형, 및 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 폴리누클레오티드를 포함하는 조성물, 제품 및 벡터를 제공한다. 이러한 자기내성화는 통상적으로 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열에 존재하는 에피토프(예를 들어 MHC 클래스 II 에피토프)일 것이다.
그룹 1, 그룹 2 및 그룹 7 먼지 진드기 알레르겐의 펩티드 단편
집 먼지 진드기의 주요 알레르겐은 그룹 1 먼지 진드기 알레르겐 (Der p 1, Der f 1), 그룹 2 먼지 진드기 알레르겐 (Der p 2, Der f 2) 및 3 먼지 진드기 알레르겐 (Der p 7, Der f 7)을 포함하며, 여기에서 Der p "X" 및 Der f "X"는 단백질 "X"가 각각 D. 프테로니시누스(D. pteronyssinus) 및 D. 파리나에(D. farinae)로부터 유래된 상동체이다. 도 1에서 보여진 바와 같이, 각 Der p 단백질은 이의 상응하는 Der f 단백질에 고도의 상동성을 갖는다.
MHC 클래스 II-결합 T 세포 에피토프를 포함하는 영역은 주어진 단백질의 Der p 및 Der f 상동체 사이에 특히 잘 보존되어 있다. 그러므로, 예를 들어 D. 프테로니시누스 또는 D. 파리나에 중 하나의 단백질 1의 관련 영역으로부터 유래된 펩티드는 그룹 1 먼지진드기 알레르겐에 대한 자기내성화에 의한 집 먼지 진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 사용하는데 적합하다. 유사하게 균주 중 하나로부터의 단백질 2의 관련 영역으로부터 유래된 펩티드는 그룹 2 먼지 진드기 알레르겐에 대한 자기내성화에 의한 집 먼지 진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 사용하는데 적합하며, 균주 중 하나로부터의 단백질 7의 관련 영역으로부터 유래된 펩티드는 그룹 7 먼지 진드기 알레르겐에 대한 자기내성화에 의한 집 먼지 진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 사용하는데 적합하다.
그룹 1 알레르겐은 파파인에 대해 상동인 시스테인 프로테아제이다. 이 효소는 세포내 밀착연접의 단백질 성분인 오클루딘(occludin)을 절단하는 것으로 발견되었다. 이는 특정 효소의 알레르기유발성에 대한 하나의 가능한 근거를 나타낸다. 상피세포 사이의 온전한 밀착연접을 파괴함에 의해, Der p 1 및 Der f 1은 상피하 항원-제시세포, 상주하는 비만 세포 및 호산구에 대해 비정상적으로 과량으로 얻을 수 있다.
그룹 2 알레르겐의 기능은 알려지지 않았으나, Der p 2 및 Der f 2는 지질-결합 단백질의 패밀리와 멀리 떨어진 상동성을 보인다. 생체내 Der p 2로의 자극에 대한 반응에서의 혈청 IgE 수준은 전체 진드기 추출물로의 자극에 대한 반응에서의 총 혈청 IgE 반응의 대략 1/5이다.
본 발명의 펩티드는 표 3 내지 표 8에 나타낸 바와 같은 그룹 1, 그룹 2 및 그룹 3 먼지 진드기 알레르겐으로부터 유래된 것이다. 용어 "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 교체가능하게 사용된다. 상기 단백질은 또한 본원에서 "알레르겐"으로서도 언급된다.
표 3 내지 표 8은 각 단백질이 유도된 부모 단백질을 나타내는, 본 발명의 펩티드의 서열을 나타낸 것이다. 표 4 내지 표 6의 서열은 쌍으로 배열됐다. 각 쌍에서 상위 서열은 펩티드-MHC 결합 검정의 사용을 통해 T 세포 에피토프로서 선택되었다. 하위 서열은 주어진 먼지 진드기 알레르겐 그룹에서 대체 단백질의 서열 내의 상동성 검색에 의해 선택되었다. 예를 들어, 표 4의 단백질 HDM01은 Der p 1으로부터 유래된 것이고 이것의 아래의 상동성 서열은 Der f 1으로부터 유래된 것이다.
펩티드 조합
조성물은 통상적으로 적어도 4개, 최대 13개까지의 본 발명의 상이한 폴리펩티드의 조합을 포함한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 펩티드로 구성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상적으로 각각의 Der p 1, Der p 2 및 Der p 7(또는 이의 등가물)로부터 유래된 펩티드로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 이의 변이체(예를 들어 기능적 변이체)를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물 내의 폴리펩티드 조합은 인간 집단에 가능한한 널리 적용될 수 있도록 선택되었다. 즉, 본 발명의 조성물은 먼지 진드기 알레르기 환자의 많은 집단에서, 바람직하게는 이러한 환자의 패널 또는 집단에서의 먼지 진드기 알레르기 환자의 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70% 이상에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 먼지 진드기 환자의 집단에서 환자의 수는 적절한 수, 통상적으로 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 적어도 100명의 환자가다. 바람직하게는 집단은 코카시안 집단을 대표하는 빈도 범위 내에서 MHC 대립유전자 빈도를 갖는다. 11개 일반 DRB1 대립유전자 패밀리에 대한 참조 집단 대립유전자 빈도는 표 1에 나타냈다(HLA Facts Book으로부터의 데이터, Parham and Barber).
본 발명의 조성물은 통상적으로 HDM203B (서열 번호 83), HDM202 (서열 번호 81), HDM201 (서열 번호 80), HDM205 (서열 번호 85), HDM203A (서열 번호 82)의 폴리펩티드 또는 이의 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 조성물은 서열 번호 82 및 83의 폴리펩티드 또는 변이체가 하나 이상이 선택되지 않는 것을 조건부로 하여, 바람직하게는 HDM203B (서열 번호 83), HDM202 (서열 번호 81), HDM201 (서열 번호 80), HDM205 (서열 번호 85), HDM203A (서열 번호 82) 또는 이의 변이체의 폴리펩티드로부터 독립적으로 선택한 적어도 2, 3 또는 4개의 폴리펩티드를 포함한다.
HDM202 (서열 번호 81)의 특정한 변이체는 HDM202 서열의 절단체인 HDM202D (서열 번호 102; FKNRFLMSAEA), HDM202E (서열 번호 103; FKNRFLMS AE) 및 HDM202H (서열 번호 104; EFKNRFLMS AE)이다. 이는 이러한 각 서열이 R, K, H, E 및 D로부터 선택한 N 및/또는 C 말단에서의 적어도 하나(및 6개 까지)의 잔기를 첨가하여 변이될 수 있다고 예상된다.
선택적으로, 조성물은 서열 번호: 5, 51, 52, 100, 101, 72, 73, 74 또는 이의 변이체 중 어느 것의 폴리펩티드로부터 선택된 적어도 하나의 추가 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 추가 폴리펩티드는 바람직하게는 서열 번호: 51, 73, 100 및 101 중 어느 것의 폴리펩티드이다.
선택적으로, 조성물은 서열 번호: 1, 9, 21, 24, 48, 54, 56, 57, 62, 63, 65, 76, 84 및 86 중 어느 것의 폴리펩티드 또는 이의 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 추가 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 추가 폴리펩티드는 바람직하게는 서열 번호: 63 및 65 중 어느 것의 폴리펩티드 또는 이의 변이체이다.
좀더 구체적으로 말하면, 한 실시형태에서, 본 발명은 다음으로 구성된 4개 및 13개 사이의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다:
a) 서열 번호 83 및 82 중 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 서열 번호 83;
b) 서열 번호 80, 81 및 85 중 적어도 두개의 폴리펩티드 또는 이의 변이체; 및 선택적으로
c) 서열 번호 : 5 , 51 , 52, 100, 101, 72, 73 및 74 중 어느 서열의 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 이의 변이체 , 바람직하게는 서열 번호: 51, 73, 100 및 104 또는 이의 변이체; 및/또는
d) 서열 번호: 1, 9, 21, 24, 48, 54, 56, 57, 62, 63, 65, 76, 84 및 86 중 어느 서열의 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 서열 번호: 63 및 65 또는 이의 변이체.
다시 말해서, 본 발명의 특정한 한 실시형태는 4개 및 13개 사이의 펩티드 서열을 포함하는, 자기내성화에 의한 먼지 진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 이 조성물은 다음으로 이루어진다:
a) 다음 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드:
HDM203B DLRQMRTVTPIRMQGGSGS (서열 번호 83) 및
HDM203A DLRQMRTVTPIRMQGGCGS (서열 번호 82);
또는 이의 변이체; 및
b) 다음 서열을 갖는 적어도 두 개의 폴리펩티드:
HDM201 ESVKYVQSNGGAI (서열 번호 80);
HDM202 DEFKNRFLMSAEAFE (서열 번호 81 ); 및
HDM205 SYYRYVAREQS (서열 번호 85)
또는 이의 변이체 및 선택적으로;
c) 다음 서열을 갖는 적ㅇ도 하나의 폴리펩티드:
HDM09A REALAQTHSAIAVI (서열 번호 5);
HDM03D RNQSLDLAEQELVDSASQH (서열 번호 51);
HDM03E RNQSLDLAEQELVDBASQH* (서열 번호52);
HDM03V EQELVDSASQHG (서열 번호 100);
HDM03W ELVDSASQHG (서열 번호 101);
HDMlOl NYCQIYPPNVNKIREA (서열 번호 72);
HDMlOlA NYSQIYPPNVNKIREA (서열 번호 73); 및
HDMlOlB NYBQIYPPNVNKIREA* (서열 번호 74)
또는 이의 변이체, 및/또는;
d) 다음 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드:
HDMOl IDLRQMRTVTPIR (서열 번호 1);
HDM21 A KPFQLEAVFEANQNTK (서열 번호 9);
HDM48 TAIFQDTVRAEMTK (서열 번호 21 );
HDM51 A VDFKGELAMRNIEAR (서열 번호 24);
HDMOlA IDLRQMRTVTPIRMQGGSG (서열 번호 48);
HDM06A RYVAREQSSRRP (서열 번호 54);
HDM07 PNVNKIREALAQT (서열 번호 56);
HDM19A DQVDVKDSANHEIKK (서열 번호 57);
HDM23C GLEVDVPGIDPNASH (서열 번호 62);
HDM26B GVLASAIATHAKIR (서열 번호 63);
HDM35A RGLKQMKRVGDANV (서열 번호 65);
HDM102A NAQRFGISNYSQI (서열 번호 76);
HDM204 SAYLAYRNQSLDLA (서열 번호 84); 및
HDM206 DNGYGYFAANIDLMMIEE (서열 번호 86)
또는 이의 변이체. *Б=아미노부티르산
상기 (a) 내지 (d)는 본 발명의 적절한 조합의 확인을 위한 엄중하고 매우 까다롭게 선별된 기준을 나타내는 것으로 인식될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 서열로부터 무작위로 8개의 펩티드를 선택된다면, 선택할 수 있는 가능한 조합의 수는 거의 천억개일 것이다. 그에 반해서, 상기 기준이 적용되는 8개 폴리펩티드의 조합의 예를 고려하기에 유용하다. 예를 들어, 하기 폴리펩티드가 선택된 조합을 고려한다:
i) 서열 번호 80, 81 및 85 중 2개의 폴리펩티드 및 서열 번호 82 및 83 중 적어도 하나의 폴리펩티드; 및
ii) 서열 번호 5, 51, 52, 72, 73, 74, 100 및 101 중 어느 서열의 폴리펩티드로부터 선택된 2개의 추가 폴리펩티드; 및 최종적으로
iii) 서열 번호: 1, 9, 21, 24, 48, 54, 56, 57, 62, 63, 65, 76, 84 및 86 중 어느 서열의 폴리펩티드로부터 선택된 2개의 추가 폴리펩티드.
이러한 선택을 기초로 하여, 본 발명에 의해 결정된 기준이 적용되지 않는다면, 가능한 조합의 수는 총 이용할 수 있는 조합의 0.0006% 이하이다.
상기를 기초로 하여, 본 발명의 바람직한 특정 조합은 HDM201 (서열 번호 80), HDM203B (서열 번호 83), HDM205 (서열 번호 85), HDM03W (서열 번호 101), HDMlOlA (서열 번호 73), HDM26B (서열 번호 63), HDM35A (서열 번호 65), 및 선택적으로 서열 번호 24의 펩티드 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명의 다른 바람직한 조합은 HDM201 (서열 번호 80), HDM203B (서열 번호 83), HDM205 (서열 번호 85) 및 HDM03W (서열 번호 101)의 폴리펩티드를 포함하거나 이로 구성된다.
상기에 따라, 조성물은 총 13개까지의 특별한 폴리펩티드를 추가 폴리펩티드로 선택적으로 포함할 수 있다. 이러한 추가 폴리펩티드는 다른 서열, 즉 이미 선택된 폴리펩티드에 속하지 않은 서열 번호 1 내지 104(즉, 통상적으로 이의 상동체 및/또는 단편)이다. 추가 펩티드는 통상적으로 서열 번호 1 내지 104 중 어느 하나의 펩티드의 기능적 변이체이다. 추가 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열과 동일하다. 그러므로 조성물은 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열으로 제공되는 바와 같은 13개까지의 상이한 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 그러나, 선택적인 추가 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열과 100% 일치할 필요는 없다. 이들은 이전에 선택된 폴리펩티드 중에서 미리 선택되지 않은 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 적어도 9개(예를 들어 적어도 10, 11, 12 또는 13개) 또는 그 이상의 연속 아미노산과 바람직하게는 적어도 65% 일치한다. 이러한 연속 아미노산은 예를 들어 본원에 언급된 MHC 분자 중 어느 서열에 결합하는 MHC 클래스 II 에피토프를 포함할 수 있다. 다시 발해서, 조성물은 총 13개까지의 특정한 추가 폴리펩티드를 선택적으로 포함할 수 있으며, 여기에서 추가 폴리펩티드는:
(i) 상기 (a) 내지 (d)에서 선택되지 않은 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 적어도 하나 또는 그 이상의 연속 아미노산과 적어도 65% 일치하는 서열을 포함하며; 및
(ii) 9 내지 30개 아미노산 길이이다.
여기에서 각 상이한 폴리펩티드는 자기내성화에 의한 먼지 진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 동시에, 분리해서 또는 순차적으로 사용하기 위한 것이다.
그러므로 좀더 자세히 설명하면, 본 발명은 상기 (a) 및 (d)에 규정된 바와 같은 4 내지 13개의 폴리펩티드 및 선택적으로 다음을 포함하며 자기내성화에 의한 먼지 진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 동시에, 분리해서 또는 순차적으로 사용하는 제품을 제공한다:
(e) 다음과 같은 폴리펩티드 :
(i) 상기 (a) 내지 (d)에서 선택되지 않은 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 적어도 하나 또는 그 이상의 근접한 아미노산과 적어도 65% 일치하는 서열을 포함하며; 및
(ii) 9 내지 30개 아미노산 길이임; 및 선택적으로
(f) (e)에서 규정된 바와 같으나 (d)에서 추가적으로 선택되지 않은 폴리펩티드; 및 선택적으로
(g) (e)에서 규정된 바와 같으나 상기 (e) 내지 (f)에서 추가적으로 선택되지 않은 폴리펩티드; 및 선택적으로
(h) (e)에서 규정된 바와 같으나 상기 (e) 내지 (g)에서 추가적으로 선택되지 않은 폴리펩티드; 및 선택적으로
(i) (e)에서 규정된 바와 같으나 상기 (e) 내지 (h)에서 추가적으로 선택되지 않은 폴리펩티드; 및 선택적으로
(j) (e)에서 규정된 바와 같으나 상기 (e) 내지 (i)에서 추가적으로 선택되지 않은 폴리펩티드; 및 선택적으로
(k) (e)에서 규정된 바와 같으나 상기 (e) 내지 (j)에서 추가적으로 선택되지 않은 폴리펩티드; 및 선택적으로
(l) (e)에서 규정된 바와 같으나 상기 (e) 내지 (k)에서 추가적으로 선택되지 않은 폴리펩티드; 및 선택적으로
(m) (e)에서 규정된 바와 같으나 상기 (e) 내지 (l)에서 추가적으로 선택되지 않은 폴리펩티드; 및 선택적으로
(n) (e)에서 규정된 바와 같으나 상기 (e) 내지 (m)에서 추가적으로 선택되지 않은 폴리펩티드; 및 선택적으로
(o) (e)에서 규정된 바와 같으나 상기 (e) 내지 (n)에서 추가적으로 선택되지 않은 폴리펩티드; 및 선택적으로
(p) (e)에서 규정된 바와 같으나 상기 (e) 내지 (o)에서 추가적으로 선택되지 않은 폴리펩티드.
본 발명의 다른 실시형태는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함하는 자기내성화에 의한 집 먼지 진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물이며, 여기에서 폴리펩티드는 다음 중 어느 서열으로부터 선택된 것이다:
(i) HDM203B (서열 번호 83), HDM202 (서열 번호 81), HDM201 (서열 번호 80), HDM205 (서열 번호 85), HDM203A (서열 번호 82), 서열 번호 NO 1 내지 79, 84, 또는 86 내지 104 (서열 번호 1 내지 104 중 어느 하나) 중 어느 서열의 폴리펩티드; 또는
(ii) (i)에 따른 폴리펩티드의 변이체, 여기에서 상기 변이체는 다음으로 구성된 영역을 포함하는 9 내지 30개 아미노산 길이의 폴리펩티드이다:
- (i)의 서열 중 어느 서열; 또는
- (i)의 서열 중 어느 서열에 대해 환자를 자기내성화시킬 수 있는 서열인 서열 (i) 중 어느 서열에 적어도 65% 상동성을 갖는 서열, 또는
(iii) (i)에 따른 폴리펩티드의 변이체, 여기에서 상기 변이체는 다음 중 하나를 나타내는 서열로 구성된 영역을 포함하는 9 내지 30개 아미노산 길이의 폴리펩티드이다:
- (i)의 서열 중 어느 서열의 단편; 또는
- (i)의 서열 중 어느 서열의 단편의 상동체,
서열은 (i)의 서열 중 어느 서열에 대해 환자를 자기내성화시킬 수 있으며 적어도 9개 아미노산 길이이고, 여기에서 상기 상동체는 (i)의 서열 중 어느 서열의 어느 9개의 연속 아미노산에 적어도 65% 상동성을 갖는다.
본 발명의 조성물 또는 제품은 상기 정의한 서열 중 어느 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 변이체는 통상적으로 서열 번호 1 내지 104의 상응 펩티드에 존재하는 1, 2, 3 또는 그 이상의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함한다.
기능적 변이체는 본원에 언급되어 있다. 이러한 변이체는 서열 번호 1 내지 104의 상응하는 펩티드에 나타나는 클래스 II MHC 에피토프에 대해 환자를 자기내성화시킬 수 있을 것이므로, 동일한 MHC 클래스 II 분자에 결합하고/결합하거나 서열 번호 1 내지 104의 폴리펩티드에서의 상응하는 에피토프를 인식하는 T 세포에 의해 인식되는 서열을 통상적으로 포함할 것이다.
서열 번호 1 내지 104의 변이체는 절단에 의해 유래된 단편일 수 있다. 절단은 서열 번호 1 내지 104의 폴리펩티드의 N 및/또는 C-말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산을 제거함을 의미한다. 적절한 절단의 예는 실시예 5에 실례를 보여주려는 목적으로 제공된다. 특히, 서열 번호 81의 절단은 서열 번호 102 내지 104로서 제공된다. 마찬가지로, HDM03(서열 번호 89 내지 101)의 다수의 바람직한 변이체는 절단체이다. HDM03의 특히 바람직한 변이체는 HDM03V 및 HDM 03 W (서열 번호 100 및 101)이다.
T 세포 에피토프를 만드는 중심 9개의 아미노산이 실질적으로 방해되지 않는다면, 단편은 또한 하나 또는 그 이상의 내부 삭제에 의해 생성될 수 있다.
예를 들어, 서열 번호 1의 변이체는 서열 번호 1, 즉 더 짧은 서열의 단편을 포함할 수 있다. 이는 서열 번호 1의 N-말단으로부터 또는 서열 번호 1의 C-말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산을 삭제함을 포함할 수 있다. 이러한 삭제는 서열 번호 1의 말단 둘 다로부터 실시될 수 있다. 서열 번호1의 변이체는 서열 번호 1의 말단을 지나 연장되는 (예를 들어, 펩티드가 유래된 부모 단백질의 서열로부터의) 추가 아미노산을 포함할 수 있다. 변이체는 상기 논의된 삭제 및 추가의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 서열 번호 1의 한 말단으로부터 삭제될 수 있으나, 총 길이 부모 단백질 서열로부터 추가 아미노산을 서열 번호 1의 다른 말단에 첨가할 수 있다. 또한 상기 변이체의 동일한 논의는 서열 번호 2 내지 104에 적용한다.
변이체 펩티드는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 아미노산 서열 또는 이의 단편으로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 변이체 펩티드는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열에서의 적어도 9개 또는 그 이상의 연속 아미노산에서 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 좀더 바람직하게는 적절한 변이체는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 적어도 70%, 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%의 아미노산 상동성을 포함할 수 있다. 이러한 수준의 아미노산 상동성은 펩티드의 어느 구역에서든 보여질 수 있지만 중심 영역인 것이 바람직하다. 아미노산 상동성의 수준은 적어도 9개 근접한 아미노산 이상이나 비교하는 펩티드의 크기에 따라 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 적어도 16 또는 17개 아미노산일 수 있다. 따라서, 상기 특정-수준의 상동성 중 어느 서열은 서열의 전체 길이 전체에 걸쳐 있을 수 있다.
아미노산 서열에 관련하여, "서열 상동성"은 하기 파라미터를 갖는 ClustalW(thompson 등의, Nucleic Acids Res. 1994 Nov 11;22(22):4673-80)를 사용하여 평가했을 때 명시된 수치를 갖는 서열을 의미한다: 쌍 정렬 파라미터(Pairwise alignment parameters) -방법: 정밀한, 매트릭스: PAM, 갭 오픈 패널티(Gap open penalty): 10.00, 갭 익스텐션 패널티((Gap extension penalty): 0.10; 다중 정렬 파라미터(Multiple alignment parameters) -매트릭스: PAM, 갭 ㅇ오픈 패널티: 10.00, 지연에 대한 % 상동성: 30, 패널라이즈 엔드 갭(Penalize end gaps): on, 갭 세퍼레이션 디스턴스(Gap separation distance): 0, 음성 매트릭스: no, 갭 익스텐션 패널티: 0.20, 잔기- 특이 갭 패널티: on, 친수성 갭 패널티: on, 친수성 잔기: GPSNDQEKR. 특정 잔기에서의 서열 상동성은 단순히 유도체를 만드는 동일한 잔기를 포함하는 것으로 생각된다.
변이체 펩티드는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열으로부터 1, 2, 3, 4, 5 또는 그이상, 또는 10개까지의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 치환 변이체는 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 아미노산을 동일한 수의 아미노산을 치환하는 것 및 보존적 아미노산 치환을 만드는 것을 포함한다. 예를 들어, 아미노산은 유사한 특성을 갖는 대체 아미노산, 예를 들어 다른 염기성 아미노산, 다른 산성 아미노산, 다른 천연 아미노산, 다른 전하의 아미노산, 다른 친수성 아미노산, 다른 소수성 아미노산, 다른 극성 아미노산, 다른 방향족 아미노산 또는 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 적절한 치환을 선택하기 위해 사용될 수 있는 20개 주요 아미노산의 몇몇 특성은 다음과 같다:
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추가 변이체는 자연적으로 발생하는 아미노산 대신에 서열에서 나타나는 아미노산이 구조적 유사체인 것을 포함한다. 서열에서 사용된 아미노산은 또한 펩티드의 기능에 상당히 부정적인 영향을 미치지 않는다면 예를 들어 표지되는 것과 같이 변이될 수 있다. 펩티드가 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 서열 또는 이의 단편으로부터 변화된 서열을 갖는 경우, 치환은 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 서열 내에서 또는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 서열 외부에서 서열의 총 길이 전반에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 첨가, 삭제, 치환 및 변형과 같은 본원에 기재된 변이는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 서열 내에서 일어날 수 있다. 변이체 펩티드는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 아미노산 치환이 일어난 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 아미노산 서열로 필수적으로 포함하거나 구성될 수 있다. 변이체 펩티드는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열보다 더 큰 부모 단백질의 단편을 포함할 수 있다. 이 실시형태에서, 치환 및 변형과 같은 본원에서 기재된 변이는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 서열 내 및/또는 외부에서 일어날 수 있다.
본 발명의 변이체는 9 내지 30개 아미노산의 포괄적인 길이이다. 바람직하게는, 이들은 9 내지 20개 또는 바람직하게는 13 내지 17개 아미노산 길이일 수 있다. 펩티드는 서열 번호 1 내지 20 중 어느 하나에서의 펩티드 서열과 같은 길이일 수 있다.
펩티드를 예를 들어 단백질분해 절단에 의해 폴리펩티드 알레르겐으로부터 화학적으로 유도할 수 있거나 예를 들어 폴리펩티드 알레르겐의 아미노산 서열의 사용하고 서열에 기초한 펩티드를 합성함에 의해 폴리펩티드 알레르겐으로부터 지적인 방식으로 유도할 수 있다. 펩티드는 본 분야에서 널리 알려진 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
폴리펩티드가 제조되는 동안 통상적으로 보존되기 어려운 잔기를 포함하는 경우, 이러한 잔기를 치환할 수 있다. 예를 들어, 글루타메이트는 특히 펩티드의 N 말단에 존재할 때 용액 내에서 자발적으로 피로글루타메이트를 형성한다. 그러므로, 천연 알레르겐 단백질 서열의 서열 내 글루타메이트에 해당하는 본 발명의 펩티드 잔기는 이러한 잔기가 펩티드의 N 말단에 존재할 때 본 발명의 펩티드 내에서 피로글루타메이트로 치환될 수 있다.
용어 "펩티드"는 아미노산 잔기가 펩티드(-CO-NH-) 결합에 의해 연결되는 분자뿐만 아니라 펩티드 결합이 반전되는 분자도 포함한다. 이러한 레트로-인버소(retro-inverso) 펩티도미메틱(peptidomimetic)은 예를 들어 Meziere 등의 (1997) J. Immunol.159, 3230-3237에 기재된 바와 같은 본 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 이러한 접근은 측쇄의 방향이 아닌 주골격에 관한 변화를 포함하는 슈도펩티드(pseudopeptide)를 만드는 것을 포함한다. Meziere 등의 (1997) 문헌은 적어도 MHC 클래스 II 및 T 헬퍼 세포 반응에서, 이러한 슈도펩티드가 유용함을 나타낸다. CO-NH 펩티드 결합 대신 NH-CO 결합을 포함하는 레트로-인버소 펩티드는 단백질분해에 상당히 더 저항성을 나타낸다.
마찬가지로, 펩티드 결합은 전적으로 아미노산 잔기의 탄소 원자 사이의 공간을 유지하는 적절한 링커 성분을 사용하여 제공될 수 있다; 링커 성분이 펩티드 결합으로서 실질적으로 동일한 전하 분포 및 실질적으로 동일한 평면성을 갖는다면 특히 바람직하다. 이는 또한 펩티드가 외부단백질분해(exoproteolytic) 절단에 대한 감수성을 감소시기키는 것을 돕기위해 N- 또는 C-말단에서 편리하게 차단될 수 있음이 또한 인정될 것이다. 예를 들어, 펩티드의 N-말단 아미노기는 카르복시산과 반응시켜 보호할 수 있고 펩티드의 C-말단 카르복시기는 아민과 반응시켜 보호할 수 있다. 변형의 다른 예는 글리코실화 및 인산화를 포함한다. 다른 가능성있는 변형은 R 또는 K의 측쇄 아민에서의 수소가 메틸렌기로 치환될 수 있다(-NH2 → -NH(Me) 또는 N(Me)2).
본 발명에 따른 펩티드의 유사체는 또한 생체내 펩티드 반감기를 증가시키거나 감소시키는 펩티드 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 펩티드의 반감기를 증가시킬 수 있는 유사체의 예는 펩티드의 펩토이드(peptoid) 유사체, 펩티드의 D-아미노산 유도체 및 펩티드-펩토이드 하이브리드를 포함한다. 본 발명에 따라 사용된 변이체 폴리펩티드의 추가 실시형태는 폴리펩티드의 D-아미노산 형태를 포함한다. L-아미노산보다 D-아미노산을 사용한 폴리펩티드의 제형이 이의 투여 빈도에 따라, 투여될 필요가 있는 약제의 양을 감소시키는, 일반 대사 과정에 의한 약제의 원하지 않는 파괴를 매우 감소시킨다.
본 발명에 의해 제공된 펩티드는 부모 단백질 사슬을 코드하는 일차 전사의 대체 스플라이싱에 의해 생성되는 mRNA에 의해 코드되는 부모 단백질의 스플라이스 변이체로부터 유래될 수 있다. 펩티드는 또한 아미노산 돌연변이, 글리코실화 변이체 및 적어도 알레르겐의 MHC-결합 특성을 유지하는 부모 단백질의 공유 유도체일 수 있다. 모범적인 유도체는 본 발명의 펩티드가 자연적으로 발생한 아미노산보다는 다른 성분으로 치환, 화학적, 효소적 또는 다른 적절한 방식에 의해 공유적으로 변이되는 분자를 포함한다. 추가로 상이한 진드기에서 발견되는 부모 단백질의 변이체를 자연적으로 야기함을 포함한다. 이러한 변이체는 대립형질 변이체에 의해 코드될 수 있거나 대안적인 스플라이싱 변이체를 나타낸다.
상기 기술된 바와 같은 변이체는 펩티드의 합성 동안 또는 생성 후 변형에 의해 생성될 수 있거나 펩티드가 핵산의 부위 지정 돌연변이, 무작위 돌연변이 또는 효소학적 절단 및/또는 연결의 공지 기술을 사용한 재조합체 형태일 때 생성될 수 있다.
본 발명에 따라서, 조성물이 포함할 수 있는 추가 펩티드는 바람직하게는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열의 기능적 변이체이다. 즉, 펩티드가 바람직하게는 면역 반응을 유도할 수 있다. 특히, 펩티드는 바람직하게는 집 먼지 진드기 알레르기 환자에서 사이토카인 생성을 유도할 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 조성물은 집 먼지 진드기 알레르기 환자의 집단에서 환자의 30, 35, 40% 이상, 바람직하게는 45% 또는 50%에서 사이토카인 반응을 생성하는 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함할 것이다. 집 먼지 진드기 알레르기 환자의 패널에서의 환자의 수는 1명 이상, 예를 들어 20, 30, 40, 50, 80 또는 적어도 100명의 환자일 수 있다. 바람직하게는 조성물은 적어도 2개, 3개 또는 가장 바람직하게는 4개의 이러한 펩티드를 포함한다. 바람직하게는 사이토카인 반응은 IL13 또는 IFN-γ의 생성이다. 사이토카인 생성은 어떤 적절한 방법에 의해 측정할 수 있다. 사이토카인의 생성은 통상적으로 펩티드의 존재시 생성되는 사이토카인의 수준이 자극이 없을 때(즉, 펩티드 또는 다른 어떤 자극의 부재시 동일한 환자에 의해 나타나는 수준) 생성되는 상기 사이토카인의 기본 수준의 적어도 2, 3, 4 또는 5배일 경우 펩티드에 대한 반응에서 발생할 것으로 간주된다. 대안적으로, 사이토카인의 생성은 생성된 사이토카인의 양이 인식 한계, 통상적으로 250㎕에서 대략 1.25x106 세포의 시료로부터 통상적으로 90, 95 또는 바람직하게는 100 pg/ml을 초과할 경우 발생되었다고 간주될 수 있다.
사이토카인 생성을 측정하는 적절한 방법은 통상적으로 피실험자로부터의 사이토카인 방출을 측정함을 포함한다. 시료는 통상적으로 혈액 또는 혈청이다. PBMC로부터의 사이토카인 방출은 주어진 펩티드의 존재 하에 세포를 항온한 후 측정했다. 그런 다음 항온 혼합물로부터의 상청액을 예를 들어, ELISA, ELISPOT 검정 또는 유동 세포측정 검정과 같은 적절한 모든 방법을 사용하여 실험했다. 특히 바람직한 방법은 예를 들어 de Jager 등의; Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2003, VoI 10(1) p. 133-139에 기재된 바와 같은 멀티플렉스 비드 어레이 검정을 포함한다. 통상적으로, 조성물은 집 먼지 진드기 알레르기 환자의 집단에서 20%, 25% 이상, 바람직하게는 30%, 35% 또는 40%의 환자에서 사이토카인 반응을 생성하는, 총 13개까지의 상이한 펩티드들인, 미리 선택된 폴리펩티드에 속하지 않은 적어도 하나의 추가 펩티드 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
조성물은 또한 집 먼지 진드기 알레르기 환자의 집단에서 10%, 15% 이상, 바람직하게는 20%의 환자에서 사이토카인 반응을 생성하는, 총 13개까지의 상이한 펩티드들인, 미리 선택된 폴리펩티드에 속하지 않은 하나 또는 그 이상의 추가 펩티드 또는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다.
TCR에 결합할 수 있는 적절한 변이체는 공지된 기준에 따라 선택하거나 실험적으로 유도할 수 있다. 단일 펩티드 내에서 T 세포 수용체의 고도가변부와 상호작용하는 특정 잔기가 있다(Allen 등의 (1987) Nature 327: 713-5).
T 세포 수용체 상호작용에 기여하는 잔기 내에서, 계층은 주어진 펩티드 잔기의 치환에 따른 T 세포 활성화의 의존에 관련된 것으로 입증되었다. 상이한 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 T 세포 수용체 접촉 잔기를 갖는 펩티드를 사용하여, 여러 그룹이 T 세포 활성화의 과정에 따른 상당한 영향을 나타냄을 입증했다. Evavold & Allen ( 1991 ) Nature 252: 1308-10에서 T 세포 증식 및 사이토카인 생성의 분리를 입증했다. 헤모글로빈(I-Ek의 맥락에서)의 잔기 64-76에 대해 특이적인 T 세포 클론의 이러한 생체외 모델에서, 글루탐산에 대한 아스파르트산의 보존적 치환이 이루어지는 펩티드 유사체로 항원투여했다. 이러한 치환은 I-Ek에 결합하는 유사체의 능력에 유의할만하게 개입하지 않는다.
이러한 유사체로 T 세포 클론에 생체외 항원투여한 후, 증식이 검출되었지만 B 세포 반응을 돕는 클론의 능력과 같은, IL-4 분비가 유지되었다. 순차적 연구에서 동일한 그룹은 사이토카인 생성으로부터 T 세포-매개 세포용해의 분리를 입증했다. 이러한 경우에, 전자는 바뀌지 않고 남아있지만 후자는 손상되었다. 생체내 달라진 펩티드 리간드의 효능은 McDevitt 및 그의 동료들(Smilek 등의 (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88 : 9633-9637)에 의해 EAE(experimental allergic encephalomyelitis; 실험적 알레르기성 뇌척수염)의 마우스 모델에서 초기에 입증되었다. 이 모델에서 EAE는 MBP(myelin basic protein; 미엘린 염기 단백질)의 뇌염발생 펩티드로 면역화하여 유도되었다. 위치 4(리신)에서의 알라닌 잔기로의 치환은 이의 제한 요소(AαuBβu)에 잘 결합하나 민감한 PL/JxSJLF1 균주에서 비면역학적이며 뿐만 아니라 뇌염발생 펩티드로 면역화하기 전 또는 후에 투여되었을 때 EAE의 시작이 예방하는 펩티드를 생성한다. 그러므로, 잔기는 T-세포의 다양한 기능을 유도하는 펩티드의 능력에 영향을 미치는 펩티드에서 확인될 수 있다.
유리하게는, 펩티드는 T-세포 증식 및 탈감작의 유도에 알맞도록 설계될 수 있다. Metzler 및 Wraith는 펩티드-MHC 친화성을 증가시키는 치환이 이루어지는 펩티드의 면역관용 능력을 개선시킴을 입증했다(Metzler & Wraith(1993) Int Immunol~ : 1159-65). 변화된 펩티드 리간드가 클론화 T 세포에서 장기간의 상당한 에너지를 발생시킬 수 있다는 것이 Sloan-Lancaster et al (1993) Nature 363: 156-9에 입증되었다.
본 발명의 조성물은 알레르겐에 민감한 환자에서 후기 반응을 유도할 수 있다. 용어 "후기 반응"은 Allergy and Allergic Diseases (1997) A. B. Kay (Ed.), Blackwell Science, pp 1113-1130에 나타난 바와 같은 의미를 포함한다. 후기 반응은 모든 후기 반응(late phase response; LPR)일 수 있다. 바람직하게는, 펩티드는 후기 천식 반응(late asthmatic response; LAR)이나 후기 비염 반응 또는 후기 피부 반응이나 후기 안구 반응을 유도할 수 있다. 특정 펩티드가 LPR을 야기하는지 아닌지를 본 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다; 특히 바람직한 방법은 Cromwell O, Durham SR, Shaw RJ, Mackay J and Kay AB. Provocation tests and measurements of mediators from mast cells and basophils in asthma and allergic rhinitis. In: Handbook of Experimental Immunology (4) Chapter 127, Editor: Weir DM, Blackwell Scientific Publications, 1986에 기재되어 있다.
그러므로, 바람직하게는, 본 발명의 개별 펩티드는 알레르겐에 민감한 환자에서 LPR을 유도할 수 있다. 알레르겐에 민감한 환자인지 아닌지를 알레르겐 추출물 용액을 사용한 피부 단자 검사, 피부 LPR 유도, 병력, 알레르겐 항원투여 및 알레르겐 특이 IgE의 측정을 위한 방사선알레르겐흡수 테스트(radioallergosorbent test; RAST)와 같은 널리 공지된 방식으로 결정할 수 있다.특정 환자가 치료에 효과가 있을것으로 예상되는지 여부는 예를 들어 상기 테스트에 기초하여 의사에 의해 결정될 수 있다.
알레르겐에 대한 환자의 탈감작 또는 자기내성화는 적절하게 민감한 환자에서 알레르겐에 의해 유도되는 알레르기성 조직 작용의 저해 또는 약화를 의미한다. 이는 T 세포가 선택적으로 활성화될 수 있고 그 후 무반응하게 되는 것을 보여준다. 게다가, 이러한 T 세포의 anergising 또는 제거가 특정 알레르겐에 대한 환자의 탈감작을 이끌어낸다. 탈감작은 알레르겐 또는 알레르겐-유래 펩티드의 이차 및 추가 투여에서 알레르겐 또는 알레르겐-유래 펩티드에 대한 반응의 감소 또는 바람직하게는 이러한 반응의 제거를 자체적으로 나타낸다. 이차 투여는 탈감작이 발생하도록 적절한 시간 간격이 경과한 후에 실시할 수 있다; 이는 바람직하게는 하루 및 몇 주 사이의 모든 간격이다. 약 2주 간격이 바람직하다.
본 발명의 조성물이 집 먼지 진드기 알레르기 환자에서 LPR을 유도할 수 있지만, 조성물이 환자를 치료하기 위해 사용되었을 때 관찰가능한 LPR이 일어나지는 않을 것이지만 반응은 다음 투여량(바람직하게는 더 높은)이 주어질 수 있는 T 세포를 부분적으로 탈감작시키기에 충분할 것인 충분히 낮은 농도의 조성물을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 방식에서 투여량은 완전한 탈감작을 부여하지만 종종 환자에게 LPR을 항상 유도하지 않도록 점점 증가된다. 그러나, 조성물 또는 펩티드가 투여된 것보다 더 높은 농도에서 활동할 수 있다.
본 발명의 조성물은 집단으로부터의 먼지 진드기 알레르기 환자의 50% 또는 그 이상의 패널에서 후기 반응을 유도할 수 있다. 좀더 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 55% 또는 그 이상, 60% 또는 그 이상, 65% 또는 그 이상, 70% 또는 그 이상, 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상의 패널에서의 탈감작 환자에 LPR을 유도할 수 있다. 조성물이 특정 백분율의 피실험자 패널에서 LPR을 유도할 수 있는지 여부를 본 분야에서 널리 공지된 방법으로 결정할 수 있다.
본 발명의 펩티드가 MHC 클래스 II 결합을 위해 요구되는 최소 필수 서열인 9개 중심 아미노산으로 이루어진 T 세포 에피토프를 포함함이 이해될 것이다. 그러나, 펩티드는 또한 9개 중심 아미노산의 측면에 추가 잔기를 포함할 수 있다. 그러므로 펩티드는 몇몇 잔기가 에피토프의 기능에 영향을 미치지 않고 변이될 수 있는 T 세포 에피토프를 포함하는 영역을 포함한다. 따라서, 상기 규정된 바와 같은 펩티드의 기능적 변이체는 펩티드의 원래 서열에 비해 가용성이 향상되도록 변형된 펩티드를 포함한다. 환자에게 적은 가용성 제제를 투여시 바람직하지 않은 비-관용 염증 반응을 야기할 수 있기 때문에, 개선된 가용성은 본 발명의 펩티드가 유도하는 알레르겐에 대한 피실험자의 자기내성화에 유리하다. 펩티드의 가용성은 T 세포 에피토프를 포함하는 영역의 측면의 잔기를 바꿈으로서 개선될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 다음을 포함함으로써 좀더 용해가 잘 되도록 조작될 수 있다:
i) T 세포 에피토프의 측면의 펩티드 잔기에 대한 N 말단: 펩티드가 유도된 단백질의 서열에서 상기 잔기에 대한 N 말단 바로 옆의 2 내지 6개의 연속 아미노산에 상응하는 1 내지 6개의 연속 아미노산; 및/또는
ii) T 세포 에피토프의 측면의 펩티드 잔기에 대한 C 말단: 펩티드가 유도된 단백질의 서열에서 상기 잔기에 대한 C 말단 바로 옆의 2 내지 6개의 연속 아미노산에 상응하는 1 내지 6개의 연속 아미노산; 또는
iii) T 세포 에피토프 측면의 펩티드 잔기에 대한 N 및 C 말단 둘다, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루타메이트 및 아스파테이트 중에서 선택한 적어도 하나의 아미노산.
추가적으로, 펩티드는 다음과 같이 좀더 용해가 잘 되도록 추가로 조작될 수 있다:
i) 펩티드의 원래 서열에서 어느 시스테인 잔기를 세린 또는 2-아미노부티르산으로 치환; 및/또는
ii) T 세포 에피토프에 포함되지 않는 펩티드의 원래 서열의 N 또는 C 말단에서의 어느 잔기를 삭제; 및/또는
iii) T 세포 에피토프에 포함되지 않는 펩티드의 원래 서열의 N 또는 C 말단에서의 4개까지의 아미노산에서의 서열 Asp-Gly을 포함하는 어느 두개의 보존 아미노산을 삭제.
핵산 및 벡터
본 발명의 조성물 및 제품의 기초가 되는 개별 펩티드를 직접적으로 투여할 수 있거나, 코딩 서열로부터의 발현에 의해 간접적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 폴리누클레오티드는 상기 기재된 펩티드 중 어느 것과 같이, 본 발명의 펩티드를 코드할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 코드하고 이를 발현할 수 있는 폴리누클레오티드의 형태로 생성되거나 수송될 수 있다. 본 발명의 펩티드의 사용, 수송 또는 투여에 대한 본원의 참조는 코드하는 폴리누클레오티드로부터 발현을 통한 펩티드의 직접 사용, 수송 또는 투여를 포함하는 의도이다.
용어 " 핵산 분자" 및 "폴리누클레오티드"는 본원에서 교환가능하게 사용되며 모든 길이의 데옥시리보누클레오티드 또는 리보누클레오티드 중 하나 또는 이의 유사체의 누클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 폴리누클레오티드의 비-제한적 예는 유전자, 유전자 단편, 메신저 RNA(mRNA), cDNA, 재조합체 폴리펩티드, 플라스미드, 벡터, 어느 서열의 분리된 DNA, 어느 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 분리되거나 정제된 형태로 제공될 수 있다. 선택된 폴리펩티드를 "코드하는" 핵산 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 위치할 때 생체내 폴리펩티드로 전사되고(DNA의 경우) 번역되는(mRNA의 경우) 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계선은 5'(아미노) 말단에서 시작 코돈 및 3'(카르복시) 말단에서 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 핵산 서열은 바이러스로부터의 cDNA, 원핵 또는 진핵 mRNA, 바이러스로부터의 게놈 서열, 또는 진핵 DNA나 RNA 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 전사 종결 서열은 코딩 서열의 3'에 위치할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어 Sambrook 등의 문헌(19104, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)에서의 실시예에 기재된 바와 같은, 본 분야에서 널리 공지된 방법에 따라 합성할 수 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드 분자는 삽입 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 발현 카세트의 형태로 제공되어, 표적으로 하는 피실험자에게 생체내에서 본 발명의 펩티드가 발현되도록 한다. 이러한 발현 카세트는 결국 통상적으로 핵산 면역화를 위한 시약으로서 사용하기에 적합한 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터) 내에 제공된다. 이러한 발현 카세트를 숙주 피검자에게 직접적으로 투여할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 피실험자에게 투여할 수 있다. 바람직하게는 폴리펩티드를 유전자 벡터를 사용하여 제조하고/제조하거나 투여할 수 있다. 적절한 벡터는 충분한 양의 유전정보를 수송할 수 있어 본 발명의 펩티드의 발현을 가능하게 하는 모든 벡터일 수 있다.
그러므로 본 발명은 이러한 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 그러므로, 본 발명은 본 발명의 상이한 폴리펩티드를 코드하는 4개 또는 그 이상의 폴리누클레오티드 서열 및 선택적으로 본원에서 규정된 상이한 폴리펩티드를 코드하는 하나 또는 그 이상의 폴리누클레오티드 서열을 추가로 포함하는 자기내성화에 의한 먼지 진드기에 대한 알레르기 예방 또는 치료에 사용하기 위한 벡터를 제공한다. 벡터는 본 발명의 상이한 폴리펩티드를 코드하는 4, 5, 6 또는 7개 폴리누클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 조성물 및 제품이 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드의 혼합물을 포함할 수 있음이 인정될 것이다. 따라서, 본 발명은 폴리펩티드 중 어느 하나 대신에 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 폴리누클레오티드를 갖는, 본원에서 규정된 바와 같은 조성물 또는 제품을 제공한다.
발현 벡터는 분자생물학 분야에서 일상적으로 구성되는 것이며 예를 들어 플라스미드 DNA, 적당한 개시인자, 프로모터, 증폭제 및 예를 들어 필수적일 수 있으며 본 발명의 펩티드의 발현이 가능하도록 하기 위한 정확한 순서로 위치하는 폴리아데닐화 시그널과 같은 다른 요소의 사용을 포함할 수 있다. 다른 적합한 벡터는 본 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 이에 관련하여 추가 실시예에 대해서 Sambrook 등의 문헌을 인용하였다.
그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는 이러한 벡터를 수송하고 벡터로부터 전사가 일어나도록 하는 것에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는,본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터 내에서의 본 발명의 용도는 숙주 세포에 의한 코딩 서열의 발현을 위해 제공될 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 결합한다. 즉, 벡터는 발현 벡터이다.
"작동가능하게 결합"은 기재된 바와 같은 성분들이 이들의 일상 기능을 실행하기 위해 환경을 설정하는 요소의 배열을 의미한다. 그러므로, 프로모터와 같은 주어진 조절 서열은 적합한 효소가 존재할 때 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 핵산 서열에 작동가능하게 결합한다. 프로모터는 서열의 발현에 직접적으로 기능을 하는 동안에는 서열에 근접해 있을 필요는 없다. 그러므로, 예를 들어, 전사되었지만 아직 번역되지는 않은 서열에 개입하여 프로모터 서열 및 핵산 서열 사이에 존재할 수 있으며 프로모터 서열은 코딩 서열에 "작동가능하게 결합"하는 것으로 여전히 간주될 수 있다.
많은 발현 시스템이 본 분야에 기재되어 있으며, 이들 각각은 통상적으로 발현 조절 서열에 작동가능하게 결합된 대상 유전자 또는 누클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 구성되어 있다. 이러한 조절 서열은 전사 프로모터 서열 및 시작 및 종결 서열을 포함한다. 본 발명의 벡터는 예를 들어 플라스미드, 복제의 기원을 가지고 제공되는 바이러스 또는 파지 벡터 및 선택적으로 프로모터의 조절제를 포함할 수 있다. "플라스미드"는 염색체외 유전자 요소의 형태인 벡터이다. 벡터는 예를 들어 박테리아 플라스미드의 경우 암피실린 저항 유전자 또는 진균류 벡터에 대한 저항 유전자와 같은 하나 또는 그 이상의 선별가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 벡터는 예를 들어 DNA 또는 RNA의 도입을 위해 생체내에서 사용할 수 있거나 예를 들어 포유동물 숙주 세포와 같은 숙주 세포를 트랜스펙션시키거나 형질전환시키기 위해 사용할 수 있다. 벡터는 또한 예를 들어 폴리펩티드가 생체내 발현되도록 하기 위한 사용에 적용시킬 수 있다.
"프로모터"는 폴리펩티드-코딩 폴리누클레오티드의 전사를 개시하고 조절하는 누클레오티드 서열이다. 프로모터는 유도가능한 프로모터(프로모터에 작동가능하게 결합되는 폴리누클레오티드 서열의 발현이 피분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도됨), 억제가능한 프로모터(프로모터에 작동가능하게 결합되는 폴리누클레오티드 서열의 발현이 피분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 억제됨) 및 구성적 프로모터를 포함할 수 있다. 용어 "프로모터" 또는 "조절 요소"는 이러한 영역의 기능적(예를 들어, 조절, 전사 또는 번역) 세그먼트 및 총-길이 프로모터 영역을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에 따른 발현 카세트인 폴리누클레오티드는 추가로 시그널 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 시그널 펩티드가 발현되고 프로모터와의 작동가능한 결합으로 또한 코딩 서열에 의해 코드되는 폴리펩티드의 분비를 촉진하는 것과 같이 시그널 펩티드 서열은 프로모터와 작동가능한 결합으로 일반적으로 삽입된다.
통상적으로 시그널 펩티드 서열은 10 내지 30개 아미노산, 예를 들어 15 내지 20개 아미노산의 펩티드를 코드한다. 종종 아미노산은 소수성이 우세하다. 통상적 상황에서, 시그널 펩티드는 발현 세포의 소포체에 시그널 펩티드를 갖는 성장 폴리펩티드 사슬을 표적으로 한다. 시그널 펩티드는 골지체를 통한 폴리펩티드의 분비가 허용되도록, 소포체 내에서 절단된다. 그러므로, 본 발명의 펩티드는 환자 내에서 세포로부터 발현 및 이러한 세포로부터의 분비에 의해 환자에게 제공된다.
대안적으로, 본 발명의 폴리누클레오티드는 항원 제시 세포의 표면에서 MHC 클래스 II 분자에 의한 본 발명의 펩티드의 제시를 가능하게 하는 적합한 방식으로 발현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발현 카세트인 폴리누클레오티드는 항원 제시 세포를 표적으로 할 수 있거나 코드된 펩티드의 발현은 이러한 세포 내에서 우선적으로 자극될 수 있다.
대상 폴리누클레오티드를 본발명의 펩티드의 사용시 생체외, 탈체 또는 생체내에서 사용할 수 있다. 이러한 폴리누클레오티드는 자기내성화에 의한 알레르기의 예방 또는 치료시에 투여하거나 사용할 수 있다.
유전자 수송 방법이 본 분야에 널리 공지되어 있다. U.S. 특허 번호 제 5,399,346호, 제5,580,859호 및 제5,5104,466호를 참조하라. 핵산 분자를 표준 근육내 또는 피내 주입; 경피 입자 수송, 흡입; 국소적 또는 경구적, 비강내 또는 점막 모드의 투여와 같이 투여받는 피검자 내로 직접적으로 도입시킬 수 있다. 대안적으로 분자를 환자로부터 제거된 세포 내로 탈체 도입할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발현 벡터 또는 벡터인 폴리누클레오티드를 환자의 APC로 탈체 도입할 수 있다. 대상 핵산 분자를 포함하는 세포는 면역 반응이 핵산 분자에 의해 코드되는 펩티드에 대항하여 개시되는 것과 같이 피검자 내로 재-도입된다. 이러한 면역화에서 사용된 핵산 분자를 일반적으로 본원에서 "핵산 백신"으로서 언급한다.
본 발명의 폴리펩티드, 폴리누클레오티드, 벡터 또는 세포가 실질적으로 분리된 형태로 존재할 수 있다. 이것들을 의도하는 용도를 방해하지 않고 실질적으로 분리된 것으로 여겨지는 담체 및 희석제와 함께 혼합할 수 있다. 이것들은 또한 실질적으로 정제된 형태로, 적어도 90%, 예를 들어, 단백질, 폴리누클레오티드, 세포 또는 제형의 건조질량의 적어도 95%, 98% 또는 99%를 일반적으로 포함할 것이다.
항원 제시 세포(Antigen presenting cells; APC)
본 발명은 치료에서 순차적으로 사용할 수 있는, APC 표면 상에서 본 발명의 펩티드를 나타내는 APC의 집단을 생성하는 방법의 생체외 사용을 포함한다. 이러한 방법은 환자로부터 수득된 세포의 시료에 탈체 실행될 수 있다. 그러므로 이러한 방식으로 생성된 APC는 자기내성화에 의한 먼지 진드기 알레르기의 치료 또는 예방에 사용할 수 있는 치료제를 형성한다. 세포는 환자로부터 유도되었기 때문에 환자의 면역계에 의해 받아들여질 수 있다. 그러므로 원래 수득된 원래 수득되었던 환자에 대해 이러한 방식으로 생성된 세포의 수송은 본 발명의 치료학적 실시형태를 구성한다.
제형 및 조성물
본 발명의 펩티드, 폴리누클레오티드, 벡터 및 세포는 단독으로 또는 조합의 형태로 환자에게 제공될 수 있다. 본 발명의 각 분자 또는 세포는 분리된, 실질적으로 분리된, 정제된 또는 실질적으로 정제된 형태로 환자에게 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드를 다른 펩티드로부터 실질적으로 유리되게 환자에게 제공할 수 있다.
본 발명의 본 발명의 펩티드, 폴리누클레오티드 또는 조성물이 정제되지 않은 형태로 존재하는 것이 가능하지만, 약학적 제형으로서 존재하는 것이 바람직하다. 그러므로, 본 발명의 추가 양상에 따라, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 용인가능한 담체 또는 희석제 및 선택적으로 하나 또는 그 이상의 다른 치료학적 성분과 함께 본 발명에 따른 조성물, 벡터 또는 제품을 포함하는 자기내성화에 의해 먼지 진드기에 의한 알레르기를 예방하거나 치료하기 위한 용도를 위한 약학적 제형을 제공한다. 담체는 제형의 다른 성분과 양립가능하고 투여받는 사람에게 유해하지 않아야 한다는 점에서 "용인가능"해야 한다. 통상적으로, 주입 및 최종 제형을 위한 담체는 멸균되어 있으며 발열원이 없다.
본 발명의 펩티드, 폴리누클레오티드 또는 세포를 포함하는 조성물의 제형은 본 분야의 숙련자에게 당연히 쉽게 이용가능한 표준 약학적 제형 화학 및 방법론을 사용하여 실시될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 분자 또는 세포를 포함하는 조성물을 하나 또는 그 이상의 약학적으로 용인가능한 보형약 또는 부형제와 함께 병용할 수 있다. 습윤제 또는 유화제, pH 버퍼링 물질 등과 같은 보조물질이 보형약 또는 부형제 내에 존재할 수 있다. 이러한 보형약, 부형제 및 보조물질은 일반적으로 조성물을 투여받는 환자에서 면역 반응을 유도하지 않아야 하며 과도한 독성 없이 투여될 수 있어야 하는 약제이다. 약학적으로 용인가능한 보형약은 물, 식염수, 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산 및 에탄올과 같은 액상을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 약학적으로 용인가능한 염은 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 미네랄산염; 및 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염, 벤조산염 등과 같은 유기산염을 포함할 수 있다. 약학적으로 용인가능한 보형약, 부형제 및 보조물질의 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)에서 입수할 수 있다.
이러한 조성물을 식괴 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조하거나 포장하거나 판매할 수 있다. 주입가능한 조성물을 방부제를 포함하는 다중-투여 용기 또는 앰플과 같은 단위 약제학적 제형으로 제조하거나 포장하거나 판매할 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액, 오일 또는 수성 부형제의 유화제, 페이스트 및 이식가능한 서방성 또는 생분해성 제형을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 조성물은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하나 이에 한정되지는 않는 하나 또는 그 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 조성물의 한 실시형태에서, 유효성분은 재구성된 조성물을 비경구 투여하기 전에 적합한 부형제(예를 들어, 발열원이 없는 멸균수)와 재구성하기 위한 건조(예를 들어, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다. 약학적 조성물은 주입가능한 멸균 액체, 또는 오일 현택액 또는 용액의 형태로 제조되거나 포장되거나 판매될 수 있다. 이러한 현탁액 또는 용액은 본 분야에 알려진 바에 따라 제형화될 수 있으며, 유효성분 이외에, 본원에 기재된 분산제, 습윤제 또는 현탁제와 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 이러한 주입가능한 멸균 제형은 예를 들어 물 또는 1,3-부탄 디올과 같은 약학적으로 용인가능한 비독성 용매 또는 희석제를 사용하여 제조할 수 있다. 다른 용인가능한 희석제 및 용매는 링거 용액, 등장성 염화나트륨 및 합성 모노- 또는 디-글리세리드와 같은 고정유를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 융용한 다른 비경구적으로 투여가능한 조성물은 미세결정화 형태, 리포솜 제형 또는 생분해가능한 중합체 시스템의 구성성분으로서의 유효 성분을 포함한다. 서방성 또는 이식용 조성물은 유화제, 이온 교환 수지, 약한 가용성 중합체 또는 약한 가용성 염과 같은 약학적으로 용인가능한 소수성 물질 또는 중합체 물질을 포함할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 펩티드 또는 폴리누클레오티드를 특정 담체와 함께 캡슐화하시키거나 흡착시키거나 결합시킬 수 있다. 적합한 담체는 폴리(락티드) 및 폴리(락티드-코-글리코리드)로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어 Jeffery 등의 (1993) Pharm. Res. 10:362-368를 참조하라. 다른 미립자 시스템 및 중합체 또한 사용할 수 있으며, 예를 들어 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴, 스페르민(spermine), 스페르미딘뿐만 아니라 이러한 분자들의 접합체일 수 있다.
본원에서 언급된 모든 펩티드, 폴리누클레오티드 또는 세포의 제형은 물질의 성질 및 수송 방법과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 이러한 모든 물질을 다양한 약제학적 제형으로 투여할 수 있다. 이를 경구적으로(예를 들어 정제, 알약, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산 분말 또는 과립), 비경구, 피내, 피하, 흡입에 의해, 정맥내, 근육내, 흉골내, 경피, 설하, 비강내, 구강내 또는 주입 기술에 의해 투여할 수 있다. 물질은 또한 좌약으로서 투여할 수 있다. 의사는 각 특정 환자에게 요구되는 투여 경로를 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 제형의 조성물은 부작용을 유발하지 않고 효과적인 각 펩티드/폴리누클레오티드/세포를 적합한 농도로 포함할 것이다. 통상적으로, 조성물 내의 각 펩티드의 농도는 0.03 내지 200 nmol/ml의 범위일 것이다. 좀더 바람직하게는 0.3 내지 200 nmol/ml, 3 내지 180 nmol/ml, 10 내지 150 nmol/ml 또는 30 내지 120 nmol/ml 범위이다. 조성물 또는 제형은 95% 또는 98% 이상 또는 적어도 99%의 순도를 가질 것이다.
그러므로 한 실시형태에서, 본 발명의 펩티드, 폴리누클레오티드, 세포 또는 조성물을 하나 또는 그 이상의 치료제와 함께 병용하여 치료에 사용한다. 제제는 분리하여, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 이들을 동일하거나 상이한 조성물 상태로 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서, 피검자를 또한 추가 치료제로 치료할 수 있을 것이다.
그러므로 조성물은 본 발명의 분자 및/또는 세포 및 또한 하나 또는 그 이상의 다른 치료학적 분자를 포함하도록 제형화되었다. 본 발명의 조성물은 대안적으로 병용 치료의 일부로서 하나 또는 그 이상의 치료학적 조성물과 동시에, 순차적으로 또는 분리하여 사용할 수 있다.
치료학적 방법 및 치료받을 환자
본 발명은 상기 기재된 알레르겐에 대해 인간 환자를 탈감작시키거나 자기내성화시킬 수 있어 먼지 진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 유용한 펩티드, 폴리누클레오티드, 벡터 및 세포에 관한 것이다. 본 발명은 자기내성화에 의해 먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하는 용도의 조성물, 제품, 벡터 및 제형을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드/폴리누클레오티드/세포를 단독으로 또는 조합의 형태료 투여함을 포함하는 먼지 진드기 알레르기 환자를 자기내성화하거나 탈감작시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물 또는 제형으로 치료되거나 제공될 환자는 바람직하게는 인간이다. 치료될 환자는 민감하거나 민감할 것으로 여겨지는 위험에서 알레르겐에 대해 민감하다고 알려질 수 있음이 인식될 수 있다. 환자를 본 분야에서 널리 기술되고 본원에서 기술된 바와 같은 기술을 사용하여 민감화에 대해 실험할 수 있다. 대안적으로, 환자는 먼지 진드기에 대한 알레르기의 가족력을 가질 수 있다. 환자가 먼지 진드기에 노출되었을 때 알레르기 증상을 보일 수 있기 때문에 먼지 진드기에 대한 민감화에 대해 환자를 실험하는 것이 필수적이지는 않을 수 있다. 노출된다는 것은 예를 들어 대략 일주일 이상 50℃ 이상에서 세탁하지 않은 의류, 매트리스, 베개, 베개 케이스, 시트, 담요 또는 그외 침구류, 또는 대략 일주일 이상 진공청소하지 않은 카펫, 커튼 또는 가구의 커버 아이템에 가까이 있음을 의미한다. 가까이 간다는 것은 상기 기재한 아이템들로부터 10미터 또는 그 이하, 5미터 또는 그 이하, 2미터 또는 그 이하, 1미터 또는 그 이하 또는 0미터에 있음을 의미한다. 알레르기 증상은 안구 가려움, 콧물, 호흡곤란, 붉어지는 가려운 피부 또는 발진이다.
치료할 환자는 모든 연령일 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 환자는 1 내지 90세, 5 내지 60세, 10 내지 40세 또는 좀더 바람직하게는 18 내지 35세의 연령 그룹일 수 있다.
바람직하게는, 치료할 환자는 코카시안 집단의 대표적인 빈도의 범위 내에서 MHC 대립유전자 빈도를 갖는 집단 출신이다. 11개 일반 DRB1 대립유전자 패밀리에 대한 참고 집단 대립유전자 빈도를 표 1에 나타냈다(HLA Facts Book, Parham and Barber로부터의 데이터).
<표 1>
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참조 빈도는 빈도에 대해 보고한 많은 연구의 분석으로부터 얻어졌으며 q여지는 숫자는 평균값을 의미한다. 그러므로 바람직하게는, 치료할 환자는 표 1에 언급된 대립유전자(적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 모든 대립유전자)에 대한 참조 집단으로서 동등한 MHC 대립유전자 빈도, 예를 들어 이러한 숫자±1, 2, 3, 5, 10. 15 또는 20%의 범위 내를 갖는 집단 출신이다.
바람직하게는 환자는 하기 DRB1 대립유전자의 대립유전자 빈도가 다음과 같은 집단 출신이다:
4 - 적어도 9%
7 - 적어도 10%
11 - 적어도 8%.
환자는 적어도 2주, 1달, 6달, 1년 또는 5년 동안 먼지 진드기에 알레르기가 있었을 수 있다. 환자는 알레르기에 의해 유발되는 발진, 코막힘, 콧물 및/또는 기침으로 고통받았을 수 있다. 환자는 먼지 진드기 알레르기를 치료하는 다른 조성물/화합물을 투여했거나 투여하지 않았을 수 있다. 환자는 50% 이상, 바람직하게는 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90%의 일일 평균 상대 습도를 경험하는 지리학적 지역에서 거주할 수 있다. 환자는 먼지 진드기 집단이 지속되는 것으로 알려진 지리학적 지역, 예를 들어 미주의 동부 절반(및 미주의 주요 서부 해안도시), 캐나다의 인구밀집 지역, 서부 유럽, 일본, 한국 및 남아메리카의 해안 지역, 오스트리아 및 남아프리카에서 거주할 수 있다.
조합 면역요법
많은 환자가 알레르기성이거나 여러 폴리펩티드 항원에 대해 탈감작이 요구되기 때문에, 본 발명은 또한 다중 항원에 대해 알레르기성을 나타내는 환자를 탈감작하는 수단을 제공한다. 일차 폴리펩티드 항원 또는 알레르겐에 대해 환자에서 유도된 "내성"은 다른 항원에 대한 부적합한 면역 반응이 다른 항원에 대한 내성을 제공하기 위해 하향조절될 수 있는 "면역허용원(tolergeneic) 환경"을 환자 내에서 생성할 수 있다.
이러한 발견은 다중 알레르겐에 대한 환자의 알레르기가 상당히 감소된 기간 동안에 치료될 수 있으며, 일부 알레르겐(예를 들어, 땅콩)에 심각한 알레르기를 나타내고 다른 알레르겐(예를 들어 고양이 비듬)에 좀더 가벼운 알레르기를 나타내는 환자가 좀더 가벼운 알레르겐에 대한 내성이 수립된 후 면역허용원 환경이 다른 좀더 강한 알레르겐에 대한 내성을 제공하는데 사용되는 치료로부터 효과를 볼 수 있음을 의미한다. 게다가, 관련되지 않은 항원 또는 알레르겐에 대해 추가적으로 민감한(또는 다른 방법으로 면역화된) 자가면역 질환을 앓고 있는 환자는 관련되지 않은 항원 또는 알레르겐에 대한 내성을 우선 수립한 후 이러한 면역허용원 환경이 자가면역 질환에 관련된 자가항원에 대한 내성을 제공하는데 사용되는 치료 양생법으로 효과를 볼 수 있다.
그러므로 방법은 상기 기재된 먼지 진드기 알레르겐 및 하나 또는 그 이상의 상이한 추가 폴리펩티드 항원에 대한 환자의 먼지 진드기 알레르기를 탈감작하기 위해 제공된다. 방법은 첫 번째 단계로 환자에게 본 발명에 따른 조성물/제품/제형을 투여하며, 투여는 먼지 진드기 알레르겐에 대항하는 저반응(hyporesponsive) 상태를 생성하기에 충분한 방식으로 실행된다. 먼지 진드기 알레르겐에 대해 저반응 상태가 수립되거나 적어도 탈감작에 대한 변화가 나타나면, 방법은 환자가 민감하게 반응하는 상이한 이차 폴리펩티드 항원을 포함하는 이차 조성물의 투여를 수반한다. 이차 조성물의 투여는 일차 조성물의 사용에 의해 수립된 면역허용원 환경의 이점을 취하기 위한 방식으로 실행되며 상이한 이차 폴리펩티드 항원엥 대한 내성을 수립하는 것이 가능하다. 이차 조성물은 Feld1의 큰 단편 또는 처음의 일차 조성물과 함께 공동투여된다. "공동투여된"은 예를 들어, 두 성분이 동일한 조성물 내에 존재하거나 분리된 조성물 형태로 근소하거나 동일한 시간에 다른 부위에 분리된 조성물로 투여되는 동시투여 뿐만 아니라 다른 시간에서의 분리된 조성물 형태의 폴리펩티드 항원의 수송을 의미한다. 예를 들어, 이차 조성물은 일차 조성물의 수송 전에 또는 뒤이어 동일한 부위 또는 다른 부위에 수송시킬 수 있다. 두 수송 간의 타이밍은 약 몇초 간격, 약 몇분 간격, 약 몇시간 간격 또는 심지어 몇일 간격의 범위일 수 있다. 게다가, 다른 수송 방법을 사용할 수 있다.
이차 폴리펩티드 항원은 바람직하게는 먼지 진드기 알레르겐과 상이한 알레르겐이다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 적합한 알레르겐은 공지된 방법을 통해 수득하고/수득하거나 생성할 수 있다. 적합한 알레르겐의 클래스는 다른 먼지 진드기 알레르겐, 꽃가루, 동물 비듬(특히 고양이 비듬), 풀, 흙, 먼지, 항생물질, 쏘는 곤충의 독 및 여러 환경원(화학원 또는 금속 포함), 약물 및 음식 알레르겐을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 일반 나무 알레르겐은 미루나무, 포플라나무, 물푸레나무, 자작나무, 단풍나무, 오크, 느릅나무, 히코리나무 및 피칸나무로부터의 꽃가루를 포함한다; 일반 식물 알레르겐은 쑥, 돼지풀, 질경이, 수영(sorrel-dock) 및 명아주로부터 유래된 것을 포함한다; 식물 접촉 알레르겐은 옻나무, 덩굴 옻나무 및 쇄기풀로부터 유래된 것을 포함한다; 일반 풀 알레르기는 독보리, 티모시 그라스, 존슨 그라스, 버뮤다 그라스, 페스큐(fescue) 및 블루그라스 알레르겐을 포함한다; 일반 알레르겐은 또한 알테르나리아(Alternaria), 푸사리움(Fusarium), 호르모덴드룸(Hormodendrum), 아스페르길루스(Aspergillus), 미크로폴리스포라(Micropolyspora), 털곰팡이 및 호열성 악티노마이세테스와 같은 곰팡이 또는 진균류로부터 수득될 수 있다; 상피 알레르겐은 집먼지 또는 유기물먼지(통상적으로 진균류 유래)로부터 또는 깃털 및 개 비듬과 같은 동물원으로부터 수득할 수 있다; 일반 음식 알레르겐은 우유 및 치즈(유제품), 계란, 밀, 견과류(예를 들어 땅콩), 해산물(예를 들어, 조개), 완두콩, 콩 및 글루텐 알레르겐을 포함한다; 일반 환경 알레르겐은 금속(니켈 및 금), 화학물(포름알데히드, 트리니트로페놀 및 테펜틴), 라텍스, 고무, 섬유(면 또는 울), 삼베, 머리 염색, 화장품, 세제, 향수알레르겐을 포함한다; 일반 약물 알레르겐은 국부 마취제 및 살리실산염 알레르겐을 포함한다; 항생물질 알레르겐은 페니실린, 테트라실린 및 술폰아미드 알레르겐을 포함한다; 일반 곤충 알레르겐은 벌, 말벌, 개미 독 및 바퀴벌레 꽃받침 알레르겐을 포함한다. 특히 널리 특성화된 알레르겐은 주요 고양이 알레르겐 FeI dl, 벌 독 포스포리파아제 A2 (PLA) (Akdis 등의 (1996) J. Clin. Invest. 98:1676-1683), 자작나무 꽃가루 알레르겐 v 1 (Bauer 등의 (1997) Clin. Exp. Immunol. 107:536-541), 및 다중-에피토프 재조합 그라스 알레르겐 rKBG8.3 (Cao 등의 (1997) Immunology 90:46-51)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 적절한 알레르겐 및 그외 적절한 알레르겐은 상업적으로 입수가능하며/입수가능하거나 공지된 기술에 따라 추출물로서 쉽게 제조할 수 있다.
바람직하게, 이차 폴리펩티드 알레르겐은 하기의 알레르겐 서열 목록 및 데이터베이스 수납 번호(NCBI Entrez 수납 번호)로부터 선택되었다. NCBI는 네셔널 센터 포 바이오테크놀러지 인포메이션(National Center for Biotechnology information)이며 미국 국립 보건원(US National Institutes of Health)의 산하기관이다. 데이터베이스 수납을 찾을 수 있는 NCBI 웹사이트는 www.ncbi.nlm.nih.gov/이다. 알레르겐 서열 및 데이터베이스 수납번호(NCBI Entrez 수납번호)는 다음과 같다:
집 먼지 진드기
Dermatophagoides pteronyssinus
Der p 1
Figure pct00003
Der p 2
Figure pct00004
Der p 3
Figure pct00005
Der p 4
KYXNPHFIGXRSVITXLME
Der p 5
Figure pct00006
Der p 6
AIGXQPAAEAEAPFQISLMK
Der p 7
Figure pct00007
Der p9
IVGGSNASPGDAVYQIAL
Dermatophagoides farinae
Der f 1
Figure pct00008
Figure pct00009
Der f2
Figure pct00010
Der f3
Figure pct00011
Der f4
AVGGQDADLAEAPFQISLLK
Der f 7
Figure pct00012
추가 진드기 알레르겐 서열 (NCBI entrez 수납):
1170095; 1359436; 2440053; 666007; 487661; 1545803; 84702; 84699; 625532; 404370; 1091577; 1460058; 7413; 9072; 387592.
고양이
Felis 서열 (NCBI entrez accession):
539716; 539715; 423193; 423192; 423191; 423190; 1364213; 1364212; 395407; 163827; 163823; 163825; 1169665; 232086; 1169666.
라텍스
Hevea 서열:
Hev b l
Figure pct00013
Hev b 3
Figure pct00014
추가 Hevea 서열 (NCBI entrez accession):
3319923; 3319921; 3087805; 1493836; 1480457; 1223884; 3452147; 3451147; 1916805; 232267; 123335; 2501578; 3319662; 3288200; 1942537; 2392631; 2392630; 1421554; 1311006; 494093; 3183706; 3172534; 283243; 1170248; 1708278; 1706547; 464775; 2661042; 231586; 123337; 116359; 123062; 2213877; 542013; 2144920; 1070656; 2129914; 2129913; 2129912; 100135; 82026; 1076559; 82028; 82027; 282933; 280399; 100138; 1086972; 108697; 1086976; 1086978; 1086978; 1086976; 1086974; 1086972; 913758; 913757; 913756; 234388; 1092500; 228691; 1177405; 18839; 18837; 18835; 18833; 18831; 1209317; 1184668; 168217; 168215; 168213; 168211; 168209; 348137.
독보리
Lolium 서열:
126385 Lol p 1
Figure pct00015
126386 Lol p 2a
Figure pct00016
126387 Lol p 3
Figure pct00017
2498581 Lol p 5a
Figure pct00018
2498582 Lol p 5b
Figure pct00019
455288 Lol p isoform 9
Figure pct00020
1582249 Lol p 11
Figure pct00021
추가 Lolium 서열 (NCBI entrez accession):
135480; 417103; 687261; 687259; 1771355; 2388662; 631955; 542131; 542130; 542129; 100636; 626029; 542132; 320616; 320615; 320614; 100638; 100634; 82450; 626028; 100639; 283345; 542133; 1771353; 1763163; 1040877; 1040875; 250525; 551047; 515377; 510911; 939932; 439950; 2718; 168316; 168314; 485371; 2388664; 2832717; 2828273; 548867.
올리브 나무
올리브 서열
416610 Ole e l
Figure pct00022
파리에타리아 ( Parietaria )
파리에타리아 서열:
2497750 Par j P2
Figure pct00023
1352506 Par j P5
Figure pct00024
1532056 Par j P8
Figure pct00025
1532058 Par j P9
Figure pct00026
2497749 Par j P9
Figure pct00027
1086003 Par j 1
Figure pct00028
추가 파리에타리아 서열 (NCBI entrez accession):
543659; 1836011; 1836010; 1311513; 1311512; 1311511; 1311510; 1311509; 240971.
티모시그라스
Phleum 서열:
Phl p 1
Figure pct00029
Phl p 1
Figure pct00030
Figure pct00031
Phlp 2
Figure pct00032
Phl p 5
Figure pct00033
Phl p 5
Figure pct00034
Phl p 5b
Figure pct00035
Phl p 5a
Figure pct00036
Phl p 5
Figure pct00037
Phl p 5
Figure pct00038
Phl p 5
Figure pct00039
Phl p 5
Figure pct00040
Phl p 5
Figure pct00041
Phl p 5
Figure pct00042
Figure pct00043
Phl p5b
Figure pct00044
Phl p5a
Figure pct00045
Phl p 5
Figure pct00046
Phl p 5b
Figure pct00047
Figure pct00048
Phl p 5
Figure pct00049
Phl p 5
Figure pct00050
Phl p 5
Figure pct00051
Phl p 5b
Figure pct00052
Figure pct00053
Phl p 5a
Figure pct00054
Phl p 5
Figure pct00055
Phl p 6
Figure pct00056
Phl p 6
Figure pct00057
Phl p 6
Figure pct00058
Phl p 6
Figure pct00059
Phl p 6
Figure pct00060
Phl p 6
Figure pct00061
Phl p 7
Figure pct00062
Phl p 11
Figure pct00063
추가 Phleum 서열 (NCBI entrez accession):
458878; 548863; 2529314; 2529308; 2415702; 2415700; 2415698; 542168; 542167; 626037; 542169; 541814; 542171; 253337; 253336; 453976; 439960.
말벌 (및 관련)
Vespula 서열:
465054 ALLERGEN VES V 5
Figure pct00064
1709545 ALLERGEN VES M 1
Figure pct00065
1352699 ALLERGEN VES V 1
Figure pct00066
1346323 ALLERGEN VES V 2
Figure pct00067
549194 ALLERGEN VES VI 5
Figure pct00068
추가 vespula 서열 (NCBI entrez accession):
549193; 549192; 549191; 549190; 5491104; 117414; 126761; 69576; 625255; 6271104; 627188; 627187; 482382; 112561; 627186; 627185; 1923233; 1047645; 1047647; 745570; 225764; 162551.
나무 알레르겐 서열 (주로 자작나무) 서열:
114922 Bet v 1
Figure pct00069
130975 Bet v 2
Figure pct00070
Figure pct00071
1168696 Bet v 3
Figure pct00072
809536 Bet v 4
Figure pct00073
543675 Que a I - Quercus alba=오크 나무 (단편)
Figure pct00074
543509 Car b I - Carpinus betulus=서어나무 (단편)
Figure pct00075
543491 AIn g I - Alnus glutinosa=오리나무 (단편)
Figure pct00076
1204056 Rubisco
Figure pct00077
추가 나무 알레르겐 서열 (NCBI entrez accession number):
131919; 128193; 585564; 1942360; 2554672; 2392209; 2414158; 1321728; 1321726; 1321724; 1321722; 1321720; 1321718; 1321716; 1321714; 1321712; 3015520; 2935416; 464576; 1705843; 1168701; 1168710; 1168709; 1168708; 1168707; 1168706; 1168705; 1168704; 1168703; 1168702; 1842188; 2564228; 2564226; 2564224; 2564222; 2564220; 2051993; 18131041; 15368104; 534910; 534900; 5341048; 1340000; 1339998; 2149808; 66207; 2129477; 1076249; 1076247; 629480; 481805; 81443; 1361968; 1361967; 1361966; 1361965; 1361964; 1361963; 1361962; 1361961; 1361960; 1361959; 320546; 629483 ; 629482; 629481; 541804; 320545; 81444; 541814:; 629484; 474911; 452742; 1834387; 298737; 298736; 1584322; 1584321; 584320; 1542873; 1542871; 1542869; 1542867; 1542865; 1542863; 1542861; 1542859; 1542857; 1483232; 1483230; 1483228; 558561; 551640; 488605; 452746; 452744; 452740; 452738; 452736; 452734; 452732; 452730; 452728; 450885; 17938; 17927; 17925; 17921; 297538; 510951; 2104331; 2104329; 166953.
땅콩
땅콩 서열
1168391 Ara h 1
Figure pct00078
돼지풀
Ambrosia sequences 113478 Amb a 1
Figure pct00079
113479 Amb a 2
Figure pct00080
113477 Amb a 1.3
Figure pct00081
113476 Amb a l.2
Figure pct00082
113475 Amb a 1.1
Figure pct00083
백향목 서열
493634 Cry j IB 전구물질
Figure pct00084
493632 Cry j IA 전구물질
Figure pct00085
1076242 Cry j II 전구물질 - 일본 백향목
Figure pct00086
1076241 Cryj II 단백질 - 일본 백향목
Figure pct00087
Figure pct00088
541803 Cry j I 전구물질 - 일본 백향목
Figure pct00089
541802 Cry j I 전구물질- 일본 백향목
Figure pct00090
개
Canis 서열:
Can f 1
Figure pct00091
Figure pct00092
혈청 알부민 단편
EAYKSEIAHRYNDLGEEHFRGLVL
혈청 알부민 단편
Figure pct00093
Can f2
Figure pct00094
추가 개 알레르겐 단백질 (NCBI entrez accession):
1731859
말
Equus 서열:
1575778 Equ c1
Figure pct00095
3121755 Equ c 2
SQXPQSETDYSQLSGEWNTIYGAASNIXK
Euroglyphus (진드기)
Euroglyphus 서열:
Eur m 1 (변이체)
Figure pct00096
Eur m 1 (변이체)
Figure pct00097
Eur m 1 (변이체)
Figure pct00098
Eur m 1 (변이체)
Figure pct00099
Figure pct00100
포아(Poa) (그라스) 서열
113562 POLLEN ALLERGEN POA P 9
Figure pct00101
113561 POA P 9
Figure pct00102
113560 POA P 9
Figure pct00103
Figure pct00104
바퀴벌레 서열
2833325 Cr pi
Figure pct00105
2231297 Cr p2
Figure pct00106
Figure pct00107
1703445 Bla g 2
Figure pct00108
1705483 Bla g 4
Figure pct00109
2326190 Bla g 5
Figure pct00110
추가 바퀴벌레 서열 (NCBI Entrez accession numbers):
2580504; 1580797; 1580794; 1362590; 544619; 544618; 15315104; 1580792; 1166573; 1176397; 21047849.
알레르겐 (일반) 서열:
NCBI accession numbers
2739154; 3719257; 3703107; 3687326; 3643813; 3087805; 1864024; 1493836; 1480457; 25910476; 25910474; 1575778; 763532; 746485; 163827; 163823; 3080761; 163825; 3608493; 3581965; 2253610; 2231297; 21047849; 3409499; 3409498; 3409497; 3409496; 3409495; 3409494; 3409493; 3409492; 3409491; 3409490; 34094104; 3409488; 3409487; 3409486; 3409485; 3409484; 3409483; 3409482; 3409481; 3409480; 3409479; 3409478; 3409477; 3409476; 3409475; 3409474; 3409473; 3409472; 3409471; 3409470; 3409469; 3409468; 3409467; 3409466; 3409465; 3409464; 3409463; 3409462; 3409461; 3409460; 3409459; 3409458; 3409457; 3409456; 3318885; 3396070 ; 3367732; 1916805; 3337403; 2851457; 2851456; 1351295; 549187; 136467; 1173367; 2499810; 2498582; 2498581; 1346478; 1171009; 126608; 114091; 2506771; 1706660; 1169665; 1169531; 232086; 4161048; 114922; 2497701; 1703232; 1703233; 1703233; 1703232; 3287877; 3122132; 3182907; 3121758; 3121756; 3121755; 3121746; 3121745; 3319925; 3319923; 3319921; 3319651; 33187104; 3318779; 3309647; 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1871507; 1322185; 1322183; 1047645 ; 1047647 ; 1850544 ; 1850542 ; 1850540 ; 2810417; 452742; 1842045 ; 1839305; 1836011; 1836010; 1829900; 18291049; 18291048; 18291047; 18291046; 18291045; 18291044; 1825459 ; 18010487 ; 159653 ; 1773369 ; 1769849; 1769847; 608690 ; 1040877 ; 1040875; 1438761; 1311513; 1311512; 1311511; 1311510; 1311509; 13116104; 1246120; 1246119; 1246118; 1246117; 1246116; 1478293; 1478292; 1311642; 1174278; 1174276; 1086972; 1086974; 1086976; 1086978; 1086978; 1086976; 1086974; 1086972; 999009; 999356; 999355; 994866; 994865; 913758; 913757; 913756; 913285; 913283; 926885; 807138; 632782; 601807; 546852; 633938; 544619; 544618; 453094; 451275; 451274; 407610; 407609; 404371; 409328; 299551; 299550; 264742; 261407; 255657; 250902; 250525; 1613674; 1613673; 1613672; 1613671; 1613670; 1613304; 1613303; 1613302; 1613240; 1613239; 1613238; 1612181; 1612180; 1612179; 1612178; 1612177; 1612176; 1612175; 1612174; 1612173; 1612172; 1612171; 1612170; 1612169; 1612168; 1612167; 1612166; 1612165; 1612164; 1612163; 1612162; 1612161; 1612160; 1612159; 1612158; 1612157; 1612156; 1612155; 1612154; 1612153; 1612152; 1612151; 1612150; 1612149; 1612148; 1612147; 1612146; 1612145; 1612144; 1612143; 1612142; 1612141; 1612140; 1612139; 1093120; 447712; 447711; 447710; 1587177; 158542; 1582223; 1582222; 15315104 ; 1580792 ; 886215; 15451047; 15451045; 15451043; 15451041; 15458104; 1545887; 1545885; 1545883; 1545881; 1545879; 1545877; 1545875; 166486 ; 1498496 ; 1460058; 972513; 1009442 ; 1009440 ; 1009438 ; 1009436 ; 1009434 ; 7413 ; 1421808 ; 551228; 452606 ; 32905; 1377859 ; 1364213; 1364212; 395407; 22690 ; 22688 ; 22686; 22684 ; 488605 ; 17680 ; 1052817 ; 1008445 ; 1008443 ; 992612; 706811 ; 886683; 747852 ; 939932 ; 19003 ; 1247377 ; 1247375; 1247373; 862307 ; 312284 ; 999462; 999460 ; 999458 ; 587450 ; 763064 ; 886209 ; 1176397 ; 1173557 ; 902012; 997915; 997914; 997913; 997912; 997911; 997910; 99790; 997908; 997907; 997906; 997905; 997904; 997903; 997902; 997901; 997900; 9971049; 9971048; 9971047; 9971046; 9971045; 9971044; 9971043; 9971042; 910984; 910983; 910982; 910981; 511604 ; 169631 ; 169629 ; 169627 ; 168316 ; 168314 ; 607633 ; 555616; 293902 ; 485371 ; 455288 ; 166447 ; 166445 ; 166443 ; 166435 ; 162551 ; 160780; 552080 ; 156719 ; 156715 ; 515957 ; 515956 ; 515955 ; 515954 ; 515953 ; 459163; 166953 ; 386678 ; 169865.
특히 바람직한 알레르겐/항원은 다음을 포함한다: 고양이 비듬 단백질 Fel d1, 집 먼지 진드기 단백질 Der P1, DerP2, 및 Der P7; 돼지풀 단백질 amb a 1.1, a 1.2, a 1.3 또는 a 1.4; 독보리 단백질 lol pi 및 lol p5; 티모시 그라스 단백질 phl p1 및 phl p5; 버뮤다 그라스 단백질 단백질 Cyn d 5; 알테르나리아 알테르네이트(Alternaria alternate) 단백질 Alt a 1, Alt a 2 및 에놀라아제 (Alt a 6); 자작나무 단백질 Bet vl 및 P14; 독일 바퀴 단백질 Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5 및 Bla g 6; 쑥 단백질 Art v 1; 러시안 티슬(Russian thistle) 단백질 Sal k 1 및 Sal k 2; 땅콩 Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, Ara h5, Ara h6, 식물 프로필린 또는 지질 수송 단백질 또는 인간 백혈구 항원.
수송 방법
본 발명의 조성물로 제형화되면 공지된 다양한 경로 및 기술을 사용하여 피검자 생체내로 수송시킬 수 있다. 예를 들어, 조성물을 주입가능한 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 제공할 수 있으며 통상적인 바늘 및 주사기 또는 액상 제트 주입 시스템(liquid jet injection system)을 사용하여 비경구, 피하, 상피, 피내, 근육내, 동맥내, 복강내, 정맥내 주입을 통해 투여할 수 있다. 조성물은 또한 통상적으로 비강, 기관내, 장, 직장 또는 질과 같은 점막 조직 또는 피부로 투여할 수 있거나, 호흡기 또는 폐 투여에 적합한 미세 분무 스프레이로서 제공될 수 있다. 투여의 다른 형태는 경구 투여, 좌약, 혀밑 투여 및 능동 또는 수동 경피적 수송 기술을 포함한다.
본 발명의 펩티드가 투여될 경우, 적절한 항원 제시 세포에 접촉하기 위한 능력을 가질 신체 부위에 펩티드를 투여하는 것이 바람직하며, 이 경우 환자의 T 세포에 접촉할 기회를 가질 것이다. APC가 투여될 경우, 환자의 적합한 T 세포에 접촉하고 활성화할 능력을 가질 신체 부위에 투여하는 것이 바람직하다.
수송 요법
펩티드/폴리펩티드/세포(다수의 펩티드를 포함하는 조성물과 같은)의 투여는 상기 기재된 적합한 방법으로 수행할 수 있다. 펩티드의 적합한 양은 실험에 의거하여 결정될 수 있으나, 통상적으로는 하기 주어진 범위 내에서 이루어진다. 각 펩티드의 단일 투여는 환자에게 유효한 효과를 나타내기에 충분할 것이나, 이는 펩티드가 1회 이상 투여된다면, 이러한 경우 예를 들어 6달마다 2-4주 동안 일주일에 1회 또는 2회, 또는 4 내지 6달마다 1주일 동안 1일 1회의 통상적인 투여 요법이 유용할 수 있음이 인지될 것이다. 인지될 바와 같이, 각 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 펩티드 및/또는 폴리누클레오티드의 조합이 단일 또는 병용하여 투여될 수 있다.
투여량은 조성물의 성질, 투여 경로 및 투여 요법의 스케줄 및 타이밍을 포함하는 많은 요소에 따라 결정될 것이다. 본 발명의 분자의 적합한 투여량은 투여당 15㎍까지, 20㎍까지, 25㎍까지, 30㎍까지, 50㎍까지, 100㎍까지, 500㎍까지 또는 그 이상일 수 있다. 적합한 투여량은 15㎍ 이하 그러나 적어도 1ng, 또는 적어도 2ng 또는 적어도 5ng 또는 적어도 50ng 또는 적어도 100ng 또는 적어도 500ng 또는 적어도 1㎍ 또는 적어도 10㎍일 수 있다. 본 발명의 몇몇 분자에서, 투여량은 예를 들어 1mg까지, 2mg까지, 3mg까지, 4mg까지, 5mg까지 또는 그 이상으로 더 높을 수 있다. 이러한 투여량은 선택한 경로에 의해 투여하기 위한 적당한 부피가 가능한 농도로 액상 제형으로 제공될 수 있다.
키트
본 발명은 또한 용기 내에 키트의 형태로 포장된 본 발명의 치료용도에 적합한 본원에 기재된 성분의 조합에 관한 것이다. 이러한 키트는 본 발명의 치료를 가능하게 하는 일련의 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 상이한 펩티드, 폴리펩티드 및/또는 세포, 또는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드, 폴리펩티드 및/또는 세포 및 동시 투여 또는 순차 또는 분리 투여에 적합한 하나 또는 그 이상의 추가 치료제를 포함할 수 있다. 키트는 선택적으로 다른 적합한 시약 또는 지시서 등을 포함할 수 있다.
실시예 1
MHC 클래스 II 결합 탐색
이 연구의 목적은 7개의 가장 일반적인 인간 MHC 클래스 II HLA-DRB* 알로타입(평균 코카시안 집단에서 발견되는 알로타입의 총 63% 정도에 해당됨)에서 강한 친화성을 갖는 펩티드의 분명한 패널을 확인하기 위한 것이다. 집 먼지 진드기(House Dust Mite; HDM) 알레르겐 Der P 1, Der P 2 및 Der P 7에서 결합 펩티드를 확인하기 위해 생체외 결합 검정을 이러한 알레르겐 단백질로부터 펩티드의 부분집합에 실시했다. 결합 검정에서 테스트된 펩티드는 "펩티드 스레딩(threading)"(Biovation, Ltd., Aberdeen, Scotland, UK에 의해 실행됨)으로 알려진 인실리코 접근법에 의해 처음으로 확인되었다. 이는 MHC 클래스 II HAL-DR 분자의 결합 그루브 내에 수용될 가능성에 대해 서열로부터 연이은 펩티드의 생물정보학적 분석이다. 펩티드의 이러한 부분집합은 수성의 산성 환경에서 가용성에 대해 미리 스크리닝되었으며 44개 펩티드의 최종 패널을 생체내 MHC 클래스 II 결합 검정에서 실험하여 선택했다.
방법
사용된 검정은 경쟁적 MHC 클래스 II 결합 검정이며, 여기에서 각 펩티드는 조사된 각 인간 MHC 클래스 II 알로타입으로부터 알려진 조절 결합제를 대체하는 이의 능력에 대해 분석되었다. 이 연구에서 사용된 알로타입 및 조절 펩티드는 표 2에 나타냈다:
<표 2>
Figure pct00111
각 44개 HDM 펩티드(표 3A 및 3B에 나타냄)를 경쟁 검정으로 분석하고 조절 펩티드와 비교하여 상대적 결합에 대해 스크리닝했다. 경쟁 검정의 특성에 기인하여 각 펩티드에 대한 데이터는 조절 펩티드의 데이터와 이의 IC50의 비율로 나타냈다. 그러므로, 조절 펩티드와 동등한 IC50을 갖는 펩티드는 동일한 결합 친화성을 갖지만, 이보다 낮은 비율을 갖는 펩티드는 높은 친화성을 가지며 이보다 더 높은 비율을 갖는 것은 낮은 친화성을 갖는다.
결과
수용액에서의 가용성은 효과적인 치료제일 펩티드에 대한 필수적 기준이다. 그러므로, 가용성의 결과로서 다중 결합 레지스터에서 고빈도의 큰 소수성 아미노산 잔기를 갖는 매우 소수성인 펩티드를 제거했다. 이는 불규칙한 HLA-DRB1*결합제의 특성이다. 결합 검정으로부터의 데이터를 표 3B에 나타냈다. 각 펩티드의 상대적 결합은 연구에서 각각의 알로타입에 대해 나타냈다. 데이터는 실험한 44개 펩티드 중 24개가 MHC 클래스 II 알로타입 중 하나 또는 그 이상에 결합함을 보여준다. 교차-반응성의 범위는 오직 하나의 알로타입에만 결합하는 5개 펩티드, 2개의 알로타입에 결합하는 8개 펩티드, 3개의 알로타입에 결합하는 9개 펩티드 및 4개의 상이한 MHC 클래스 II 알로타입(적색)에 결합하는 2개의 펩티드이다. 또한 이러한 펩티드가 MCH 구조의 상동성을 통해 시험되지 않은 유사한 알로타입에 결합하는 능력이 있음을 예상할 수 있다. 이는 본원의 여러 경우에서 DRB1*0101, *0401, *0701 및 *1101에 대한 펩티드의 교차-반응성에서 보여질 수 있다. 또한 결합 검정의 가장 높은 농도의 수용액에서의 펩티드의 가용성 상태를 나타낸다. 수치는 불용성 침전물이 나타나는 가장 낮은 농도를 보여준다. 검정에서 침전물의 형성의 중요하지 않은 비특이성 효과가 드러난다. 가장 높은 농도에서 침전된 여러 펩티드도 또한 MCH 클래스 II에 결합한다; 그러나 이들은 조절 펩티드과 경쟁하면 효과를 나타내지 못한다. 침전물을 형성하는 펩티드는 많은 소수성 잔기의 존재로 인해 높은 친화성 및 불규칙한 결합을 나타낼 수 있다.
펩티드의 % 순도를 표 3A에 나타냈다. 이는 순도가 60-90%로 달라짐으로써 중요하다. 이는 상대적으로 불순할 경우 경쟁하는 펩티드의 능력에 영향을 미칠 것으로 여겨질 것이다. 예를 들어, HDM23A 및 HDM32는 낮은 친화성 결합을 보인다; 그러나 이들은 다른 HDM 펩티드에 비해 감소된 순도(각각 66.7% 및 68.7%)를 갖는다. 그러므로, 순도가 고려할만한 수준에 들어간다면, 이들은 높은 순도의 펩티드와 동등한 친화성을 가질 것이다.
몇몇 MHC 클래스 II 알로타입은 다른 것보다 좀더 많은 펩티드에 결합한다; 이는 상이한 MHC 클래스 II 결합 그루브에서 포켓 위치 사이의 가변성이 있는 것으로 예상될 수 있다. 그러나 또한 다양한 조절 펩티드의 친화성 사이의 많은 널리 특성화된 차이가 있다. 분명히 고친화성 조절 펩티드는 더 적은 결합 펩티드의 동정에서의 결과인 경쟁 HDM 펩티드에 의해 치환되는 것이 좀더 어려울 것이다. 이는 본원에서 나타낸 데이터에 의해 설명될 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 헤마글루티닌 307-319 조절 펩티드는 DRB1*0101>*0401>*0701>*1101의 알로타입에 따른 친화성의 변화를 나타낼 것이다. 이는 알로타입 각각에 많은 결합제가 있음을 반영하는 것으로, DRB1*0101은 가장 적은 수의 결합제(5개)를 가지며 DRB1*1101은 가장 많은 수의 결합제(14개)를 갖는다. 게다가, DRB1*1501에 대한 결합 검정은 이 알로타입에 대한 미엘린 염기 단백질 85-99의 높은 친화성에 기인하기 때문에 매우 엄중하다. 높은 엄중성 스크린에서 초기 연구에서 실험된 Fel d 1 펩티드 EQVAQYKALPVVLENA는 고친화성 결합제가 이러한 엄중성에서 확인될 수 있음을 나타내는 0.97의 비율을 나타낸다.
게다가, 낮은 친화성 결합제를 확인하기 위해, 검정을 좀 더 덜 엄중한 조건 하에서 실시했다. 모든 Der p 결합 펩티드는 이러한 알로타입에 대해 실험되었을 때 높은 비율을 나타냈으며 이는 이들이 조절 펩티드에 비해 낮은 친화성 결합제임을 나타내는 것이다. DQA*0102/DQB1*0602 결합 검정에서 DR 검정에서 사용된 것에 비해 낮은 친화성을 갖는 인간 인슐린의 B-사슬로부터의 펩티드를 사용한다. 이는 DQ 검정이 매우 민감하고 이러한 MHC 클래스 II 알로타입에 대한 가장 강한 결합제에 있어서 매우 낮은 비율 수치를 생성하는 경향이 있는 것에 영향을 준다. 이러한 민감성은 또한 스크리닝된 패널 내에서 상대적으로 많은 수의 DQ 결합 펩티드의 원인이다. 최종적으로, 근접 분석에서, DRB1*0101, *0401, *0701 슈퍼패밀리에 대한 리간드로서 확인된 펩티드가 다음과 같은 알로타입의 이러한 패밀리에 대한 불규칙 결합제의 특성인 모티프에 결합함이 발견되었다: P1 = Y, F, W, L, I, V 또는 M(큰 방향족 또는 소수성 잔기), P6 = S, T, C, A, P, V, I, M(작은 비-전하 잔기).
이러한 3개 알로타입 모두 또는 조합에 대한 결합제로 확인된 16개 펩티드이외에(예를 들어, HDM 21B RGKPFQLEAVFEANQNT) 1-4-7 알로타입에 대한 친화성 범위를 갖는 불규칙 결합제가 있음을 제시하는 이러한 모티프를 포함한다.
결론
펩티드의 범위는 실험한 MHC 클래스 II 알로타입에 결합하는 능력을 가지고 있으며 CD4+ T 세포의 생체외 증식을 자극하고 T 세포 사이토카인 분비를 자극하는 능력에 대해 실험된 것임을 보여준다.
<표 3a>
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
<표 3b>
Figure pct00115
Figure pct00116
실시예 2
상동성 탐색
MHC 클래스 II-결합에 대해 상기와 같이 확인된 24개 펩티드 각각의 서열을 부모 서열이 유래된 먼지 진드기 알레르겐 그룹에서의 대체 단백질의 서열을 탐침하는데 사용했다. 예를 들어, 펩티드 HDM01을 Der f 1에서의 상동성 서열을 탐침하는데 사용했다. 상기에서 확인한 24개 펩티드 모두에 동일하게 실행했다. 실시예 1 및 실시예 2에서 확인된 펩티드를 표 4 내지 표 6에 나타냈다.
<표 4>
Figure pct00117
<표 5>
Figure pct00118
<표 6>
Figure pct00119
표 4에서, "부모에서의 잔기" 위치가 유래된 Der p 1의 서열은 NCBI 수납번호 P08176의 공개적으로 입수가능한 서열이다. Der p 2(표 5) 및 Der p7(표 6)에 대한 상응 서열은 각각 NCBI 수납번호 P49278 및 P49273이다. Der f 1의 서열은 NCBI 수납번호 P16311로부터 입수되며, Der f 2 은 NCBI 수납번호 QOO855로부터, Der f 7은 NCBI 수납번호 Q26456로부터 입수된다.
실시예 3
MHC 클래스 II 결합 탐색
본 연구의 목적은 가장 일반적인 7개 인간 MHC 클래스 II HLA-DRB1* 알로타입(평균 코카시안 인구에서 발견되는 알로타입의 총 약 63%임)에 대한 강한 친화성을 갖는 펩티드의 명확한 패널을 확인하기 위한 것이다. 주요 집 먼지 진드기 알레르겐 Der p 1, Der p 2 및 Der p 7에서의 결합 펩티드를 확인하기 위한 것이다. 상업적으로 입수가능한 EpiMatrix 알고리즘(EpiVax Inc.)을 사용하여 "펩티드 스레딩"으로 알려진 인실리코 접근으로 펩티드를 확인했다. 이는 MHC 클래스 II HLA-DR 분자의 결합 그루브 내에 적응될 가능성에 대한 서열로부터의 펩티드의 생물정보학적 분석이다. EpiMatrix는 선택된 MHC 분자 각각으로의 결합의 평가된 가능성에 의해 모든 폴리펩티드 서열로부터, 9개 아미노산에 의해 오버래핑된 10개 아미노산 길이의 세그먼트를 정렬하는 매트릭스-기저 알고리즘이다(De Groot 등의, AIDS Research and Human Retroviruses 13:539-41 (1997)). 매트릭스 모티프를 발전시키는 방식은 Schafer 등의, 16 Vaccine 1998 (1998) 문헌에 의해 공개되었다. 이러한 예에서, HLA DRl, DR2, DR3, DR4, DR7, DR8, DRl 1, DRl 3 및 DRl 5에 대한 결합 가능성을 평가했다. 추정되는 MHC 리간드는 단백질 서열에서 각 10-mer 프레임을 점수매기는 것에 의해 선택되었다. 이러한 점수는 각 MHC 대립유전자에 결합한다고 알려진 10개 아미노산 서열의 매트릭스에 10-mer의 서열을 비교하여 얻어졌다. 배후의 연구들은 EpiMatrix가 공개된 MHC 리간드를 정확히 예상했음을 증명하였다(Jesdale et al., in Vaccines '97 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1997)). 다중 MHC 분자에 결합하는 펩티드의 성공적인 예상이 또한 확인되었다.
선택된 MHC 분자로의 결합의 평가된 가능성은 하기와 같이 EpiMatrix에 의해 계산되었다. 펩티드를 주어진 MHC 대립유전자에 대한 알려진 MHC 결합제와 비교하여, 각 아미노산에 대한 결합의 상대적 촉진 또는 저해를 평가하여 점수를 매겼다. 이러한 정보는 펩티드 전역에 걸쳐 합산된 것이며 합산 점수(EMX 점수)를 총 펩티드에 할당했다. 알려진 MHC 리간드의 점수와 EMX 점수를 비교한 후, EpiMatrix를 "평가된 결합 가능성(estimated binding probability)"(약어로 EBP, 그러나 엄격하게는 가능성은 아님)에 도달했다. EBP는 주어진 MHC 분자에 결합할 높거나 더 높은 EpiMatrix 점수를 갖는 펩티드의 비율을 의미한다. EBP는 100%(결합하기에 적합하게 높은)로부터 1%이하(결합하기에 매우 좋지 않은)의 범위이다.
EpiMatrix 분석을 NCBI 데이터베이스(NCBI 수납번호 P08176)에서 공지된 바와 같은 Der p 1의 총 서열 상에서 실시했다. 이러한 분석은 우수한 MHC 클래스-II 결합을 가질 것으로 예상된 상기 서열로부터 유래된 코어 펩티드(및 이들의 측면 서열)을 확인한다. 이러한 서열을 하기 표 7A(Der p 1)에 나타냈다. 표 7B(Der p 2) 및 표 7C(Der p 7)는 알려진 서열 Der p 2 및 Der p 7(NCBI 수납번호 p49278 및 P49273) 각각의 동일한 분석에 대한 서열을 나타낸 것이다.
표 7A에서 - C: "서열에서의 잔기"는 분석된 서열 내에서 펩티드의 위치를 나타낸다. 코어 펩티드(진하게 표시된 중앙 아미노산)은 분석 동안 확인된 실제 결합 서열을 규정한다. 안정화 측면(N-말단 및 C-말단, 진하게 표시하지 않음)은 코어 서열의 사용을 포함하며 통상적으로 펩티드의 제조를 목적을 위해 요구된다. "히트 수"는 서열 내에서 실험된 모든 MHC 유형에 대한 높은 예상 결합 친화성의 수를 의미한다. "EpiMatrix 클러스터 점수(Cluster Score)"는 클러스터의 길이에 대해 일반화된 히트수로부터 유래한다. 그러므로 클러스터 점수는 무작위 펩티드 표준에 상대적인 MHC 결합 특성의 예상 총계에서 초과하거나 부족하다. 10 또는 그 이상의 점수는 광범위한 MHC 결합 특성을 나타낸다. Epivax는 또한 펩티드 함유 에피토프의 소수성을 분석한다. 1 이상의 점수는 투여 및/또는 제조에 부적합한 것으로 여겨진다.
<표 7a>
Figure pct00120
<표 7b>
Figure pct00121
<표 7c>
Figure pct00122
실시예 4
추가 실험을 위한 펩티드 선별
실시예 1 내지 3에서 확인된 펩티드 및 에피토프를 기초로 하여, 본 발명의 발명자들은 추가 실험을 위한 표 8에서 보여지는 펩티드를 선별했다. 선별된 펩티드 중 일부는 실시예 1 내지 3의 펩티드의 변이체일 수 있음이 고려될 수 있으나 또한 본 발명의 펩티드일 수도 있음이 고려되었다. 특히, 표 8에서 진하게 표시한 잔기는 부모 단백질의 천연 서열에서의 상응 잔기로부터의 변경을 의미한다. 이러한 변경은 T 세포 에피토프로서 펩티드의 기능성을 감소시킴 없이 가용성을 향상시키고 펩티드의 형성을 감소시킨다. 보여지는 변경은 나타낸 바와 같이 세린(S) 또는 5-아미노부티르산(Б) 또는 시스틴(C)으로 천연 서열의 시스테인(C)을 치환하는 것이다.
추가적으로, 몇몇 서열은 실시예 1 내지 3의 펩티드의 서열과 비교했을 때 이들이 유도된 부모 단백질의 잔기를 더 많이 또는 더 적게 포함할 수 있다. 그러므로, 이러한 서열은 실시예 1 내지 3의 서열의 절단 또는 연장 변이체를 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 HDM03F는 Der p1의 잔기 149-165에 상응한다. HDM03E는 잔기 149-167에 상응한다. 따라서, HDM03F는 HDM03E의 N 말단으로부터 2개 잔기가 제거되어 형성된 HDM03E의 절단 변이체로 여겨질 수 있다. 표 8의 "부모에서의 잔기"는 표 4 내지 7에서 사용된 바와 같이 Der p 1, Der p 2 및 Der p 7의 서열을 의미한다. N 말단 글루타메이트(E) 잔기를 갖는 표 8의 이러한 펩티드, 예를 들어 HDM03K, L, V 및 W는 펩티드의 기능에 영향을 미치는 것 없이, 제조 동안 안정성을 향상시키기 위해 글루타메이트를 피로글루타메이트로 치환할 수 있다. 이러한 펩티드의 추가 실험으로부터의 데이터를 통상적으로 이러한 치환이 일어난 펩티드를 사용하여 수득했다.
<표 8>
Figure pct00123
Figure pct00124
실시예 5
사이토카인 방출 검정 및 펩티드 조합의 선택
PBMC로부터 사이토카인 분비 프로필은 실시예 3으로부터 펩티드를 사용하는 펩티드 자극에 대한 반응에서 분석하였다. 사이토카인 방출 검정으로부터의 상청액으로 ELISA 검정을 사용하여 2개 사이토카인, IFN-γ 및 IL-14의 존재를 테스트했다. PBMC로부터의 사이토카인 분비를 나타낸 펩티드를 사용하여 펩티드 자극에 대한 반응을 분석했다. 사이토카인 방출 검정으로부터의 상청액으로 ELISA 검정 또는 멜티플렉스 비드 어레이 검정을 사용하여 2개 사이토카인, IFN-γ 및 IL-14의 존재를 테스트했다.
통상적인 사이토카인 방출 검정에서 피검자 당 40x106의 PBMC가 요구된다. 좀더 자세하게는, 200㎍/ml 용액 250㎕의 적당한 항원 또는 펩티드 농도를 48 웰 플레이트의 적절한 웰에 분배했다. 플레이트를 37℃에서 최대 4시간 동안 5% CO2 가습 항온기 내에 항온시켰다. 그런 다음 5x106 세포/ml PBMC 현탁액 250㎕를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 항온기에서 다시 5일 동안 항온했다. 자극 후에, 배양 상청액의 시료를 표준 프로토콜에 따라 ELISA 또는 멀티플렉스 비드 검정에 의해 수득했다.
각 펩티드에 대한 IL-13 및 IFN-γ를 100pg/ml, 즉 1.25x106 세포 당 100pg을 초과하는 펩티드에 대해 웰 내에서 생성된 사이토카인의 양이 제공되는 양성 T 세포 에피토프로서 점수를 매겼다. 그러므로, 환자는 환자로부터의 세포가 IL-13 또는 IFN-γ에 대한 100pg/ml 이상의 반응을 야기한다면 펩티드에 대해 반응한다고 간주된다. 각 펩티드에 대한 응답자의 퍼센트를 도 2에 나타냈다.
100pg/ml 이상의 IL-13 또는 IFN-γ반응을 갖는 환자의 페센트에 의한 상위 5개 펩티드는 HDM203B, HDM201, HDM205, HDM203A 및 HDM202(서열 번호 83, 80, 85, 82 및 81)이다.
HDM203A 및 203B는 더 좋은 제조가능성 및 안정성을 이루기 위해 시스테인(C 말단으로부터 3번째 잔기)이 세린으로 치환되는 것과 같이 변이된 203B를 갖는 동일한 서열의 변이체이다. 그러므로 펩테드의 바람직한 조합은 이러한 펩티드 또는 이의 변이체 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
다음의 가장 유력한 펩티드는 HDM09A, HDM03D, HDM03E, HDMlOl, HDMlOlA, HDMlOlB (서열 번호: 5, 51, 52, 72, 73 및 74)이다. 바람직한 펩티드 조합은 이 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 펩티드를 통상적으로 포함할 수 있다. 이러한 그룹 중 HDM03D 및 HDM03E는 시스테인(Der p 1의 천연 서열의 C 말단으로부터 5번째 잔기)을 치환하는 세린 및 아미노부티르산을 각각 갖는 서로의 서열 변이체이다. 이러한 서열은 등가물로 간주된다.
HDM03V 및 HDM03W(서열 번호 100 및 101)로 명명된 HDM03의 추가 변이체 또한 적합한 것으로 여겨진다. 이러한 변이체는 각각 HDM03D의 마지막 11개 또는 10개 C 말단 잔기의 절단을 포함하는 단편이다. 이러한 펩티드는 상기 기재된 검정에 포함되지는 않으나 실험에서 HDM03D에 대해 적어도 등가일 수 있다고 여겨진다(데이터는 나타내지 않음).
HDM 101, HDM 101A, 및 HDM 101B는 또한 HDM101에서의 시스테인(N 말단으로부터 3번째 잔기)을 치환하는 세린을 갖는 HDM101A 및 아미노부티르산을 갖는 HDM101B의 서로의 서열 변이체이다. 세 HDM101 시리즈 펩티드 모두는 제조가능성 및 안정성에 바람직한 HDM101A 또는 HDM101B의 등가물로서 간주된다.
실험된 나머지 펩티드 중에서, 하기의 것들이 실험된 환자의 25% 이상에서 반응을 나타냈다: HDMOl [Der p1], HDMOlA [Der p1], HDM06A [Der p2], HDM07 [Der p1], HDM19A [Der p2], HDM21A [Der p2], HDM23C [Der p2], HDM26B [Der p2], HDM35A [Der p7], HDM48 [Der p7], HDM51 A [Der f 7], HDM102A [Der p1], HDM204 [Der p1] 및 HDM206 [Der p1] (각각 서열 번호 1, 48, 54, 56, 57, 9, 62, 63, 65, 21, 24, 76, 84, 및 86). 바람직한 펩티드 조합은 통상적으로 이러한 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 추가 펩티드를 포함할 수 있다. 혼합물에 추가 펩티드가 첨가되었다고 간주되었을 때, 이러한 최종 그룹으로부터의 대표는 이전 그룹이 Der p 1에 의해 우세하므로 Der p2 및 Der p7로부터 초래된 에피토프로부터 바람직하게 선택되었다. HDM26B [Der p2] 및 HDM 35 A [Der p7]가 특히 바람직하다. 추가 연구(데이터는 나타내지 않음)는 이들이 Der p 2 및 Der p 7 각각으로부터의 최상의 실행 펩티드임을 입증했다.
도 3은 HDM201, HDM202, HDM203B 및 HDM205의 코어 혼합물에 대해 반응하는 환자의 수를 나타낸다. 첨가된 HDM03D 및 HDMlOlA의 증대 효과 및 첨가된 HDM26B 및 HDM35A의 추가 증대 효과 또한 나타냈다. 2차 및 3차 그룹의 펩티드로부터의 첨가 에피토프의 유익함을 명확하게 나타냈다.
중요하게, 코어 혼합믈로의 펩티드 03D,26B,35A,101A의 첨가는 응답자로부터 비-응답자까지 4명의 환자를 변환시킨다. 이는 또한 혼합물로부터 펩티드 201, 202, 203B 또는 205 중 하나의 삭제가, 대부분의 인간이 이러한 펩티드 그룹에 대한 3 내지 4가지의 반응을 갖는 바와 같이 제시된 혼합물에 대한 전체 응답자의 수를 감소시키지 않을 것임이 분명하다. 이는 HDM201, HDM203B 및 HDM205의 코어 혼합물에 대한 유사한 결과를 나타내는, 도 4에서 입증되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Circassia Limited <120> Peptides for vaccine <130> N.102418A <150> GB 0715949.4 <151> 2007-08-15 <150> GB 0716224.1 <151> 2007-08-20 <150> GB 0723337.2 <151> 2007-11-28 <160> 245 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 1 Ile Asp Leu Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 2 Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 3 Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala 1 5 10 15 Ser Gln His <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 4 Arg Tyr Val Ala Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 5 Arg Glu Ala Leu Ala Gln Thr His Ser Ala Ile Ala Val Ile 1 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 6 Asp Gln Val 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Gln Leu Glu Ala Val 1 5 10 15 Phe Glu Ala Asn Gln Asn 20 <210> 114 <211> 17 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 114 Met Met Lys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Ala Ala Phe Val Ala Val Ser 1 5 10 15 Ala <210> 115 <211> 23 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 115 Glu Leu Asp Met Arg Asn Ile Gln Val Arg Gly Leu Lys Gln Met Lys 1 5 10 15 Arg Val Gly Asp Ala Asn Val 20 <210> 116 <211> 13 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 116 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 <210> 117 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 117 Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu 1 5 10 15 <210> 118 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Thr Glu Arg Val Arg Leu Val Thr Arg His Ile Tyr Asn Arg Glu Glu 1 5 10 15 <210> 119 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg 1 5 10 15 <210> 120 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Phe Val Asn Gln His Leu Cys 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<213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 135 His Ile Gly Ile Ile Asp Leu Lys Gly Glu Leu Asp Met Arg Asn 1 5 10 15 <210> 136 <211> 15 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 136 Ile Asp Leu Lys Gly Glu Leu Asp Met Arg Asn Ile Gln Val Arg 1 5 10 15 <210> 137 <211> 13 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 137 Lys Arg Val Gly Asp Ala Asn Val Lys Ser Glu Asp Gly 1 5 10 <210> 138 <211> 13 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 138 Ala Asn Val Lys Ser Glu Asp Gly Val Val Lys Ala His 1 5 10 <210> 139 <211> 13 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 139 Asp Asp Val Val Ser Met Glu Tyr Asp Leu Ala Tyr Lys 1 5 10 <210> 140 <211> 13 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 140 Lys Val Leu Ala Pro Ala Phe Lys Lys Glu Leu Glu Arg 1 5 10 <210> 141 <211> 304 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 141 Tyr Ala Arg Pro Ser Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Tyr Lys Lys Ala 1 5 10 15 Phe Asn Lys Ser Tyr Ala Thr Phe Glu Asp Glu 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artemisiifolia <400> 220 Met Gly Ile Lys His Cys Cys Tyr Ile Leu Tyr Phe Thr Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Leu Leu Gln Pro Val Arg Ser Ala Glu Asp Val Glu Glu Phe 20 25 30 Leu Pro Ser Ala Asn Glu Thr Arg Arg Ser Leu Lys Ala Cys Glu Ala 35 40 45 His Asn Ile Ile Asp Lys Cys Trp Arg Cys Lys Ala Asp Trp Ala Asn 50 55 60 Asn Arg Gln Ala Leu Ala Asp Cys Ala Gln Gly Phe Ala Lys Gly Thr 65 70 75 80 Tyr Gly Gly Lys His Gly Asp Val Tyr Thr Val Thr Ser Asp Lys Asp 85 90 95 Asp Asp Val Ala Asn Pro Lys Glu Gly Thr Leu Arg Phe Ala Ala Ala 100 105 110 Gln Asn Arg Pro Leu Trp Ile Ile Phe Lys Arg Asn Met Val Ile His 115 120 125 Leu Asn Gln Glu Leu Val Val Asn Ser Asp Lys Thr Ile Asp Gly Arg 130 135 140 Gly Val Lys Val Asn Ile Val Asn Ala Gly Leu Thr Leu Met Asn Val 145 150 155 160 Lys Asn Ile Ile Ile His Asn Ile Asn Ile His Asp Ile Lys Val Cys 165 170 175 Pro Gly Gly Met Ile Lys Ser Asn Asp Gly Pro Pro Ile Leu Arg Gln 180 185 190 Gln Ser Asp Gly Asp Ala Ile Asn Val Ala Gly Ser Ser Gln Ile Trp 195 200 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125 Ile Ser Pro Arg His Arg His Gly Leu Pro Arg Gln Arg Arg Arg Ser 130 135 140 Ala Arg Val Ser Ala Tyr Leu His Ala Asp Asp Phe His Lys Ile Ile 145 150 155 160 Thr Thr Ile Glu Ala Leu Pro Glu Phe Ala Asn Phe Tyr Asn Phe Leu 165 170 175 Lys Glu His Gly Leu Asp Val Val Asp Tyr Ile Asn Glu Ile His Ser 180 185 190 Ile Ile Gly Leu Pro Pro Phe Val Pro Pro Ser Arg Arg His Ala Arg 195 200 205 Arg Gly Val Gly Ile Asn Gly Leu Ile Asp Asp Val Ile Ala Ile Leu 210 215 220 Pro Val Asp Glu Leu Lys Ala Leu Phe Gln Glu Lys Leu Glu Thr Ser 225 230 235 240 Pro Asp Phe Lys Ala Leu Tyr Asp Ala Ile Arg Ser Pro Glu Phe Gln 245 250 255 Ser Ile Ile Ser Thr Leu Asn Ala Met Pro Glu Tyr Gln Glu Leu Leu 260 265 270 Gln Asn Leu Arg Asp Lys Gly Val Asp Val Asp His Phe Ile Arg Val 275 280 285 Asp Gln Gly Thr Leu Arg Thr Leu Ser Ser Gly Gln Arg Asn Leu Gln 290 295 300 Asp Asp Leu Asn Asp Phe Leu Ala Leu Ile Pro Thr Asp Gln Ile Leu 305 310 315 320 Ala Ile Ala Met Asp Tyr Leu Ala Asn Asp Ala Glu Val Gln Glu Leu 325 330 335 Val Ala Tyr Leu Gln Ser Asp Asp Phe His Lys Ile Ile Thr Thr Ile 340 345 350 Glu Ala Leu Pro Glu Phe Ala Asn Phe Tyr Asn Phe Leu Lys Glu His 355 360 365 Gly Leu Asp Val Val Asp Tyr Ile Asn Glu Ile His Ser Ile Ile Gly 370 375 380 Leu Pro Pro Phe Val Pro Pro Ser Gln Arg His Ala Arg Arg Gly Val 385 390 395 400 Gly Ile Asn Gly Leu Ile Asp Asp Val Ile Ala Ile Leu Pro Val Asp 405 410 415 Glu Leu Lys Ala Leu Phe Gln Glu Lys Leu Glu Thr Ser Pro Asp Phe 420 425 430 Lys Ala Leu Tyr Asp Ala Ile Asp Leu Arg Ser Ser Arg Ala 435 440 445 <210> 243 <211> 352 <212> PRT <213> Blattella germanica <400> 243 Met Ile Gly Leu Lys Leu Val Thr Val Leu Phe Ala Val Ala Thr Ile 1 5 10 15 Thr His Ala Ala Glu Leu Gln Arg Val Pro Leu Tyr Lys Leu Val His 20 25 30 Val Phe Ile Asn Thr Gln Tyr Ala Gly Ile Thr Lys Ile Gly Asn Gln 35 40 45 Asn Phe Leu Thr Val Phe Asp Ser Thr Ser Cys Asn Val Val Val Ala 50 55 60 Ser Gln Glu Cys Val Gly Gly Ala Cys Val Cys Pro Asn Leu Gln Lys 65 70 75 80 Tyr Glu Lys Leu Lys Pro Lys Tyr Ile Ser Asp Gly Asn Val Gln Val 85 90 95 Lys Phe Phe Asp Thr Gly Ser Ala Val Gly Arg Gly Ile Glu Asp Ser 100 105 110 Leu Thr Ile Ser Asn Leu Thr Thr Ser Gln Gln Asp Ile Val Leu Ala 115 120 125 Asp Glu Leu Ser Gln Glu Val Cys Ile Leu Ser Ala Asp Val Val Val 130 135 140 Gly Ile Ala Ala Pro Gly Cys Pro Asn Ala Leu Lys Gly Lys Thr Val 145 150 155 160 Leu Glu Asn Phe Val Glu Glu Asn Leu Ile Ala Pro Val Phe Ser Ile 165 170 175 His His Ala Arg Phe Gln Asp Gly Glu His Phe Gly Glu Ile Ile Phe 180 185 190 Gly Gly Ser Asp Trp Lys Tyr Val Asp Gly Glu Phe Thr Tyr Val Pro 195 200 205 Leu Val Gly Asp Asp Ser Trp Lys Phe Arg Leu Asp Gly Val Lys Ile 210 215 220 Gly Asp Thr Thr Val Ala Pro Ala Gly Thr Gln Ala Ile Ile Asp Thr 225 230 235 240 Ser Lys Ala Ile Ile Val Gly Pro Lys Ala Tyr Val Asn Pro Ile Asn 245 250 255 Glu Ala Ile Gly Cys Val Val Glu Lys Thr Thr Thr Arg Arg Ile Cys 260 265 270 Lys Leu Asp Cys Ser Lys Ile Pro Ser Leu Pro Asp Val Thr Phe Val 275 280 285 Ile Asn Gly Arg Asn Phe Asn Ile Ser Ser Gln Tyr Tyr Ile Gln Gln 290 295 300 Asn Gly Asn Leu Cys Tyr Ser Gly Phe Gln Pro Cys Gly His Ser Asp 305 310 315 320 His Phe Phe Ile Gly Asp Phe Phe Val Asp His Tyr Tyr Ser Glu Phe 325 330 335 Asn Trp Glu Asn Lys Thr Met Gly Phe Gly Arg Ser Val Glu Ser Val 340 345 350 <210> 244 <211> 182 <212> PRT <213> Blattella germanica <400> 244 Ala Val Leu Ala Leu Cys Ala Thr Asp Thr Leu Ala Asn Glu Asp Cys 1 5 10 15 Phe Arg His Glu Ser Leu Val Pro Asn Leu Asp Tyr Glu Arg Phe Arg 20 25 30 Gly Ser Trp Ile Ile Ala Ala Gly Thr Ser Glu Ala Leu Thr Gln Tyr 35 40 45 Lys Cys Trp Ile Asp Arg Phe Ser Tyr Asp Asp Ala Leu Val Ser Lys 50 55 60 Tyr Thr Asp Ser Gln Gly Lys Asn Arg Thr Thr Ile Arg Gly Arg Thr 65 70 75 80 Lys Phe Glu Gly Asn Lys Phe Thr Ile Asp Tyr Asn Asp Lys Gly Lys 85 90 95 Ala Phe Ser Ala Pro Tyr Ser Val Leu Ala Thr Asp Tyr Glu Asn Tyr 100 105 110 Ala Ile Val Glu Gly Cys Pro Ala Ala Ala Asn Gly His Val Ile Tyr 115 120 125 Val Gln Ile Arg Phe Ser Val Arg Arg Phe His Pro Lys Leu Gly Asp 130 135 140 Lys Glu Met Ile Gln His Tyr Thr Leu Asp Gln Val Asn Gln His Lys 145 150 155 160 Lys Ala Ile Glu Glu Asp Leu Lys His Phe Asn Leu Lys Tyr Glu Asp 165 170 175 Leu His Ser Thr Cys His 180 <210> 245 <211> 200 <212> PRT <213> Blattella germanica <400> 245 Tyr Lys Leu Thr Tyr Cys Pro Val Lys Ala Leu Gly Glu Pro Ile Arg 1 5 10 15 Phe Leu Leu Ser Tyr Gly Glu Lys Asp Phe Glu Asp Tyr Arg Phe Gln 20 25 30 Glu Gly Asp Trp Pro Asn Leu Lys Pro Ser Met Pro Phe Gly Lys Thr 35 40 45 Pro Val Leu Glu Ile Asp Gly Lys Gln Thr His Gln Ser Val Ala Ile 50 55 60 Ser Arg Tyr Leu Gly Lys Gln Phe Gly Leu Ser Gly Lys Asp Asp Trp 65 70 75 80 Glu Asn Leu Glu Ile Asp Met Ile Val Asp Thr Ile Ser Asp Phe Arg 85 90 95 Ala Ala Ile Ala Asn Tyr His Tyr Asp Ala Asp Glu Asn Ser Lys Gln 100 105 110 Lys Lys Trp Asp Pro Leu Lys Lys Glu Thr Ile Pro Tyr Tyr Thr Lys 115 120 125 Lys Phe Asp Glu Val Val Lys Ala Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Gly 130 135 140 Lys Leu Thr Trp Ala Asp Phe Tyr Phe Val Ala Ile Leu Asp Tyr Leu 145 150 155 160 Asn His Met Ala Lys Glu Asp Leu Val Ala Asn Gln Pro Asn Leu Lys 165 170 175 Ala Leu Arg Glu Lys Val Leu Gly Leu Pro Ala Ile Lys Ala Trp Val 180 185 190 Ala Lys Arg Pro Pro Thr Asp Leu 195 200

Claims (27)

  1. 4개 이상의 폴리펩티드를 포함하는, 자기내성화(tolerisation)에 의해 집 먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하기 위한 조성물로서, 상기 폴리펩티드는 다음 중에서 독립적으로 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물
    (i) HDM203B (서열 번호 83), HDM201 (서열 번호 80), HDM205 (서열 번호 85), HDM203A (서열 번호 82), HDM202 (서열 번호 81), 서열 번호 1 내지 79, 84, 또는 86 내지 104 (이는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 하나임) 중 어느 하나의 폴리펩티드; 또는
    (ii) 상기 (i)에 따른 폴리펩티드의 변이체로서, 여기에서 상기 변이체는
    - (i)의 서열 중 어느 서열; 또는
    - (i) 의 서열 중 어느 서열과 65% 이상의 상동성을 갖는 서열로서
    (i)의 서열 중 어느 서열으로 환자를 자기내성화시킬 수 있는 서열 로 구성된 영역을 포함하는 9 내지 30개의 아미노산 길이의 폴리펩티드; 또는
    (iii) 상기 (i)에 따른 폴리펩티드의 변이체로서, 여기에서 상기 변이체는
    - (i)의 서열 중 어느 서열의 단편; 또는
    - (i)의 서열 중 어느 서열의 단편의 상동체,
    중 하나를 나타내는 서열로 이루어진 영역을 포함하는 9 내지 30개 아미노산 길이의 폴리펩티드,
    상기 서열은 (i)의 서열 중 어느 서열으로 환자를 자기내성화시킬 수 있으며 9개 이상의 아미노산 길이를 갖고, 여기에서 상기 상동체는 (i)의 서열 중 어느 서열에서 어느 9개의 연속 아미노산에 적어도 65%의 상동성을 갖는다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 집단에서 먼지 진드기 알레르기성인 환자의 패널 중 50% 이상 또는 60% 이상을 자기내성화시킬 수 있고/있거나;
    (b) 제1항의 (i)로부터 선택된 폴리펩티드 또는 제1항의 (ii) 또는 (iii)에서 규정된 바와 같은 이의 변이체를 4개 이상 포함하고/포함하거나
    (c) 하나의 추가 폴리펩티드 내지 총 13개 이하의 유일한/상이한 폴리펩티드를 포함하며, 여기에서 상기 추가 폴리펩티드는 :
    - (a)에서 선택되지 않은 상기 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열에서의 9개 이상 또는 그 이상의 연속된 아미노산에 65% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하고;
    - 9개 내지 30개 아미노산 길이이며/이거나;
    (d) 13개 이하의 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 9개 내지 20개 또는 13개 내지 17개 아미노산 길이인 제2항에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하며/포함하거나 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 104 중 어느 서열에서의 9개 이상의 연속된 아미노산과 70% 이상의 서열 상동성을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 80, 81, 82, 83 및 85의 폴리펩티드 또는 제1항의 (ii) 또는 (iii)에서 규정된 바와 같은 이의 변이체로부터 선택한 하나 이상의 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 서열 번호 82 및 83의 하나 이상의 폴리펩티드 또는 변이체가 선택되지 않는 조건 하에서 서열 번호 80, 81, 82, 83 및 85의 폴리펩티드 또는 제1항의 (ii) 또는 (iii)에서 규정된 바와 같은 이의 변이체로부터 독립적으로 선택한 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 5, 51, 52, 100, 101, 72, 73 및 74 중 어느 서열의 폴리펩티드 또는 제1항의 (ii) 또는 (iii)에서 규정된 바와 같은 이의 변이체로부터 선택한 하나 이상의 추가 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 서열 번호 51, 73, 100 및 101 중 어느 서열의 폴리펩티드 또는 제1항의 (ii) 또는 (iii)에서 규정된 바와 같은 이의 변이체로부터 선택한 하나 이상의 추가 펩티드를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 서열 번호 1, 9, 21, 24, 48, 54, 56, 57, 62, 63, 65, 76, 84 및 86 중 어느 서열의 폴리펩티드 또는 제1항의 (ii) 또는 (iii)에서 규정된 바와 같은 이의 변이체로부터 선택한 하나 이상의 추가 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 서열 번호 63 및 65 중 어느 서열의 폴리펩티드 또는 제1항의 (ii) 또는 (iii)에서 규정된 바와 같은 이의 변이체로부터 선택한 하나 이상의 추가 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 다음으로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물:
    (a) 서열 번호 83 및 82 중 하나 이상의 폴리펩티드 또는 제1항의 (ii) 또는 (iii)에서 규정된 바와 같은 이의 변이체; 및
    (b) 서열 번호 80, 81 및 85 중 2개 이상의 폴리펩티드 또는 제1항의 (ii) 또는 (iii)에서 규정된 바와 같은 이의 변이체; 및 선택적으로
    (c) 서열 번호 51, 73, 100 및 101 중 하나 이상의 폴리펩티드 또는 제1항의 (ii) 또는 (iii)에서 규정된 바와 같은 이의 변이체
    (d) 서열 번호 63 및 65 중 하나 이상의 폴리펩티드 또는 제1항의 (ii) 또는 (iii)에서 규정된 바와 같은 이의 변이체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (c)의 하나 이상의 폴리펩티드가 서열 번호 101의 폴리펩티드임을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드가
    (i) N 말단 아세틸화;
    (ii) C 말단 아미드화;
    (iii) 아르기닌 및/또는 리신의 측쇄 아민에서의 하나 또는 그 이상의 수소가 메틸렌기로 치환;
    (iv) 글리코실화; 및
    (v) 인산화
    중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 변형을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 펩티드가 가용성이 되도록 조작됨으로써
    (i) T 세포 에피토프 측면의 펩티드의 잔기에 대한 N 말단: 펩티드가 유래하는 단백질의 서열에서 상기 잔기에 대한 N 말단에 인접한 2 내지 6개의 연속 아미노산에 상응하는 1 내지 6개의 연속 아미노산; 및/또는
    (ii) T 세포 에피토프 측면의 펩티드의 잔기에 대한 C 말단: 펩티드가 유래하는 단백질의 서열에서 상기 잔기에 대한 C 말단에 인접한 1 내지 6개의 연속 아미노산에 상응하는 1 내지 6개의 연속 아미노산; 또는
    (iii) T 세포 에피토프 측면의 펩티드 잔기에 대한 N 및 C 말단 둘 다, 아르기난, 리신, 히스티딘, 글루타메이트 및 아스파테이트 중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산이 포함되게 하고,
    상기 폴리펩티드는 적어도 3.5mg/ml의 가용성을 가지며 T 세포 에피토프는 3.5mg/ml 이하의 가용성을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 펩티드가 가용성이 되도록 조작됨으로써,
    (i) 상기 펩티드의 천연 서열 중 어느 시스테인 잔기가 세린 또는 2-아미노부티르산으로 치환; 및/또는
    (ii) T 세포 에피토프에 포함되지 않는, 펩티드의 천연 서열의 N 또는 C 말단에서 3개 이하의 아미노산 중 어느 소수성 잔기가 삭제; 및/또는
    (iii) T 세포 에피토프에 포함되지 않는, 펩티드의 천연 서열의 N 또는 C 말단에서 4개 이하의 아미노산 중 서열 Asp-Gly를 포함하는 두 개의 연속적인 아미노산이 삭제되게 한 것임을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 각 폴리펩티드가 0.03 내지 200 nmol/ml, 0.3 내지 200 nmol/ml 또는 30 내지 120 nmol/ml 범위의 농도임을 특징으로 하는 조성물.
  16. 발현 시 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에서 규정된 바와 같은 조성물을 생성하는 3개 이상의 폴리누클레오티드 서열을 포함하는, 자기내성화에 의해 먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하기 위한 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상이한 폴리펩티드를 발현할 수 있는 각 폴리누클레오티드 서열은 동일하거나 상이한 폴리누클레오티드 벡터 내에 존재함을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제1항에서 규정된 바와 같은 상이한 폴리펩티드를 각각 코드하는 3개 이상의 폴리누클레오티드 서열과 선택적으로 제2항에서 규정된 바와 같은 상이한 폴리펩티드를 코드하는 하나 또는 그 이상의 추가 폴리누클레오티드 서열을 포함하는, 자기내성화에 의해 먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하기 위한 벡터.
  19. 제1항 또는 제2항에서 규정된 바와 같은 상이한 폴리펩티드를 각각 코드하는 4개 내지 13개의 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 자기내성화에 의해 먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하기 위한 벡터로서, 서열 번호 82 및 83의 폴리펩티드 중 하나 이상이 선택되지 않는 조건 하에서 4개 이상의 폴리누클레오티드 서열이 각각 서열 번호 80, 81, 82, 83 및 85로부터 선택된 상이한 폴리펩티드를 코드함을 특징으로 하는 벡터.
  20. 4개 내지 13개의 폴리펩티드를 포함하는 제품으로서, 서열 번호 82 및 83의 폴리펩티드 또는 변이체 중 하나 이상은 선택되지 않는 조건 하에서 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 폴리펩티드가 서열 번호 80, 81, 82, 83 및 85의 폴리펩티드 또는 제1항의 (ii) 또는 (iii)에서 규정된 바와 같은 이들의 변이체로부터 독립적으로 선택되며 각각의 상이한 폴리펩티드가 자기내성화에 의해 집 먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하기 위해 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 사용되는 것을 특징으로 하는 제품.
  21. 제1항 또는 제2항에서 규정된 바와 같은 상이한 폴리펩티드를 각각 코드하는 4개 내지 13개의 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 제품으로서, 서열 번호 82 및 83의 폴리펩티드 중 하나 이상은 선택되지 않는 조건 하에서 4개 이상의 폴리누클레오티드 서열이 각각 서열 번호 80, 81, 82, 83 및 85로부터 선택된 상이한 폴리펩티드를 코드하며 각각의 상이한 폴리펩티드가 인간의 집 먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하기 위해 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 사용되는 것을 특징으로 하는 제품.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물; 제18항 또는 제19항에 따른 벡터; 또는 제20항 또는 제21항에 따른 제품; 및 약학적으로 용인가능한 담체나 희석제를 포함하는, 자기내성화에 의해 먼지 진드기에 대한 알레르기를 예방하거나 치료하기 위한 약학적 제형.
  23. 제22항에 있어서, 조성물, 벡터 또는 제품이 경구 투여, 비강 투여, 경피 투여, 피하 투여, 설하 투여, 피내 투여, 구강 투여 또는 흡입이나 주사에 의한 투여용으로 제형화됨을 특징으로 하는 약학적 제형.
  24. 추가 폴리펩티드 알레르겐에 대해서 환자를 자기내성화시키는데 사용하기 위한 추가 폴리펩티드 알레르겐을 추가로 포함하는, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 규정된 바와 같은 조성물 또는 제20항 또는 제21항에서 규정된 바와 같은 제품.
  25. T 세포를 제1항에서 규정된 바와 같은 폴리펩티드와 접촉시키는 단계와, 상기 T 세포가 상기 폴리펩티드에 의해 자극되는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, T 세포가 제1항에서 규정된 바와 같은 폴리펩티드를 인식하는지 여부를 측정하는 생체외 방법.
  26. 환자가 집 먼지 진드기 알레르겐에 대한 반응에서 알레르기성 증상에 의해 특성화되는 질환을 갖고 있거나 가질 위험이 있는지 여부를 측정하는 생체외 방법에 있어서, 상기 방법은 환자가 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 규정된 바와 같은 조성물에 반응하는 T 세포를 갖는지 여부를 시험하는 단계와 그에 따라 환자가 상기 질환을 갖거나 가질 위험이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 조성물에 대한 T-세포 면역 반응이, 조성물과 T 세포의 상호작용이 허용되는 조건 하에서 피검자로부터 수득한 시료에서 T 세포와 조성물을 접촉시키는 단계와; T 세포 중 어느 것이 자극되는지 여뷰를 측정함으로써 T-세포 면역 반응이 존재 또는 부재하는지 여부를 측정하는 단계에 의해 평가되는 것을 특징으로 하는 방법.
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