ES2293641T5

ES2293641T5 - Alergeno recombinante, fragmentos del mismo, moleculas de adn recombinante correspondiente, vectores y huespedes que contienen las moleculas de adn, usos para diagnostico y terapeuticos de dichos alergenos y fragmentos.

Info

Publication number: ES2293641T5
Application number: ES95922855T
Authority: ES
Inventors: Sylvia Laffer; Dietrich Kraft; Peter Valent; Wolfgang Sperr; Tanja Ball; Rudolf Valenta; Susanne Vrtala; Markus Susani
Original assignee: Phadia AB
Current assignee: Phadia AB
Priority date: 1994-06-14
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 2010-12-13
Anticipated expiration: 2015-06-14
Also published as: US20020052490A1; WO1995034578A1; US6559120B2; ATE371671T1; US7148019B2; ES2293641T3; DE69535587T2; DE69535587D1; US6008340A; SE9402089D0; EP0763059B1; DE69535587T3; US20030171567A1; EP0763059B2; EP0763059A1; JPH10501417A; AU2759895A

Abstract

UNA MOLECULA DE ADN RECOMBINANTE QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA (I) QUE CODIFICA UN POLIPEPTIDO QUE PRESENTA LA ANTIGENICIDAD DE UNO, DOS O MAS CLONES LDE EPITOPE PHL P I (28, 34, 41, 42, 43, 50, 52, 64, 80, 85, 86, 95, 97, 98, 103, 108, 109, 113, 114) CON LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DEFINIDAS EN LA FIGURA 2 Y PREFERIBLEMENTE SIENDO DERIVADOS DE HIERBAS O PLANTAS MONOCOTILEDONICAS, O UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDO (II) QUE HIDRIDIZA CON DICHA SECUENCIA DE NUCLEOTIDO (I) BAJO CONDICIONES DE ALTA SEVERIDAD. POLIPEPTIDOS QUE PRESENTAN LA ANTIGENICIDAD DE UNO, DOS O MAS CLONES DEL EPITOPE PHL P I (28, 34, 41, 42, 43, 50, 52, 64, 80, 85, 86, 95, 97, 98, 103, 108, 109, 113, 114) CON LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DEFINIDAS EN LA FIGURA 2. VECTORES DE EXPRESION RECOMBINANTE QUE CONTIENEN LA MOLECULA RECOMBINANTE Y CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS CON EL VECTOR. METODOS DE DIAGNOSTICO BASADOS EN LA UTILIZACION DE LOS POLIPEPTIDOS EN INMUNOENSAYOS PARA ANTICUERPOS HUMORALES Y REACCIONES CELULARES.

Description

La presente invención se refiere a los aspectos del título del alérgeno de polen de césped principal Phl p I y epítopes de unión a IgE presentes en este alérgeno y los haptenos correspondientes. La invención se refiere a fragmentos incluyendo haptenos de unión a IgE, de otros cereales y alérgenos de plantas monocotiledóneas que contienen los epítopes de unión a IgE de PhI p l. La invención se refiere principalmente a epítopes que normalmente se encuentran en uno o más alérgenos del grupo I.

Antecedentes de la invención

Hasta el 20% de la población en los países industrializados sufre de los síntomas alérgicos de Tipo I (rinitis, conjuntivitis, asma bronquial) (Myamoto et al, 1992). La reticulación de IgE que se une a los mastocitos y basófilos mediante el receptor PcERI de alta afinidad es el episodio clave que conduce a laliberación de los mediadores biológicos tales como histamina (Segal et al., 1977). El episodio de reticulación por alérgenos representa, por lo tanto, una diana potencial para la terapia de la alergia de Tipo I. Tales planteamientos terapéuticos se podrían usar o bien porciones de la molécula de IgE u otros ligandos, que interfieren con la unión de IgE al receptor FcE de alta afinidad, o reactivos que bloquean la cascada de transducción de señal posterior previniendo de esta manera la desgranulación de los mastocitos (Dreskin et al., 1988). Otra posibilidad para la terapia específica sería usar haptenos derivados de alérgenos completos que mediante unión al IgE de manera monovalente podría bloquear la reticulación de IgE (Valenta et al., 1993a).Los haptenos de IgE también se podrían usar para modular la respuesta inmune o apra inducir la tolerancia mediante inmunoterapia con un mínimo de efectos secundariso anafilácticos. Los haptenos se pueden obtener a partir de alérgenos completos mediante digestión proteolítica. Sin embargo, a menudo esto da como resultado una mezcla de fragmentos y enzimas que son difíciles de caracterizar. La síntesis de péptidos basada en la secuencia de aminoácidos de los alérgenos, es un planteamiento alternativo. Recientemente se aislaron un número de ADNc que codifican importantes alérgenos (Scheiner et al., 1992) que se pueden usar para determinar los epítopes de IgE mediante técnicas biológicas moleculares.

La alergia de polen de césped se extiende por todo el mundo y de acuerdo con la frecuencia de alergia al polen de césped se puede esperar que el 75% de todos los pacientes alérgicos que sufren de alergia de polen de césped (Freidhoff et al., 1986).

Entre los pacientes alérgicos al polen de césped más del 90% muestra la reactividad de IgE con los alérgenos del grupo I (Freidhoff et al., 1986; Valenta et al., 1992).

La secuencia de aminoácidos completa y secuencias de nucleótidos de los alérgenos principales de polen de césped se han conocido durante algún tiempo (Phl p I de fleo de los prados) (Laffer et al., 1993); Lol p I de ray grass (Lolium perenne) (Pérez et al., 1990; Griffith et al., 1991; Universidad de Melbourne documento WO-A-9203550; Brunet C. et al., Simposio Internacional de Biología Molecular de Alérgenos y la Respuesta Atópica, Ciudad de Québec, Canadá, febrero 18 -22, 1995; Lamontagne P et al., Simposio Internacional de Biología Molecular de Alérgenos y la Respuesta Atópica, Ciudad de Québec, Canadá, febrero 18 -22, 1995), y de centeno de Sec c I de fleo de los prados (Phleum pratense) (Laffer et al., datos no publicados).

Durante el año de prioridad se ha descrito la determinación de los clones 80, 97 y 98 como portadores para un epítope de unión a IgE conservado del grupo I (Ball et al., 1994a, b, c; Laffer et al., 1994).

Esch y Klapper (Mol Immunol, vol 26, nº 6, páginas 557 -561, 1989) describen el aislamiento de una serie de péptidos de cinco alérgenos del grupo I. Los péptidos se generaron mediante digestión tríptica limitada y se ensayaron con un mAb conocido para reacción cruzada con todos estos alérgenos del Grupo I. Los péptidos así identificados eran altamente homólogos entre sí.

Valenta et al (Arbeiten aus dem Paul Ehrlich Institut, 1994) compara las propiedades de alérgenos de polen de abedul y fleo de los prados recombinantes con sus parejas naturales con relación a las propiedades de unión a igE y liberación de histamina. Concluyen que los alérgenos recombinantes se pueden considerar seriamente para diagnosis de la alergia de Tipo

I.

Definición

El término hapteno de IgE identifica fragmentos cortos de alérgeno sobre los que solamente un anticuerpo de IgE con una especificidad dada se permite que se una. El hapteno de unión a IgE verdadero no proporcionará liberación de histamina debido a que contiene el sitio de unión para un anticuerpo de IgE exclusivamente. El término epítope en el contexto de la presente invención se refiere a un epítope de IgE si no se especifica de otra manera. Se puede localizar un epítope sobre o bien un hapteno de IgE o un polipéptido más largo que comprende varios sitios / epítopes de unión a IgE. El término IgE preferiblemente se refiere a un IgE humano.

Objetivos de la invención

Los objetivos de la invención son para proporcionar ensayos sencillos, mejores y más fiables in vitro o in vivo para alergia de polen de césped así como procedimientos terapéuticos mejorados para esta enfermedad.

La invención

Un primer aspecto de al invención es una molécula de ADN recombinante tal como se define en la reivindicación 1.

Un segundo aspecto de la invención es un vector de expresión de ADN recombinante o sistema de clonación que comprende una secuencia de control de expresión unido de manera operativa a cualesquiera de las moléculas recombinantes definidas en la reivindicación 1.

Un tercer aspecto de la invención es una célula huésped que contiene una molécula recombinante o vector de acuerdo con el primer o segundo aspecto, respectivamente, tal como se define en la reivindicación 4.

Un cuarto aspecto de la invención es una proteína o polipéptido recombinante tal como se define en la reivindicación 5. La proteína o polipéptido puede estar condensado a un polipéptido adicional, tal como β-galactosidasa, GST o proteína lambda c II tal como se define en la reivindicación 6.

En los polinucleótidos y proteínas / polipéptidos de la invención, al menos una de las secuencias definidas en las secuencias 2 constituye una parte esencial. Para los polinucleótidos esto significa que cada uno de ellos no debe ser más largo que el 25% de la secuencia de ADN que codifica el alérgeno PhI p l de longitud completa y preferentemente contiene una secuencia de nucleótidos que codifican al menos un epítope de PhI p l, como si estuviera presente en los fragmentos PHI p I específicados en las secuencias 2. Las cadenas oligo / polinucleótidas de la invención son más cortas que el 25 % del ADN que codifica el anérgeno PhI p I de longitud completa.

Para las proteínas y polipéptidos de la invención “parte esencial” significa que cada uno de ellas(os) debería ser más corto(a) que el 25 % del alérgeno PhI p I de longitud completa.

Por la expresión “un polipéptido que muestra la antigenicidad de al menos uno de los clones 80, 97, 98, significa cualquier parte de péptido que muestra al menos un epítope definido por estos clones y que puede ser reconocible inmunológicamente. Se puede contemplar que los polipéptidos que muestran epítopes de PhI p I se pueden derivatizar para llevar a cabo grupos analíticamente detectables o fases sólidas solubles en agua o insolubles en agua adecuados para inmunoensayos de anticuerpos dirigidos contra ellos, por ejemplo, los anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgM o IgG. En aspectos de la invención con relación a los diagnósticos in vitro (véase más adelante) los péptidos de la invención pueden estar a) ligados a una fase insoluble en agua por una adsorción física o un enlace covalente, o b) conjugado de manera covalente a un grupo detectable analíticamente (marca).

El quinto aspecto de la invención es un procedimiento in vitro para la diagnosis de la alergia a proteínas de plantas tal como se define en la reivindicación 7. Las alergias de referencia son en la mayoría contra el polen de césped. Los anticuerpos relevantes son la mayoría de la clase IgE pero los anticuerpos de IgG también pueden proporcionar información sobre la alergia. En general este procedimiento comprende poner en contacto una muestra de fluido de anticuerpo derivada de un paciente con un polipéptido de la invención. Las cantidades y condiciones se seleccionan de manera que un complejo inmune entre el polipéptido y anticuerpos en la muestra se forman en una cantidad que es una función de la cantidad de los anticuerpos en la muestra. El complejo inmune después se mide de una manera per se.

Un sexto aspecto de la invención es un procedimiento que emplea la medición preferiblemente in vitro, la reacción celular contra un epítope de PhI p l tal como se define en la reivindicación 8.

Las muestras usadas en los procedimientos mencionados anteriormente a menudo se derivan de sangre tal como sangre entera, suero y plasma, aunque también se pueden usar otros fluidos corporales que contienen Ig (lágrimas, etc).

Las formas sólidas comúnmente aceptadas útiles para inmunoensayos son las paredes de pocillos, esferas, barras, hojas, tiras, almohadillas, de microvaloración etc. La fase sólida puede ser porosa o no porosa. El material en la fase sólida puede ser un polímero seleccionado entre polisacáridos y sus derivados, por ejemplo, dextrano, pululan, azarosa, celulosa, etc, o polímeros sintéticos, preferiblemente polímeros de vinilo, tales como poliacrilamidas, poliacrilatos, poliestireno, alcohol polivinílico, etc. Los polímeros en cuestión están a menudo reticulados, particularmente en el caso del polímero de base como tal sea soluble en agua. Los ejemplos de grupos detectables analíticamente son isótopos, sustratos de enzimas, fluoróforos, haptenos, biotina, etc.

Un séptimo aspecto de la invención es el uso de un polipéptido recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 para la producción de un medicamento, tal como se define en la reivindicación 9.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Una descripción detallada que se refiere al procedimiento para determinar un epítope de unión a IgE codificado por los clones 80, 97 y 98. Durante el año de prioridad el mismo procedimiento dio como resultado que se dedujeron los epítopes de unión a IgE (clones 28; 34, 41, 42, 43, 50, 52, 64, 85, 86, 95, 103, 108, 113, 114). Véanse las secuencias 2 para sus secuencias y posiciones específicas dentro del alérgenoPhI p l.

Construcción de una genoteca de ADNc de epítopes del ADNc de PhI p I.

El fragmento de ADNc que codifica Phl p l (Valenta et al, 1992; Laffer et al., 1993) se escindió del plásmido pUC 18 y se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1990). Después se digirió al azar el ADNc con ADNasa (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1990) y se aislaron los fragmentos más cortos que 400 pares de bases mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa. Después los fragmentos de ADNc se reapraron en el extremo con polimerasa de T4 (Boehringer Mannheim, Alemania), se unieron con engarces ECO R I de 8 meros fosforilados en 5’ (Schmidheini, Windisch, Suiza). Después de al digestión con Eco R I, se retiraron los engarces usando una columna de corte (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) y se ligaron las inserciones en los brazos lambda gtll desfosforilados (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). El ADN del fago se empaquetó después in vitro usando extracto de empaquetamiento in vitro (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). En als partículas de fago recombinantes, las inserciones de ADN se llegaron a condensar al gen de la β-galactosidasa.

Inmunoselección de IgE y análisis de los clones de epítopes

Se usaron 100.000 fagos de la genoteca de Phl p l para infectar E. coli Y1090 a una densidad de 5.000 fagos por placa (diámetro de 140 mm). La síntesis de las proteínas recombinantes se indujo cubriendo las placas con filtros de celulosa (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania) sumergidas en IPTG 10 mM (Huynh et al., 1985). Se aislaron 114 clones del epítope PhI p l usando IgE de suero de un paciente alérgico a Phl p l e IgE antihumano de conejo marcado con 125I (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Suecia) como se ha descrito (Breiteneder et al., 1989; Valenta et al., 1991; Vrtala et al., 1993a). Después se caracterizaron los clonesv de los epítopes mediante hibridación con e oligonucleótidos sintéticos que se extienden sobre el ADNc de PhI p l (Oligo A: 5’ GGG GGC TTG TCC ACA TCC TTG TAG CCG C 3’ pares de bases 191 -218 SEQ ID Nº: 1 oligo B: 5’ GGA GAG GTC GA AGTC GTA GGG G 3’ pares de bases 272 -3932 SEQ ID Nº: 2). Oligo C: 5’ CCG CCA CCA CGT CTC CGT CGC CG 3’ pares de bases 573 -537 SEQ ID Nº 3). Se ensayaron diecinueve clones que se habían hibridado con uno solamente de los oligonucleótidos para evaluar la unión de IgE con suero de 12 pacientes alérgicos a Phl p l. Los clones 80, 97 y 98 unidos a IgE de la mayoría de los pacientes se ensayaron además para evaluar la reactividad de IgE con suero de 90 pacientes alérgicos al polen de césped como se ha descrito (Valenta et al., 1992). Para el análisis de secuencia de ADN, se preparó ADN de fago, el epítope que codifica los ADNc se escindieron con Kpnl/Saci, se subclonó en el plásmido pUC 18 y se secuenciaron ambas hebras de ADN usando los cebadores directos e inversos lambda gtll (Clontech, palo Alto, Estados Unidos) con 35s dCTP (Sanger et al., 1977).

Expresión y purificación de un epítope de Ph1p lrecombinante inmunodominante

El epítope codificado por el clon 98 que se unió al IgE del 40% de 90 pacientes alérgicos al polen de césped y contenían el fragmento de ADNc m´s corto se seleccionó para purificación. Los fagos del clon 98 recombinantes se usaron para infectar E. coli 1089 lisogénica (Huynh et al., 1985). El epítope Phl p l codificado por el clon 98 se expersó como proteína de fusión de la β-galactosidasa en cultivo líquido (Huynh et al., 1985) y se purificó mediante afinidad usando una columna de afinidad de β-galactosidasa (Promega, Madison, Estados Unidos) como se ha descrito (Vrtala et al., 1993a). Se obtuvo β-galactosidasa tras la infección de E. coli 1089 con fago lambda gtll vacío y se purificó de la misma manera.

Unión de IgE de alérgenos de polen de fleo de los prados natural y epítopes de Ph1p recombinante.

Se extrajeron los alérgenos de polen de fleo de los prados natural a partir de polen de fleo de los prados (Allergon, Välinge, Suecia) (Vrtala et al., 1993b) se separaron mediante SDS -PAGE (Laemmli et al., 1970) y se transfirieron a nitrocelulosa (Towbin et al., 1979). El epítope de Phl p l recombinante (clon 98) y β-galactosidasa se purificaron y se transfirieron sobre nitrocelulosa. Su usó IgE de pacientes alérgicos al polen de césped para detectar las proteínas transferidas a nitrocelulosa como se ha descrito (Jarolim et al., 1989) mientras que la unión d IgE a los epítopes recombinantes se realizó usando impresiones de partículas de bacteriófagos sometidas a prueba de bandas en una membrana de filtro de clones de fago como se ha descrito en algún lugar (Spitzauer et al., 1993). Los péptidos de unión a IgE que se prepararon por Cambridge Research Biochemicals, Reino Unido, se midió mediante ensayo de transferencia de puntos. Cien nanogramos de dos microgramos de péptido por mancha se transfirieron a nitrocelulosa (Scheicher y Schuell, Dassel, Alemania). Se incluyeron como control positivo los péptidos reactivos derivados de otros alérgenos y sueros reactivos.

Liberación de histamina in vitro de los basófilos de pacientes

Se seleccionaron cuatro pacientes alérgicos al polen de césped con fuerte a reactividad a IgE a los alérgenos del grupo I de polen de césped de acuerdo con la historia del caso, ensayo serológico usando RAST e inmunotransferencia con alérgenos de polen de césped recombinante y ensayo de pinchazo en la piel como se ha descrito (Valenta et al., 1992). Después que se obtuvo el consentimiento informado se recogieron muestras de sangre heparinizadas y se prepararon granulocitos mediante sedimentación en dextrano (Valenta et al., 1992). Después se incubaron granulocitos con dosis crecientes de alérgenos de plen de fleo de los prados, anti – IgE mAb E – 124-2-8 (control positivo), el epítope recombinante de Ph1 p l (clon 98) condensado a β-galactosidasa y (control negativo), respectivamente. La histamina liberada expresada como porcentaje de histamina total se midió en los sobrenadantes sin células mediante radioinmunoensayo (Immunotech, Marsella, Francia)

(Valenta et al., 1989).

Para asegurar que los anticuerpos de IgE específicos para el clon 98 estaban presentes en el suero del paciente cuando se realizó la liberación de histamina, los sobrenadantes que se obtuvieron a partir de la preparación de granulocitos se sondaron en paralelo con alérgenos de polen de fleo de los prados transferido a nitrocelulosa y el epítope Phl p l (clone 98) como se ha descrito (Valenta et al., 1993b). Los sobrenadantes eran de cuatro individuos alérgicos al polen de césped y a partir de un individuo de control no alérgico. También se llevó a cabo un control de tampón sin la adición de un sobrenadante.

RESULTADOS

Aislamiento y caracterización de un clo epítope de IgE inmunodominante a partir de Phi pl.

100.000 fagos de la genoteca de epítopes Phl p l se seleccionaron usando suero IgE de un individuo alérgico al polen de césped con reactividad de IgE a los alérgenos de polen de césped del grupo I. Se obtuvieron 114 clones de fago de unión a IgE y se ensayaron posteriormente para hibridación con 3 oligonucleótidos sintéticos que se extienden sobre ADNc de Phi p l. Se ensayaron adicionalmente 19 clones que se hibridaron con solamente un oligonucleótido con suero IgE de 12 pacientes alérgicos a Phi p l. Todos los pacientes ensayados mostraban reactividad a IgE con el clon 98 que después contenía un epítope inmunodominante. El clon 80 reaccionó con diez de doce pacientes reactivos Phl p l y el clon 97 con once de doce pacientes. Cuando se ensayó con IgE de suero de 90 pacientes alérgicos al polen de césped que se seleccionaron de acuerdo con la historia del caso, RAST (ensayo radioalergoabsorbente) y ensayos de pinchazo de piel, 40% del suero ensayado mostró reactividad de IgE con el clon 98 mientras que el 35% reaccionó con el clon 80 y 97 (datos no mostrados).

Los ADNc de los tres clones de epítopes inmunodominante se secuenciaron y se encontró que codificaban casi la misma parte de la molécula de Phi p l. La figura 2 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos deducidas de los clones de epítope con las secuencias de aminoácidos del alérgeno de polen de césped principal de Phl p l de fleo de los prados (Laffer et al., 1993). El aminoácido del clon 98 se alineó con las secuencias de aminoácidos de los otros alérgenos principales de polen de césped de ray grass (Lolium perenne), Lol p l (Pérez et al., 1990; Griffith et al., 1991), y de centeno de fleo de los prados (Phleum pratense), Sec c l (Laffer et al., datos no publicados). Se encontró que el clon 98 que reaccionó con IgE de todos los pacientes contenía un epítope de IgE inmunodominante de 15 aminoácidos de Phl p l que está altamente conservado entre los otros alérgenos del grupo I y cubre los aminoácidos 101 -115 de la proteína de Phl p l. la parte terminal C del péptido mostró que era crítico para la unión a IgE debido a que el clon 80 y 97 estaban reconocidos menos frecuentemente. Los péptidos de 12 aminoácidos de longitud se sintetizaron de acuerdo con la secuencia de aminoácidos deducida de Ph1 p l con 3 superposiciones de aminoácidos, que se extendían sobre el alérgeno completo. No se pudo detectar ninguna reactividad del IgE de los pacientes con estos péptidos que indica que la longitud crítica para la unión a IgE del epítope del clon 98 está en el intervalo entre 13 -15 aminoácidso (datos no mostrados). Dos péptidos sintéticos (D: aa 76 -87, E: aa 117 -129) que flanqueaba el epítope de IgE del clon 98 tampoco mostraban unión a IgE (datos no mostrados)

Comparación de procedimientos diferentes para la determinación de los epítopes de células B

Se usaron diferentes procedimientos para determinar epítopes de IgE (= epítopes de células B) de Phl p l. Los péptidos de superposición (Geysen et al., 1987) con una longitud de 12 aminoácidos que se sintetizaron de acuerdo con las secuencias de aminoácidos deducida de Phl p l se ensayaron mediante transferencia de puntos para evaluar la reactividad con IgE de suero de pacientes alérgicos de polen de césped. Además diez péptidos que civren las regiones de una alta antigenicidad predicha (Jameson et al., 1988) del alérgeno Phi p l maduro:

Péptido A: aa 1 -17 Péptido B: aa 20 -39 Péptido C: aa 44 -69 Péptido D: aa 76 -87 Péptido E: aa 117 -129 Péptido F: aa 136 -147 Péptido G: aa 151 -159 Péptido H: aa 177 -193 Péptido I: aa 199 -209 Péptido J: aa 214 -237)

también se ensayaron para antigenicidad de IgE con suero de 35 pacientes alérgicos de polen de césped mediante transferencia de puntos. Ninguno de los péptidos ensayados reaccionaban con IgE de más de 5% de los pacientes alérgicos al polen de césped (datos no mostrados).

Dado que el mapeo del epítope basado en el uso de péptidos sintéticos no era exitoso, se usó una estrategia de mapeo recombinante (Mehra et al., 1986). Se construyó una genoteca de ADNc de expresión de epítopes usando ADNc de Phl p l fragmentado al azar. Se pudieron aislar 114 clones de epítopes de IgE de 100.000 fagos que se seleccionaron con IgE de suero de pacientes. Se seleccionaron 19 clones de epítopes que contenían ADNc que se hibridaban solamente con un nucleótido y, por lo tanto, contenían fragmentos pequeños de Phl p l. estos clones se ensayaron después con suero de 12 diferentes pacientes alérgicos de polen de césped para determinar los epítopes de IgE inmunodominantes. Se aisló un epítope de IgE prominente codificado por el clon 98. Esta secuencia no estaba predicha que era antigénica mediante análisis de ordenador (Jameson et al., 1988) ni se identificó mediante ensayo de péptidos sintéticos de superposición que se extienden sobre el Phl p l completo (Geyssen et al, 1987).

Capacidad de unión de IgE de epítopes de Phl p l recombinante

Se expresaron epítopes de Phl p l recombinantes como proteínas de fusión de la βgalactosidasa y se ensayaron para evaluar la unión a IgE como proteínas nativas y desnaturalizaads. La β-galactosidasa producida por el fago lambda gtll sin inserción se usó como un control negativo. Los epítopes de IgE recombinantes se obtuvieron mediante superposición de placas de E. coli/fago recombinante con membranas sumergidas en IPTG (Valenta et al., 1992) mientras para los ensayos en condiciones desnaturalizantes, se purificaron epítopes de IgE mediante afinidad a anticuerpos anti -β-galactosidasa y se separaron mediante desnaturalización con SDS – PAGE (Laemmli et al., 1970) y se electrotransfirieron a nitrocelulosa (Towbin et al., 1979). El clon 98 unido a IgE de los 12 pacientes alérgicos a Phl p l y cuando se ensayaron con suero de 90 pacientes alérgicos al polen de césped que se seleccionaron de acuerdo con criterios clínicos (historia del caso, RAST y ensayo de pinchadura en la piel) se encontraron un 40% de reactivos.

Aunque el clon 98 representó el epítope inmunodominante algunos clones parecían poseer una capacidad de unión a IgE mayor. El epítope del clon 98 inmunotransferido y desnaturalizado también se unió a IgE de los pacientes alérgicos del grupo I. Comparados con los extractos de polen de fleo de los prados naturales se observó una intensidad diferente de unión a IgE. Esto se puede explicar por la presencia de alérgenos del grupo V que migran conjuntamente con los alérgenos del grupo I en los extractos naturales. La β-galactosidasa no se unía a IgE en ninguno de los dos ensayos.

Identificación del epítope de IgE de Phl p l recombinante inmunodominante (clon 98) como un hapteno de IgE mediante ensayos de liberación de histamina in vitro

El epítope de IgE de Phl p l recombinante codificado por el clon 98 se ensayó para evaluar su capacidad para liberar histamina a partir de basófilos de pacientes alérgicos al polen de césped. Aunque los tres pacientes mostraron distinta reactividad de IgE al epítope de Phl p l recombinante transferida a nitrocelulosa, no se observó liberación de histamina cuando los granulocitos de los pacientes se incubaron con el epítope purificado. Se midió una liberación de histamina dependiente y específica de la dosis cuando los granulocitos de los pacientes se incubaron con alérgenos de polen de césped naturales y anti -IgE mAb (control positivo) mientras que no se obtuvo ninguna liberación y tras la incubación con β-galactosidasa (control negativo). Un epítope del clon 98 de pacientes alérgicos al polen de césped pero con altos niveles de IgE contra los alérgenos del grupo V también se incluyó en los ensayos de liberación de histamina. Este paciente no mostró liberación de histamina con el epítope del clon 98 mientras se podía obtener una liberación de histamina dependiente de la dosis con extractos de polen de césped totales que contenían los alérgenos del grupo V.

DISCUSIÓN

El presente estudio demuestra la determinación eficaz de epítopes de IgE usando técnicas de recombinación. El ADNc que codifica el alérgeno principal de polen de césped, Phl p l (Valenta et al., 1992; Laffer et al., 1993), que es la diana para anticuerpos de IgE del 90% de los pacientes alérgicos de polen de césped, y de este modo es la diana para los anticuerpos de IgE de ahsta 75% de todos los pacientes alérgicos (Freidhoff et al., 1986; Valenta et al., 1992) se seleccionó como material de partida para construir una genoteca de ADNc de expresión de epítope. Usando IgE de pacientes alérgicos de polen de césped, se aisló in epítope de IgE inmunodominante que contiene un péptido de Phl p l que tiene una longitud de 15 aminoácidos.

El epítope de 15 aminoácidos descrito no se predijo mediante un algoritmo de ordenador (Jameson et al., 1988) ni se detectó mediante la tecnología de síntesis de péptidos de superposición (Geysen et al., 1987).

El conocimiento de los epítopes de IgE es de particular importancia debido a la liberación de mediadores biológicos tales como histamina durante la reacción efectora alérgica requiere una reticulación divalente mediante alérgenos de IgE unido a mastocitos y basófilos (Segal et al., 1977). Los haptenos de IgE derivados de alérgenos contienen solamente un epítope de IgE y de este modo no pueden desencadenar mecanismos efectores alérgicos salvo que estén polimerizados. El epítope de IgE inmunodominante que se derivó del Phl p l de alérgeno de polen de césped se purificó por lo tanto y se ensayó para evaluar su capacidad de inducir liberación de histamina de los basófilos de pacientes alérgicos de polen de césped. Aunque en todos los experimentos la liberación de histamina se podría inducir con alérgenos de polen de fleo de los prados de una forma dependiente de al dosis, no se provocó ninguna liberación de histamina con el epítope de Phl p l recombinante que por lo tanto representa un hapteno de IgE inmunodominante.

Los haptenos de IgE pueden útiles para dos planteamientos terapéuticos de enfermedades alérgicas. Los haptenos se pueden usar para bloquear el IgE unido a mastocitos y basófilos que por lo tanto inhiben la liberación del mediador. Los epítopes sintéticos se podrían sintetizar en grandes cantidades y usarse directamente en los órganos efectores (mucosa nasal de pulmón, conjuntiva). Sin embargo tal planteamiento requiere la caracterización de muchos haptenos diferentes de acuerdo con el patrón de unión a IgE del paciente. Usando las técnicas de ADN recombinante para la caracterización de alérgenos y la determinación de epítopes de IgE tal planteamiento puede ser posible. Además, se espera que debido a las reactividades cruzadas inmunológicas entre la mayoría de los alérgenos, puede ser posible definir un número limitado de epítopes de IgE (Valenta et al., 1993a). Como se demostró para Phl p l, los epítopes de IgE se pueden determinar mediante inmunoselección de genotecas de expresión derivadas de los ADNc de alérgenos. Un número representativo de pacientes se puede ensayar para evaluar la reactividad de IgE con clones de epítopes recombinantes para obtener estructuras inmunodominantes. En una segunda etapa la mayoría de los epítopes de IgE relevantes adicionales de cada alérgeno se han de caracterizar. Esto podría ser posible debido a que los epítopes de células B, diferentes de los epítopes de células T, ensamblan una conformación mayor que también han de ser disponibles sobre la superficie del alérgeno (Berzofsky et al., 1985; Chothia et al., 1991; Laver et al., 1990) de este modo se puede asumir que la diversidad de los epítopes de células B puede ser mucho más restrictiva que la de los epítopes de células T.

Además del bloqueo de la reacción efectora alérgica, los haptenos de IgE también se pueden usar para modular las respuestas de IgE aplicando estrategias de vacunación de con el propósito de la inducción de tolerancia inmunológica. El tratamiento de hiposensibilización de alergias de tipo I que está establecido en todo el mundo requiere la aplicación creciente de alérgenos mediante la inyección o administración oral. Aunque la hiposensibilización se usa de manera exitosa desde 1911 (Noon et al, 1911), muchos pacientes que experimentan esta terapia padecen de graves efectos secundarios tal como choque anafiláctico. El uso de haptenos de IgE derivados de los alérgenos podría contribuir considerablemente a la mejora de esta terapia mediante reducción de tales efectos secundarios. También pueden ser ventajosos otros procedimientos diferentes que modulan la respuesta de IgE en pacientes alérgicos que se están desarrollando actualmente a partir del uso de haptenos de IgE.

En conclusión, el estudio de los investigadores demuestra que mediante el uso de técnicas recombinantes se podría un hapeno de IgE inmunodominante del Phl p l de alérgeno de fleo de los prados principal. Este alérgeno se seleccionó como un alérgeno modelo debido a una alta proporción (> 90%) de los pacientes alérgicos al polen de césped, y de esta manera casi el 75% de los pacientes alérgicos muestran reactividad de IgE con esta molécula. Aunque el epítope de 10 aminoácidos obtenido unido a IgE entre aproximadamente 40% de los pacientes alérgicos al polen de césped, no se liberó histamina de los basófilos de los pacientes y por lo tanto se puede considerar como hapteno. Los inventores son conscientes que la adición al epítope de Phl p l descrito ciertamente más epítopes de la misma molécula y otros alérgenos de deben definir que bloquean la liberación de histamina mediante saturación de mastocitos y basófilos de los pacientes alérgicos. Sin embargo, los resultados estimulan continuar la caracterización de los haptenos de IgE para su uso futuro en la terapia específica de enfermedades alérgicas.

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10 SECUENCIAS 1. ADNc y la secuencia de aminoácidos deducida de los clones del epítope de Phl p l descubiertas hasta la fecha de prioridad (c80, c97, c98),

imagen1

SECUENCIAS 2. Alineación de las secuencias de aminoácidos deducida de todos

clones del epítope de de IgE de Phl p l con la secuencia completa de aminoácidos del alérgeno

de de Phl pl,

El número de clon está en el extremo derecho. La secuencia de aminoácidos completa

del alérgeno de Phl p l se proporciona por las líneas más largas. La parte subrayada

corresponde al péptido señal y no está presente en el polipéptido maduro.

Lista de secuencias de los números de ID para las secuencias descritas

SEQ ID Nº 1: Oligo A ADNc

SEQ ID Nº 2: Oligo B ADNc

SEQ ID Nº 3: Oligo C ADNc

SEQ ID Nº 4: Phl p 1 Proteína

SEQ ID Nº 5: Clon NT Proteína

SEQ ID Nº 6: Clon 113 Proteína

SEQ ID Nº 7: Clon 45 Proteína

SEQ ID Nº 8: Clon 43 Proteína

SEQ ID Nº 9: Clon 34 Proteína

SEQ ID Nº 10: Clon 80 Proteína

SEQ ID Nº 11: Clon 80 ADNc

SEQ ID Nº 12: Clon 114 Proteína

SEQ ID Nº 13: Clon 95 Proteína

SEQ ID Nº 14: Clon 50 Proteína

SEQ ID Nº 15: Clon 97 Proteína

SEQ ID Nº 16: Clon 97 ADNc

SEQ ID Nº 17: Clon 103 Proteína

SEQ ID Nº 18: Clon 98 Proteína

SEQ ID Nº 19: Clon 98 ADNc

SEQ ID Nº 20: Clon 64 Proteína

SEQ ID Nº 21: Clon 109 Proteína

SEQ ID Nº 22: Clon 85 Proteína

SEQ ID Nº 23: Clon 86 Proteína

SEQ ID Nº 24: Clon 41 Proteína

SEQ ID Nº 25: Clon 108 Proteína

SEQ ID Nº 26: Clon 28 Proteína

SEQ ID Nº 27: Clon 42 Proteína

SEQ ID Nº 28: Clon 52 Proteína

imagen2

<110> Pharmacia Diagnostics

<120> Fragmentos de Phl p 1 recombinantes

<130> P06670EP00/HAM

<140> 95922855.2

<141> 1995-06-14

<150> SE9402089-B

<151> 1994-06-14

<160> 28

<170> Patent in versión 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> ADN

<213> Phleum pratense

<400> 1

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<210> 2

<211> 22

<212> ADN

<213> Phleum pratense

<400> 2

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<210> 3

<211> 23

<212> ADN

<213> Phleum pratense

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<210> 4

<211> 263

<212> PRT

<213> Phleum pratense

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<212> PRT

<213> Phleum pratense

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<213> Phleum pratense 15 <400> 6

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<212> PRT

<213> Phleum pratense

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<213> Phleum pratense

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<212> PRT

<213> Phleum pratense

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<212> PRT

<213> Phleum pratense

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<211> 63

<212> ADN

<213> Phleum pratense

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<212> PRT

<213> Phleum pratense

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20

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<212> PRT

<213> Phleum pratense 25 <400> 13

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<212> PRT

<213> Phleum pratense

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<212> ADN

<213> Phleum pratense

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<213> Phleum pratense

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<213> Phleum pratense

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<212> ADN 20 <213> Phleum pratense

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20

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<213> Phleum pratense

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<213>: Phleum pratense 15 <400> 25

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<212> PRT

<213> Phleum pratense

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Claims

Reivindicaciones

1.

Una molécula de ADN recombinante que codifica un polipéptido definido por la secuencia de aminoácidos.
2.

Un vector de expresión de ADN recombinante o sistema de clonación que comprende una secuencia de control de expresión unido de manera operativa a una molécula definida en la reivindicación 1.
3.

Un vector de expresión recombinante en el que una secuencia de control de expresión está unida de manera operativa a una secuencia de nucleótidos de codificación que se hibridiza en condiciones muy rigurosas con un clon de ADNc de Phl p l definida por la secuencia de aminoácidos de los clones 80, 97 ó 98 y que la secuencia de nucleótidos de codificación es más corta que el 25 % del ADN que codifica el alérgeno PhI p I de longitud completa.
4.

Una célula huésped que contiene una molécula recombinante o vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3.
5.

Un polipéptido definido por las secuencias de aminoácidos de los clones 80, 97 ó 98.
6.

Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5 en el que el polipéptido está condensado a β-galactosidasa, GST o proteína lambda cll.
7.

El procedimiento de diagnosis de alergia, in vitro, a proteínas vegetales en pacientes que comprende poner en contacto una muestra de fluido corporal, que se sospecha que contiene anticuerpo contra la proteína vegetal, con un polipéptido definido en las reivindicaciones 5 ó 6 en condiciones que permiten la formación de un complejo que contiene el anticuerpo y el polipéptido, después de lo cual el complejo se mide y se relaciona con la

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cantidad del anticuerpo en la muestra, tomándose un nivel elevado como una indicación de alergia contra una proteína vegetal que comprende el polipéptido.

5 8. Procedimiento para medir, in vitro, la reacción celular contra el epítope Phl p l, en el que el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 se usa para estimular la reacción celular.
9. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido

10 recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6 para la producción de un medicamento el tratamiento de alergia al polen.