JP2002272455A - 特異性不明のｔ細胞のクローン化法及びその認識ペプチドリガンドの同定方法 - Google Patents
特異性不明のｔ細胞のクローン化法及びその認識ペプチドリガンドの同定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 特異性不明のＴ細胞のクローン化
法及びその認識ペプチドリガンドの同定方法を提供す
る。 【解決手段】 特異性不明のＴ細胞を、システイ
ンを除く１９種の天然アミノ酸からなるペプチドのコン
ビナトリアルランダムペプチドライブラリー（Ｘｎペプ
チドライブラリー(ｎはアミノ酸の個数)）、インターロ
イキン、前記Ｔ細胞と同一個体由来のＤＮＡ合成を停止
させた主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII抗
原発現細胞と共に培養することを特徴とする特異性不明
のＴ細胞のクローン化法、及びより得られるＴ細胞クロ
ーンを、インターロイキン及び前記Ｔ細胞と同一個体由
来のＤＮＡ合成を停止させたＭＨＣクラスII発現細胞の
存在下、Ｘｎペプチドライブラリーを用いて増殖刺激活
性を調べることにより、当該Ｔ細胞クローンが認識する
ペプチドリガンドを同定する方法。
法及びその認識ペプチドリガンドの同定方法を提供す
る。 【解決手段】 特異性不明のＴ細胞を、システイ
ンを除く１９種の天然アミノ酸からなるペプチドのコン
ビナトリアルランダムペプチドライブラリー（Ｘｎペプ
チドライブラリー(ｎはアミノ酸の個数)）、インターロ
イキン、前記Ｔ細胞と同一個体由来のＤＮＡ合成を停止
させた主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII抗
原発現細胞と共に培養することを特徴とする特異性不明
のＴ細胞のクローン化法、及びより得られるＴ細胞クロ
ーンを、インターロイキン及び前記Ｔ細胞と同一個体由
来のＤＮＡ合成を停止させたＭＨＣクラスII発現細胞の
存在下、Ｘｎペプチドライブラリーを用いて増殖刺激活
性を調べることにより、当該Ｔ細胞クローンが認識する
ペプチドリガンドを同定する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は特異性が不明の末梢
のメモリーＴ細胞をコンビナトリアルペプチドライブラ
リーを用いて刺激、増殖、クローン化し、そのクローン
のペプチドリガンドを同定する新規な方法を開示する。
この方法により、自己免疫疾患に関与したＴ細胞の認識
エピトープや悪性腫瘍におけるＴ細胞によって認識され
るペプチドリガンドの同定が可能になる。
のメモリーＴ細胞をコンビナトリアルペプチドライブラ
リーを用いて刺激、増殖、クローン化し、そのクローン
のペプチドリガンドを同定する新規な方法を開示する。
この方法により、自己免疫疾患に関与したＴ細胞の認識
エピトープや悪性腫瘍におけるＴ細胞によって認識され
るペプチドリガンドの同定が可能になる。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】自己免
疫疾患の病態形成には、自己反応性T細胞の活性化が重
要な役割を果たし、それらの活性化されたＴ細胞を中心
に産生されるサトカインや炎症性メディエーターが組織
傷害等を導いていると考えられている。従来これらの活
性化するＴ細胞全体やサイトカイン、炎症性メディエー
ターを広範囲にまた非特異的に抑制することによる治療
薬の開発、適用が広く行われてきた。
疫疾患の病態形成には、自己反応性T細胞の活性化が重
要な役割を果たし、それらの活性化されたＴ細胞を中心
に産生されるサトカインや炎症性メディエーターが組織
傷害等を導いていると考えられている。従来これらの活
性化するＴ細胞全体やサイトカイン、炎症性メディエー
ターを広範囲にまた非特異的に抑制することによる治療
薬の開発、適用が広く行われてきた。
【０００３】一方、特異的免疫療法が究極の治療法とし
て着目されている。すなわち、末梢に存在するＴ細胞が
認識するペプチドリガンドを同定することが出来れば、
自己免疫疾患の発症原因となっているＴ細胞が認識する
抗原のエピトープを探しだし、そのＴ細胞を標的にした
特異的な免疫療法の開発に道を開く事が出来る。また、
悪性腫瘍免疫においてはその腫瘍細胞を特異的に攻撃す
るＴ細胞を活性化する特異免疫療法の開発が可能になる
と考えられる。しかしながら、患者に特異的な抗原、特
にＴ細胞によって認識される抗原のアミノ酸配列をいか
にして同定するかが大きな課題となっていた。
て着目されている。すなわち、末梢に存在するＴ細胞が
認識するペプチドリガンドを同定することが出来れば、
自己免疫疾患の発症原因となっているＴ細胞が認識する
抗原のエピトープを探しだし、そのＴ細胞を標的にした
特異的な免疫療法の開発に道を開く事が出来る。また、
悪性腫瘍免疫においてはその腫瘍細胞を特異的に攻撃す
るＴ細胞を活性化する特異免疫療法の開発が可能になる
と考えられる。しかしながら、患者に特異的な抗原、特
にＴ細胞によって認識される抗原のアミノ酸配列をいか
にして同定するかが大きな課題となっていた。
【０００４】Ｔ細胞の認識するペプチドリガンドの同定
方法の開発については、多くの努力が払われてきた。従
来報告されているＴ細胞クローンの認識エピトープを同
定する場合には、確立の過程で予想される特定の抗原を
予め添加しておき、その天然抗原に対して応答するＴ細
胞クローンのみを増殖させる手法が取られてきた。しか
しながら、この方法では特定の予想した抗原を認識する
Ｔ細胞クローンのみしか増殖できず、またその抗原を認
識するＴ細胞が含まれない場合は、増殖するＴ細胞が全
く得られないことになる。
方法の開発については、多くの努力が払われてきた。従
来報告されているＴ細胞クローンの認識エピトープを同
定する場合には、確立の過程で予想される特定の抗原を
予め添加しておき、その天然抗原に対して応答するＴ細
胞クローンのみを増殖させる手法が取られてきた。しか
しながら、この方法では特定の予想した抗原を認識する
Ｔ細胞クローンのみしか増殖できず、またその抗原を認
識するＴ細胞が含まれない場合は、増殖するＴ細胞が全
く得られないことになる。
【０００５】さらに、クローン化されたＴ細胞の認識す
るペプチドリガンドを同定する方法として、ペプチドラ
イブラリーを用いた方法が、Y. Tanaka, H. Ohyama, M.
Ogawa,Y. Nishimura 「コンビナトリアルペプチドラ
イブラリーおよびマススペクトルを用いた自己K-ras反
応性CD4+Ｔ細胞クローンに対するペプチドスーパーアゴ
ニストの同定」J. Immunol., 162: 7155-7161（1999）
やB. Hemmer, B. T. Fleckenstein, M. Vergelli, G. J
ung, H. McFarlandら「ヒト自己反応性クラスII拘束性
Ｔ細胞クローンの高効率細菌性及び自己リガンドの同
定」J. Exp. Med.,185: 1651-1659（1997）等により報
告されている。
るペプチドリガンドを同定する方法として、ペプチドラ
イブラリーを用いた方法が、Y. Tanaka, H. Ohyama, M.
Ogawa,Y. Nishimura 「コンビナトリアルペプチドラ
イブラリーおよびマススペクトルを用いた自己K-ras反
応性CD4+Ｔ細胞クローンに対するペプチドスーパーアゴ
ニストの同定」J. Immunol., 162: 7155-7161（1999）
やB. Hemmer, B. T. Fleckenstein, M. Vergelli, G. J
ung, H. McFarlandら「ヒト自己反応性クラスII拘束性
Ｔ細胞クローンの高効率細菌性及び自己リガンドの同
定」J. Exp. Med.,185: 1651-1659（1997）等により報
告されている。
【０００６】しかしながら、特異性が不明な末梢のＴ細
胞については、まずクローンとして確立する事自体が困
難であり、評価するに充分な量の細胞を得られるように
増殖させることが困難であった。その解決策としてＩＬ
−２存在下に、固相化抗ＣＤ３抗体でＴ細胞を刺激する
試みも行われてきたが、長期間維持するのが困難であっ
た。これは、その抗原提示細胞−ペプチド−Ｔ細胞相互
作用を介した生理的な抗原提示細胞の応答の欠落による
ものと推定されている。
胞については、まずクローンとして確立する事自体が困
難であり、評価するに充分な量の細胞を得られるように
増殖させることが困難であった。その解決策としてＩＬ
−２存在下に、固相化抗ＣＤ３抗体でＴ細胞を刺激する
試みも行われてきたが、長期間維持するのが困難であっ
た。これは、その抗原提示細胞−ペプチド−Ｔ細胞相互
作用を介した生理的な抗原提示細胞の応答の欠落による
ものと推定されている。
【０００７】以上のように特異性が不明な末梢のＴ細胞
を増殖、クローン化し、更にそのＴ細胞の認識エピトー
プを効率的に解析する方法は未だ考案されていない。
を増殖、クローン化し、更にそのＴ細胞の認識エピトー
プを効率的に解析する方法は未だ考案されていない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】このような状況を鑑み、
鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、末梢血由来のメ
モリーＴ細胞を、インターロイキン存在下、コンビナト
リアルランダムペプチドライブラリー（Ｘｎペプチド）
を用いて刺激、増殖させ、Ｔ細胞クローンを分離する行
程、さらに分離されたＴ細胞クローンの認識エピトープ
をペプチドライブラリーによるコンビナトリアルアッセ
イにより、活性化能を有するペプチドを同定する行程か
らなるＴ細胞エピトープの解析方法を見出し、本発明を
完成するに至った。本発明に従い同定されるペプチド配
列をもとにタンパク質の配列情報データベース等を用い
て、分離したＴ細胞の認識する関連する天然ペプチドリ
ガンドを同定することが可能となる。
鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、末梢血由来のメ
モリーＴ細胞を、インターロイキン存在下、コンビナト
リアルランダムペプチドライブラリー（Ｘｎペプチド）
を用いて刺激、増殖させ、Ｔ細胞クローンを分離する行
程、さらに分離されたＴ細胞クローンの認識エピトープ
をペプチドライブラリーによるコンビナトリアルアッセ
イにより、活性化能を有するペプチドを同定する行程か
らなるＴ細胞エピトープの解析方法を見出し、本発明を
完成するに至った。本発明に従い同定されるペプチド配
列をもとにタンパク質の配列情報データベース等を用い
て、分離したＴ細胞の認識する関連する天然ペプチドリ
ガンドを同定することが可能となる。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の主な構成要件は、末梢血
または組織由来の特異性不明のＴ細胞を、コンビナトリ
アルランダムペプチドライブラリー（Ｘｎペプチドライ
ブラリー）、インターロイキン及び前記Ｔ細胞と同一個
体由来のＤＮＡ合成を停止させた主要組織適合遺伝子複
合体（ＭＨＣ）クラスII抗原発現細胞、さらに選択的に
アゴニスト活性を有する抗ＣＤ２９抗体の存在下、共培
養することからなる特異性不明のＴ細胞クローンの増殖
方法、及び当該方法に従い増殖された特異性不明のＴ細
胞クローンについて、コンビナトリアルペプチドライブ
ラリーに対する反応性を調べることを特徴とする特異性
不明のＴ細胞クローンの認識エピトープまたは当該Ｔ細
胞により認識されるペプチドリガンドの同定方法であ
る。
または組織由来の特異性不明のＴ細胞を、コンビナトリ
アルランダムペプチドライブラリー（Ｘｎペプチドライ
ブラリー）、インターロイキン及び前記Ｔ細胞と同一個
体由来のＤＮＡ合成を停止させた主要組織適合遺伝子複
合体（ＭＨＣ）クラスII抗原発現細胞、さらに選択的に
アゴニスト活性を有する抗ＣＤ２９抗体の存在下、共培
養することからなる特異性不明のＴ細胞クローンの増殖
方法、及び当該方法に従い増殖された特異性不明のＴ細
胞クローンについて、コンビナトリアルペプチドライブ
ラリーに対する反応性を調べることを特徴とする特異性
不明のＴ細胞クローンの認識エピトープまたは当該Ｔ細
胞により認識されるペプチドリガンドの同定方法であ
る。
【００１０】まず、Ｔ細胞クローンの増殖方法において
使用されるＴ細胞は、特異性が明らかでないＴ細胞であ
れば特に限定されるものではない。そのようなＴ細胞
は、末梢血、臓器、リンパ節などより得ることができ
る。
使用されるＴ細胞は、特異性が明らかでないＴ細胞であ
れば特に限定されるものではない。そのようなＴ細胞
は、末梢血、臓器、リンパ節などより得ることができ
る。
【００１１】Ｘｎペプチドライブラリーは、システイン
を除く１９種の天然アミノ酸が任意にｎ個（ｎ＝９，１
１，１３，１５，１７，１９）繋がったペプチドライブ
ラリーで、主にコンビナトリアルなペプチド合成法で合
成できるが、１９種の天然アミノ酸が任意に含まれる物
であれば、その合成手法は特に制限されない。また、Ｘ
ｎペプチドは大腸菌やファージ、酵母を用いて生物的に
発現させたペプチドライブラリーを精製して用いた場合
も、ランダムな配列を有するライブラリーであれば同様
に使用可能である。使用されるＸｎペプチドライブラリ
ーは、Ｘ17及びＸ19において高いＴ細胞増殖活性が認め
られ、特にＸ19が顕著な増殖活性を示した。Ｘｎペプチ
ドの好適な濃度としては１〜１０００μＭであり、さら
に６２〜２５０μＭが好適な条件である。
を除く１９種の天然アミノ酸が任意にｎ個（ｎ＝９，１
１，１３，１５，１７，１９）繋がったペプチドライブ
ラリーで、主にコンビナトリアルなペプチド合成法で合
成できるが、１９種の天然アミノ酸が任意に含まれる物
であれば、その合成手法は特に制限されない。また、Ｘ
ｎペプチドは大腸菌やファージ、酵母を用いて生物的に
発現させたペプチドライブラリーを精製して用いた場合
も、ランダムな配列を有するライブラリーであれば同様
に使用可能である。使用されるＸｎペプチドライブラリ
ーは、Ｘ17及びＸ19において高いＴ細胞増殖活性が認め
られ、特にＸ19が顕著な増殖活性を示した。Ｘｎペプチ
ドの好適な濃度としては１〜１０００μＭであり、さら
に６２〜２５０μＭが好適な条件である。
【００１２】次に添加されるインターロイキンとして
は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイ
キン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ−
９）、インターロイキン（ＩＬ−１５）が組み合わて使
用される。また、インターロイキン−２（以下、ＩＬ−
２）を単独で使用しても効果が認められる。さらに、上
記インターロイキンを組み合わせて使用することも可能
である。
は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイ
キン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ−
９）、インターロイキン（ＩＬ−１５）が組み合わて使
用される。また、インターロイキン−２（以下、ＩＬ−
２）を単独で使用しても効果が認められる。さらに、上
記インターロイキンを組み合わせて使用することも可能
である。
【００１３】また、前記ＭＨＣクラスII抗原発現細胞と
しては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ＭＨＣクラスII
抗原を発現するように遺伝子組換えが行われた形質転換
細胞または不死化Ｂ細胞などが選択使用され、これらは
いずれもＴ細胞と同一個体由来のものが使用される。さ
らに、これらの細胞は、マイトマイシンＣ等の細胞分裂
阻害剤や放射線照射で処理することにより、ＤＮＡ合成
を停止させたものが培養液中に添加される。
しては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ＭＨＣクラスII
抗原を発現するように遺伝子組換えが行われた形質転換
細胞または不死化Ｂ細胞などが選択使用され、これらは
いずれもＴ細胞と同一個体由来のものが使用される。さ
らに、これらの細胞は、マイトマイシンＣ等の細胞分裂
阻害剤や放射線照射で処理することにより、ＤＮＡ合成
を停止させたものが培養液中に添加される。
【００１４】さらに、培養液中にアゴニスト活性を有す
る抗ＣＤ２９抗体を添加することにより、Ｔ細胞のクロ
ーナルな増殖の効率が高まり、かつＸ19反応性のＴ細胞
を増殖できることが確認できた。使用される抗ＣＤ２９
抗体は、定法に従い得られるもので、アゴニスト活性を
有するものであれば特に限定されるものではない。
る抗ＣＤ２９抗体を添加することにより、Ｔ細胞のクロ
ーナルな増殖の効率が高まり、かつＸ19反応性のＴ細胞
を増殖できることが確認できた。使用される抗ＣＤ２９
抗体は、定法に従い得られるもので、アゴニスト活性を
有するものであれば特に限定されるものではない。
【００１５】上記の増殖方法により特異性不明のＴ細胞
クローンを大量に増殖することが可能となる。本方法を
用いた場合、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（以下、ＣＤ４Ｔ細胞と
称することもある）を特異的に増殖できることが明らか
となった。また、増殖応答しているＣＤ４Ｔ細胞の種類
を評価した結果、メモリーＴ細胞が増殖応答しているこ
とが明らかとなった。
クローンを大量に増殖することが可能となる。本方法を
用いた場合、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（以下、ＣＤ４Ｔ細胞と
称することもある）を特異的に増殖できることが明らか
となった。また、増殖応答しているＣＤ４Ｔ細胞の種類
を評価した結果、メモリーＴ細胞が増殖応答しているこ
とが明らかとなった。
【００１６】次に上記の増殖方法により増殖された特異
性不明のＴ細胞クローンについて、当該Ｔ細胞クローン
の認識するエピトープまたは当該Ｔ細胞により認識され
るペプチドリガンドの同定方法が確立された。すなわ
ち、得られたＴ細胞クローンを、ＩＬ−２及び前記Ｔ細
胞と同一個体由来のＤＮＡ合成を停止させたＭＨＣクラ
スII抗原発現細胞の存在下、Ｘｎペプチドライブラリー
を用いたポジショナルスキャニングを行い、任意のアミ
ノ酸（システインを除く１９種の天然アミノ酸）をとり
うるＸｎペプチド内の各ポジションにおいて増殖活性化
能を示すアミノ酸を評価することにより、活性化能を有
するペプチド配列を特定することが可能となった。
性不明のＴ細胞クローンについて、当該Ｔ細胞クローン
の認識するエピトープまたは当該Ｔ細胞により認識され
るペプチドリガンドの同定方法が確立された。すなわ
ち、得られたＴ細胞クローンを、ＩＬ−２及び前記Ｔ細
胞と同一個体由来のＤＮＡ合成を停止させたＭＨＣクラ
スII抗原発現細胞の存在下、Ｘｎペプチドライブラリー
を用いたポジショナルスキャニングを行い、任意のアミ
ノ酸（システインを除く１９種の天然アミノ酸）をとり
うるＸｎペプチド内の各ポジションにおいて増殖活性化
能を示すアミノ酸を評価することにより、活性化能を有
するペプチド配列を特定することが可能となった。
【００１７】Ｘｎペプチドのｎ数は対象となるＴ細胞に
より適宜選択されるものであり、特に限定はされない
が、本発明ではＸ９をベースにしたＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ
４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫ（配列表配列番号１）とＫ
ＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫ
（配列表配列番号２）（Ｘはシステインを除く１９種の
天然アミノ酸；Ｋはリジン；Ｇはグリシン）を用いた。
より適宜選択されるものであり、特に限定はされない
が、本発明ではＸ９をベースにしたＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ
４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫ（配列表配列番号１）とＫ
ＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫ
（配列表配列番号２）（Ｘはシステインを除く１９種の
天然アミノ酸；Ｋはリジン；Ｇはグリシン）を用いた。
【００１８】上記に従い特定されたペプチド配列が、Ｔ
細胞クローンにより認識されるペプチドリガンドであ
る。当該ペプチドリガンドが何に基づくものかをパター
ンマッチサーチを用いた検索により見出すことができ
る。この結果、特異性不明のＴ細胞クローンが認識する
ペプチドリガンドの同定が可能となる。
細胞クローンにより認識されるペプチドリガンドであ
る。当該ペプチドリガンドが何に基づくものかをパター
ンマッチサーチを用いた検索により見出すことができ
る。この結果、特異性不明のＴ細胞クローンが認識する
ペプチドリガンドの同定が可能となる。
【００１９】
【実施例】《実施例１：ペプチドライブラリーの合成》
９６ウェルペプチド合成機モデルSRM96A（島津製作所）
を用いて、Fmocペプチド合成法を用いて合成した。ラン
ダムペプチドライブラリーの場合、システインを除く１
９種のFmoc-Lアミノ酸の等モル混合物を１つの結合位置
に対して２回の結合反応を行った。アミノ酸の結合反応
の終了したコンビナトリアルランダムペプチドライブラ
リーは２−メチルインドールで樹脂から切り出し、氷温
に冷却した無水エチルエーテルで沈殿後、洗浄を5回お
こなった。ペプチドの沈殿を窒素ガス雰囲気下で乾燥
後、トリフルオロ酢酸に溶解し、エチルエーテル沈殿
後、再度乾燥させた。調製したペプチドは０．０１Ｎ塩
酸を含む５０％アセトニトリルに溶解後、凍結乾燥させ
た。乾燥後、秤量したペプチドは無水ジメチルスルホキ
シドに５０ｍＭになるように（アミノ酸の平均分子量を
１１０と仮定して）溶解し、−８０℃に保存した。培養
に使用するときには、ペプチド溶液を培養メディウムで
１ｍＭになるように希釈し、遠心して沈殿物を除去後、
０．４５μｍのフィルターで滅菌濾過して、試験に供し
た。
９６ウェルペプチド合成機モデルSRM96A（島津製作所）
を用いて、Fmocペプチド合成法を用いて合成した。ラン
ダムペプチドライブラリーの場合、システインを除く１
９種のFmoc-Lアミノ酸の等モル混合物を１つの結合位置
に対して２回の結合反応を行った。アミノ酸の結合反応
の終了したコンビナトリアルランダムペプチドライブラ
リーは２−メチルインドールで樹脂から切り出し、氷温
に冷却した無水エチルエーテルで沈殿後、洗浄を5回お
こなった。ペプチドの沈殿を窒素ガス雰囲気下で乾燥
後、トリフルオロ酢酸に溶解し、エチルエーテル沈殿
後、再度乾燥させた。調製したペプチドは０．０１Ｎ塩
酸を含む５０％アセトニトリルに溶解後、凍結乾燥させ
た。乾燥後、秤量したペプチドは無水ジメチルスルホキ
シドに５０ｍＭになるように（アミノ酸の平均分子量を
１１０と仮定して）溶解し、−８０℃に保存した。培養
に使用するときには、ペプチド溶液を培養メディウムで
１ｍＭになるように希釈し、遠心して沈殿物を除去後、
０．４５μｍのフィルターで滅菌濾過して、試験に供し
た。
【００２０】《実施例２：ペプチドライブラリーの解
析》合成したＸ19コンビナトリアルランダムペプチドラ
イブラリーの凍結乾燥品を１００μＬの蒸留水に溶解
後、遠心して沈殿物を除去した。塩酸加水分解反応２１
時間後のサンプルを２０μＬ用いて、反応試薬２０μ
Ｌ、バッファー６０μＬと反応後、その２０μＬをＨＰ
ＬＣでアミノ酸組成分析を行った。
析》合成したＸ19コンビナトリアルランダムペプチドラ
イブラリーの凍結乾燥品を１００μＬの蒸留水に溶解
後、遠心して沈殿物を除去した。塩酸加水分解反応２１
時間後のサンプルを２０μＬ用いて、反応試薬２０μ
Ｌ、バッファー６０μＬと反応後、その２０μＬをＨＰ
ＬＣでアミノ酸組成分析を行った。
【００２１】アスパラギン酸＋アスパラギンは１０．７
ｐmol、セリンは４３．０ｐmol、グルタミン酸＋グルタ
ミンは５８．８ｐmol、グリシンは６８．５ｐmol、ヒス
チジンは２２．１ｐmol、アルギニンは５．９ｐmol、ス
レオニンは３４．０ｐmol、アラニンは６３．５ｐmol、
プロリンは１３．５ｐmol、チロシンは３８．５ｐmol、
バリンは８４．２ｐmol、メチオニンは３１．１ｐmol、
リジンは４５．９ｐmol、イソロイシンは８．９ｐmol、
ロイシンは６６．１ｐmol、フェニルアラニンは３．８
ｐmol含有されていると解析された。この方法で分析で
きないトリプトファンを除く、１８種のアミノ酸が全て
ほぼ同等に含まれていることが確認できた。
ｐmol、セリンは４３．０ｐmol、グルタミン酸＋グルタ
ミンは５８．８ｐmol、グリシンは６８．５ｐmol、ヒス
チジンは２２．１ｐmol、アルギニンは５．９ｐmol、ス
レオニンは３４．０ｐmol、アラニンは６３．５ｐmol、
プロリンは１３．５ｐmol、チロシンは３８．５ｐmol、
バリンは８４．２ｐmol、メチオニンは３１．１ｐmol、
リジンは４５．９ｐmol、イソロイシンは８．９ｐmol、
ロイシンは６６．１ｐmol、フェニルアラニンは３．８
ｐmol含有されていると解析された。この方法で分析で
きないトリプトファンを除く、１８種のアミノ酸が全て
ほぼ同等に含まれていることが確認できた。
【００２２】また、合成したＸ19コンビナトリアルラン
ダムペプチドライブラリーのＮ末端から３番目までのア
ミノ酸をプロテインシークエンサーModel492（アプライ
ドバイオシステムズ社）でエドマン分解法により解析し
た結果、Ｎ末端から３番目までの各位置には１９種全て
のアミノ酸が含まれていることが確認できた。
ダムペプチドライブラリーのＮ末端から３番目までのア
ミノ酸をプロテインシークエンサーModel492（アプライ
ドバイオシステムズ社）でエドマン分解法により解析し
た結果、Ｎ末端から３番目までの各位置には１９種全て
のアミノ酸が含まれていることが確認できた。
【００２３】《実施例３：マイトマイシンＣによる末梢
血単核細胞の処理》５〜１０×１０6個／ｍｌの末梢血
単核細胞（ＰＢＭＣ）を２０μｇ／ｍｌのマイトマイシ
ンＣを含んだ培養液（RPMI1640培地に２ｍＭ L-グルタ
ミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌ
のストレプトマイシン、１０％の加熱不活化自己血漿を
含む）中で撹拌しながら、２時間培養した。RPMI1640培
地で２回洗浄後、培養液中で更に３〜５時間培養した。
細胞を回収後、RPMI1640培地で２回洗浄し、以後の試験
に用いた。
血単核細胞の処理》５〜１０×１０6個／ｍｌの末梢血
単核細胞（ＰＢＭＣ）を２０μｇ／ｍｌのマイトマイシ
ンＣを含んだ培養液（RPMI1640培地に２ｍＭ L-グルタ
ミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌ
のストレプトマイシン、１０％の加熱不活化自己血漿を
含む）中で撹拌しながら、２時間培養した。RPMI1640培
地で２回洗浄後、培養液中で更に３〜５時間培養した。
細胞を回収後、RPMI1640培地で２回洗浄し、以後の試験
に用いた。
【００２４】《実施例４：ペプチドの長さによるＴ細胞
の増殖刺激活性の違いについて》アミノ酸の長さによる
効果を検討する目的で、９,１１,１３,１５,１７,１９
個の長さを有するランダムなアミノ酸配列からなるペプ
チドＸｎ（ｎはアミノ酸の個数を表す）を作製した。こ
れらのペプチドの１６、６２、２５０μＭ存在下と、対
照として無関係なペプチド（VPIQRAVYQNVVVNN）と細胞
活性化のための陽性対照ＰＭＡ（Pholborl Myristic A
cetate：１ng／ml）とionomycin（0.3ｍＭ）、培地のみ
を設定した。
の増殖刺激活性の違いについて》アミノ酸の長さによる
効果を検討する目的で、９,１１,１３,１５,１７,１９
個の長さを有するランダムなアミノ酸配列からなるペプ
チドＸｎ（ｎはアミノ酸の個数を表す）を作製した。こ
れらのペプチドの１６、６２、２５０μＭ存在下と、対
照として無関係なペプチド（VPIQRAVYQNVVVNN）と細胞
活性化のための陽性対照ＰＭＡ（Pholborl Myristic A
cetate：１ng／ml）とionomycin（0.3ｍＭ）、培地のみ
を設定した。
【００２５】１．５×１０5／ウェルの健常人由来ＰＢ
ＭＣをＩＬ−２存在下、或いは非存在下、これらのペプ
チドの１６、６２、２５０μＭ存在下、もしくは無関係
なペプチド（VPIQRAVYQNVVVNN）或いは細胞活性化のた
めの陽性対照ＰＭＡとionomycin存在下、その増殖応答
を調べた。
ＭＣをＩＬ−２存在下、或いは非存在下、これらのペプ
チドの１６、６２、２５０μＭ存在下、もしくは無関係
なペプチド（VPIQRAVYQNVVVNN）或いは細胞活性化のた
めの陽性対照ＰＭＡとionomycin存在下、その増殖応答
を調べた。
【００２６】ＩＬ−２添加群では、培養４日目にＩＬ−
２を添加し、また全ての群には培養６日目に3Ｈチミジ
ンを添加して、増殖応答について調べた。図１Ａに示す
ようにＸ17とＸ19が高濃度で弱い増殖応答を示した他は
顕著な増殖応答は示さなかった。しかしながら、ＩＬ−
２を添加した場合、Ｘ19のように長いペプチドは濃度依
存的に強い増殖応答を示した（図１Ｂ）。
２を添加し、また全ての群には培養６日目に3Ｈチミジ
ンを添加して、増殖応答について調べた。図１Ａに示す
ようにＸ17とＸ19が高濃度で弱い増殖応答を示した他は
顕著な増殖応答は示さなかった。しかしながら、ＩＬ−
２を添加した場合、Ｘ19のように長いペプチドは濃度依
存的に強い増殖応答を示した（図１Ｂ）。
【００２７】また、増殖応答を示したＴ細胞のサブポピ
ュレーションはＣＤ４Ｔ細胞であった（図２）。これら
の増殖応答は、ヒトＭＨＣクラスIIに対するモノクロー
ナル抗体（抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体、
抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体）を添加することで濃度依存的に抑
制され、特に抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の効果が強いことが明
らかになった。更に、これらのモノクローナル抗体を混
合して使用することにより、その効果は飽和した。また
この効果はＭＨＣクラスＩに対する抗体では認められな
かった。
ュレーションはＣＤ４Ｔ細胞であった（図２）。これら
の増殖応答は、ヒトＭＨＣクラスIIに対するモノクロー
ナル抗体（抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体、
抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体）を添加することで濃度依存的に抑
制され、特に抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の効果が強いことが明
らかになった。更に、これらのモノクローナル抗体を混
合して使用することにより、その効果は飽和した。また
この効果はＭＨＣクラスＩに対する抗体では認められな
かった。
【００２８】《実施例５：ヒトＴ細胞クローンの増殖応
答評価》ヒトＣＤ４Ｔ細胞クローンとして、OT1.1（DP5
拘束性にp53p153-165ペプチドを認識）、T31.1（DP5拘
束性にTEL/AML-1ペプチドを認識）、DT13.2（DQ6拘束性
にDer f Ip18-31ペプチドを認識）、SK2.11（DQ6拘束性
にAchRp75-87ペプチドを認識）、29.28.1（DR8拘束性に
Rasp3-20ペプチドを認識）、29.15.2（DR51拘束性にRas
p3-20ペプチドを認識）、MK20.2（DR53拘束性にGADp111
-131ペプチドを認識）、HY6.22（DR4拘束性にDer f Ip8
2-94ペプチドを認識）、YT15.1（DR15拘束性にBCGap84-
100ペプチドを認識）、SF36.16（DR4拘束性にBCGap84-1
00ペプチドを認識）、BC20.7（DR14拘束性にBCGap84-10
0ペプチドを認識）、BC33.5（DR14拘束性にBCGap84-100
ペプチドを認識）、BC42.1（DR14拘束性にBCGap84-100
ペプチドを認識）を用いた。
答評価》ヒトＣＤ４Ｔ細胞クローンとして、OT1.1（DP5
拘束性にp53p153-165ペプチドを認識）、T31.1（DP5拘
束性にTEL/AML-1ペプチドを認識）、DT13.2（DQ6拘束性
にDer f Ip18-31ペプチドを認識）、SK2.11（DQ6拘束性
にAchRp75-87ペプチドを認識）、29.28.1（DR8拘束性に
Rasp3-20ペプチドを認識）、29.15.2（DR51拘束性にRas
p3-20ペプチドを認識）、MK20.2（DR53拘束性にGADp111
-131ペプチドを認識）、HY6.22（DR4拘束性にDer f Ip8
2-94ペプチドを認識）、YT15.1（DR15拘束性にBCGap84-
100ペプチドを認識）、SF36.16（DR4拘束性にBCGap84-1
00ペプチドを認識）、BC20.7（DR14拘束性にBCGap84-10
0ペプチドを認識）、BC33.5（DR14拘束性にBCGap84-100
ペプチドを認識）、BC42.1（DR14拘束性にBCGap84-100
ペプチドを認識）を用いた。
【００２９】ヒトＴ細胞クローンを５０Ｕ／mlのヒト組
換えＩＬ−２とそのＴ細胞が認識する本来のペプチドを
加えた放射線処理した対応する自己ＰＢＭＣで弱く刺激
した。Ｔ細胞クローンのＸ19ペプチドによる増殖は、２
×１０4個／ウエルの被験Ｔ細胞を２０Ｕ／mlのヒト組
換えＩＬ−２とマイトマイシンＣ処理した１×１０5個
／ウエルの自己ＰＢＭＣを含む培養液（RPMI1640培地に
２ｍＭ L-グルタミン、１００Ｕ／mlのペニシリン、１
００μg／mlのストレプトマイシン、１０％の加熱不活
化自己血漿を含む）中で、２５０μＭのＸ19存在下もし
くは非存在下、９６ウエル平底培養プレートを用いて評
価した。７２時間の増殖応答試験の内、最後の１６時間
は１μCi／ウエルの3Ｈチミジンを添加した。
換えＩＬ−２とそのＴ細胞が認識する本来のペプチドを
加えた放射線処理した対応する自己ＰＢＭＣで弱く刺激
した。Ｔ細胞クローンのＸ19ペプチドによる増殖は、２
×１０4個／ウエルの被験Ｔ細胞を２０Ｕ／mlのヒト組
換えＩＬ−２とマイトマイシンＣ処理した１×１０5個
／ウエルの自己ＰＢＭＣを含む培養液（RPMI1640培地に
２ｍＭ L-グルタミン、１００Ｕ／mlのペニシリン、１
００μg／mlのストレプトマイシン、１０％の加熱不活
化自己血漿を含む）中で、２５０μＭのＸ19存在下もし
くは非存在下、９６ウエル平底培養プレートを用いて評
価した。７２時間の増殖応答試験の内、最後の１６時間
は１μCi／ウエルの3Ｈチミジンを添加した。
【００３０】表１に示すように、OT1.1とT31.1の様にＨ
ＬＡ拘束性が同じで特異性が異なるＴ細胞クローン間で
も、Ｘ19存在下で明らかな増殖応答を示した。また、2
9.28.1と29.15.2、YT15.1とSF36.16とBC20.7の様に同じ
ペプチドを認識するが異なるＨＬＡ拘束性を有するＴ細
胞クローン間でもＸ19存在下で明らかな増殖応答が認め
られた。更に、BC20.7、BC33.5、BC42.1の様に同一のペ
プチドを認識し、またＨＬＡ拘束性も同一であるが用い
るＶβ鎖が異なるＴ細胞クローン間でもＸ19存在下で明
らかな増殖応答が認められた。
ＬＡ拘束性が同じで特異性が異なるＴ細胞クローン間で
も、Ｘ19存在下で明らかな増殖応答を示した。また、2
9.28.1と29.15.2、YT15.1とSF36.16とBC20.7の様に同じ
ペプチドを認識するが異なるＨＬＡ拘束性を有するＴ細
胞クローン間でもＸ19存在下で明らかな増殖応答が認め
られた。更に、BC20.7、BC33.5、BC42.1の様に同一のペ
プチドを認識し、またＨＬＡ拘束性も同一であるが用い
るＶβ鎖が異なるＴ細胞クローン間でもＸ19存在下で明
らかな増殖応答が認められた。
【００３１】
【表１】
【００３２】《実施例６：ヒト末梢血Ｔ細胞集団の調
製》末梢血Ｔ細胞集団の調製はStemsep Kits（ステムセ
ル テクノロジー社）を用いた。対応する健常成人より
Ficoll-Paqueを用いてＰＢＭＣを用事調製し、ＣＤ８、
ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６とグリコフォ
リンＡに対する抗体結合−磁性粒子の混合物と共に培養
した。磁性カラムを用いて抗体結合細胞を取り除き、Ｃ
Ｄ４陽性Ｔ（ＣＤ４Ｔ）細胞を調製した。分離した細胞
の９５％以上がＣＤ４Ｔ細胞であることが確認できた。
製》末梢血Ｔ細胞集団の調製はStemsep Kits（ステムセ
ル テクノロジー社）を用いた。対応する健常成人より
Ficoll-Paqueを用いてＰＢＭＣを用事調製し、ＣＤ８、
ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６とグリコフォ
リンＡに対する抗体結合−磁性粒子の混合物と共に培養
した。磁性カラムを用いて抗体結合細胞を取り除き、Ｃ
Ｄ４陽性Ｔ（ＣＤ４Ｔ）細胞を調製した。分離した細胞
の９５％以上がＣＤ４Ｔ細胞であることが確認できた。
【００３３】メモリーＴ細胞の調製には抗ＣＤ４５ＲＡ
抗体を、ナイーブＴ細胞の調製には抗ＣＤ４５ＲＯ抗体
を上記の抗体混合物に加えて使用することにより調製し
た。
抗体を、ナイーブＴ細胞の調製には抗ＣＤ４５ＲＯ抗体
を上記の抗体混合物に加えて使用することにより調製し
た。
【００３４】《実施例７：ＣＤ４Ｔ細胞の効率的な増殖
条件の検討》３×１０4／ウエルのマイトマイシンＣ処
理ＰＢＭＣを播いて置いたテラサキプレートのウエル
に、ＰＢＭＣから分離したＣＤ４Ｔ細胞を１個／ウエル
になるように加えた。培養液中には、Ｘ19（２５０μ
Ｍ）、ＩＬ−２（５０Ｕ／ml）、ＩＬ−４（１０Ｕ／m
l）、ＩＬ−７（５０Ｕ／ml）、ＩＬ−９（５０Ｕ／m
l）、ＩＬ−１５（１ｎg／ml）、抗ＣＤ２９抗体ＭＡＲ
４（2.5μg／ml）を種々の組み合わせで添加した。これ
らの細胞の培養開始後７日後に、細胞増殖を顕微鏡観察
により評価した。増殖が認められたウエルは、更にマイ
トマイシンＣ処理ＰＢＭＣを播いて置いた９６ウエルプ
レートにＸ19及びＩＬ−２存在下、７日間培養し、増殖
試験を行った。stimulation index （cpm with IL-2 +
X19／cpm with IL-2 only）が２．０以上を示したウエ
ルを「Ｘ19反応性」と評価した。これらの実験の結果を
表２にまとめる。
条件の検討》３×１０4／ウエルのマイトマイシンＣ処
理ＰＢＭＣを播いて置いたテラサキプレートのウエル
に、ＰＢＭＣから分離したＣＤ４Ｔ細胞を１個／ウエル
になるように加えた。培養液中には、Ｘ19（２５０μ
Ｍ）、ＩＬ−２（５０Ｕ／ml）、ＩＬ−４（１０Ｕ／m
l）、ＩＬ−７（５０Ｕ／ml）、ＩＬ−９（５０Ｕ／m
l）、ＩＬ−１５（１ｎg／ml）、抗ＣＤ２９抗体ＭＡＲ
４（2.5μg／ml）を種々の組み合わせで添加した。これ
らの細胞の培養開始後７日後に、細胞増殖を顕微鏡観察
により評価した。増殖が認められたウエルは、更にマイ
トマイシンＣ処理ＰＢＭＣを播いて置いた９６ウエルプ
レートにＸ19及びＩＬ−２存在下、７日間培養し、増殖
試験を行った。stimulation index （cpm with IL-2 +
X19／cpm with IL-2 only）が２．０以上を示したウエ
ルを「Ｘ19反応性」と評価した。これらの実験の結果を
表２にまとめる。
【００３５】実験１では、各インターロイキンの組み合
わせ添加による増殖効果を比較検討し、Ｘ19と共にＩＬ
−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５を添加すること
によりＣＤ４Ｔ細胞の増殖効率並びにＸ19との反応性が
高くなることが明らかになった。
わせ添加による増殖効果を比較検討し、Ｘ19と共にＩＬ
−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５を添加すること
によりＣＤ４Ｔ細胞の増殖効率並びにＸ19との反応性が
高くなることが明らかになった。
【００３６】更に実験２で、この組み合わせに、アゴニ
スティックな活性を有する抗ＣＤ２９抗体を添加する
と、ＣＤ４Ｔ細胞のクローナルな増殖の効率は高まり、
しかもＸ19反応性のＣＤ４Ｔ細胞を増殖できることが確
認できた。
スティックな活性を有する抗ＣＤ２９抗体を添加する
と、ＣＤ４Ｔ細胞のクローナルな増殖の効率は高まり、
しかもＸ19反応性のＣＤ４Ｔ細胞を増殖できることが確
認できた。
【００３７】実験３では増殖応答しているＣＤ４Ｔ細胞
の種類を評価した。その結果、メモリーＴ細胞がこれら
の刺激で増殖応答していることが明らかに出来た。
の種類を評価した。その結果、メモリーＴ細胞がこれら
の刺激で増殖応答していることが明らかに出来た。
【００３８】
【表２】
【００３９】《実施例８：クローン化されたＴ細胞のペ
プチドリガンドの同定法》実施例７でＰＢＭＣから直接
得られたクローン化されたＴ細胞クローンのペプチドリ
ガンドを同定するために、Ｘ９をベースにしたＫＧＸ1
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫ（配列表配列番
号１）、またはＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
Ｘ９ＧＫＧＫＫ（配列表配列番号２）の二つのコンビナ
トリアルペプチドライブラリーを用いて、増殖刺激活性
を調べた（Ｘはシステインを除く１９種の天然アミノ
酸；Ｋはリジン；Ｇはグリシン）。使用されたペプチド
の濃度は２５０μＭで、ＩＬ−２及びマイトマイシンＣ
処理ＰＢＭＣ存在下で評価を行った。
プチドリガンドの同定法》実施例７でＰＢＭＣから直接
得られたクローン化されたＴ細胞クローンのペプチドリ
ガンドを同定するために、Ｘ９をベースにしたＫＧＸ1
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫ（配列表配列番
号１）、またはＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
Ｘ９ＧＫＧＫＫ（配列表配列番号２）の二つのコンビナ
トリアルペプチドライブラリーを用いて、増殖刺激活性
を調べた（Ｘはシステインを除く１９種の天然アミノ
酸；Ｋはリジン；Ｇはグリシン）。使用されたペプチド
の濃度は２５０μＭで、ＩＬ−２及びマイトマイシンＣ
処理ＰＢＭＣ存在下で評価を行った。
【００４０】それぞれのＴ細胞クローンは上記２種のＸ
９をベースにしたコンビナトリアルペプチドに対してＩ
Ｌ−２依存的に増殖した。充分な増殖性を示した19.6.4
7Ｔ細胞を用いて得られた反応パターンを図３及び４に
示す。
９をベースにしたコンビナトリアルペプチドに対してＩ
Ｌ−２依存的に増殖した。充分な増殖性を示した19.6.4
7Ｔ細胞を用いて得られた反応パターンを図３及び４に
示す。
【００４１】図３に示すように、ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４
Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫの場合、２位のチロシン（Ｔ
ｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍ
ｅｔ）が、３位でのチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラ
ニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、４位でのアスパ
ラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギ
ン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、５位および
６位でのグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラ
ニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、７位でのプロ
リン（Ｐｒｏ）、８位でのチロシン（Ｔｙｒ）、フェニ
ルアラニン（Ｐｈｅ）、９位でのロイシン（Ｌｅｕ）、
イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）が効率よく
増殖応答を誘導した。
Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫの場合、２位のチロシン（Ｔ
ｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍ
ｅｔ）が、３位でのチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラ
ニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、４位でのアスパ
ラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギ
ン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、５位および
６位でのグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラ
ニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、７位でのプロ
リン（Ｐｒｏ）、８位でのチロシン（Ｔｙｒ）、フェニ
ルアラニン（Ｐｈｅ）、９位でのロイシン（Ｌｅｕ）、
イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）が効率よく
増殖応答を誘導した。
【００４２】また、図４に示すように、ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ
３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫの場合も同じ様
な結果が得られたが、８位ではフェニルアラニン（Ｐｈ
ｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、メチオニン（Ｍｅｔ）が増
殖応答を誘導したが、９位ではグリシン（Ｇｌｙ）、セ
リン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔ
ｈｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）が増殖応答を刺激した。
３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫの場合も同じ様
な結果が得られたが、８位ではフェニルアラニン（Ｐｈ
ｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、メチオニン（Ｍｅｔ）が増
殖応答を誘導したが、９位ではグリシン（Ｇｌｙ）、セ
リン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔ
ｈｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）が増殖応答を刺激した。
【００４３】これらの結果から、 Ｘ２：Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ Ｘ３：Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ Ｘ４：Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ Ｘ５：Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ Ｘ６：Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ Ｘ７：Ｐｒｏ Ｘ８：Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ Ｘ９：Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ｓｅ
ｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ の組み合わせの中から選ばれるペプチドがこのＴ細胞ク
ローンにより認識されるペプチドリガンドであると考え
られた。
ｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ の組み合わせの中から選ばれるペプチドがこのＴ細胞ク
ローンにより認識されるペプチドリガンドであると考え
られた。
【００４４】これらの結果を基に、パターンマッチサー
チによりSWISS-PLOTとTrMBLを用いて検索した。８残基
のうち７残基マッチでピックアップした結果、表３に示
す３種の非自己配列が得られた。
チによりSWISS-PLOTとTrMBLを用いて検索した。８残基
のうち７残基マッチでピックアップした結果、表３に示
す３種の非自己配列が得られた。
【００４５】
【表３】
【００４６】19.6.47Ｔ細胞の供与者はスギ花粉症患者
であり、また、19.6.47の樹立はスギ花粉飛散後期に行
われたため、表３に示したいくつかの非自己ペプチドの
うち、Cry j I断片（p324-331）に反応する可能性が高
いと考え、この部分を含む合成ペプチド（Cry j Ip301-
321）とCry j I 精製蛋白に対する19.6.47の反応性を観
察した。
であり、また、19.6.47の樹立はスギ花粉飛散後期に行
われたため、表３に示したいくつかの非自己ペプチドの
うち、Cry j I断片（p324-331）に反応する可能性が高
いと考え、この部分を含む合成ペプチド（Cry j Ip301-
321）とCry j I 精製蛋白に対する19.6.47の反応性を観
察した。
【００４７】Ｔ細胞クローン（19.6.47）を、放射線照
射された（45Gy）ＰＢＭＣと精製Cryj Ｉ蛋白（50，5.
0，0.5mg／ml）、Cry j Ｉ p301-321（250ｍＭ，25ｍ
Ｍ，2.5ｍＭ）、もしくは無関係のペプチドと共に培養
された。
射された（45Gy）ＰＢＭＣと精製Cryj Ｉ蛋白（50，5.
0，0.5mg／ml）、Cry j Ｉ p301-321（250ｍＭ，25ｍ
Ｍ，2.5ｍＭ）、もしくは無関係のペプチドと共に培養
された。
【００４８】図５に示すように19.6.47Ｔ細胞はCryj130
1-321（DVFYNGAYFVSSGKYEGGNIF)と反応するだけでな
く、精製Cry j Ｉとも濃度依存性に増殖反応を示した。
従って、19.6.47Ｔ細胞は生体内では天然リガンドとし
てスギ花粉の３０２−３１０位のペプチドを認識してい
ると考えられた。
1-321（DVFYNGAYFVSSGKYEGGNIF)と反応するだけでな
く、精製Cry j Ｉとも濃度依存性に増殖反応を示した。
従って、19.6.47Ｔ細胞は生体内では天然リガンドとし
てスギ花粉の３０２−３１０位のペプチドを認識してい
ると考えられた。
【００４９】このようにして、Ｘ19ペプチド用いて末梢
のＣＤ４メモリーＴ細胞のクローンの拡大を誘導し、更
にその認識エピトープをコンビナトリアルペプチドライ
ブラリーを使用することにより末梢のＣＤ４メモリーＴ
細胞のクローンの拡大を誘導し、そのリガンドも同定す
ることが出来た。
のＣＤ４メモリーＴ細胞のクローンの拡大を誘導し、更
にその認識エピトープをコンビナトリアルペプチドライ
ブラリーを使用することにより末梢のＣＤ４メモリーＴ
細胞のクローンの拡大を誘導し、そのリガンドも同定す
ることが出来た。
【００５０】
【発明の効果】本発明は、これまで同定できなかった末
梢血や組織由来の特異性不明のＴ細胞の抗原ペプチドの
配列を決定することが可能とするものである。詳細に
は、得られた抗原特異性不明のメモリーＴ細胞を増殖さ
せ、そのペプチドリガンドを同定することにより、自己
免疫疾患に関与したＴ細胞の認識エピトープや抗腫瘍活
性を有するＣＤ４Ｔ細胞によって認識されるペプチドリ
ガンドの同定を可能にする。同定されたペプチドリガン
ドにより、Ｔ細胞が認識する天然リガンドを同定もしく
は類推できるようになる。その結果、自己免疫疾患の特
異免疫療法や悪性腫瘍の腫瘍免疫療法に新たな道が開か
れうる。さらに、本発明の方法は感染症に対する感染防
御ペプチドの同定にも有効な手段となりうる。
梢血や組織由来の特異性不明のＴ細胞の抗原ペプチドの
配列を決定することが可能とするものである。詳細に
は、得られた抗原特異性不明のメモリーＴ細胞を増殖さ
せ、そのペプチドリガンドを同定することにより、自己
免疫疾患に関与したＴ細胞の認識エピトープや抗腫瘍活
性を有するＣＤ４Ｔ細胞によって認識されるペプチドリ
ガンドの同定を可能にする。同定されたペプチドリガン
ドにより、Ｔ細胞が認識する天然リガンドを同定もしく
は類推できるようになる。その結果、自己免疫疾患の特
異免疫療法や悪性腫瘍の腫瘍免疫療法に新たな道が開か
れうる。さらに、本発明の方法は感染症に対する感染防
御ペプチドの同定にも有効な手段となりうる。
【図１】 Ｘｎペプチドを用いたＴ細胞の増殖効果を示
す図。Ａ：ＩＬ−２非存在下、Ｂ：ＩＬ−２存在下。Ｘ
ｎペプチドの濃度：黒棒（２５０μＭ）、斜線棒（６２
μＭ）、白抜き棒（１６μＭ）。
す図。Ａ：ＩＬ−２非存在下、Ｂ：ＩＬ−２存在下。Ｘ
ｎペプチドの濃度：黒棒（２５０μＭ）、斜線棒（６２
μＭ）、白抜き棒（１６μＭ）。
【図２】 Ｘ19ペプチドを用いたＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ
８Ｔ細胞の増殖効果及び抗ＭＨＣ抗体のＴ細胞増殖に及
ぼす影響を示す図。ＤＲ：抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体，ＤＱ：
抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体，ＤＰ：抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体、clas
s II：抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体及び抗
ＨＬＡ−ＤＰ抗体の混合物，class Ｉ：抗ヒトＭＨＣク
ラスＩ抗体，control：コントロールマウスIgＧ抗体。
Ｘｎペプチドの濃度：黒棒（３０μｇ／ｍｌ）、斜線棒
（１０μｇ／ｍｌ）。全てのデータは３重測定の平均値
標準偏差である。
８Ｔ細胞の増殖効果及び抗ＭＨＣ抗体のＴ細胞増殖に及
ぼす影響を示す図。ＤＲ：抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体，ＤＱ：
抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体，ＤＰ：抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体、clas
s II：抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体及び抗
ＨＬＡ−ＤＰ抗体の混合物，class Ｉ：抗ヒトＭＨＣク
ラスＩ抗体，control：コントロールマウスIgＧ抗体。
Ｘｎペプチドの濃度：黒棒（３０μｇ／ｍｌ）、斜線棒
（１０μｇ／ｍｌ）。全てのデータは３重測定の平均値
標準偏差である。
【図３】 末梢血単核細胞から分離したＴ細胞クローン
の認識リガンドをコンビナトリアルペプチドライブラリ
ー（ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫ）
を用いたポジショナルスキャンニングによる解析結果を
示す図。
の認識リガンドをコンビナトリアルペプチドライブラリ
ー（ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫ）
を用いたポジショナルスキャンニングによる解析結果を
示す図。
【図４】 末梢血単核細胞から分離したＴ細胞クローン
の認識リガンドをコンビナトリアルペプチドライブラリ
ー（ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧ
ＫＫ）を用いたポジショナルスキャンニングによる解析
結果を示す図。
の認識リガンドをコンビナトリアルペプチドライブラリ
ー（ＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧ
ＫＫ）を用いたポジショナルスキャンニングによる解析
結果を示す図。
【図５】 分離したＴ細胞クローン（19.6.47）が認識
すると推定されたスギ花粉及び対応ペプチドに対する増
殖応答を示す図。精製Cry j Ｉ蛋白（黒棒：50μg／m
l，斜線棒：5.0μg／ml，白抜き棒：0.5μg／ml）、Cry
j Ｉ p301-321（黒棒：250μＭ，斜線棒：25μＭ，白
抜き棒：2.5μＭ）、irrelevant：無関係のペプチド（V
PIQRAVYQNVVVNN）。
すると推定されたスギ花粉及び対応ペプチドに対する増
殖応答を示す図。精製Cry j Ｉ蛋白（黒棒：50μg／m
l，斜線棒：5.0μg／ml，白抜き棒：0.5μg／ml）、Cry
j Ｉ p301-321（黒棒：250μＭ，斜線棒：25μＭ，白
抜き棒：2.5μＭ）、irrelevant：無関係のペプチド（V
PIQRAVYQNVVVNN）。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute <120> Example of a Sequence Listing <130> JP397 <160> 2 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <222> (3)...(11) <223> Each Xaa having 19 amino acid residues except cysteine. <400> 1 Lys Gly Xa1 Xa2 Xa3 Xa4 Xa5 Xa6 Xa7 Xa8 Xa9 Gly Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <222> (3)...(11) <223> Each Xaa having 19 amino acid residues except cysteine. <400> 2 Lys Gly Xa1 Xa2 Xa3 Xa4 Xa5 Xa6 Xa7 Xa8 Xa9 Gly Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 5/02 (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA31 DA02 GA11 GA23 HA15 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ20 QQ79 QR48 QR72 QR77 QR80 QS24 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA01 BA18 BA23 BB19 BB23 BB34 CA24 CA46 4H045 AA10 AA30 BA16 BA17 EA50 FA34
Claims (14)
- 【請求項１】 特異性不明のＴ細胞を、システインを除
く１９種の天然アミノ酸からなるペプチドのコンビナト
リアルランダムペプチドライブラリー（Ｘｎペプチドラ
イブラリー(ｎはアミノ酸の個数)）、インターロイキ
ン、前記Ｔ細胞と同一個体由来のＤＮＡ合成を停止させ
た主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII抗原発
現細胞と共に培養することを特徴とする特異性不明のＴ
細胞のクローン化法。 - 【請求項２】 当該Ｘｎペプチドライブラリーが、Ｘ17
またはＸ19である請求項１記載のクローン化法。 - 【請求項３】 当該Ｘｎペプチドライブラリーが、Ｘ19
である請求項１記載のクローン化法。 - 【請求項４】 当該Ｘｎペプチドライブラリーの濃度
が、１〜１０００μＭである請求項１から３のいずれか
に記載のクローン化法。 - 【請求項５】 当該Ｘｎペプチドライブラリーの濃度
が、６２〜２５０μＭである請求項４記載のクローン化
法。 - 【請求項６】 当該インターロイキンが、インターロイ
キン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−
７）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）及びインター
ロイキン−１５（ＩＬ−１５）を組み合わせて添加する
請求項１に記載のクローン化法。 - 【請求項７】 当該インターロイキンが、インターロイ
キン−２（ＩＬ−２）である請求項１記載のクローン化
法。 - 【請求項８】 当該インターロイキンが、ＩＬ−２、Ｉ
Ｌ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９及びＩＬ−１５を組み合わ
せて添加する請求項１に記載のクローン化法。 - 【請求項９】 当該ＭＨＣクラスII抗原発現細胞が、末
梢血単核細胞、ＭＨＣクラスII抗原を発現するように遺
伝子組換えが行われた形質転換細胞または不死化Ｂ細胞
から選択される請求項１に記載のクローン化法。 - 【請求項１０】 選択的にアゴニスト活性を有する抗Ｃ
Ｄ２９抗体を添加する請求項１に記載のクローン化法。 - 【請求項１１】 請求項１から１０に記載のクローン化
法により得られる特異性不明のＴ細胞クローンを、イン
ターロイキン及び前記Ｔ細胞と同一個体由来のＤＮＡ合
成を停止させたＭＨＣクラスII抗原発現細胞の存在下、
Ｘｎペプチドライブラリーを用いて増殖刺激活性を調
べ、増殖応答が見られたペプチドを基に、パターンマッ
チサーチにより、当該Ｔ細胞クローンが認識するペプチ
ドリガンドを同定する方法。 - 【請求項１２】 当該Ｘｎペプチドライブラリーが、Ｘ
９をベースとしたＫＧＸ1Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ
８Ｘ９ＧＫ（配列表配列番号１）またはＫＧＸ1Ｘ２Ｘ
３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＫＧＫＫ（配列表配列番
号２）（Ｘはシステインを除く１９種の天然アミノ酸；
Ｋはリジン；Ｇはグリシン）である請求項１１に記載の
同定方法。 - 【請求項１３】 当該インターロイキンがＩＬ−２であ
る請求項１１に記載の同定方法。 - 【請求項１４】 当該ＭＨＣクラスII抗原発現細胞が、
末梢血単核細胞、ＭＨＣクラスII抗原を発現するように
遺伝子組換えが行われた形質転換細胞または不死化Ｂ細
胞から選択される請求項１１に記載の同定方法。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013535209A (ja) * | 2010-08-06 | 2013-09-12 | ルードヴィヒ−マクシミリアン−ウニヴェルズィテート ミュンヘン | Ｔ細胞の標的抗原の同定 |
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|---|---|---|---|---|
| JP5697447B2 (ja) * | 2007-08-15 | 2015-04-08 | サーカッシア リミテッド | アレルゲンに対する脱感作のためのペプチド |
| ES2552678T3 (es) | 2008-06-30 | 2015-12-01 | Universitätsklinikum Heidelberg | Células sanguíneas inmunosupresoras y métodos de producir las mismas |
| US20100147866A1 (en) * | 2008-12-15 | 2010-06-17 | Weir Spm, Inc. | Ball Injector |
| WO2017218533A1 (en) | 2016-06-13 | 2017-12-21 | Torque Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for promoting immune cell function |
| CA3074826A1 (en) | 2017-09-05 | 2019-03-14 | Torque Therapeutics, Inc. | Therapeutic protein compositions and methods of making and using the same |
-
2001
- 2001-03-21 JP JP2001079621A patent/JP4812951B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6010058141, 日本免疫学会総会・学術集会記録, 20000926, 第３０巻, ｐ． ３１７， ３−Ｆ−３４３−Ｐ／Ｏ * |
| JPN6010058142, 月刊組織培養工学 １２月臨時増刊号, 20011230, 第２７巻第１４号通巻３４９号, ｐ． ２９（５６１）−３３（５６５） * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013535209A (ja) * | 2010-08-06 | 2013-09-12 | ルードヴィヒ−マクシミリアン−ウニヴェルズィテート ミュンヘン | Ｔ細胞の標的抗原の同定 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| US7132243B2 (en) | 2006-11-07 |
| CA2357484C (en) | 2011-12-13 |
| US20020192705A1 (en) | 2002-12-19 |
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| CA2357484A1 (en) | 2002-09-21 |
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