ES2552678T3

ES2552678T3 - Células sanguíneas inmunosupresoras y métodos de producir las mismas

Info

Publication number: ES2552678T3
Application number: ES09772430.6T
Authority: ES
Inventors: Peter Terness; Gerhard Opelz; Helmut Simon; Sandra Ehser; Christian Kleist; Flavius Sandra-Petrescu; Mircea Iancu; Lucian Jiga; Jing-Jing Chuang; Thilo Oelert
Original assignee: Universitaetsklinikum Heidelberg
Current assignee: Universitaetsklinikum Heidelberg
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2015-12-01
Anticipated expiration: 2029-06-30
Also published as: EP2318020B1; WO2010000730A1; PL2318020T3; EP2318020A1; US20150132326A1; US20170319619A1; US11123368B2; DK2318020T3; US20110223145A1

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, rechazo de injerto de órgano o enfermedad del injerto frente al huésped en un paciente, comprendiendo dicha composición sangre completa aislada o Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) tratada (i) con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente quimioterapéutico, o (ii) con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente quimioterapéutico y un autoantígeno; y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

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En algunos casos, es deseable añadir solamente el agente quimioterapéutico solo. Este es el caso en el que, por ejemplo, se usa sangre completa de donante o las PBMC como células inmunosupresoras para inhibir rechazos a trasplante. Para esta aplicación son particularmente preferentes algunos metabolitos de triptófano (quinureninas). Para esta aplicación también es preferente la mitomicina C.

La divulgación también proporciona un método para el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad autoinmune, comprendiendo dicho método: a) obtener una muestra de células sanguíneas; b) tratar dicha muestra de células sanguíneas con un agente quimioterapéutico y un autoantígeno; y c) administrar tales células sanguíneas tratadas a dicho paciente; en el que dichas células sanguíneas tratadas mejoran dicha enfermedad autoinmune en dicho paciente.

De acuerdo con este aspecto de la divulgación, en primer lugar las células sanguíneas se cargan o se pulsan con uno o más antígenos, tal como uno o más autoantígenos, y a continuación se modifican ex vivo con un agente quimioterapéutico como se describe a continuación en la sección de Ejemplos. En una realización, las células sanguíneas se pulsan con uno o más autoantígenos diabetogénicos tales como GAD, un autoantígeno de células de los islotes (ICA), o autoantígeno NRP-A7. En una realización en particular, las células sanguíneas se pulsan con cada uno de GAD 65, ICA 512 y NRP-A7. De forma alternativa, las células sanguíneas se pueden pulsar con lisados de islote pancreático. En otra realización, las células sanguíneas se pulsan con colágeno (por ejemplo, para tratar la artritis). En otra realización, las células sanguíneas se pulsan con proteína básica de mielina (MBP) (por ejemplo, para tratar la esclerosis múltiple), o un derivado de la misma, como se ha descrito anteriormente.

En una divulgación adicional, las células sanguíneas se pulsan con MBP o un derivado, péptido sintético del mismo, y la enfermedad autoinmune es esclerosis múltiple.

Además, en otra divulgación, la muestra de sangre se trata en primer lugar con el autoantígeno y posteriormente con el agente quimioterapéutico.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para el tratamiento de un receptor de injerto, comprendiendo dicho método a) la obtener una muestra de células sanguíneas de un donante, b) tratar dicha muestra de células sanguíneas con un agente quimioterapéutico, y c) administrar tales células sanguíneas tratadas a dicho receptor del injerto, en el que dichas células sanguíneas de donante tratadas mejoran el riesgo de desarrollar rechazo al injerto en dicho paciente.

Además, la divulgación se refiere a un método para el tratamiento de un receptor de injerto, comprendiendo dicho método

a)obtener una muestra de células sanguíneas de un donante, en el que el receptor padece rechazo al injerto de órganos;

b)tratar dicha muestra de células sanguíneas con un agente quimioterapéutico; y

c) administrar tales células sanguíneas tratadas a dicho receptor de injerto, en el que dichas células sanguíneas de donante tratadas mejoran el rechazo al injerto de órganos en desarrollo en dicho paciente.

En una divulgación adicional, el agente quimioterapéutico es un metabolito de triptófano, lo más preferentemente un derivado de quinurenina, tal como Tranilast. También preferentemente, el agente quimioterapéutico es mitomicina C.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para el tratamiento de un receptor de injerto, comprendiendo dicho método

a)obtener una muestra de células sanguíneas de un receptor

b)tratar dicha muestra de células sanguíneas con un agente quimioterapéutico, y

c) administrar tales células sanguíneas tratadas a dicho receptor de injerto, en el que dichas células sanguíneas de receptor tratadas mejoran el riesgo de desarrollar la enfermedad de injerto frente al huésped iniciada en dicho paciente.

a)obtener una muestra de células sanguíneas de un receptor, en el que el receptor está padeciendo la enfermedad de injerto frente al huésped;

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c) administrar tales células sanguíneas tratadas a dicho receptor de injerto, en el que dichas células sanguíneas de receptor tratadas mejoran la enfermedad de injerto frente al huésped en desarrollo en dicho paciente.

Descripción de las figuras

Fig. 1. Efecto de las BC tratadas con MMC cargadas con MBP en linfocitos T en reposo o activados de pacientes con MS. Estimulación primaria (A, B): Las MBP-MMC-BC se coincuban con linfocitos periféricos en reposo (A) (n = 8) o linfocitos periféricos activados (B) (n = 7). Controles negativos: solamente las MBP-BC o linfocitos; controles positivos: las MBP-BC sin tratar con MMC más linfocitos. Reestimulación (C, D): los linfocitos CD4+ se aíslan y se reestimulan con las MBP-BC del mismo donante. El eje de abscisas muestra el tratamiento previo de células CD4. El eje de ordenadas muestra la proliferación de linfocitos T. La primera columna representa solamente las BC (control negativo). Los datos representan la media ± SD y se expresan como porcentaje de valores de control positivo (BC cargadas con MBP + linfocitos = 100 %).

Fig. 2. Influencia del medio de cultivo de las MMC-BC en linfocitos T estimulados. Las BC tratadas con MMC o sin tratar se cultivan durante 72 h. Los sobrenadantes (medio acondicionado) se recogen y se usan para cultivos de linfocitos T estimulados con anticuerpo anti-CD3 con o sin BC autólogas. Los controles consistían solamente en las BC y linfocitos. Los datos representan la media ± SD y se expresan como porcentaje de valores de control positivo (BC + anti-CD3 + linfocitos = 100 %) (n = 4).

Fig. 3. Análisis del ciclo celular de linfocitos T expuestos a las MMC-BC. Los linfocitos T estimulados con anticuerpo anti-CD3 se cocultivan con las BC autólogas (A) sin tratar y (B) tratadas con MMC (25 µg de MMC/ml). Veinticuatro horas después de complementación con BrdU 10 µM las células se analizan mediante citometría de flujo usando un Kit de Flujo para BrdU. Los cuadrantes presentados muestran el porcentaje de células en el ciclo celular correspondiente (G0/G1, G2/M, S) así como el de las células muertas.

Fig. 4. Análisis de citometría de flujo de apoptosis después de tratamiento de las BC con MMC. Las BC se tratan con 50 µg/ml de MMC y se etiquetan con anexina-V-FITC y 7-AAD después de 2, 6 y 24 horas de incubación. Los controles consistían en las BC sin tratar (-MMC). El cuadrante inferior y superior muestra apoptosis. Se presentan porcentajes de células apoptóticas.

Fig. 5. Efecto de las BC que presentan MBP, tratadas con MMC in vivo. (A) Los ratones Tg4 se inyectan i.v. con cualquiera de las MBP-BC (♦) o las MBP-BC tratadas con MMC (■). (B) Los ratones inmunizados en el experimento A con las MBP-BC tratadas con MMC (■) se someten a exposición inmune el día 28 con las BC cargadas con MBP. Los ratones inmunizados en el experimento A con las MBP-BC (♦) sirvieron como controles. La evaluación de la EAE se realizó de acuerdo con la puntuación de Coligan. Los datos se muestran como valores medidos ± ETM (n = 8 por grupo).

Fig. 6. Vacunación profiláctica frente a la EAE con las BC tratadas con MMC cargadas con MBP. (A) Los ratones Tg4 se inmunizan de forma repetitiva con las MBP-MMC-BC. En el día 0 estos ratones (■), así como los ratones no vacunados (♦), se someten a exposición inmune con las BC pulsadas con MBP. (B) Se muestra la gravedad de la EAE (puntuación de Coligan), comenzando desde el día 10 después de la exposición inmune de MBP-BC. Los datos se presentan como media ± ETM (n = 8 no vacunados, n = 10 grupo vacunado).

Fig. 7. Fenotipo de las BC tratadas con MMC. Las BC humanas tratadas con MMC (50 µg/ml) y sin tratar se etiquetan con anticuerpos monoclonales específicos conjugados con FITC o PE para la clase II de MHC, CD80, CD86, y la expresión de las moléculas se analizó mediante citometría de flujo con un FACScalibur. La unión de los anticuerpos se presenta en los histogramas: el histograma de color gris relleno representa el control de isotipo, la línea de color rojo la unión a las BC tratadas con MMC, y la línea de color azul a las BC sin tratar con MMC.

Fig. 8. PCR Cuantitativa en Tiempo Real de células dendríticas tratadas con MMC. El ARN total de las BC tratadas con MMC y sin tratar se extrajo 18 horas después del tratamiento, se transcribió de forma inversa y se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real basándose en el método de SYBR Green. Los datos se normalizan con respecto a la ARN polimerasa II. El eje de ordenadas muestra el número de veces de cambio de los niveles de la expresión de ARN (± ETM) de las BC tratadas con MMC en comparación con los homólogos sin tratar (para cada gen n ≥ 5)

Fig. 9. Efecto de células sanguíneas tratadas con MMC en linfocitos CD4+-T in vivo. Los linfocitos TG4 T específicos para MBP se etiquetan con colorante CFSE y se transfieren i.v. a ratones B10.PL singeneicos. Después de 24 h, PBS (control negativo) (parte superior), células sanguíneas cargadas con MBP (control positivo) (parte media), o células sanguíneas cargadas con MBP / tratadas con MMC (parte inferior) se inyectan i.v.. Después de 4 días en total, se aíslan células de los nódulos linfáticos y se analizan para tinción con CFSE de

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linfocitos F23.1+ (Vβ8.2) CD4+ T. Los datos representan porcentajes medios de linfocitos T que proliferan con

CFSEbajo (las MBP-MMC-BC con respecto al grupo de PBS: p = 0,031; las MBP-MMC-BC con respecto al grupo

de las MBP-BC: p = no significativo). La invención se explica adicionalmente con los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Procedimientos Experimentales

(a) Ratones

Los ratones B10.PL se obtuvieron en Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine). Los ratones Tg4 transgénicos para TCR (fondo de I-Au) expresan un TCR derivado de un clon de linfocitos CD4+ T encefalitogénico específico para un péptido MBP (aa 1-9) (9).

(b) Generación de células dendríticas

Las DC de murino se generan a partir de células de médula ósea de ratones B10.PL de acuerdo con el protocolo de Lutz et al. (10). Para activación, se añade CpG-ODN 1668 0,5 µM. 90 min más tarde, se obtienen BMDC no adherentes. Se añade MMC (50 µg/ml) durante 30 min de cultivo y las células (106/ml) se lavan minuciosamente. El péptido Ac-ASQKRPSQRS (Ac1-10) de MBP1-10 acetilado N-terminal se añade a una concentración de 5 µM en combinación con CpG-ODN. Las DC humanas se generan de acuerdo con un protocolo convencional como se ha descrito anteriormente (11). Para estudios de linfocitos T específicos para MBP, se añaden 30 µg/ml de MBP (Sigma-Aldrich) a las DC inmaduras hasta maduración. Se añade MMC (10-100 µg/ml) al medio de cultivo de DC; después de 30 min de incubación, las células se lavan.

(c) Estudios de linfocitos T in vitro

Los linfocitos de murino se cultivan con las BC derivadas de BM. Los linfocitos de sangre periférica humana de pacientes con MS se coincuban con las BC autólogas cargadas con MBP. En un experimento en paralelo, las DRB1*0301-BC de donantes sanos se cargan con MBP y se coincuban con linfocitos CD4+ T específicos para MBP (clon ES-BP8T) como se ha descrito anteriormente (11). En un experimento de control, las BC se cargan con un péptido irrelevante con interacción comparable con DRB1*0301. La restricción de HLA se puede calcular con el software SYFPEITHI (www.uni-tuebingen.de/uni/kxi). Los cocultivos se realizan a una proporción de BC:linfocitos T de 1:10. La proliferación de linfocitos T se mide mediante la incorporación de [3H]timidina.

(d) Sobrenadantes de las MMC-BC

Las BC maduras se tratan con 25, 50 o 75 µg/ml de MMC y se lavan. Después de 72 h de incubación adicional, los sobrenadantes se recogen y se usan como medio de cultivo celular en un ensayo de proliferación de linfocitos T. Se estimulan 2 x 105 células/pocillo durante 4 días con anticuerpo monoclonal anti-CD3 (dilución a 1:6400).

(e) Análisis del ciclo celular

Los linfocitos se estimulan durante 2 días con anticuerpo monoclonal anti-CD3 y el análisis del ciclo celular se realiza usando el Kit de Flujo de BrdU (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania). Las células (106) se incuban durante la noche con BrdU 10 µM. Después de fijación, permeabilización y tratamiento con 300 µg/ml de DNasa, las células se tiñen con anticuerpo anti-BrdU etiquetado con FITC y 7-AAD y se analizan mediante citometría de flujo.

(f) Modelo de EAE

La EAE se induce mediante inyección i.v. de 5 x 106 BC activadas (en 0,2 ml) pulsadas con 5 µM de péptido MBP autoantigénico (+/-MMC). En el día 1 y 2 después de la inmunización, cada ratón se inyecta i.p. con 200 ng de toxina Pertussis (Calbiochem, Darmstadt, Alemania) en 50 µl de DPBS. Los síntomas se evalúan diariamente de acuerdo con la puntuación de Coligan.

(g) Micromatriz de Affymetrix

El ARN se convierte en ds-cADN usando cebadores de T7-(dT)24 y el sistema Superscript Choice (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). El ARNc etiquetado con biotina se genera a partir de la muestra de ADNc, se hibrida con chips genéticos de U133 Plus 2.0 (Affymetrix, High Wycombe, UK), se tiñe con estreptavidina-ficoeritrina (MoBiTec, Göttingen Alemania) y se escanea usando el Escáner GeneArray (Affymetrix). Los datos de micromatriz de muestras derivadas de 3 donantes de BC sin relacionar se analizan usando la herramienta de Minería de Datos de Affymetrix (DMT 4.0), la herramienta de publicación de Affymetrix (MDB 3.0), y el software de análisis de datos estadísticos (Affymetrix Microarray Suite 5.0). Se realizan comparaciones entre las BC tratadas con MMC y sin tratar para genes con una llamada de detección positiva en al menos un grupo experimental y con un número de veces de cambio de

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llegan a ser arreactivas para reestimulación con el mismo antígeno. Estos son signos de suspensión activa en lugar de una falta de respuesta inmune.

Un estudio previo mostró que la exposición a células tumorales necróticas, al contrario que la exposición a células apoptóticas, induce la inmunoestimulación (12). Esto, así como otras observaciones (13), condujo a la hipótesis de que la muerte celular necrótica es inmunogénica, mientras que la muerte celular apoptótica es escasamente inmunogénica o incluso tolerogénica. Desde un punto de vista fisiológico esto tiene sentido, porque la apoptosis es el proceso normal de la muerte celular en nuestros tejidos. Si la apoptosis indujera respuestas inmunes, esto conduciría a inflamación y autoinmunidad. Liu et al. (13) usaron este fenómeno para inducir tolerancia de forma activa. Los esplenocitos apoptóticos en fase de muerte se cargan con ovoalbúmina y se inyectan en ratones singeneicos. Después de una fase inicial de estimulación de linfocitos T, los receptores llegaron a ser tolerantes a la ovoalbúmina (13). Es interesante indicar que los informes muestran que la esperanza de vida de DC tiene consecuencias importantes para la interacción de DC-linfocitos T, y de este modo determina el resultado inmunológico. Hugues et al. concluyeron que las interacciones estables favorecen el cebado de linfocitos T, mientras que breves contactos entre las DC y linfocitos T pueden contribuir a la inducción de tolerancia de linfocitos T (32). En la presente serie de experimentos, MMC aceleraba el proceso natural de la apoptosis, acortando la esperanza de vida de las DC inyectadas y por lo tanto su contacto con los linfocitos T. Esto proporciona una posible explicación para el efecto tolerogénico observado. Obeid et al. (33) analizado recientemente el potencial inmunogénico de células tumorales convertidas en apoptóticas mediante diversos fármacos quimioterapéuticos y observaron que las antraciclinas generan células estimuladoras mientras que otros fármacos, tales como la mitomicina C, no lo hacen. Si se usan antraciclinas, la proteína de chaperón, calreticulina, estaba regulada de forma positiva y era responsable de la acción estimuladora. Este hallazgo es importante para terapia tumoral, que se dirige a la eliminación de células malignas y a la estimulación de forma simultánea de la respuesta inmune frente al tumor. Los hallazgos de los inventores son interesantes en este contexto al demostrar que el tratamiento con MMC convierta a las células en apoptóticas pero -como se muestra mediante micromatriz de Affymetrix -no regula de forma positiva la calreticulina; en su lugar, regula de forma positiva algunas moléculas inmunosupresoras. Aunque la observación de Obeid et al.

(33) se puede usar para mejorar la terapia en cáncer, la observación de los inventores tiene un potencial terapéutico para controlar enfermedad autoinmune o rechazo al injerto.

En el presente estudio, la regulación positiva de genes proapoptóticos, incluyendo LRDD (que codifica PIDD), TNFRSF10b (que codifica TRAIL-R2), PERP, FDXR, TRAF4, y DDIT3 sugería la inducción de apoptosis. Adicionalmente, los inventores observaron regulación negativa de genes que protegen de la apoptosis, tales como NRG2 y CFLAR (que codifica cFLIP y sus variantes I-FLICE, usurpina, FLAME-1). De la forma más importante, la apoptosis de las DC tratadas con MMC se demostró con FACS.

El análisis de expresión genética mostraba que, de forma simultánea a la inducción de la apoptosis, una serie de genes fuertemente inmunosupresores se regulan de forma positiva. La ADM (adrenomedulina), cuya expresión aumentó 10 veces, es un péptido que previene la mortalidad inducida por sepsis, anula la colitis, y proporciona una terapia altamente eficaz para la artritis mediante la disminución de la presencia de células Th1 autorreactivas, induciendo la regulación de los linfocitos T e inhibiendo las respuestas autoinmunes e inflamatorias (14). Otro gen cuya expresión estaba regulada de forma positiva por MMC era TSC22D3 (que codifica GILZ). De forma interesante, el mismo gen está regulado de forma positiva después de la exposición de las DC a glucocorticoides, IL-10, o TGFβ, todos inhibidores inmunológicos bien conocidos (15). GILZ confiere un fenotipo supresor a las DC y las previene de la activación de los linfocitos T (15). Una molécula inducida por GILZ es LILRB4 (que codifica ILT3), una proteína que hace que los monocitos y las DC se hagan tolerogénicos y tiene importancia clínica (16). Algunos receptores humanos de trasplante de corazón con injertos estables tienen linfocitos T supresores en circulación que regulan de forma positiva ILT3 en células de presentación de antígeno al donante (16). Estos hallazgos demuestran una función inmunorreguladora importante de ILT3. Los inventores encontraron un aumento significativo de la expresión de ILT3 en las MMC-BC. Otros genes funcionalmente importantes cuya expresión estaba modulada por MMC son MAFB que dirigen la diferenciación más allá de las DC hacia los monocitos (17), CSF2RA -que transduce señales de GM-CSF (18), MAP4K4 -que media la señalización y la migración celular de TNF-α (19, 20), y GAB2 -que transmite señales repartidas por receptores de citoquina, factor de crecimiento, y antígeno (21). Todos ellos podrían desempeñar un papel en la inmunosupresión inducida por las DC tratadas con MMC.

Tomadas en conjunto, las observaciones de Obeid et al. (33) y las de los inventores sugieren que la inducción de la apoptosis con regulación positiva simultánea de moléculas activadoras convierte a las células en inmunogénicas, mientras que la apoptosis y la regulación positiva de las moléculas inhibidoras convierte a las células en inmunosupresoras.

En la década de 1970, un copolímero de aminoácidos aleatorio, denominado acetato de glatiramer, se desarrolló para imitar la composición de MBP. En ensayos clínicos, el glatiramer reducía la evolución de la discapacidad y reducía de forma significativa la tasa de recaída de MS (34). Algunos estudios mostraban que el copolímero se toleraba frente a una diversidad de antígenos de mielina diferentes. Más recientemente, algunos ligandos científicos de MBP alterados y otros autoantígenos formados por sustitución de aminoácidos en los sitios de contacto de estos epítopo con el receptor de linfocitos T mostraban efectos similares en modelos animales (4). Estas y otras observaciones (35) indican que el uso de un solo epítopo puede inhibir una enfermedad causada por la reactividad

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hacia múltiples autoepítopos al dirigirlos algunos mecanismos reguladores no específicos hacia un cierto órgano. Aparentemente, al contrario que la "propagación" del epítopo, también es posible la "contención" del epítopo. Basándose en estas observaciones, se puede concebir que las MMC-BC cargadas con MBP, aunque dirigiendo la respuesta inmune a un antígeno, también pueden controlar algunas reacciones para moléculas vecinas. Una variante elegante del modelo de los inventores sería la carga de las DC inhibitorias con acetato de glatiramer u otros péptidos alterados derivados de autoantígenos. Sería de esperar que la acción supresora de los péptidos se amplificara.

Los datos in vivo de los inventores se derivan de estudios en el modelo de EAE de murino. Se ha cuestionado hasta que punto este modelo refleja la patogénesis de la MS en seres humanos (1). Por supuesto, ningún dato en ratón, incluyendo los derivados a partir de estudios de EAE, se puede extrapolar de forma automática a seres humanos. Merece la pena mencionar, sin embargo, que a pesar de todas las críticas, los 3 compuestos terapéuticos 3 aprobados para uso en MS -acetato de glatiramer, mitoxantrona y natlizumab -aparecieron directamente a partir de hallazgos en el modelo de EAE (36). Las observaciones de los inventores en ratones ganan relevancia adicionalcon el hallazgo de que los linfocitos T de los pacientes con MS también se suprimen con las MMC-BC cargadas con MBP.

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Claims

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