PL205323B1 - Sposób wydzielania i oczyszczania alergenów pyłków traw grup 1, 2, 3, 10 i 13 oraz sposób otrzymywania alergenów pyłków traw grupy 13 - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób szybkiego i efektywnego wydzielania i oczyszczania pięciu alergenów pyłków traw z grup 1, 2, 3, 10 i 13 oraz sposób otrzymywania alergenów pyłków traw grupy 13. Naturalnym surowcem do oczyszczania alergenów są pyłki słodkich traw, jak np. Phleum pratense. Oczyszczanie według wynalazku oparte jest na odpowiedniej kombinacji hydrofobowej chromatografii interakcyjnej, filtracji żelowej i chromatografii kationowymiennej. Tak otrzymane proteiny mogą być stosowane do celu udoskonalenia diagnostyki alergii pyłkowych jak również w preparatach farmaceutycznych do leczenia alergii pyłkowych.

Alergie typu 1 mają ogromne znaczenie. Aż do 20% ludności w krajach uprzemysłowionych cierpi z powodu takich dolegliwości jak alergiczny nieżyt nosa, zapalenie spojówek lub dychawica oskrzelowa, które to dolegliwości są wywoływane przez alergeny znajdujące się w powietrzu (aeroalergeny). Alergeny te są uwalniane z różnorodnych źródeł takich jak rośliny, roztocza, koty lub psy. Aż do 40% alergików typu 1 wykazuje specyficzną reaktywność IgE z alergenami pyłków traw (Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-201).

Substancje wywołujące alergie typu 1, składają się z protein, glikoprotein lub polipeptydów. Alergeny te wchłaniane są przez błonę śluzową uczulonej osoby, wiążąc przeciwciała IgE na powierzchni komórek tucznych. Dwie lub więcej i cząsteczki IgE są sieciowane razem przez alergen, a następnie wytrząsane mediatorami (np. histaminą, prostaglandyną) i cytokinami przez komórki efektora i w ten sposób wywołują odpowiednie objawy kliniczne.

W zależ ności od względnej dla alergika częstości, z jaką przeciwciała IgE reagują przeciw pewnym alergenom, zostają one zróżnicowane na alergeny silne i słabe. W przypadku pyłków traw (Phleum pratense) alergeny Phl p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92, 789-796), Phl p 5 (Matthiesen i Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21, 297-307; Petersen et al., 1992), Phi p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54) i Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993) są charakteryzowane jako alergeny silne, a Phl p 4 (Lowenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62) oraz grupy 10 i 11 z Lolium perenne (Ansari et al., 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 80, 229-235) jako alergeny słabe. Ostatnio opisano kolejny wysokocząsteczkowy silny alergen, który został oznaczony jako Phi p 13. Alergeny grup 1 i 13 są glikozylowane.

Wynalazek dotyczy grup alergenów 1, 2, 3, 10 i 13. Sposoby oczyszczania naturalnych alergenów oparte są na wydzielaniu każdego z nich z poszczególnych protein. Oczyszczanie przeprowadza się przy pomocy chromatografii powinowactwa przy użyciu specyficznych przeciwciał, którymi są np. alergeny grupy 1 z Lolium perenne (Boutin et al., 1996, Int. Arch. Allergy Immunol. 112, 218-225) i Phleum pratense (Grobe et al., 1999, Eur. J. Biochem. 263, 33-40). Metoda ta jest jednak ograniczona względem swojej pojemności i przeprowadzana jest w ekstremalnym pH, w związku z tym otrzymane podstawowe konformacje nie mogą być ustalone z całą pewnością. Inne metody postępowania oparte są na różnych wielostopniowych, następujących po sobie etapach chromatograficznych. W ten sposób każdorazowo otrzymuje się indywidualny alergen, jak np. z grupy 10 (Ansari et al., 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 80, 229-235) lub grupy 3 (Ansari et al., 1989, Biochemistry 28, 8665-8670). Inne alergeny zostają w tej metodzie utracone lub nie są otrzymywane w czystej formie.

Sekwencje DNA znajdują się między innymi wśród alergenów Phl p 1 (Laffer et al., 1994, J. Allergy Clin. Immunol. 94, 1190-98; Petersen et al., 1995, J. Allergy Clin. Immunol. 95(5). 987-994), Phl p 5 (Vrtala et al., 1993, J. Immunol. 151 (9), 4773-4781), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108 (1), 55-59) i Phl p 2 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304). Przy pomocy sekwencji cDNA możliwe jest tworzenie rekombinowanych alergenów, które mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce i leczeniu (Scheiner i Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391).

Klasyczną metodą skutecznego terapeutycznego leczenia alergii stanowi specyficzna immunoterapia lub hipouczulanie (Fiebig, 1995, Allergo J. 4(6), 336-339; Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4), 558-562). W metodzie tej wstrzykuje się pacjentom podskórnie dawki ekstraktów naturalnych alergenów, chociaż niewątpliwie istnieje niebezpieczeństwo reakcji alergicznych lub nawet wstrząsu anafilaktycznego. Aby zminimalizować ryzyko wprowadza się innowacyjne preparaty w formie alergoidów. Przy tym stosuje się chemicznie modyfikowane ekstrakty alergenów, które wyraźnie redukują reaktywność IgE, jednak T-komórkowa reaktywność jest identyczna w porównaniu z niezmienionym ekstraktem (Fiebig, 1995, Allergo, J. 4 (7), 377-382).

Dalsza poprawa skuteczności leczenia jest możliwa przy użyciu alergenów wysokocząsteczkowych. Zdefiniowane mieszaniny [koktajle] z naturalnych alergenów mogą zastąpić dotychczasowe ekstrakty,

PL 205 323 B1 te z kolei różne alergeny wykazują większą liczbę immunogenów, ale nie alergenowych protein towarzyszących, które nie są konieczne do specyficznej immunoterapii. Zastosowanie mieszanin [koktajli] alergenów dopuszcza również przygotowanie odpowiednich mieszanin alergenów, dobranych odpowiednio do zakresu nadwrażliwości konkretnego pacjenta. Realistyczne perspektywy, przeprowadzania pewnych hipouczuleń z naturalnymi alergenami wysokiej czystości, dają alergeny modyfikowane, przy tym epitopy IgE zostają zniszczone przez nieodwracalną modyfikację drugorzędowej i trzeciorzędowej struktury, zasadniczo bez szkody dla leczenia komórek T epitop (T-cell epitope).

Wynalazek może być korzystnie stosowany w diagnostyce in vitro i in vivo chorób alergicznych, szczególnie kataru siennego. W tym celu oczyszczanie grupy alergenów do wykrywania przeciwciał IgE przeprowadza się sposobem według wynalazku.

Istotą wynalazku jest sposób wydzielania i oczyszczania alergenów pyłków traw grup 1, 2, 3, 10 i 13, charakteryzują cy się tym, ż e tworzy się wodny ekstrakt pył ków wybranych spoś ród gatunków Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Festuca pratensis, Holcus lanatus, Poa pratensis i/lub Secale cereale, rozpuszczalne składniki poddaje się hydrofobowej chromatografii interakcyjnej, a następnie filtracji żelowej i jeśli właściwe chromatografii kationowymiennej.

Biochemiczny sposób według wynalazku poprzez efektywne trzyetapowe oczyszczanie prowadzi do wydzielenia 4 alergenów silnych i 1 alergenu słabego z wodnych krótkotrwałych ekstraktów pyłków. Z reguły jest to sposób na tyle efektywny, aby każdorazowo uzyskać czyste rozdzielenie.

W korzystny sposób ekstrakcję przeprowadza się przy pomocy buforowanego roztworu wodnego Tris/HCI. Jednak podczas wykonywania wynalazku mogą być również stosowane inne znane buforowane roztwory wodne.

Korzystne jest, aby najpierw za pomocą hydrofobowej chromatografii interakcyjnej, na przykład na Sepharose®, oddzielić alergeny traw grup 1, 2, 3, 10 i 13 od innych składników. Na tym etapie wiele zanieczyszczeń wiąże się z nośnikiem, podczas gdy pożądane alergeny znajdują się w produkcie podsitowym. W tym celu mogą być również stosowane odpowiednie inne materiały nośne.

Korzystne jest przy tym, aby w wyniku filtracji żelowej alergeny grupy 1 i 13 otrzymywane były w oddzielnych frakcjach oddzielonych od frakcji alergenów grup 2, 3 i 10. W etapie tym alergeny traw rozdziela się zatem na trzy frakcje.

Sposób według wynalazku, można korzystnie zakończyć etapem chromatografii kationowymiennej, aby uzyskać rozdział alergenów grup 2, 3 i 10 między sobą.

Istotą wynalazku jest również sposób otrzymywania alergenów pyłków traw grupy 13, charakteryzujący się tym, że tworzy się wodny ekstrakt pyłków wybranych spośród gatunków Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Festuca pratensis, Holcus lanatus, Poa pratensis i/lub Secale cereale, rozpuszczalne składniki poddaje się hydrofobowej chromatografii interakcyjnej, a następnie filtracji żelowej w wyniku której otrzymuje się trzy frakcje, gdzie grupy 1, 13 znajdują się w dwóch oddzielnych frakcjach, a grupy 2, 3 i 10 stanowią frakcję trzecią. Rzeczone pyłki należą korzystnie do gatunku Phleum pratense.

Identyfikacja wymienionych, znanych alergenów następuje w oparciu o ich znane różnorodne własności fizyczne, chemiczne, biologiczne i immunologiczne, szczególnie za pomocą izoelektrycznego ogniskowania, pomiaru absorpcji UV, SDSPAGE oraz specyficznych przeciwciał. Te sposoby i techniki są znane i szeroko opisane.

Wydajność uzyskiwania alergenów sposobem według wynalazku wynosi 0,5-1,5% względem protein pochodzących z pyłków traw.

Wynalazek może również służyć do poprawy diagnostyki in vivo i in vitro w ramach identyfikacji widma uczuleniowego specyficznego dla poszczególnych pacjentów.

Wynalazek może także służyć do wytwarzania ulepszonych preparatów do specyficznej immunoterapii alergii pyłków traw, co osiąga się przez oddzielenie od i immunogenów, lub przez leczenie nieistotnymi składnikami ekstraktu. Ponadto można przez chemiczną wymianę oczyszczonych alergenów uzyskać preparaty alergoidów.

Na rysunku Fig. 1 przedstawiono schemat wydzielania i oczyszczania danych pięciu alergenów z ekstraktów traw polnych. Obok odpowiednich oznaczeń alergenów Phl p i od 1 do 13 w tekście stosowane są również oznaczenia alergenów od 1 do 13.

Aby oczyścić określony alergen wykonuje się ekstrakt rozpuszczalnych składników. W tym celu odwirowuje się ekstrakt przez 3 do 8 minut, korzystnie 5 minut przy 18.000 do 30.000 x g, następnie przeprowadza się dalsze oczyszczanie. Alternatywnie można również rozdzielić nierozpuszczalne składniki innymi metodami, i na przykład poprzez przeprowadzanie filtracji.

PL 205 323 B1

Sposób według wynalazku został przedstawiony szczegółowo poniżej:

Oczyszczanie naturalnych alergenów pyłków traw przeprowadza się sposobem trzyetapowym (patrz rysunek Fig. 1). Wodny ekstrakt buforowanego roztworu Tris/HCI (20 mM Tris/HCI, 1 mM EDTA, pH 8,0) z pyłkami wirowano przez 30 minut, i następnie korzystnie przy 20.000 x g przez pięć minut, a następnie rozdzielono. Warstwę górną buforowanego Tris/HCI (20 mM Tris/HCI, 1 mM EDTA, pH 8,0) zadano 1M sulfonianu amonu i poddano hydrofobowej chromatografii interakcyjnej (HIC) (Phenyl-Sepharose, High Perforance, Pharmacia). Typową kolumnę o pojemności 50 do 100 ml upakowuje się materiałami nośnymi i omywa strumieniem około 5 ml/min. Frakcja przepływowa zawiera proteiny pięciu grup alergenów: grupy 1 (30-35 kDa), grupy 2 (11 kDa), grupy 3 (12 kDa), grupy 10 (13 kDa) i grupy 13 (55-60 kDa). Następnie zmniejsza się jej objętość, korzystnie przez ultrafiltrację lub liofilizację.

W drugim etapie alergeny grup 13 i 1 w wyniku filtracji żelowej, oddziela się od alergenów niskocząsteczkowych, wykorzystując zróżnicowanie masy cząsteczkowej, przy użyciu Superdex® 75 prep grade (Pharmacia) lub podobnych znanych właściwych materiałów nośnych. Korzystne medium do elucji stanowi 50 mM kwaśnego węglanu amonowego, który omywa kolumnę strumieniem około 5 ml/min. Otrzymuje się trzy frakcje, które stanowią alergeny 1, 13 (rozdzielone) oraz 2, 3, 10 i (w jednej frakcji).

Niskocząsteczkowe alergeny grup 2, 3 i 10, które uzyskano razem w trzeciej frakcji w wyniku filtracji żelowej, zostają rozdzielone między sobą, za pomocą chromatografii kationowymiennej. W tym celu próbkę poddaje się liofilizacji w wodnym buforze, korzystnie 20 mM buforu fosforanowego, nastawia się pH 7,2 i rozdziela za pomocą buforu zrównoważonego na kolumnie kationowymiennej (np. Source S ®). W produkcie podsitowym znajdują się kwaśne alergeny 2. Związane alergeny 3 i 10 wymywane są jeden po drugim, przez gradient solny od 0 do 500 mM NaCI w ilości około 20 objętości kolumny. Tym samym rozdziela się niskocząsteczkowe grupy alergenów na pojedyncze alergeny. Podczas przeprowadzania sposobu według wynalazku mogą być również użyte inne materiały kationowymienne.

Sposób według wynalazku umożliwia więc, uzyskanie większej liczby wysoko oczyszczonych, naturalnych alergenów traw przy nieznacznym nakładzie pracy i czasu. Uzyskuje się to poprzez zastosowanie specjalnej sekwencji etapów chromatograficznych jak również dobór mediów chromatograficznych i wysokoskalibrowanych, technologicznie zaawansowanych sposobów wytwarzania. Dzięki zastosowanemu sposobowi oczyszczania otrzymuje się cenne proteiny o niezmienionej konformacji i antygenowoś ci, co jest warunkiem skutecznej diagnostyki chorób alergicznych.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wydzielania i oczyszczania alergenów pyłków traw grup 1, 2, 3, 10, 13, znamienny tym, że tworzy się wodny ekstrakt pyłków wybranych spośród gatunków Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Festuca pratensis, Holcus lanatus, Poa pratensis i/lub Secale cereale, rozpuszczalne składniki poddaje się hydrofobowej chromatografii interakcyjnej, a następnie filtracji żelowej i jeśli właściwe chromatografii kationowymiennej.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakcje przeprowadza się przy użyciu buforowanego wodnego roztworu Tris/HCI.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że najpierw za pomocą hydrofobowej chromatografii interakcyjnej alergeny traw grup 1, 2, 3, 10, 13 oddziela się od innych składników.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w wyniku filtracji żelowej alergeny grup 1 i 13 otrzymuje się w oddzielnych frakcjach, oddzielonych od frakcji alergenów grup 2, 3, i 10.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że alergeny grup 2, 3 i 10 otrzymane w wyniku filtracji żelowej zostają rozdzielone między sobą poprzez chromatografię kationowymienną.
6. 6. Sposób otrzymywania alergenów pyłków traw grupy 13, znamienny tym, że tworzy się wodny ekstrakt pyłków wybranych spośród gatunków Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Festuca pratensis, Holcus lanatus, Poa pratensis i/lub Secale cereale, rozpuszczalne składniki poddaje się hydrofobowej chromatografii interakcyjnej, a następnie filtracji żelowej w wyniku której otrzymuje się trzy frakcje, gdzie grupy 1, 13 znajdują się w dwóch oddzielnych frakcjach, a grupy 2, 3 i 10 stanowią frakcję trzecią.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że pyłki należą do gatunku Phleum pratense.