JP4942892B2 - 草花粉アレルゲンの単離精製方法 - Google Patents

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Description

【０００１】
本発明は、草花粉から群１、２、３、１０および１３の５つのアレルゲンを迅速にかつ効果的に分離、精製する方法に関する。アレルゲン精製に用いる天然原料は、例えば、プレウム プラテンセ（Phleum pratense）のような甘味のある草の花粉である。精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過、およびカチオン交換クロマトグラフィーの新規な組み合わせによる。この方法によって得られるタンパク質は、花粉アレルギーのより改善された診断および花粉アレルギー疾患の治療用医薬製剤に用いることができる。
【０００２】
１型アレルギーは、世界的にも重要である。先進工業国において、人口の２０％までもが、植物、ダニ、猫、犬といった種々の発生源から放たれた、空気中に存在するアレルゲン（空気アレルゲン）によってもたらされるアレルギー性鼻炎、結膜炎、アレルギー性気管支喘息といった病気を患っている。草花粉アレルゲンの場合には、次々にこの１型アレルギー患者の４０％までもが、特定ＩｇＥ活性を示している（Freidhoffらによる1986, J. Allergy Clin Immunol 78, 1190-201）。
【０００３】
１型アレルギーを引き起こす物質は、タンパク質、糖タンパク質およびポリペプチドである。粘膜を介して取り込まれた後、感作された体内において、これらのアレルゲンは、肥満細胞の表面に結合しているＩｇＥ分子と反応する。２またはそれ以上のＩｇＥ分子がアレルゲンを介して相互に結合した場合には、メディエーター（例えば、ヒスタミン、プロスタグランジン）およびエフェクター細胞によるサイトカインの分泌が起こり、それに対応した臨床的な症状が生じる。
【０００４】
あるアレルゲンに対するＩｇＥ抗体を有するアレルギー患者の相対数に応じて、大きい方のアレルゲンと小さい方のものとに区別される。オオアワガエリ（timothy grass、プレウム プラテンセ）の場合には、Phl p 1 (Petersenらによる1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92, 789-796)、Phl p 5 (MatthiesenおよびLoewensteinらによる1991, Clin. Exp. Allergy 21, 297-307; Petersenらによる1992)、Phl p 6 (Petersenらによる1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54)およびPhl p 2/3(Dolecekらによる,1993)が、これまでに大きい方のアレルゲンとして特徴づけられ、Phl p 4(Loewenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62）およびLolium perenneからの群１０および１１(Ansariらによる1987, J. Allergy Clin Immunol. 80, 229-235)が小さい方のものとして特徴づけられている。さらに、Phl p 13という名のさらに高分子量の大きい方のアレルゲンが最近記載されている。群１および１３のアレルゲンは、グリコシル化されている。
【０００５】
本発明と関連して、アレルギー群１、２、３、１０および１３が特に重要である。天然アレルゲンの確立された精製方法は、それぞれの場合において、個々のタンパク質の分離による。特定の抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、群１アレルゲンがロリウム ペレンネ（Lolium perenne）(Boutinらによる1996, Int. Arch. Allergy Immunol. 112, 218-225)およびプレウム プラテンセ(Grobeらによる1999, Eur. J. Biochem. 263, 33-40)から、これまでに精製されている。この方法は、容量に限界があり、極度のｐＨを用いるため、本来の構造で得ることができるか否かは保証されない結果を伴う。他の方法は、クロマトグラフィー工程を連続させた種々の多工程である。例えば、群１０(Ansariらによる1987, J. Allergy Clin Immunol. 80, 229-235)または群３(Ansariらによる1989, Biochemistry 28, 8665-8670)のような個々のアレルゲンは、どの場合でも得られる。他のアレルゲンは、これらの方法では、なくなってしまうか、純粋な状態では調製することができない。
【０００６】
特に、Phl p 1 (Lafferらによる1994, J. Allergy Clin. Immunol. 94, 1190-98; Petersenらによる1995, J. Allergy Clin. Immunol. 95(5), 987-994)、Phl p 5 (Vrtalaらによる1993, J. Immunol. 151(9), 4773-4781)、Phl p 6 (Petersenらによる1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108(1), 55-59)およびPhl p 2 (Dolecekらによる1993, FEBS 335(3), 229-304)のＤＮＡ配列データを得ることができる。ｃＤＮＡ配列を用いて診断および治療に用いることのできる組換えアレルゲンを作ることもできる（ScheinerおよびKraft, 1995, Allergy 50, 384-391）。
【０００７】
効果的なアレルギーの治療上の処置の典型的な方法は、特定の免疫療法または減感作療法である（Fiebig, 1995, Allergo J. 4(6), 336-339; Bousquetらによる1998, J. Allergy Clin Immunol. 102(4), 558-562）。これらの方法では、患者に、投与量を増加して天然アレルゲン抽出物を皮下注射する。しかし、この方法では、アレルギー反応またはアナフィラキシーショックの危険を伴う。これらの危険を最小限にするため、アレルゴイドの形態の画期的な製剤が用いられている。これらは化学的に修飾したアレルゲン抽出物であり、処理されていない抽出物と比較して著しく減少したＩｇＥ反応性を有するが、同一のＴ細胞活性を有する（Fiebig, 1995, Allergo J. 4(7), 377-382）。
【０００８】
高純度アレルゲンを用いることにより、治療の最適化の度合いを高めることが可能となる。以前の抽出物は、種々のアレルゲンを添加して、特定の免疫療法には必要でない非アレルギー性の付随タンパク質の他に免疫原性のものを比較的多量に含むため、天然アレルゲンからの限定された混合物は、これらに取って替わることができる。アレルゲン混合物を用いることにより、感作領域に対応した患者特異的アレルゲン混合物の製造もまた可能となる。高純度の天然アレルゲンを用いた安全な減感作療法の現実的な見通しが、修飾アレルゲンによって提示される。この場合、治療に必要なＴ細胞エピトープは害されることなく、ＩｇＥエピトープは、第２および第３の構造の不可逆的な修飾により破壊される。
【０００９】
本発明は、同様にしてインビトロおよびインビボのアレルギー疾患、特に花粉症の診断に有利に用いることができる。この目的を達成するために、精製アレルゲン群をＩｇＥ抗体の検出の確立した方法に用いる。
【００１０】
本発明は、効率的な３段階精製によって短時間水溶性花粉抽出物から４つの大きい方のアレルゲンおよび１つの小さい方のアレルゲンを分離する生化学的精製方法に関する。用いる天然原料は、例えば、特にプレウム プラテンセ、ロリウム ペレンネ、ダクチリス グロメラタ（Dactylis glomerata）、ポア プラテンシス（Poa pratensis）、シノドン ダクチロン（Cynodon dactylon）、ホルクス ラナツス（Holcus lanatus）といったグラミンの花粉である。図１は、草花粉抽出物から上述した５つのアレルゲンの精製の概要を示す。本明細書中では、他に用いない限り、Phl p １からPhl p 13の呼び名のアレルゲンは、１〜１３のアレルゲンの名に対応する。
【００１１】
従って、本発明は、本質的に純粋な群１、２、３、１０および１３の草アレルゲンの分離の方法に関し、グラミン花粉の水溶性抽出物を用意し、可溶性成分を疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過の工程、および所望に応じて、カチオン交換クロマトグラフィーで処理するものである。
【００１２】
本発明によれば、１つのタイプのクロマトグラフィーを複数工程で行うこともまた可能であるが、一般的には、この場合は、この方法が効果的であるため、一つの分離工程で十分である。
方法は、特にプレウム プラテンセ、ロリウム ペレンネ、ダクチリス グロメラタ、フェスツカ プラテンシス（Festuca pratensis）、ホルクス ラナツス、セカレ セレアレ（Secale cereale）種の花粉からアレルゲンを分離するのに特に適する。
【００１３】
好ましい態様では、抽出が、トリス／Hcl緩衝水溶液を用いて行われる。しかし、本発明によれば、他の既知の緩衝液を用いることもできる。
アレルゲンの精製には、抽出物の水溶性成分を用いる。この目的のために、抽出物を、３〜８分間、好ましくは、５分間、18,000〜30,000×gで遠心分離し、上澄みをさらに精製するために取る。代わりに、水溶性成分は、他の方法、例えば濾過によって分離することもできる。
【００１４】
最初のクロマトグラフィー工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、Sepharose（登録商標）を用いて行われる。この場合、多量の不純物が、支持体上に固定されるが、所望のアレルゲンはカラム中を通過して、フラクション中に位置が確認される。相当する他の支持体材料もまた、同様に用いることができる。
従って、本発明は、群１、２、３、１０および１３草アレルゲンを疎水性相互作用クロマトグラフィーにより他の成分から分離するに相当する方法に関する。
【００１５】
それに続く精製工程において、草アレルゲンは、３つのフラクションに分離され、群１および１３のアレルゲンはそれぞれ１つのフラクションを示し、群２、３および１０は、３つめのフラクションを示す。従って、本発明は、特に群１および１３アレルゲンが、それに続くゲル濾過工程による分離フラクションから得られ、群２、３および１０アレルゲンから分離される方法に関する。
【００１６】
本発明によれば、後者は、それに続くカチオン交換によるクロマトグラフィー工程によってそれぞれ分離することができる。従って、本発明は、ゲル濾過工程後に得られる群２、３および１０アレルゲンをそれに続くカチオン交換クロマトグラフィーによってそれぞれ分離する方法に関する。
【００１７】
アレルゲンは、それ自体公知の、特に等電点電気泳動法、ＵＶ吸収測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび特異的抗体などの方法によって、それらについて既知の異なる物理的、化学的、生物学的または免疫学的な物性によって特定される。これらの方法および技術は、知られており、一般的な用語として記載されている。本発明によって得られるアレルゲンの収量は、当初用いた草花粉の総タンパク質に対して、０．５〜１．５％である。
【００１８】
本発明は、また、アレルゲン成分を決定する患者特異的感作領域を特定する役割としてインビボおよびインビトロ診断を改善するのにもまた用いる。従って、本発明は、請求項１〜６によって得られるアレルゲンを用いて花粉アレルギーをインビボおよびインビトロで診断する方法に関する。
【００１９】
本発明は、同様に草花粉アレルギーの特異的免疫療法のための改善された製剤を製造するために用い、免疫原性はあるが治療には不適切な抽出成分を分離することによって達成される。さらに、精製アレルゲンの化学反応により、アレルゴイド製剤を得ることができる。従って、本発明は、本発明の方法によって得られる１または２以上のアレルゲンおよび所望に応じて、相当する助剤および賦形剤を含む医薬製剤に関する。
【００２０】
方法について、以下、詳細に記載する。
オオアワガエリ（timothy grass）草花粉からの天然アレルゲンの精製を３工程で行う（図１参照）。トリス／Hcl緩衝液（20mM トリス／Hcl、1mM EDTA、ｐＨ8.0）を用いて３０分間の、花粉の水性抽出後、抽出物を遠心分離、好ましくは、５分間で20,000×ｇで分離する。トリス／HCl緩衝（20mM トリス／HCl、1mM EDTA、ｐＨ8.0）上澄み液を１Ｍアンモニウム硫酸塩で処理し、その後に、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Phenyl-Sepharose High Performance, Pharmacia）で処理する。典型的なカラムは、支持材料を５０〜１００mlで充填し、約５ml/minの流速で操作する。カラムを通過するフラクションは、５つのアレルゲン群：群１（３０〜３５ｋＤａ）、群２（１１ｋＤａ）、群３（１２ｋＤａ）、群１０（１３ｋＤａ）および群１３（５５〜６０ｋＤａ）を含む。その後、好ましくは、限外濾過または凍結乾燥により、体積を減少させる。
【００２１】
第２の工程では、Superdex(登録商標) 75 準備グレード（Pharmacia）または、この目的に適する類似の既知の支持材料を用いて、異なる分子量に従ったゲル濾過により、群１３および１アレルゲンを低分子量アレルゲンゲル濾過によって分離する。溶出液は、好ましくは、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムである。カラムは、約５ml/minの流速で操作する。３つのフラクション、即ち、アレルゲン１および１３（それぞれ分離される）および２、３および１０（一つのフラクション）を含むものが得られる。
【００２２】
ゲル濾過の３つめのフラクションで一緒に溶離された、低分子量群２、３および１０アレルゲンがカチオン交換クロマトグラフィーによってそれぞれ分離される。この目的のために、凍結乾燥された試料を緩衝液、好ましくは、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２に溶かし、およびこの緩衝液で平衡化したカチオン交換カラム（例えば、Source S(登録商標)）を用いる。カラムを通過するフラクションは、酸性アレルゲン２を含む。結合アレルゲン３および１０は、０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの塩勾配によって約２０カラム体積後にそれぞれ続けて溶離する。従って、低分子量アレルゲン群は、それぞれのアレルゲンに分離される。他のカチオン交換材料もまた、本発明に従って、用いることもできる。
【００２３】
特定の一連のクロマトグラフィー工程およびクロマトグラフィー媒体の選択によって特定され、得られる本発明による方法によって、本発明は、労力および時間のかかることなく多量の高純度、天然草アレルゲンを分離する、高度に測量可能な製造方法を容易にするものであり、技術的にも実施することができる。用いられる精製方法は、タンパク質に対しても非常に穏やかなため、それらの構造および抗原性が保持される。このことは、アレルギー疾患の良好な診断に必要条件である。
【図面の簡単な説明】
【図１】草花粉抽出物から上述した５つのアレルゲンの精製の概要を示す。

Claims (7)

  1. 高純度の群１、２、３、１０および１３草アレルゲンを分離する方法であって、グラミン（Gramineae）花粉の水性抽出物を用意し、該水性抽出物の可溶性成分を疎水性相互作用クロマトグラフィーで処理し、該クロマトグラフィーのカラムを通過したフラクションをゲル濾過の工程で処理することを特徴とする、前記方法。
  2. ゲル濾過の工程で得られた可溶性成分をカチオン交換クロマトグラフィーでさらに処理することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. プレウム プラテンセ、ロリウム ペレンネ、ダクチリス グロメラタ、フェスツカ プラテンシス、ホルクス ラナツス、ポア プラテンシス、セカレ セレアレ種の花粉を抽出に用いることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
  4. 抽出が、トリス／Hcl緩衝水性溶液を用いて行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 第１工程において、群１、２、３、１０および１３草アレルゲンを疎水性相互作用クロマトグラフィーによって他の成分から分離することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 群１および１３アレルゲンをそれに続くゲル濾過工程によって、別個のフラクションから得、群２、３および１０アレルゲンから分離することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  7. ゲル濾過工程の後に得られる群２、３および１０アレルゲンを、それに続くカチオン交換クロマトグラフィーによって互いから分離することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
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