ES2247433T3 - Procedimiento para la preparacion de proteinas de mosaico hipoalergenicas. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion de proteinas de mosaico hipoalergenicas.Info
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Abstract
Un proceso para la preparación de un antígeno de mosaico hipoalergénico derivado de un alergeno, mediante el cual: a) en una primera operación el alergeno es dividido al menos en dos partes y se determina la reactividad frente a anticuerpos IgE de cada parte, y b) en una segunda operación se combinan las partes del alergeno que no tienen reacción detectable frente a anticuerpos IgE para formar un antígeno de mosaico que comprende los aminoácidos del alergeno, pero el orden de los aminoácidos del antígeno de mosaico es diferente del del alergeno que se presenta en forma natural.
Description
Procedimiento para la preparación de proteínas de
mosaico hipoalergénicas.
El presente invento se refiere a antígenos de
mosaico derivados de alergenos que se presentan en forma natural, y
en particular al alergeno Phi p 2 del polen de heno de fleo. Los
antígenos de mosaico presentan una actividad alergénica reducida y
son útiles como vacunas contra la alergia para el tratamiento de
pacientes alérgicos sensibilizados y para vacunación
profiláctica.
Un gran porcentaje de la población padece
alergias mediadas por anticuerpos IgE. Estos pacientes sufren
reacciones alérgicas contra varios antígenos. Un alto porcentaje de
las reacciones alérgicas son provocadas por el polen de las plantas.
Los síntomas de las alergias, tales como la rinoconjuntivitis
alérgica, asma, dermatitis e incluso choque anafiláctico, son
debidas al reconocimiento de alergenos por los anticuerpos IgE. Las
moléculas de los anticuerpos IgE son responsables en alto grado de
los síntomas de las reacciones alérgicas, tales como la fiebre del
heno, asma y urticaria.
Las moléculas de IgE se unen a un alergeno como
el del polen de las plantas, por ejemplo. La región de cola de la
molécula de IgE, la parte Fc, se une a receptores Fc que están
situados principalmente en la superficie de las células madre en
tejidos y en basófilos de la sangre. La unión con el antígeno activa
las células madre o los basófilos para secretar una variedad de
citoquinas y compuestos biológicamente activos, especialmente
histamina. Estas moléculas hacen que los vasos sanguíneos se dilaten
y presenten fugas, lo que ayuda, a su vez, a las células blancas,
anticuerpos y componentes del complemento a introducirse en los
lugares de reacción. Estas moléculas son responsables en alto grado,
por otra parte, de los síntomas de las reacciones alérgicas. Existen
grados diferentes de reacciones alérgicas que van desde una ligera
irritación de los ojos y los síntomas de un ligero resfriado con
dolores severos, hasta síntomas peligrosos para la vida, como el
choque anafiláctico que puede producirse, por ejemplo, después de la
picadura de una abeja.
Con el fin de evitar estas reacciones alérgicas,
se han desarrollado vacunas para la alergia que se basan en la
aplicación de pequeñas cantidades de compuestos hipoalergénicos. Se
cree que aplicando vacunas hipoalergénicas, se producen anticuerpos
IgG que reaccionan con el alergeno inmediatamente después de que el
individuo haya entrado en contacto con el alergeno. Mediante los
denominados anticuerpos de bloqueo se evita en alto grado un
contacto entre el alergeno y las moléculas de anticuerpos IgE
presentes en el cuerpo del paciente. Por consiguiente, la reacción
entre el alergeno y las células madre, mediada por moléculas de
anticuerpos IgE, se evita en alto grado.
Valenta y otros describen teóricamente en el
artículo de revisión "Recombinant Allergen Molecules: Tools to
study effector cell activation" Inmunological Reviews, Vol. 179,
febrero de 2001, páginas 119-127, el mecanismo
patológico que subyace a los síntomas inmediatos de la alergia.
En el Joint Congress de la British Society for
Immunology and the Biochemical Society, Valenta y otros presentaron
el 10 de diciembre de 1996 epitopos de anticuerpos IgE del alergeno
principal Phi p 2 del polen del heno de fleo.
Focke y otros describen en el FASEB Journal, Vol,
15, No. 11, septiembre de 2001, páginas 2042-2044,
péptidos sintéticos del alergeno Phi p 1 que fueron propuestos para
la vacunación contra la alergia.
En el campo de la terapia de las reacciones
alérgicas se han utilizado diferentes vacunas. Primeramente se
aplicaron pequeñas cantidades del alergeno a los pacientes. Con el
desarrollo de la ingeniería genética, pueden utilizarse alergenos
recombinantes para la vacunación. Una desventaja importante de tales
vacunas que contienen alergenos es que la aplicación de las mismas
provoca en el paciente efectos colaterales no deseados. Por ejemplo,
si se aplica subcutáneamente al paciente el alergeno al cual es
alérgico, puede producirse un efecto secundario no deseado, tal como
una zona de picor y hasta un choque anafiláctico, puesto que los
anticuerpos IgE presentes en el cuerpo del paciente reaccionan con
el alergeno y provocan la reacción alérgica.
Con el fin de superar los efectos secundarios no
deseados, se describe un proceso para la preparación de un antígeno
hipoalergénico de mosaico derivado de un alergeno, mediante cuyo
proceso:
a) en un primer paso, el alergeno es dividido al
menos en dos partes y se determina la reactividad frente a
anticuerpos IgE de cada parte, y
b) en una segunda operación, las partes del
alergeno que no tienen reacción IgE detectable se combinan con un
antígeno de mosaico que comprende los aminoácidos del alergeno, pero
el orden de los aminoácidos del antígeno de mosaico es diferente del
del alergeno que se presenta en forma natural.
Los términos "antígeno de mosaico
hipoalergénico" aportados por el presente proceso se refieren a
que el antígeno comprende sustancialmente todos los aminoácidos del
alergeno que se presenta en forma natural. La diferencia con el
alergeno que se presenta en forma natural, sin embargo, es que el
alergeno es dividido en un primer paso en partes diferentes. Cuando
la secuencia de aminoácidos del alergeno es conocida, es de
conocimiento general común de los expertos en la técnica preparar
péptidos de longitudes variables a partir del antígeno. Los péptidos
pueden ser preparados por síntesis química, procedimiento que es
bien conocido en la técnica. Alternativamente, los péptidos pueden
ser preparados fácilmente por reacción en cadena de polimerasa,
puesto que pueden ser sintetizados fácilmente cebadores adecuados
cuando la secuencia es conocida.
Ha de determinarse la reactividad de cada parte
del alergeno que está presente como péptido o polipéptido. Esto
puede hacerse haciendo reaccionar el péptido con sueros de pacientes
que son alérgicos al alergeno que se presenta en forma natural. Los
anticuerpos IgE presentes en tales sueros reaccionarán con el
péptido si está presente en el mismo un epitopo para anticuerpos
IgE. Sin embargo, si no existen epitopos lineales para IgE o si se
destruyen epitopos IgE conformacionales separando en partes todo el
alergeno que se presenta en forma natural, no se producirá unión de
los anticuerpos IgE con el péptido. Los anticuerpos IgE pueden ser
subsiguientemente detectados fácilmente por reacción con anticuerpos
específicos que se unen al anticuerpo IgE. Estos anticuerpos son
usualmente marcados para la detección.
Un aspecto importante del presente invento es
dividir el alergeno en partes tales que no reaccionan con
anticuerpos IgE. Si una parte del alergeno reacciona aun con
anticuerpos IgE en una cantidad sustancial, tales partes del
alergeno no deberán utilizarse para la preparación del antígeno de
mosaico. Es aconsejable comprobar las partes del alergeno que se
presenta en forma natural a utilizar en el antígeno de mosaico con
sueros de diferentes pacientes alérgicos, puesto que puede haber
variaciones en lo que respecta a la especificidad y concentración de
anticuerpos IgE en cada suero.
Cuando el alergeno ha sido dividido en varias
partes que no presentan ninguna reactividad detectable frente a
anticuerpos IgE, estas partes son reorganizadas para crear el
antígeno de mosaico. Que la parte del alergeno no tiene reactividad
sustancial frente a anticuerpos IgE, significa que la reactividad
con IgE del alergeno completo que se presenta en forma natural es
comprobada preferiblemente al menos con cinco sueros procedentes de
pacientes alérgicos y se comprueban también las partes del mismo. La
unión de moléculas IgE al alergeno y sus partes se determina
cuantitativamente y ha de reducirse la reactividad IgE de cada parte
a no más del 10%, y preferiblemente a no más del 5%, del valor
obtenido para el alergeno que natural.
La redisposición de las partes del alergeno que
se presenta en forma natural en el antígeno de mosaico se refiere en
el caso más simple a que el alergeno se divide en dos partes, a
saber una parte A que tiene el terminal N y finaliza en el punto de
división, y una parte B que se inicia con el punto de división y
finaliza con el terminal carboxílico del polipéptido. Los términos
"punto de división" se refieren a la posición en el polipéptido
en la que acaba una parte y comienza otra parte. Si ambas partes del
alergeno natural no tienen una reactividad sustancial frente a
anticuerpos IgE, las dos partes se reorganizan de tal modo que ahora
la parte B representa el terminal N y la parte A representa el
terminal C.
Cuando el alergeno que se presenta en forma
natural es dividido en tres partes que tienen el orden A, B y C que
se presenta en forma natural, existen seis antígenos de mosaico
posibles, a saber C, B, A; o A, C, B, por ejemplo. Cuantas más
partes se formen, se ofrecerán más opciones para crear antígenos de
mosaico. En una realización preferida del presente invento, se evita
la combinación de partes que están localizadas en posiciones
adyacentes en el alergeno que se presenta en forma natural, por
ejemplo C, A, B. Por consiguiente, la razón es que pueden formarse
nuevamente epitopos de unión de anticuerpos IgE sobre el antígeno de
mosaico. Sin embargo, es esencial que el antígeno de mosaico
contenga sustancialmente todos los aminoácidos del alergeno que se
presenta en forma natural. Ciertamente, algunos aminoácidos que no
tienen claramente funciones pueden ser eliminados, o bien algunos
aminoácidos pueden ser eliminados por razones de producción, pero
debe mantenerse el mayor número de aminoácidos posible. Además, el
antígeno de mosaico puede comprender también aminoácidos utilizados
para fines de producción. Preferiblemente en las partes del alergeno
que se presenta en forma natural que son reorganizadas en el
antígeno de mosaico, tienen la mayor dimensión posible. Los puntos
de división se seleccionan preferiblemente para destruir los
epitopos de unión a anticuerpos IgE, con lo cual los epitopos IgE se
mantienen lo más alejados posible.
En una realización preferida, el proceso se
utiliza con alergenos del grupo 2. Se describen alergenos
preferibles del grupo 2 en las siguientes publicaciones:
Freidhoff LR, Ehrlich-Kautzky E,
Grant JH, Meyers DA, Marsh DG. "A study of the human immune
response to Lolium perenne (rye) pollen and its components, Lol p I
and Lol p II (rye I and rye II). I. Prevalence of reactivity to the
allergens and correlations among skin test, IgE antibody, and IgE
antibody data". J Allergy Clin Immunol 1986, 78,
1190-1201. Freidhoff LR,
Ehrlich-Kautzky E, Meyers DA, Marsh DG. "A study
of the human immune response to Lolium perenne (rye) pollen and its
components, Lol p I and Lol p II (rye I and rye II). Longitudinal
variation of antibody levels in relation to symptomatology and
pollen exposure and correction of seasonally elevated antibody
levels to basal values". J Allergy Clin Immunol 1987, 80,
646-655. Ansari AA, Shenbagamurthi P. Marsh DG.
"Complete amino acid sequence of a Lollium perenne (perennial rye
grass) pollen allergen, Lol p II". J Biol chem 1989, 264,
11181-11185. Dolecek C. Vítala S, Laffer S.
Steinberger P, Kraft D. Scheiner O. Valenta R. "Molecular
characterization of Phi p II, a major timothy grass (Phleum
pratense) pollen allergen". FEBS left 1993,
335, 299-304.
335, 299-304.
En una realización especialmente preferida, el
alergeno utilizado para el antígeno de mosaico es el alergeno Phi p
2 del polen del heno de fleo. La secuencia del alergeno Phi p 2 del
polen de heno se describe en el documento WO 94/23035. Una
descripción más detallada del alergeno Phi p 2 del polen del heno de
fleo se presenta en la publicación de De Marino y otros de la
revista Structure (1999) vol. 7, No. 8, p. 943-952.
El antígeno Phi p 2 es preferido puesto que reacciona con los
anticuerpos IgE séricos de aproximadamente el 70% de los individuos
alérgicos al polen del heno y provoca la liberación de histamina de
los basófilos de pacientes sensibilizados.
En el curso del presente invento se ha encontrado
que el alergeno Phi p 2 es dividido preferiblemente en tres
péptidos, a saber el péptido 1 que tiene los aminoácidos
1-33, el péptido 2 que tiene los aminoácidos
34-64, y el péptido 3 que tiene los aminoácidos
65-96. Reorganizando los péptidos en el orden 1, 3 y
2, se crea un antígeno de mosaico que puede ser utilizado para
vacunación hipoalergénica. Este antígeno de mosaico tiene la ventaja
de que produce una cantidad suficiente de anticuerpos IgE de
bloqueo, pero casi se evitan completamente las reacciones
secundarias no deseadas asociadas con la vacunación.
La secuencia de aminoácidos del antígeno de
mosaico preferido tiene la identificación SEQ ID NO: 1. La
codificación de ADN para este antígeno de mosaico preferido tiene la
identificación SEQ ID NO:2 de secuencia.
El antígeno de mosaico creado por el
procedimiento expuesto en la presente descripción puede ser
utilizado preferiblemente para la preparación de un medicamento para
el tratamiento de una reacción alérgica. El antígeno de mosaico Phi
p 2 preferido puede ser utilizado para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de la alergia al polen de heno.
Puesto que el alergeno Phi p 2 es un antígeno contra el cual un gran
porcentaje de pacientes alérgicos han generado anticuerpos IgE, el
antígeno de mosaico es muy útil en el tratamiento de pacientes que
sufren de fiebre del heno.
Un antígeno de mosaico preparado mediante el
proceso descrito puede formularse como medicamento para el
tratamiento de una reacción alérgica. El componente principal es el
antígeno de mosaico, que se administra preferiblemente junto con un
coadyuvante. Existen varios coadyuvantes adecuados para la
aplicación a humanos, tales como, por ejemplo, el gel de hidróxido
de aluminio. En otra realización del presente invento, es posible
también unir el antígeno de mosaico directamente por enlace
covalente a otro componente que potencia en general la reacción
inmunológica del organismo.
Es posible también utilizar una codificación de
ADN para un antígeno de mosaico, o una secuencia de ADN
complementaria como vacuna de ADN. Para vacunas de ácidos nucleicos
se inserta una secuencia de polinucleótidos adecuada en las células
blanco. Adicionalmente a la codificación de secuencia para el
antígeno de mosaico, tal como en una vacuna de ADN, puede contener
también elementos de regulación como promotores, puntos de unión con
ribosomas o secuencias de terminación. Tales secuencias de ADN
deberán incorporarse preferiblemente en un portador adecuado que
permita que el ADN entre en la maquinaria de síntesis de proteínas
de las células.
Un antígeno de mosaico como se describe con
detalle en la presente memoria está previsto preferiblemente para
aplicación a humanos. Es posible también, sin embargo, utilizar el
antígeno de mosaico para animales valiosos, tales como mascotas (por
ejemplo, perros o gatos) o caballos.
Las figuras y tablas describen realizaciones
preferidas del presente invento.
Comparación de la reactividad frente a
anticuerpos IgE de péptidos sintéticos derivados del alergeno Phi p
2 y del rPhi p 2 completo (alergeno del tipo natural producido
recombinantemente). Nitrocelulosa conteniendo (A) péptidos del
alergeno Phi p 2 (P1, P2, P3) en manchas de puntos, albúmina de
suero humano (HSA), un péptido (p) de control, y un alergeno sin
reactividad cruzada al polen del heno de fleo (rPhi p 5), y (B) rPhi
p 5 y Phi p 2 (rPhi p 2), se expusieron a sueros de 35 pacientes (1
- 35) alérgicos al polen de heno, y a suero de un individuo (N) no
alérgico.
Representación esquemática del alergeno natural
Phi p 2 recombinante marcado con histidina y del mosaico del
alergeno Phi p 2 recombinante marcado con histidina. Se indica la
posición de los tres péptidos.
Secuencia de ADN de los cebadores utilizados
paras la construcción del mosaico Phi p 2 y representación
esquemática de la aproximación PCR (reacción en cadena de
polimerasa) utilizada para el ensamblaje de la codificación de ADN
complementario para el mosaico rPhi p 2. Los puntos Nde | y Eco R |
de restricción están subrayados en los cebadores P2/1 y P2/6,
respectivamente. Los cebadores corresponden a los números 6 a 11 de
identificación de secuencia.
ADN complementario (SEQ ID NO:2) y secuencia de
aminoácidos deducida (SEQ ID NO:1) y del mosaico Phi p 2 marcado con
histidina. Los aminoácidos están indicados en el código de una sola
letra, y los números de pares de bases y aminoácidos se representan
en el margen derecho.
Pureza del mosaico rPhi p 2 y del antígeno rPhi
p 2. Gel manchado de Comassie que contiene Phi p 2 (pista P2),
mosaico de Phi p 2 (pista P2M) y un marcador de peso molecular
(pista M).
Análisis por espectroscopia de masas de mosaico
rPhi p 2 purificado (A) y del antígeno rPhi p 2 (B). La relación
masa/carga se representa en el eje x y la intensidad de señal está
expresada como porcentaje de la señal más intensa obtenida en el
rango de masas investigado.
Comparación de la capacidad de unión a
anticuerpos IgE del antígeno rPhi p 2 (P2) y el mosaico de rPhi p 2
(P2M). El antígeno rPhi p 2 (P2) y el mosaico rPhi p 2 (P2M) en
mancha de nitrocelulosa, así como albúmina de suero humano (HSA), se
pusieron en contacto con suero de doce pacientes
(1-12) alérgicos al polen de heno reactivos al
antígeno rPhi p 2. Se detectaron anticuerpos IgE unidos con
anticuerpos IgE antihumanos marcados con ^{125}I y se visualizaron
por autorradiografía.
Actividad alergénica reducida del mosaico rPhi p
2 determinada por liberación de histamina de basófilos. Basófilos
procedentes de un paciente alérgico al polen de heno se expusieron a
concentraciones crecientes del antígeno rPhi p 2 y del mosaico de
rPhi p 2 (eje x). La liberación de histamina está expresada como
porcentaje de liberación de histamina total en el eje y.
Anticuerpos de conejo contra mosaico rPhi p 2
reconocen al alergeno rPhi p 2 natural. Antisueros de conejo contra
el mosaico rPhi p 2 (\alphaP2M), mosaico
(\alphaP2M-KLH) con acoplamiento KLH y antígeno
rPhi p 2 (\alphaPhi p 2), así como tampón (C), se expusieron a
albúmina de suero humano (HSA) acoplada con KLH en manchas de
puntos, rPhi p 2 (P2) y mosaico de rPhi p 2 (P2M). Se detectaron
anticuerpos de conejo unidos con anticuerpos IgG de mono contra
conejo marcados con ^{125}I y se visualizaron por auto
radiografía.
Tabla
1
Características de péptidos sintéticos derivados
de Phi p 2. Se presenta la secuencia, número de aminoácidos,
posición del alergeno Phi p 2, peso molecular y punto isoeléctrico
de los péptidos. El péptido 1 corresponde a la identificación SEQ ID
NO:3 de secuencia; el péptido 3 corresponde a la identificación SEQ
ID NO:4 de secuencia; y el péptido 2 corresponde a la identificación
SEQ ID NO:5 de secuencia.
Tabla
2
Reacciones cutáneas de tipo inmediato al antígeno
rPhi p 2 y al mosaico de Phi p 2 (P2M). Se ensayó con dos pacientes
(individuos 1, 2) alérgicos al polen de fleo en cuanto a reactividad
cutánea con P2 y P2M. Se visualizan los diámetros medios de pápula
(mm) para cinco concentraciones diferentes de rPhi p 2 y mosaico de
Phi p 2, así como para extracto de polen de heno de fleo e
histamina.
Tabla
3
Inhibición de la unión de anticuerpos IgE de
pacientes alérgicos al polen de heno al antígeno rPhi p 2 por
anticuerpos \alphaP2M de conejo y anticuerpos \alphaP2 de
conejo. Se presenta la inhibición porcentual de la unión de
anticuerpos IgE para cinco pacientes.
Se ilustra adicionalmente el invento mediante los
siguientes ejemplos:
Con el fin de identificar fragmentos de Phi p 2
sin actividad alergénica, se sintetizaron químicamente (Tabla 1)
péptidos que comprendían cada uno aproximadamente 1/3 de la proteína
Phi p 2. Los péptidos tenían una longitud comprendida entre 32 y 34
aminoácidos con pesos moleculares de alrededor de 3700 Daltons y
juntos cubrían la secuencia completa de aminoácidos del antígeno Phi
p 2.
Los tres péptidos se sintetizaron utilizando la
estrategia Fmoc (9-fluoroenilmetoxycarbonil) con
activación con HBTU
(2-(1H-benzotriazol-1-il)
1,1,3,3, tetrametiluronio hexafluorofosfato) (ciclos de 0,1 mmol a
pequeña escala) en el sintetizador de péptidos modelo 433A de
Applied Biosystems (Foster City, CA). Se utilizaron resinas
PEG-PS (polietilenglicol poliestireno) precargadas
(carga de 0,15-0,2 mmol/g) (fabricadas por Septive
Biosystems, Warrington, UK) como fase sólida para construir los
péptidos. Los productos químicos se adquirieron en Applied
Biosystems. El acoplamiento de los aminoácidos se confirmó por
monitorización de conductividad en un sistema de control con
realimentación. Se añadió a cada péptido un residuo de cisteína en
el terminal N o en el terminal C para facilitar el acoplamiento de
los péptidos a portadores. Los péptidos se separaron de las resinas
con una mezcla de 250 \mul de agua destilada, 250 \mul de
triisopropilsilano (Flukan, Buchs, Switzerland), y 9,5 ml de TFA
durante 2 h, y se precipitaron en butilmetileter (Flukan, Buchs,
Switzerland). La identidad de los péptidos fue comprobada por
espectrometría de masas y se purificaron hasta más del 90% por
cromatografía líquida de alta presión preparatoria (PiChem, Graz,
Austria) como se describe en la publicación de Focke M, Mahler V,
Bail T, Sperr WR, Majlesi Y, Valent P, Kraft D, Valenta R.
"Nonanaphylactic synthetic peptides derived fron B cell epitopes
of the major grass pollen allergen Phi p 1, for allergy
vaccination". FASEB J. 2001, 15: 2042-2044).
Se evaluó la actividad alergénica de los péptidos
derivados del antígeno Phi p 2 comparando la reactividad frente a
anticuerpos IgE del antígeno rPhi p 2 completo con la de los
péptidos, por análisis de manchas de puntos (figura 1). (Publicación
"Nitrocellulose-dotted Phi p
2-derived peptides (P1-P3), an
immunologically unrelated major grass pollen allergen, rPhi p 5")
(Vrtala S. Sperr WR, Reimitzer I, van Ree R, Laffer S, Müller WD,
Valent P, Lechner K, Rumpold H, Kraft D, Scheiner O. Valenta R).
"cDNA cloning of a major allergen from thimoty grass (Phleum
Pratense) pollen; characterization of the recombinant Phi p V
allergen". J. Immunol. 1993, 151: 4773-4781), y
para fines de control se expusieron a sueros de pacientes alérgicos
al polen de heno y a suero de un individuo no alérgico, albúmina de
suero humano y un péptido de control.
Se detectaron anticuerpos IgE unidos como se ha
descrito anteriormente (Valente R, Dùchene M, Ebner C, Valent P,
Sillaber C, Devikker P, Ferreira F, Tejkl M, Edelmann H, Kraft D,
Scheiner O) en la publicación "Profilins constitute a novel family
of functional plant pan-allergens". J.Exp.Med.
1992, 175: 377-385. Sueros procedentes de 35
pacientes, todos alérgicos al polen de heno, presentaron reactividad
IgE frente al antígeno rPhi p 2 manchado con nitrocelulosa, pero
ningún suero reaccionó con ninguno de los tres péptidos derivados de
Phi p 2 (Figura 1). El suero del individuo no elérgico no presentó
reactividad Ige a ninguno de los péptidos o proteínas.
Se obtuvo una proteína recombinante del mosaico
Phi p 2 por recombinación de los tres péptidos derivados de Phi p 2
en secuencia alterada. La proteína de mosaico se creo bajo la
suposición de que la recombinación de tres fragmentos de Phi p 2 no
alergénicos en orden alterado proporcionará una proteína de mosaico
con estructura tridimensional perturbada y, en consecuencia, con
actividad alergénica reducida. Adicionalmente, se esperó que la
proteína de mosaico presentase mejor inmunogenicidad en comparación
con las unidades peptídicas individuales más pequeñas y preservase
la secuencia de aminoácidos primaria completa de Phi p 2, que
contiene así los epitopos de células T pertinentes del antígeno Phi
p 2.
La figura 2 muestra el ensamblaje de los tres
péptidos en el alergeno natural Phi p 2, en comparación con el de la
proteína de mosaico Phi p 2. Con el fin de comparar las dos
proteínas, se produjo un antígeno recombinante Phi p 2 que contenía
una cola de hexahistidina en el terminal C, y una proteína de
mosaico recombinante Phi p 2 que contenía también una cola de
hexahistidina en el terminal C (figura 2) para permitir la
purificación de ambas proteínas por cromatografía de afinidad al
níquel (Quiagen, Hilden, Germany).
El mosaico recombinante de Phi p 2 fue construido
por amplificación genética basada en la técnica PCR de ADNs
complementarios que codifican para los tres péptidos en el orden que
se muestra en la figura 2 utilizando como plantilla los cebadores
ilustrados en la figura 3 y el cADN que codifica la secuencia de Phi
p 2 (Dolecek C, Vrtala S. Laffer S, Steinberger P, Kraft D, Scheiner
O, Valenta R. "Molecular characterization of Phi p II, a major
timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen". FEBS
lett. 1993, 335: 299-304), como se describe en la
publicación de Linhart B, Jahn-Schmid B, Verdino P,
Séller W, Ebner C, Kraft D, Valenta R, "Combination vaccines for
the Treatment of grass pollen allergy consisting of genetically
engineered hybrid molecules with increased immunogenicity". FASEB
J. 2002, 16: 1301-1303.
La figura 4 muestra la secuencia de ADN y la
secuencia de aminoácidos deducida correspondiente a la proteína de
mosaico recombinante del antígeno Phi p 2. La proteína de mosaico
marcada con histidina está codificada por un ADN de 309 bp para una
proteína con un peso molecular calculado de 11769 daltons, casi
idéntico al del antígeno recombinante Phi p 2 marcado con histidina
(11784 daltons).
El ADN complementario que codifica para un
alergeno rPhi p 2 marcado con histidina se obtuvo por amplificación
PCR utilizando una combinación del cebador P2/1 5' (SEQ ID NO:6) y
el cebador P2/7 3' (SEQ ID NO:12), siendo la secuencia de ADN la
siguiente: CGC GAA TTC TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC TTC TGG CGC
GTA GGT GGC, y el ADN complementario que codifica para el alergeno
Phi p 2 como plantilla.
Los ADN complementarios que codifican para este
mosaico de Phi p 2 marcado con histidina y para el alergeno Phi p 2
marcado con histidina se ligaron independientemente a plásmidos
pET17b conteniendo el fragmento Nde I/Eco RI (Novagen) Las
secuencias de ADN de las dos estructuras de plásmidos fueron
confirmada por análisis de secuencia y las proteínas recombinantes
se expresaron en Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) por
inducción con
isopropil-\beta-tiogalactopiranosido
para una densidad óptica a 600 nm de 0,4 en medio de cultivo líquido
(medio LB conteniendo 100 mg/l de ampicilina) durante cuatro horas
adicionales a 37ºC. Las células de E.coli de un cultivo de
500 ml fueron recogidas por centrifugación y preparadas para
purificación en condiciones nativas (rPhi p 2) o de
desnaturalización (mosaico rPhi p 2) de acuerdo con las indicaciones
de los fabricantes (Quiagen, Hilden, Germany). Se analizaron
muestras de proteínas en cuanto a pureza por electroforesis en gel
de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida
(SDS-PAGE) y tinción de proteínas (como describen
Fling SP, y Gregerson DS en la publicación "Peptide and protein
molecular weight determination by electrophoresis using a
high-molarity Tris buffer system without urea".
Anal.Biochem. 1986, 155:83-88) (figura 4).
La figura 5 muestra la pureza de las proteínas
recombinantes marcadas con histidina (rPhi p 2: P2; mosaico de rPhi
p 2: P2M). Aunque las dos proteínas no presentaron un comportamiento
de migración idéntico en el ensayo SDS-PAGE, un
análisis por espectroscopia de masas realizado como han descrito
Niederberger V, Hayek B, Vrtala S, Laffer S, Twardosz A, Vangelista
L, Sperr WR, Valent P, Rumpold H, Kraft D, Ehrenberger K, Valenta R,
Spitzauer S, en la publicación "Calcium-dependent
immunoglobulin E recognition of the apo- and
calcium-bound form of a
cross-reactive two EF-hand timothy
grass pollen allergen, Phi p 7. FASEB J. 1999, 13:
843-856", mostró pesos moleculares casi idénticos
de las dos proteínas (rPhi p 2: 11775 daltons; mosaico de rPhi p 2:
11770 daltons), que son muy concordantes con los pesos moleculares
deducidos, incluyendo las metioninas, en sus terminales N (figura
6).
La capacidad de unión con anticuerpos IgE del
mosaico Phi p 2 purificado (P2M) se comparó con la del antígeno
natural Phi p 2 mediante experimentos de mancha de puntos como se ha
descrito para los péptidos que utilizan sueros de doce pacientes
alérgicos al polen de heno de fleo (figura 7). Los sueros de los
doce pacientes alérgicos al polen de heno contenían anticuerpos IgE
contra rPhi p 2, pero ningún suero presentó reactividad de
anticuerpos IgE frente al mosaico rPhi p 2 o a la albúmina de suero
humano de control negativo (figura 7). La actividad alergénica muy
reducida del mosaico rPhi p 2 fue demostrada adicionalmente mediante
experimentos de liberación de histamina por basófilos y pruebas
cutáneas. Los basófilos del paciente alérgico al polen de heno
fueron enriquecidos por sedimentación en dextran y expuestos a
concentraciones crecientes de rPhi p 2 purificado o mosaico de rPhi
p 2, como describen Valent P, Besemer J, Muhm M, Majdic O, Lechner
K, Bettelhei P, en la publicación "Interleukin 3 activates human
blood basophils via high-affinity binding sites".
Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1989, 86: 5542-5546.
La histamina liberada en los sobrenadantes de
células libres se determinó por triplicado por radioinmunoensayo y
se expresó como porcentaje medio del contenido de histamina total de
las células, como han descrito Valent y otros.
La figura 8 muestra que el mosaico rPhi p 2
(liberación máxima comprendida entre 1 y 10 \mug/ml) presentó una
actividad alergénica reducida más de mil veces en comparación con el
alergeno rPhi p 2 (liberación máxima de 10^{-3} \mug/ml).
La actividad alergénica fuertemente atenuada del
mosaico rPhi p 2 fue confirmada por pruebas cutáneas en pacientes
alérgicos al polen de heno (tabla 2). Se realizaron ensayos SPT
(pruebas de punción cutánea) en los antebrazos de los individuos. Se
aplicaron alícuotas de veinte microlitros que contenían 5
concentraciones de rPhi p 2 y de mosaico P2M derivado de Phi p 2 (1
\mug/ml, 2 \mug/ml, 4 \mug/ml, 8 \mug/ml, 16 \mug/ml).
Adicionalmente, se ensayaron soluciones normalizadas para punción
cutánea (extracto de polen de heno de fleo e histamina)
(Allergopharma, Reinbeck, Germany). Las reacciones se registraron 20
minutos después del ensayo SPT por fotografía y transferencia con
una cinta adhesiva a papel de la zona de pápula rodeada por un trazo
de bolígrafo. Se calculó el diámetro medio de la pápula (Dm)
midiendo los diámetros máximos longitudinal y transversal y
dividiendo su suma por 2, como han descrito Focke y otros.,
2001.
El antígeno rPhi p 2 indujo fuertes reacciones
eruptivas ya a la concentración más baja ensayada, es decir de 1
\mug/ml, mientras que el mosaico rPhi p 2 indujo solamente
reacciones eruptivas suaves a las concentraciones máximas ensayadas
(es decir, de 8 a 16 \mug/ml) confirmando así la actividad
alergénica reducida de la proteína de mosaico.
Con el fin de comprobar si la inmunización con el
mosaico Phi p 2 y el mosaico Phi p 2 induce la reacción de
anticuerpos IgG con el antígeno natural Phi p 2, se inmunizaron
conejos con el mosaico rPhi p 2, con el mosaico rPhi p 2 con
acoplamiento KLH o con el antígeno rPhi p 2 utilizando coadyuvante
de Freund como han descrito Focke y otros.
La reactividad de los anticuerpos IgG de conejo
frente al antígeno rPhi p 2 fue estudiada mediante experimentos de
manchas de puntos (figura 9). Se depositaron manchas de puntos del
antígeno natural Phi p 2 (P2) así como el correspondiente mosaico
inmunogénico Phi p 2 (P2M) sobre bandas de nitrocelulosa (1
\mug/punto). Las bandas de nitrocelulosa fueron expuestas a los
sueros de conejo preinmunes o inmunes (1:500) y se detectaron
anticuerpos de conejo unidos con un antisuero de mono contra conejo
marcado con ^{125}I diluido al 1:1000 (Amersham Pharmacia Biotech)
como han descrito Valenta y otros (1992).
El antisuero de mosaico anti rPhi p 2 de conejo
reaccionó fuertemente con el inmunógeno (mosaico rPhi p 2) así como
con el alergeno rPhi p 2 (figura 9). La reactividad de anticuerpos
fue de intensidad comparable con la obtenida con el antisuero
generado por inmunización con el mosaico de acoplamiento KLH y más
fuerte que la reactividad inducida por inmunización con el alergeno
rPhi p 2 (figura 9).
Se estudió si los anticuerpos IgG inducidos por
inmunización con el mosaico rPhi p 2 inhiben la unión de los
anticuerpos IgE del suero de los pacientes alérgicos al antígeno
rPhi p 2 completo mediante ensayo ELISA competitivo utilizando
sueros de cinco pacientes alérgicos al polen de heno (tabla 3). Las
placas ELISA (Nunc Maxisorp. Rokslide, Denmark) fueron recubiertas
con rPhi p 2 (1 \mug/ml) y se preincubaron con una solución
diluida al 1:100 del mosaico anti Phi p 2 y el antisuero anti Phi p
2 y, para fines de control, con los correspondientes sueros
preinmunizados. Después de lavar las placas se incubaron con sueros
diluidos en la proporción 1:3 de cinco pacientes alérgicos al polen
de heno sensibilizados con Phi p 2 y se detectaron anticuerpos IgE
unidos con anticuerpos IgE monoclonales de rata antihumanos
conjugados con fosfato alcalino (Pharmingen, San Diego, CA),
diluidos al 1:1000. Se calculó la inhibición porcentual de la unión
con anticuerpos IgE conseguida por preincubación con el mosaico anti
Phi p 2 y el antígeno Phi p 2, del modo siguiente: % de inhibición
de unión con anticuerpos IgE =
100-OD_{I}/OD_{P}x100. OD_{I} y OD_{P}
representan las extinciones después de preincubación con el suero de
conejos inmunes y preinmunes, respectivamente, como han descrito
Focke y otros (2001).
Los anticuerpos del mosaico anti Phi p 2
inhibieron la unión de los anticuerpos IgE de pacientes alérgicos al
polen de heno con el antígeno Phi p 2 (inhibición media del 20,93%)
a pesar de producirse esta inhibición en un grado inferior al
conseguido por preincubación con anticuerpos inducidos por
inmunización con el alergeno rPhi p 2 (inhibición media del
54,73%).
Los resultados de los estudios de inmunización
muestran así que los anticuerpos generados contra el mosaico rPhi p
2 reconocen al alergeno natural Phi p 2 e inhiben el reconocimiento
del antígeno Phi p 2 por los anticuerpos IgE de pacientes
alérgicos.
<110> Biomay Produktions- und
Handels-AktiengeselIschaft
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la preparación de
antígenos de mosaico hipoalergénicos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> mosaico
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\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patent In Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia de polipéptidos reorganizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 309
<2l2> ADN
<2l3> Secuencia Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia de nucleótidos reorganizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: polipéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Lys Val Thr Phe Thr Val Glu Lys Gly
Ser Asn Glu Lys His}
\sac{Leu Ala Val Leu Val Lys Tyr Glu Gly Asp Thr
Met Ala Glu Val Glu}
\sac{Leu Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: polipéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu His Gly Ser Asp Glu Trp Val Ala Met
Thr Lys Gly Glu Gly}
\sac{Gly Val Trp Thr Phr Asp Ser Glu Glu Pro Leu
Gln Gly Pro Phe Asn}
\sac{Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: polipéptido
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<400> 5
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\sa{Cys Phe Arg Phe Leu Thr Glu Lys Gly Met Lys
Asn Val Phe Asp Asp}
\sac{Val Val Pro Glu Lys Tyr Thr Ile Gly Ala Thr
Ala Pro Glu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
<21l> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatttccat atggtcccga aggtgacgtt cacg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgaggaac cggaagagct ccacctccgc catggt
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggaggtgg agctcttccg gttcctcacc gagaag
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagccgtgc tcccgctctt ctggcgcgta ggtggc
\hfill36
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<210> 10
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskiptacgcgccag aagagcgga gcacggctcc gacgag
\hfill36
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 51
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcgcgaattct cagtggtggt ggtggtggtg gttgaagggc ccctggagcg g
\hfill51
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgaattct cagtggtggt ggtggtggtg ctcttctggc gcgtaggtgg c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Un proceso para la preparación de un antígeno
de mosaico hipoalergénico derivado de un alergeno, mediante el cual:
a) en una primera operación el alergeno es dividido al menos en dos
partes y se determina la reactividad frente a anticuerpos IgE de
cada parte, y b) en una segunda operación se combinan las partes del
alergeno que no tienen reacción detectable frente a anticuerpos IgE
para formar un antígeno de mosaico que comprende los aminoácidos del
alergeno, pero el orden de los aminoácidos del antígeno de mosaico
es diferente del del alergeno que se presenta en forma natural.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1ª, en el que en la primera operación se preparan al menos dos
partes del alergeno por síntesis química o utilizando la reacción en
cadena de polimerasa y se hace reaccionar cada parte del alergeno
con suero obtenido de individuos alérgicos, y se determina la
reactividad de los anticuerpos IgE contenidos en tal suero frente a
cada parte del alergeno.
3. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1ª o 2ª, en el que el orden de las partes del
alergeno que no tienen reactividad sustancial con anticuerpos IgE
obtenidos de individuos alérgicos no se corresponde con el orden de
esas partes en el alergeno natural, hasta el punto en que la parte
que se presenta normalmente en el terminal N y la parte que aparece
normalmente en el terminal C están intercambiadas.
4. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el alergeno es un alergeno
del grupo 2.
5. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el alergeno es el alergeno
Phi p 2 del polen de heno de fleo.
6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
5ª, en el que el alergeno Phi p 2 se divide en tres péptidos, a
saber: el péptido 1 que tiene los aminoácidos 1-33,
el péptido 2 que tiene los aminoácidos 34-64, y el
péptido 3 que tiene los aminoácidos 65-96 de la
secuencia de aminoácidos del alergeno natural Phi p 2, y el antígeno
de mosaico se crea encadenando los péptidos en el orden siguiente:
péptido 1, péptido 3 y péptido 2.
7. Un antígeno de mosaico que tiene la secuencia
de aminoácidos SEQ ID NO:1.
8. Una secuencia de ADN que tiene la codificación
de la secuencia SEQ ID:2 de aminoácidos para el alergeno de mosaico
de la reivindicación 7ª.
9. La utilización de un alergeno de mosaico
obtenible mediante un proceso de acuerdo con la reivindicación 6ª,
para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una
reacción alérgica, cuya reacción alérgica está provocada por el
polen del heno.
10. La utilización de un alergeno de mosaico de
acuerdo con la reivindicación 9ª, en los casos en que la reacción
alérgica es provocada por el polen del heno de fleo.
11. La utilización de un alergeno de mosaico de
acuerdo con la reivindicación 10ª, en los casos en que la reacción
alérgica es provocada por el antígeno Phi p 2 del polen del heno de
fleo.
12. Una vacuna prevista para ser utilizada en el
tratamiento de pacientes alérgicos al polen del heno,
caracterizada porque comprende un alergeno de mosaico
obtenible mediante el proceso de acuerdo con la reivindicación 6ª o
utilizando el alergeno de mosaico de la reivindicación 7ª.
13. Una vacuna prevista para ser utilizada en el
tratamiento de pacientes alérgicos al polen del heno,
caracterizada porque comprende una secuencia de ADN cuya
codificación corresponde a un antígeno de mosaico obtenible mediante
el proceso de acuerdo con la reivindicación 6ª o la secuencia de ADN
de la reivindicación 8ª.
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