JP4812951B2 - 特異性不明のｔ細胞のクローン化法及びその認識ペプチドリガンドの同定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は特異性が不明の末梢のメモリーＴ細胞をコンビナトリアルペプチドライブラリーを用いて刺激、増殖、クローン化し、そのクローンのペプチドリガンドを同定する新規な方法を開示する。この方法により、自己免疫疾患に関与したＴ細胞の認識エピトープや悪性腫瘍におけるＴ細胞によって認識されるペプチドリガンドの同定が可能になる。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
自己免疫疾患の病態形成には、自己反応性T細胞の活性化が重要な役割を果たし、それらの活性化されたＴ細胞を中心に産生されるサトカインや炎症性メディエーターが組織傷害等を導いていると考えられている。従来これらの活性化するＴ細胞全体やサイトカイン、炎症性メディエーターを広範囲にまた非特異的に抑制することによる治療薬の開発、適用が広く行われてきた。
【０００３】
一方、特異的免疫療法が究極の治療法として着目されている。すなわち、末梢に存在するＴ細胞が認識するペプチドリガンドを同定することが出来れば、自己免疫疾患の発症原因となっているＴ細胞が認識する抗原のエピトープを探しだし、そのＴ細胞を標的にした特異的な免疫療法の開発に道を開く事が出来る。また、悪性腫瘍免疫においてはその腫瘍細胞を特異的に攻撃するＴ細胞を活性化する特異免疫療法の開発が可能になると考えられる。しかしながら、患者に特異的な抗原、特にＴ細胞によって認識される抗原のアミノ酸配列をいかにして同定するかが大きな課題となっていた。
【０００４】
Ｔ細胞の認識するペプチドリガンドの同定方法の開発については、多くの努力が払われてきた。従来報告されているＴ細胞クローンの認識エピトープを同定する場合には、確立の過程で予想される特定の抗原を予め添加しておき、その天然抗原に対して応答するＴ細胞クローンのみを増殖させる手法が取られてきた。しかしながら、この方法では特定の予想した抗原を認識するＴ細胞クローンのみしか増殖できず、またその抗原を認識するＴ細胞が含まれない場合は、増殖するＴ細胞が全く得られないことになる。
【０００５】
さらに、クローン化されたＴ細胞の認識するペプチドリガンドを同定する方法として、ペプチドライブラリーを用いた方法が、Y. Tanaka, H. Ohyama, M. Ogawa,Y. Nishimura 「コンビナトリアルペプチドライブラリーおよびマススペクトルを用いた自己K-ras反応性CD4+Ｔ細胞クローンに対するペプチドスーパーアゴニストの同定」J. Immunol., 162: 7155-7161（1999）やB. Hemmer, B. T. Fleckenstein, M. Vergelli, G. Jung, H. McFarlandら「ヒト自己反応性クラスII拘束性Ｔ細胞クローンの高効率細菌性及び自己リガンドの同定」J. Exp. Med., 185: 1651-1659（1997）等により報告されている。
【０００６】
しかしながら、特異性が不明な末梢のＴ細胞については、まずクローンとして確立する事自体が困難であり、評価するに充分な量の細胞を得られるように増殖させることが困難であった。その解決策としてＩＬ−２存在下に、固相化抗ＣＤ３抗体でＴ細胞を刺激する試みも行われてきたが、長期間維持するのが困難であった。これは、その抗原提示細胞−ペプチド−Ｔ細胞相互作用を介した生理的な抗原提示細胞の応答の欠落によるものと推定されている。
【０００７】
以上のように特異性が不明な末梢のＴ細胞を増殖、クローン化し、更にそのＴ細胞の認識エピトープを効率的に解析する方法は未だ考案されていない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
このような状況を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、末梢血由来のメモリーＴ細胞を、インターロイキン存在下、コンビナトリアルランダムペプチドライブラリー（Ｘｎペプチド）を用いて刺激、増殖させ、Ｔ細胞クローンを分離する行程、さらに分離されたＴ細胞クローンの認識エピトープをペプチドライブラリーによるコンビナトリアルアッセイにより、活性化能を有するペプチドを同定する行程からなるＴ細胞エピトープの解析方法を見出し、本発明を完成するに至った。本発明に従い同定されるペプチド配列をもとにタンパク質の配列情報データベース等を用いて、分離したＴ細胞の認識する関連する天然ペプチドリガンドを同定することが可能となる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の主な構成要件は、末梢血または組織由来の特異性不明のＴ細胞を、コンビナトリアルランダムペプチドライブラリー（Ｘｎペプチドライブラリー）、インターロイキン及び前記Ｔ細胞と同一個体由来のＤＮＡ合成を停止させた主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII抗原発現細胞、さらに選択的にアゴニスト活性を有する抗ＣＤ２９抗体の存在下、共培養することからなる特異性不明のＴ細胞クローンの増殖方法、及び当該方法に従い増殖された特異性不明のＴ細胞クローンについて、コンビナトリアルペプチドライブラリーに対する反応性を調べることを特徴とする特異性不明のＴ細胞クローンの認識エピトープまたは当該Ｔ細胞により認識されるペプチドリガンドの同定方法である。
【００１０】
まず、Ｔ細胞クローンの増殖方法において使用されるＴ細胞は、特異性が明らかでないＴ細胞であれば特に限定されるものではない。そのようなＴ細胞は、末梢血、臓器、リンパ節などより得ることができる。
【００１１】
Ｘｎペプチドライブラリーは、システインを除く１９種の天然アミノ酸が任意にｎ個（ｎ＝９，１１，１３，１５，１７，１９）繋がったペプチドライブラリーで、主にコンビナトリアルなペプチド合成法で合成できるが、１９種の天然アミノ酸が任意に含まれる物であれば、その合成手法は特に制限されない。
また、Ｘｎペプチドは大腸菌やファージ、酵母を用いて生物的に発現させたペプチドライブラリーを精製して用いた場合も、ランダムな配列を有するライブラリーであれば同様に使用可能である。
使用されるＸｎペプチドライブラリーは、Ｘ17及びＸ19において高いＴ細胞増殖活性が認められ、特にＸ19が顕著な増殖活性を示した。Ｘｎペプチドの好適な濃度としては１〜１０００μＭであり、さらに６２〜２５０μＭが好適な条件である。
【００１２】
次に添加されるインターロイキンとしては、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン（ＩＬ−１５）が組み合わて使用される。また、インターロイキン−２（以下、ＩＬ−２）を単独で使用しても効果が認められる。さらに、上記インターロイキンを組み合わせて使用することも可能である。
【００１３】
また、前記ＭＨＣクラスII抗原発現細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ＭＨＣクラスII抗原を発現するように遺伝子組換えが行われた形質転換細胞または不死化Ｂ細胞などが選択使用され、これらはいずれもＴ細胞と同一個体由来のものが使用される。さらに、これらの細胞は、マイトマイシンＣ等の細胞分裂阻害剤や放射線照射で処理することにより、ＤＮＡ合成を停止させたものが培養液中に添加される。
【００１４】
さらに、培養液中にアゴニスト活性を有する抗ＣＤ２９抗体を添加することにより、Ｔ細胞のクローナルな増殖の効率が高まり、かつＸ19反応性のＴ細胞を増殖できることが確認できた。使用される抗ＣＤ２９抗体は、定法に従い得られるもので、アゴニスト活性を有するものであれば特に限定されるものではない。
【００１５】
上記の増殖方法により特異性不明のＴ細胞クローンを大量に増殖することが可能となる。本方法を用いた場合、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（以下、ＣＤ４Ｔ細胞と称することもある）を特異的に増殖できることが明らかとなった。また、増殖応答しているＣＤ４Ｔ細胞の種類を評価した結果、メモリーＴ細胞が増殖応答していることが明らかとなった。
【００１６】
次に上記の増殖方法により増殖された特異性不明のＴ細胞クローンについて、当該Ｔ細胞クローンの認識するエピトープまたは当該Ｔ細胞により認識されるペプチドリガンドの同定方法が確立された。
すなわち、得られたＴ細胞クローンを、ＩＬ−２及び前記Ｔ細胞と同一個体由来のＤＮＡ合成を停止させたＭＨＣクラスII抗原発現細胞の存在下、Ｘｎペプチドライブラリーを用いたポジショナルスキャニングを行い、任意のアミノ酸（システインを除く１９種の天然アミノ酸）をとりうるＸｎペプチド内の各ポジションにおいて増殖活性化能を示すアミノ酸を評価することにより、活性化能を有するペプチド配列を特定することが可能となった。
【００１７】
Ｘｎペプチドのｎ数は対象となるＴ細胞により適宜選択されるものであり、特に限定はされないが、本発明ではＸ９をベースにしたＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫ（配列表配列番号１）とＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫ（配列表配列番号２）（Ｘはシステインを除く１９種の天然アミノ酸；Ｋはリジン；Ｇはグリシン）を用いた。
【００１８】
上記に従い特定されたペプチド配列が、Ｔ細胞クローンにより認識されるペプチドリガンドである。当該ペプチドリガンドが何に基づくものかをパターンマッチサーチを用いた検索により見出すことができる。この結果、特異性不明のＴ細胞クローンが認識するペプチドリガンドの同定が可能となる。
【００１９】
【実施例】
《実施例１：ペプチドライブラリーの合成》
９６ウェルペプチド合成機モデルSRM96A（島津製作所）を用いて、Fmocペプチド合成法を用いて合成した。ランダムペプチドライブラリーの場合、システインを除く１９種のFmoc-Lアミノ酸の等モル混合物を１つの結合位置に対して２回の結合反応を行った。アミノ酸の結合反応の終了したコンビナトリアルランダムペプチドライブラリーは２−メチルインドールで樹脂から切り出し、氷温に冷却した無水エチルエーテルで沈殿後、洗浄を5回おこなった。ペプチドの沈殿を窒素ガス雰囲気下で乾燥後、トリフルオロ酢酸に溶解し、エチルエーテル沈殿後、再度乾燥させた。調製したペプチドは０．０１Ｎ塩酸を含む５０％アセトニトリルに溶解後、凍結乾燥させた。乾燥後、秤量したペプチドは無水ジメチルスルホキシドに５０ｍＭになるように（アミノ酸の平均分子量を１１０と仮定して）溶解し、−８０℃に保存した。培養に使用するときには、ペプチド溶液を培養メディウムで１ｍＭになるように希釈し、遠心して沈殿物を除去後、０．４５μｍのフィルターで滅菌濾過して、試験に供した。
【００２０】
《実施例２：ペプチドライブラリーの解析》
合成したＸ19コンビナトリアルランダムペプチドライブラリーの凍結乾燥品を１００μＬの蒸留水に溶解後、遠心して沈殿物を除去した。塩酸加水分解反応２１時間後のサンプルを２０μＬ用いて、反応試薬２０μＬ、バッファー６０μＬと反応後、その２０μＬをＨＰＬＣでアミノ酸組成分析を行った。
【００２１】
アスパラギン酸＋アスパラギンは１０．７ｐmol、セリンは４３．０ｐmol、グルタミン酸＋グルタミンは５８．８ｐmol、グリシンは６８．５ｐmol、ヒスチジンは２２．１ｐmol、アルギニンは５．９ｐmol、スレオニンは３４．０ｐmol、アラニンは６３．５ｐmol、プロリンは１３．５ｐmol、チロシンは３８．５ｐmol、バリンは８４．２ｐmol、メチオニンは３１．１ｐmol、リジンは４５．９ｐmol、イソロイシンは８．９ｐmol、ロイシンは６６．１ｐmol、フェニルアラニンは３．８ｐmol含有されていると解析された。この方法で分析できないトリプトファンを除く、１８種のアミノ酸が全てほぼ同等に含まれていることが確認できた。
【００２２】
また、合成したＸ19コンビナトリアルランダムペプチドライブラリーのＮ末端から３番目までのアミノ酸をプロテインシークエンサーModel492（アプライドバイオシステムズ社）でエドマン分解法により解析した結果、Ｎ末端から３番目までの各位置には１９種全てのアミノ酸が含まれていることが確認できた。
【００２３】
《実施例３：マイトマイシンＣによる末梢血単核細胞の処理》
５〜１０×１０6個／ｍｌの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を２０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを含んだ培養液（RPMI1640培地に２ｍＭ L-グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％の加熱不活化自己血漿を含む）中で撹拌しながら、２時間培養した。RPMI1640培地で２回洗浄後、培養液中で更に３〜５時間培養した。細胞を回収後、RPMI1640培地で２回洗浄し、以後の試験に用いた。
【００２４】
《実施例４：ペプチドの長さによるＴ細胞の増殖刺激活性の違いについて》
アミノ酸の長さによる効果を検討する目的で、９,１１,１３,１５,１７,１９個の長さを有するランダムなアミノ酸配列からなるペプチドＸｎ（ｎはアミノ酸の個数を表す）を作製した。これらのペプチドの１６、６２、２５０μＭ存在下と、対照として無関係なペプチド（VPIQRAVYQNVVVNN）と細胞活性化のための陽性対照ＰＭＡ（Pholborl Myristic Acetate：１ng／ml）とionomycin（0.3ｍＭ）、培地のみを設定した。
【００２５】
１．５×１０5／ウェルの健常人由来ＰＢＭＣをＩＬ−２存在下、或いは非存在下、これらのペプチドの１６、６２、２５０μＭ存在下、もしくは無関係なペプチド（VPIQRAVYQNVVVNN）或いは細胞活性化のための陽性対照ＰＭＡとionomycin存在下、その増殖応答を調べた。
【００２６】
ＩＬ−２添加群では、培養４日目にＩＬ−２を添加し、また全ての群には培養６日目に3Ｈチミジンを添加して、増殖応答について調べた。図１Ａに示すようにＸ17とＸ19が高濃度で弱い増殖応答を示した他は顕著な増殖応答は示さなかった。しかしながら、ＩＬ−２を添加した場合、Ｘ19のように長いペプチドは濃度依存的に強い増殖応答を示した（図１Ｂ）。
【００２７】
また、増殖応答を示したＴ細胞のサブポピュレーションはＣＤ４Ｔ細胞であった（図２）。これらの増殖応答は、ヒトＭＨＣクラスIIに対するモノクローナル抗体（抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体）を添加することで濃度依存的に抑制され、特に抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の効果が強いことが明らかになった。更に、これらのモノクローナル抗体を混合して使用することにより、その効果は飽和した。またこの効果はＭＨＣクラスＩに対する抗体では認められなかった。
【００２８】
《実施例５：ヒトＴ細胞クローンの増殖応答評価》
ヒトＣＤ４Ｔ細胞クローンとして、OT1.1（DP5拘束性にp53p153-165ペプチドを認識）、T31.1（DP5拘束性にTEL/AML-1ペプチドを認識）、DT13.2（DQ6拘束性にDer f Ip18-31ペプチドを認識）、SK2.11（DQ6拘束性にAchRp75-87ペプチドを認識）、29.28.1（DR8拘束性にRasp3-20ペプチドを認識）、29.15.2（DR51拘束性にRasp3-20ペプチドを認識）、MK20.2（DR53拘束性にGADp111-131ペプチドを認識）、HY6.22（DR4拘束性にDer f Ip82-94ペプチドを認識）、YT15.1（DR15拘束性にBCGap84-100ペプチドを認識）、SF36.16（DR4拘束性にBCGap84-100ペプチドを認識）、BC20.7（DR14拘束性にBCGap84-100ペプチドを認識）、BC33.5（DR14拘束性にBCGap84-100ペプチドを認識）、BC42.1（DR14拘束性にBCGap84-100ペプチドを認識）を用いた。
【００２９】
ヒトＴ細胞クローンを５０Ｕ／mlのヒト組換えＩＬ−２とそのＴ細胞が認識する本来のペプチドを加えた放射線処理した対応する自己ＰＢＭＣで弱く刺激した。Ｔ細胞クローンのＸ19ペプチドによる増殖は、２×１０4個／ウエルの被験Ｔ細胞を２０Ｕ／mlのヒト組換えＩＬ−２とマイトマイシンＣ処理した１×１０5個／ウエルの自己ＰＢＭＣを含む培養液（RPMI1640培地に２ｍＭ L-グルタミン、１００Ｕ／mlのペニシリン、１００μg／mlのストレプトマイシン、１０％の加熱不活化自己血漿を含む）中で、２５０μＭのＸ19存在下もしくは非存在下、９６ウエル平底培養プレートを用いて評価した。７２時間の増殖応答試験の内、最後の１６時間は１μCi／ウエルの3Ｈチミジンを添加した。
【００３０】
表１に示すように、OT1.1とT31.1の様にＨＬＡ拘束性が同じで特異性が異なるＴ細胞クローン間でも、Ｘ19存在下で明らかな増殖応答を示した。また、29.28.1と29.15.2、YT15.1とSF36.16とBC20.7の様に同じペプチドを認識するが異なるＨＬＡ拘束性を有するＴ細胞クローン間でもＸ19存在下で明らかな増殖応答が認められた。更に、BC20.7、BC33.5、BC42.1の様に同一のペプチドを認識し、またＨＬＡ拘束性も同一であるが用いるＶβ鎖が異なるＴ細胞クローン間でもＸ19存在下で明らかな増殖応答が認められた。
【００３１】
【表１】
【００３２】
《実施例６：ヒト末梢血Ｔ細胞集団の調製》
末梢血Ｔ細胞集団の調製はStemsep Kits（ステムセル テクノロジー社）を用いた。対応する健常成人よりFicoll-Paqueを用いてＰＢＭＣを用事調製し、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６とグリコフォリンＡに対する抗体結合−磁性粒子の混合物と共に培養した。磁性カラムを用いて抗体結合細胞を取り除き、ＣＤ４陽性Ｔ（ＣＤ４Ｔ）細胞を調製した。分離した細胞の９５％以上がＣＤ４Ｔ細胞であることが確認できた。
【００３３】
メモリーＴ細胞の調製には抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を、ナイーブＴ細胞の調製には抗ＣＤ４５ＲＯ抗体を上記の抗体混合物に加えて使用することにより調製した。
【００３４】
《実施例７：ＣＤ４Ｔ細胞の効率的な増殖条件の検討》
３×１０4／ウエルのマイトマイシンＣ処理ＰＢＭＣを播いて置いたテラサキプレートのウエルに、ＰＢＭＣから分離したＣＤ４Ｔ細胞を１個／ウエルになるように加えた。
培養液中には、Ｘ19（２５０μＭ）、ＩＬ−２（５０Ｕ／ml）、ＩＬ−４（１０Ｕ／ml）、ＩＬ−７（５０Ｕ／ml）、ＩＬ−９（５０Ｕ／ml）、ＩＬ−１５（１ｎg／ml）、抗ＣＤ２９抗体ＭＡＲ４（2.5μg／ml）を種々の組み合わせで添加した。これらの細胞の培養開始後７日後に、細胞増殖を顕微鏡観察により評価した。
増殖が認められたウエルは、更にマイトマイシンＣ処理ＰＢＭＣを播いて置いた９６ウエルプレートにＸ19及びＩＬ−２存在下、７日間培養し、増殖試験を行った。stimulation index （cpm with IL-2 + X19／cpm with IL-2 only）が２．０以上を示したウエルを「Ｘ19反応性」と評価した。これらの実験の結果を表２にまとめる。
【００３５】
実験１では、各インターロイキンの組み合わせ添加による増殖効果を比較検討し、Ｘ19と共にＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５を添加することによりＣＤ４Ｔ細胞の増殖効率並びにＸ19との反応性が高くなることが明らかになった。
【００３６】
更に実験２で、この組み合わせに、アゴニスティックな活性を有する抗ＣＤ２９抗体を添加すると、ＣＤ４Ｔ細胞のクローナルな増殖の効率は高まり、しかもＸ19反応性のＣＤ４Ｔ細胞を増殖できることが確認できた。
【００３７】
実験３では増殖応答しているＣＤ４Ｔ細胞の種類を評価した。その結果、メモリーＴ細胞がこれらの刺激で増殖応答していることが明らかに出来た。
【００３８】
【表２】
【００３９】
《実施例８：クローン化されたＴ細胞のペプチドリガンドの同定法》
実施例７でＰＢＭＣから直接得られたクローン化されたＴ細胞クローンのペプチドリガンドを同定するために、Ｘ９をベースにした
ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫ（配列表配列番号１）、または
ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫ（配列表配列番号２）の二つのコンビナトリアルペプチドライブラリーを用いて、増殖刺激活性を調べた（Ｘはシステインを除く１９種の天然アミノ酸；Ｋはリジン；Ｇはグリシン）。使用されたペプチドの濃度は２５０μＭで、ＩＬ−２及びマイトマイシンＣ処理ＰＢＭＣ存在下で評価を行った。
【００４０】
それぞれのＴ細胞クローンは上記２種のＸ９をベースにしたコンビナトリアルペプチドに対してＩＬ−２依存的に増殖した。充分な増殖性を示した19.6.47Ｔ細胞を用いて得られた反応パターンを図３及び４に示す。
【００４１】
図３に示すように、ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫの場合、２位のチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）が、３位でのチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、４位でのアスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、５位および６位でのグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、７位でのプロリン（Ｐｒｏ）、８位でのチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、９位でのロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）が効率よく増殖応答を誘導した。
【００４２】
また、図４に示すように、ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫの場合も同じ様な結果が得られたが、８位ではフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、メチオニン（Ｍｅｔ）が増殖応答を誘導したが、９位ではグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）が増殖応答を刺激した。
【００４３】
これらの結果から、
Ｘ２：Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ
Ｘ３：Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ
Ｘ４：Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ
Ｘ５：Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ
Ｘ６：Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ
Ｘ７：Ｐｒｏ
Ｘ８：Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ
Ｘ９：Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ
の組み合わせの中から選ばれるペプチドがこのＴ細胞クローンにより認識されるペプチドリガンドであると考えられた。
【００４４】
これらの結果を基に、パターンマッチサーチによりSWISS-PLOTとTrMBLを用いて検索した。８残基のうち７残基マッチでピックアップした結果、表３に示す３種の非自己配列が得られた。
【００４５】
【表３】
【００４６】
19.6.47Ｔ細胞の供与者はスギ花粉症患者であり、また、19.6.47の樹立はスギ花粉飛散後期に行われたため、表３に示したいくつかの非自己ペプチドのうち、Cry j I断片（p324-331）に反応する可能性が高いと考え、この部分を含む合成ペプチド（Cry j Ip301-321）とCry j I 精製蛋白に対する19.6.47の反応性を観察した。
【００４７】
Ｔ細胞クローン（19.6.47）を、放射線照射された（45Gy）ＰＢＭＣと精製Cry j Ｉ蛋白（50，5.0，0.5mg／ml）、Cry j Ｉ p301-321（250ｍＭ，25ｍＭ，2.5ｍＭ）、もしくは無関係のペプチドと共に培養された。
【００４８】
図５に示すように19.6.47Ｔ細胞はCryj1301-321（DVFYNGAYFVSSGKYEGGNIF)と反応するだけでなく、精製Cry j Ｉとも濃度依存性に増殖反応を示した。従って、19.6.47Ｔ細胞は生体内では天然リガンドとしてスギ花粉の３０２−３１０位のペプチドを認識していると考えられた。
【００４９】
このようにして、Ｘ19ペプチド用いて末梢のＣＤ４メモリーＴ細胞のクローンの拡大を誘導し、更にその認識エピトープをコンビナトリアルペプチドライブラリーを使用することにより末梢のＣＤ４メモリーＴ細胞のクローンの拡大を誘導し、そのリガンドも同定することが出来た。
【００５０】
【発明の効果】
本発明は、これまで同定できなかった末梢血や組織由来の特異性不明のＴ細胞の抗原ペプチドの配列を決定することが可能とするものである。詳細には、得られた抗原特異性不明のメモリーＴ細胞を増殖させ、そのペプチドリガンドを同定することにより、自己免疫疾患に関与したＴ細胞の認識エピトープや抗腫瘍活性を有するＣＤ４Ｔ細胞によって認識されるペプチドリガンドの同定を可能にする。同定されたペプチドリガンドにより、Ｔ細胞が認識する天然リガンドを同定もしくは類推できるようになる。その結果、自己免疫疾患の特異免疫療法や悪性腫瘍の腫瘍免疫療法に新たな道が開かれうる。さらに、本発明の方法は感染症に対する感染防御ペプチドの同定にも有効な手段となりうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｘｎペプチドを用いたＴ細胞の増殖効果を示す図。Ａ：ＩＬ−２非存在下、Ｂ：ＩＬ−２存在下。Ｘｎペプチドの濃度：黒棒（２５０μＭ）、斜線棒（６２μＭ）、白抜き棒（１６μＭ）。
【図２】 Ｘ19ペプチドを用いたＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の増殖効果及び抗ＭＨＣ抗体のＴ細胞増殖に及ぼす影響を示す図。ＤＲ：抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体，ＤＱ：抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体，ＤＰ：抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体、class II：抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体及び抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体の混合物，class Ｉ：抗ヒトＭＨＣクラスＩ抗体，control：コントロールマウスIgＧ抗体。Ｘｎペプチドの濃度：黒棒（３０μｇ／ｍｌ）、斜線棒（１０μｇ／ｍｌ）。全てのデータは３重測定の平均値標準偏差である。
【図３】 末梢血単核細胞から分離したＴ細胞クローンの認識リガンドをコンビナトリアルペプチドライブラリー（ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫ）を用いたポジショナルスキャンニングによる解析結果を示す図。
【図４】 末梢血単核細胞から分離したＴ細胞クローンの認識リガンドをコンビナトリアルペプチドライブラリー（ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫ）を用いたポジショナルスキャンニングによる解析結果を示す図。
【図５】 分離したＴ細胞クローン（19.6.47）が認識すると推定されたスギ花粉及び対応ペプチドに対する増殖応答を示す図。精製Cry j Ｉ蛋白（黒棒：50μg／ml，斜線棒：5.0μg／ml，白抜き棒：0.5μg／ml）、Cry j Ｉ p301-321（黒棒：250μＭ，斜線棒：25μＭ，白抜き棒：2.5μＭ）、irrelevant：無関係のペプチド（VPIQRAVYQNVVVNN）。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は特異性が不明の末梢のメモリーＴ細胞をコンビナトリアルペプチドライブラリーを用いて刺激、増殖、クローン化し、そのクローンのペプチドリガンドを同定する新規な方法を開示する。この方法により、自己免疫疾患に関与したＴ細胞の認識エピトープや悪性腫瘍におけるＴ細胞によって認識されるペプチドリガンドの同定が可能になる。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
自己免疫疾患の病態形成には、自己反応性T細胞の活性化が重要な役割を果たし、それらの活性化されたＴ細胞を中心に産生されるサトカインや炎症性メディエーターが組織傷害等を導いていると考えられている。従来これらの活性化するＴ細胞全体やサイトカイン、炎症性メディエーターを広範囲にまた非特異的に抑制することによる治療薬の開発、適用が広く行われてきた。
【０００３】
一方、特異的免疫療法が究極の治療法として着目されている。すなわち、末梢に存在するＴ細胞が認識するペプチドリガンドを同定することが出来れば、自己免疫疾患の発症原因となっているＴ細胞が認識する抗原のエピトープを探しだし、そのＴ細胞を標的にした特異的な免疫療法の開発に道を開く事が出来る。また、悪性腫瘍免疫においてはその腫瘍細胞を特異的に攻撃するＴ細胞を活性化する特異免疫療法の開発が可能になると考えられる。しかしながら、患者に特異的な抗原、特にＴ細胞によって認識される抗原のアミノ酸配列をいかにして同定するかが大きな課題となっていた。
【０００４】
Ｔ細胞の認識するペプチドリガンドの同定方法の開発については、多くの努力が払われてきた。従来報告されているＴ細胞クローンの認識エピトープを同定する場合には、確立の過程で予想される特定の抗原を予め添加しておき、その天然抗原に対して応答するＴ細胞クローンのみを増殖させる手法が取られてきた。しかしながら、この方法では特定の予想した抗原を認識するＴ細胞クローンのみしか増殖できず、またその抗原を認識するＴ細胞が含まれない場合は、増殖するＴ細胞が全く得られないことになる。
【０００５】
さらに、クローン化されたＴ細胞の認識するペプチドリガンドを同定する方法として、ペプチドライブラリーを用いた方法が、Y. Tanaka, H. Ohyama, M. Ogawa,Y. Nishimura 「コンビナトリアルペプチドライブラリーおよびマススペクトルを用いた自己K-ras反応性CD4+Ｔ細胞クローンに対するペプチドスーパーアゴニストの同定」J. Immunol., 162: 7155-7161（1999）やB. Hemmer, B. T. Fleckenstein, M. Vergelli, G. Jung, H. McFarlandら「ヒト自己反応性クラスII拘束性Ｔ細胞クローンの高効率細菌性及び自己リガンドの同定」J. Exp. Med., 185: 1651-1659（1997）等により報告されている。
【０００６】
しかしながら、特異性が不明な末梢のＴ細胞については、まずクローンとして確立する事自体が困難であり、評価するに充分な量の細胞を得られるように増殖させることが困難であった。その解決策としてＩＬ−２存在下に、固相化抗ＣＤ３抗体でＴ細胞を刺激する試みも行われてきたが、長期間維持するのが困難であった。これは、その抗原提示細胞−ペプチド−Ｔ細胞相互作用を介した生理的な抗原提示細胞の応答の欠落によるものと推定されている。
【０００７】
以上のように特異性が不明な末梢のＴ細胞を増殖、クローン化し、更にそのＴ細胞の認識エピトープを効率的に解析する方法は未だ考案されていない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
このような状況を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、末梢血由来のメモリーＴ細胞を、インターロイキン存在下、コンビナトリアルランダムペプチドライブラリー（Ｘｎペプチド）を用いて刺激、増殖させ、Ｔ細胞クローンを分離する行程、さらに分離されたＴ細胞クローンの認識エピトープをペプチドライブラリーによるコンビナトリアルアッセイにより、活性化能を有するペプチドを同定する行程からなるＴ細胞エピトープの解析方法を見出し、本発明を完成するに至った。本発明に従い同定されるペプチド配列をもとにタンパク質の配列情報データベース等を用いて、分離したＴ細胞の認識する関連する天然ペプチドリガンドを同定することが可能となる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の主な構成要件は、末梢血または組織由来の特異性不明のＴ細胞を、コンビナトリアルランダムペプチドライブラリー（Ｘｎペプチドライブラリー）、インターロイキン及び前記Ｔ細胞と同一個体由来のＤＮＡ合成を停止させた主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII抗原発現細胞、さらに選択的にアゴニスト活性を有する抗ＣＤ２９抗体の存在下、共培養することからなる特異性不明のＴ細胞クローンの増殖方法、及び当該方法に従い増殖された特異性不明のＴ細胞クローンについて、コンビナトリアルペプチドライブラリーに対する反応性を調べることを特徴とする特異性不明のＴ細胞クローンの認識エピトープまたは当該Ｔ細胞により認識されるペプチドリガンドの同定方法である。
【００１０】
まず、Ｔ細胞クローンの増殖方法において使用されるＴ細胞は、特異性が明らかでないＴ細胞であれば特に限定されるものではない。そのようなＴ細胞は、末梢血、臓器、リンパ節などより得ることができる。
【００１１】
Ｘｎペプチドライブラリーは、システインを除く１９種の天然アミノ酸が任意にｎ個（ｎ＝９，１１，１３，１５，１７，１９）繋がったペプチドライブラリーで、主にコンビナトリアルなペプチド合成法で合成できるが、１９種の天然アミノ酸が任意に含まれる物であれば、その合成手法は特に制限されない。
また、Ｘｎペプチドは大腸菌やファージ、酵母を用いて生物的に発現させたペプチドライブラリーを精製して用いた場合も、ランダムな配列を有するライブラリーであれば同様に使用可能である。
使用されるＸｎペプチドライブラリーは、Ｘ17及びＸ19において高いＴ細胞増殖活性が認められ、特にＸ19が顕著な増殖活性を示した。Ｘｎペプチドの好適な濃度としては１〜１０００μＭであり、さらに６２〜２５０μＭが好適な条件である。
【００１２】
次に添加されるインターロイキンとしては、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン（ＩＬ−１５）が組み合わて使用される。また、インターロイキン−２（以下、ＩＬ−２）を単独で使用しても効果が認められる。さらに、上記インターロイキンを組み合わせて使用することも可能である。
【００１３】
また、前記ＭＨＣクラスII抗原発現細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ＭＨＣクラスII抗原を発現するように遺伝子組換えが行われた形質転換細胞または不死化Ｂ細胞などが選択使用され、これらはいずれもＴ細胞と同一個体由来のものが使用される。さらに、これらの細胞は、マイトマイシンＣ等の細胞分裂阻害剤や放射線照射で処理することにより、ＤＮＡ合成を停止させたものが培養液中に添加される。
【００１４】
さらに、培養液中にアゴニスト活性を有する抗ＣＤ２９抗体を添加することにより、Ｔ細胞のクローナルな増殖の効率が高まり、かつＸ19反応性のＴ細胞を増殖できることが確認できた。使用される抗ＣＤ２９抗体は、定法に従い得られるもので、アゴニスト活性を有するものであれば特に限定されるものではない。
【００１５】
上記の増殖方法により特異性不明のＴ細胞クローンを大量に増殖することが可能となる。本方法を用いた場合、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（以下、ＣＤ４Ｔ細胞と称することもある）を特異的に増殖できることが明らかとなった。また、増殖応答しているＣＤ４Ｔ細胞の種類を評価した結果、メモリーＴ細胞が増殖応答していることが明らかとなった。
【００１６】
次に上記の増殖方法により増殖された特異性不明のＴ細胞クローンについて、当該Ｔ細胞クローンの認識するエピトープまたは当該Ｔ細胞により認識されるペプチドリガンドの同定方法が確立された。
すなわち、得られたＴ細胞クローンを、ＩＬ−２及び前記Ｔ細胞と同一個体由来のＤＮＡ合成を停止させたＭＨＣクラスII抗原発現細胞の存在下、Ｘｎペプチドライブラリーを用いたポジショナルスキャニングを行い、任意のアミノ酸（システインを除く１９種の天然アミノ酸）をとりうるＸｎペプチド内の各ポジションにおいて増殖活性化能を示すアミノ酸を評価することにより、活性化能を有するペプチド配列を特定することが可能となった。
【００１７】
Ｘｎペプチドのｎ数は対象となるＴ細胞により適宜選択されるものであり、特に限定はされないが、本発明ではＸ９をベースにしたＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫ（配列表配列番号１）とＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫ（配列表配列番号２）（Ｘはシステインを除く１９種の天然アミノ酸；Ｋはリジン；Ｇはグリシン）を用いた。
【００１８】
上記に従い特定されたペプチド配列が、Ｔ細胞クローンにより認識されるペプチドリガンドである。当該ペプチドリガンドが何に基づくものかをパターンマッチサーチを用いた検索により見出すことができる。この結果、特異性不明のＴ細胞クローンが認識するペプチドリガンドの同定が可能となる。
【００１９】
【実施例】
《実施例１：ペプチドライブラリーの合成》
９６ウェルペプチド合成機モデルSRM96A（島津製作所）を用いて、Fmocペプチド合成法を用いて合成した。ランダムペプチドライブラリーの場合、システインを除く１９種のFmoc-Lアミノ酸の等モル混合物を１つの結合位置に対して２回の結合反応を行った。アミノ酸の結合反応の終了したコンビナトリアルランダムペプチドライブラリーは２−メチルインドールで樹脂から切り出し、氷温に冷却した無水エチルエーテルで沈殿後、洗浄を5回おこなった。ペプチドの沈殿を窒素ガス雰囲気下で乾燥後、トリフルオロ酢酸に溶解し、エチルエーテル沈殿後、再度乾燥させた。調製したペプチドは０．０１Ｎ塩酸を含む５０％アセトニトリルに溶解後、凍結乾燥させた。乾燥後、秤量したペプチドは無水ジメチルスルホキシドに５０ｍＭになるように（アミノ酸の平均分子量を１１０と仮定して）溶解し、−８０℃に保存した。培養に使用するときには、ペプチド溶液を培養メディウムで１ｍＭになるように希釈し、遠心して沈殿物を除去後、０．４５μｍのフィルターで滅菌濾過して、試験に供した。
【００２０】
《実施例２：ペプチドライブラリーの解析》
合成したＸ19コンビナトリアルランダムペプチドライブラリーの凍結乾燥品を１００μＬの蒸留水に溶解後、遠心して沈殿物を除去した。塩酸加水分解反応２１時間後のサンプルを２０μＬ用いて、反応試薬２０μＬ、バッファー６０μＬと反応後、その２０μＬをＨＰＬＣでアミノ酸組成分析を行った。
【００２１】
アスパラギン酸＋アスパラギンは１０．７ｐmol、セリンは４３．０ｐmol、グルタミン酸＋グルタミンは５８．８ｐmol、グリシンは６８．５ｐmol、ヒスチジンは２２．１ｐmol、アルギニンは５．９ｐmol、スレオニンは３４．０ｐmol、アラニンは６３．５ｐmol、プロリンは１３．５ｐmol、チロシンは３８．５ｐmol、バリンは８４．２ｐmol、メチオニンは３１．１ｐmol、リジンは４５．９ｐmol、イソロイシンは８．９ｐmol、ロイシンは６６．１ｐmol、フェニルアラニンは３．８ｐmol含有されていると解析された。この方法で分析できないトリプトファンを除く、１８種のアミノ酸が全てほぼ同等に含まれていることが確認できた。
【００２２】
また、合成したＸ19コンビナトリアルランダムペプチドライブラリーのＮ末端から３番目までのアミノ酸をプロテインシークエンサーModel492（アプライドバイオシステムズ社）でエドマン分解法により解析した結果、Ｎ末端から３番目までの各位置には１９種全てのアミノ酸が含まれていることが確認できた。
【００２３】
《実施例３：マイトマイシンＣによる末梢血単核細胞の処理》
５〜１０×１０6個／ｍｌの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を２０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを含んだ培養液（RPMI1640培地に２ｍＭ L-グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％の加熱不活化自己血漿を含む）中で撹拌しながら、２時間培養した。RPMI1640培地で２回洗浄後、培養液中で更に３〜５時間培養した。細胞を回収後、RPMI1640培地で２回洗浄し、以後の試験に用いた。
【００２４】
《実施例４：ペプチドの長さによるＴ細胞の増殖刺激活性の違いについて》
アミノ酸の長さによる効果を検討する目的で、９,１１,１３,１５,１７,１９個の長さを有するランダムなアミノ酸配列からなるペプチドＸｎ（ｎはアミノ酸の個数を表す）を作製した。これらのペプチドの１６、６２、２５０μＭ存在下と、対照として無関係なペプチド（VPIQRAVYQNVVVNN）と細胞活性化のための陽性対照ＰＭＡ（Pholborl Myristic Acetate：１ng／ml）とionomycin（0.3ｍＭ）、培地のみを設定した。
【００２５】
１．５×１０5／ウェルの健常人由来ＰＢＭＣをＩＬ−２存在下、或いは非存在下、これらのペプチドの１６、６２、２５０μＭ存在下、もしくは無関係なペプチド（VPIQRAVYQNVVVNN）或いは細胞活性化のための陽性対照ＰＭＡとionomycin存在下、その増殖応答を調べた。
【００２６】
ＩＬ−２添加群では、培養４日目にＩＬ−２を添加し、また全ての群には培養６日目に3Ｈチミジンを添加して、増殖応答について調べた。図１Ａに示すようにＸ17とＸ19が高濃度で弱い増殖応答を示した他は顕著な増殖応答は示さなかった。しかしながら、ＩＬ−２を添加した場合、Ｘ19のように長いペプチドは濃度依存的に強い増殖応答を示した（図１Ｂ）。
【００２７】
また、増殖応答を示したＴ細胞のサブポピュレーションはＣＤ４Ｔ細胞であった（図２）。これらの増殖応答は、ヒトＭＨＣクラスIIに対するモノクローナル抗体（抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体）を添加することで濃度依存的に抑制され、特に抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の効果が強いことが明らかになった。更に、これらのモノクローナル抗体を混合して使用することにより、その効果は飽和した。またこの効果はＭＨＣクラスＩに対する抗体では認められなかった。
【００２８】
《実施例５：ヒトＴ細胞クローンの増殖応答評価》
ヒトＣＤ４Ｔ細胞クローンとして、OT1.1（DP5拘束性にp53p153-165ペプチドを認識）、T31.1（DP5拘束性にTEL/AML-1ペプチドを認識）、DT13.2（DQ6拘束性にDer f Ip18-31ペプチドを認識）、SK2.11（DQ6拘束性にAchRp75-87ペプチドを認識）、29.28.1（DR8拘束性にRasp3-20ペプチドを認識）、29.15.2（DR51拘束性にRasp3-20ペプチドを認識）、MK20.2（DR53拘束性にGADp111-131ペプチドを認識）、HY6.22（DR4拘束性にDer f Ip82-94ペプチドを認識）、YT15.1（DR15拘束性にBCGap84-100ペプチドを認識）、SF36.16（DR4拘束性にBCGap84-100ペプチドを認識）、BC20.7（DR14拘束性にBCGap84-100ペプチドを認識）、BC33.5（DR14拘束性にBCGap84-100ペプチドを認識）、BC42.1（DR14拘束性にBCGap84-100ペプチドを認識）を用いた。
【００２９】
ヒトＴ細胞クローンを５０Ｕ／mlのヒト組換えＩＬ−２とそのＴ細胞が認識する本来のペプチドを加えた放射線処理した対応する自己ＰＢＭＣで弱く刺激した。Ｔ細胞クローンのＸ19ペプチドによる増殖は、２×１０4個／ウエルの被験Ｔ細胞を２０Ｕ／mlのヒト組換えＩＬ−２とマイトマイシンＣ処理した１×１０5個／ウエルの自己ＰＢＭＣを含む培養液（RPMI1640培地に２ｍＭ L-グルタミン、１００Ｕ／mlのペニシリン、１００μg／mlのストレプトマイシン、１０％の加熱不活化自己血漿を含む）中で、２５０μＭのＸ19存在下もしくは非存在下、９６ウエル平底培養プレートを用いて評価した。７２時間の増殖応答試験の内、最後の１６時間は１μCi／ウエルの3Ｈチミジンを添加した。
【００３０】
表１に示すように、OT1.1とT31.1の様にＨＬＡ拘束性が同じで特異性が異なるＴ細胞クローン間でも、Ｘ19存在下で明らかな増殖応答を示した。また、29.28.1と29.15.2、YT15.1とSF36.16とBC20.7の様に同じペプチドを認識するが異なるＨＬＡ拘束性を有するＴ細胞クローン間でもＸ19存在下で明らかな増殖応答が認められた。更に、BC20.7、BC33.5、BC42.1の様に同一のペプチドを認識し、またＨＬＡ拘束性も同一であるが用いるＶβ鎖が異なるＴ細胞クローン間でもＸ19存在下で明らかな増殖応答が認められた。
【００３１】
【表１】
《実施例６：ヒト末梢血Ｔ細胞集団の調製》
末梢血Ｔ細胞集団の調製はStemsep Kits（ステムセル テクノロジー社）を用いた。対応する健常成人よりFicoll-Paqueを用いてＰＢＭＣを用事調製し、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６とグリコフォリンＡに対する抗体結合−磁性粒子の混合物と共に培養した。磁性カラムを用いて抗体結合細胞を取り除き、ＣＤ４陽性Ｔ（ＣＤ４Ｔ）細胞を調製した。分離した細胞の９５％以上がＣＤ４Ｔ細胞であることが確認できた。
【００３３】
メモリーＴ細胞の調製には抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を、ナイーブＴ細胞の調製には抗ＣＤ４５ＲＯ抗体を上記の抗体混合物に加えて使用することにより調製した。
【００３４】
《実施例７：ＣＤ４Ｔ細胞の効率的な増殖条件の検討》
３×１０4／ウエルのマイトマイシンＣ処理ＰＢＭＣを播いて置いたテラサキプレートのウエルに、ＰＢＭＣから分離したＣＤ４Ｔ細胞を１個／ウエルになるように加えた。
培養液中には、Ｘ19（２５０μＭ）、ＩＬ−２（５０Ｕ／ml）、ＩＬ−４（１０Ｕ／ml）、ＩＬ−７（５０Ｕ／ml）、ＩＬ−９（５０Ｕ／ml）、ＩＬ−１５（１ｎg／ml）、抗ＣＤ２９抗体ＭＡＲ４（2.5μg／ml）を種々の組み合わせで添加した。これらの細胞の培養開始後７日後に、細胞増殖を顕微鏡観察により評価した。
増殖が認められたウエルは、更にマイトマイシンＣ処理ＰＢＭＣを播いて置いた９６ウエルプレートにＸ19及びＩＬ−２存在下、７日間培養し、増殖試験を行った。stimulation index （cpm with IL-2 + X19／cpm with IL-2 only）が２．０以上を示したウエルを「Ｘ19反応性」と評価した。これらの実験の結果を表２にまとめる。
【００３５】
実験１では、各インターロイキンの組み合わせ添加による増殖効果を比較検討し、Ｘ19と共にＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５を添加することによりＣＤ４Ｔ細胞の増殖効率並びにＸ19との反応性が高くなることが明らかになった。
【００３６】
更に実験２で、この組み合わせに、アゴニスティックな活性を有する抗ＣＤ２９抗体を添加すると、ＣＤ４Ｔ細胞のクローナルな増殖の効率は高まり、しかもＸ19反応性のＣＤ４Ｔ細胞を増殖できることが確認できた。
【００３７】
実験３では増殖応答しているＣＤ４Ｔ細胞の種類を評価した。その結果、メモリーＴ細胞がこれらの刺激で増殖応答していることが明らかに出来た。
【００３８】
【表２】
《実施例８：クローン化されたＴ細胞のペプチドリガンドの同定法》
実施例７でＰＢＭＣから直接得られたクローン化されたＴ細胞クローンのペプチドリガンドを同定するために、Ｘ９をベースにした
ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫ（配列表配列番号１）、または
ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫ（配列表配列番号２）の二つのコンビナトリアルペプチドライブラリーを用いて、増殖刺激活性を調べた（Ｘはシステインを除く１９種の天然アミノ酸；Ｋはリジン；Ｇはグリシン）。使用されたペプチドの濃度は２５０μＭで、ＩＬ−２及びマイトマイシンＣ処理ＰＢＭＣ存在下で評価を行った。
【００４０】
それぞれのＴ細胞クローンは上記２種のＸ９をベースにしたコンビナトリアルペプチドに対してＩＬ−２依存的に増殖した。充分な増殖性を示した19.6.47Ｔ細胞を用いて得られた反応パターンを図３及び４に示す。
【００４１】
図３に示すように、ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫの場合、２位のチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）が、３位でのチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、４位でのアスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、５位および６位でのグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、７位でのプロリン（Ｐｒｏ）、８位でのチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、９位でのロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）が効率よく増殖応答を誘導した。
【００４２】
また、図４に示すように、ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫの場合も同じ様な結果が得られたが、８位ではフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、メチオニン（Ｍｅｔ）が増殖応答を誘導したが、９位ではグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）が増殖応答を刺激した。
【００４３】
これらの結果から、
Ｘ２：Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ
Ｘ３：Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ
Ｘ４：Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ
Ｘ５：Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ
Ｘ６：Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ
Ｘ７：Ｐｒｏ
Ｘ８：Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ
Ｘ９：Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ
の組み合わせの中から選ばれるペプチドがこのＴ細胞クローンにより認識されるペプチドリガンドであると考えられた。
【００４４】
これらの結果を基に、パターンマッチサーチによりSWISS-PLOTとTrMBLを用いて検索した。８残基のうち７残基マッチでピックアップした結果、表３に示す３種の非自己配列が得られた。
【００４５】
【表３】
19.6.47Ｔ細胞の供与者はスギ花粉症患者であり、また、19.6.47の樹立はスギ花粉飛散後期に行われたため、表３に示したいくつかの非自己ペプチドのうち、Cry j I断片（p324-331）に反応する可能性が高いと考え、この部分を含む合成ペプチド（Cry j Ip301-321）とCry j I 精製蛋白に対する19.6.47の反応性を観察した。
【００４７】
Ｔ細胞クローン（19.6.47）を、放射線照射された（45Gy）ＰＢＭＣと精製Cry j Ｉ蛋白（50，5.0，0.5mg／ml）、Cry j Ｉ p301-321（250ｍＭ，25ｍＭ，2.5ｍＭ）、もしくは無関係のペプチドと共に培養された。
【００４８】
図５に示すように19.6.47Ｔ細胞はCryj1301-321（DVFYNGAYFVSSGKYEGGNIF)と反応するだけでなく、精製Cry j Ｉとも濃度依存性に増殖反応を示した。従って、19.6.47Ｔ細胞は生体内では天然リガンドとしてスギ花粉の３０２−３１０位のペプチドを認識していると考えられた。
【００４９】
このようにして、Ｘ19ペプチド用いて末梢のＣＤ４メモリーＴ細胞のクローンの拡大を誘導し、更にその認識エピトープをコンビナトリアルペプチドライブラリーを使用することにより末梢のＣＤ４メモリーＴ細胞のクローンの拡大を誘導し、そのリガンドも同定することが出来た。
【００５０】
【発明の効果】
本発明は、これまで同定できなかった末梢血や組織由来の特異性不明のＴ細胞の抗原ペプチドの配列を決定することが可能とするものである。詳細には、得られた抗原特異性不明のメモリーＴ細胞を増殖させ、そのペプチドリガンドを同定することにより、自己免疫疾患に関与したＴ細胞の認識エピトープや抗腫瘍活性を有するＣＤ４Ｔ細胞によって認識されるペプチドリガンドの同定を可能にする。同定されたペプチドリガンドにより、Ｔ細胞が認識する天然リガンドを同定もしくは類推できるようになる。その結果、自己免疫疾患の特異免疫療法や悪性腫瘍の腫瘍免疫療法に新たな道が開かれうる。さらに、本発明の方法は感染症に対する感染防御ペプチドの同定にも有効な手段となりうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｘｎペプチドを用いたＴ細胞の増殖効果を示す図。Ａ：ＩＬ−２非存在下、Ｂ：ＩＬ−２存在下。Ｘｎペプチドの濃度：黒棒（２５０μＭ）、斜線棒（６２μＭ）、白抜き棒（１６μＭ）。
【図２】 Ｘ19ペプチドを用いたＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の増殖効果及び抗ＭＨＣ抗体のＴ細胞増殖に及ぼす影響を示す図。ＤＲ：抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体，ＤＱ：抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体，ＤＰ：抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体、class II：抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体及び抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体の混合物，class Ｉ：抗ヒトＭＨＣクラスＩ抗体，control：コントロールマウスIgＧ抗体。Ｘｎペプチドの濃度：黒棒（３０μｇ／ｍｌ）、斜線棒（１０μｇ／ｍｌ）。全てのデータは３重測定の平均値標準偏差である。
【図３】 末梢血単核細胞から分離したＴ細胞クローンの認識リガンドをコンビナトリアルペプチドライブラリー（ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫ）を用いたポジショナルスキャンニングによる解析結果を示す図。
【図４】 末梢血単核細胞から分離したＴ細胞クローンの認識リガンドをコンビナトリアルペプチドライブラリー（ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫ）を用いたポジショナルスキャンニングによる解析結果を示す図。
【図５】 分離したＴ細胞クローン（19.6.47）が認識すると推定されたスギ花粉及び対応ペプチドに対する増殖応答を示す図。精製Cry j Ｉ蛋白（黒棒：50μg／ml，斜線棒：5.0μg／ml，白抜き棒：0.5μg／ml）、Cry j Ｉ p301-321（黒棒：250μＭ，斜線棒：25μＭ，白抜き棒：2.5μＭ）、irrelevant：無関係のペプチド（VPIQRAVYQNVVVNN）。
【配列表】
Claims (10)
- 特異性不明のＣＤ４陽性Ｔ細胞を、
（ａ）システインを除く１９種の天然アミノ酸からなるペプチドのコンビナトリアルランダムペプチドライブラリー（Ｘｎペプチドライブラリー(ｎはアミノ酸の個数）で、当該ＸｎペプチドライブラリーがＸ17またはＸ19から選択されるいずれか一つのＸｎペプチドライブラリー、
（ｂ）(1)インターロイキン−２（ＩＬ−２）、(2)インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）及びインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の組み合わせ、または(3)ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９及びＩＬ−１５の組み合わせのいずれかから選択されるインターロイキン、
（ｃ）前記Ｔ細胞と同一個体由来のＤＮＡ合成を停止させた主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII抗原発現細胞、および
（ｄ）アゴニスト活性を有する抗ＣＤ２９抗体
と共に培養することを特徴とする特異性不明のＣＤ４陽性Ｔ細胞のクローン化法。 - 当該Ｘｎペプチドライブラリーが、Ｘ19である請求項１記載のクローン化法。
- 当該Ｘｎペプチドライブラリーの濃度が、１〜１０００μＭである請求項１または２に記載のクローン化法。
- 当該Ｘｎペプチドライブラリーの濃度が、６２〜２５０μＭである請求項３に記載のクローン化法。
- 当該インターロイキンが、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）及びインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を組み合わせて添加する請求項１に記載のクローン化法。
- 当該インターロイキンが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）である請求項１記載のクローン化法。
- 当該インターロイキンが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９及びＩＬ−１５を組み合わせて添加する請求項１に記載のクローン化法。
- 当該ＭＨＣクラスII抗原発現細胞が、末梢血単核細胞、ＭＨＣクラスII抗原を発現するように遺伝子組換えが行われた形質転換細胞または不死化Ｂ細胞から選択される請求項１に記載のクローン化法。
- 請求項１から８に記載のクローン化法により得られる特異性不明のＴ細胞クローンを、ＩＬ−２及び前記Ｔ細胞と同一個体由来のＤＮＡ合成を停止させたＭＨＣクラスII抗原発現細胞の存在下、Ｘ９をベースとしたＫＧＸ 1 Ｘ ２ Ｘ ３ Ｘ ４ Ｘ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ Ｘ ８ Ｘ ９ ＧＫ（配列表配列番号１）またはＫＧＸ 1 Ｘ ２ Ｘ ３ Ｘ ４ Ｘ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ Ｘ ８ Ｘ ９ ＧＫＧＫＫ（配列表配列番号２）（Ｘはシステインを除く１９種の天然アミノ酸；Ｋはリジン；Ｇはグリシン）から選択されるＸｎペプチドライブラリーを用いて増殖刺激活性を調べ、増殖応答が見られたペプチドを基に、パターンマッチサーチにより、当該Ｔ細胞クローンが認識するペプチドリガンドを同定する方法。
- 当該ＭＨＣクラスII抗原発現細胞が、末梢血単核細胞、ＭＨＣクラスII抗原を発現するように遺伝子組換えが行われた形質転換細胞または不死化Ｂ細胞から選択される請求項９に記載の同定方法。
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