ES2638308T3 - Proteínas híbridas hipoalergénicas de alérgenos de ácaros del grupo 1 y 2 principales para uso en el tratamiento de alergias - Google Patents
Proteínas híbridas hipoalergénicas de alérgenos de ácaros del grupo 1 y 2 principales para uso en el tratamiento de alergias Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido con actividad alergénica reducida que comprende fragmentos de las secuencias de aminoácidos de los alérgenos del ácaro D.pteronyssinus del grupo 1 y grupo 2 Der p 1 y Der p 2 en los cuales las secuencias carecen de uno o más epítopos de unión de anticuerpo IgE, dichos fragmentos tienen por lo menos 50 residuos de aminoácidos en longitud, caracterizado porque el polipéptido tiene por lo menos 95% de homología con la SEQ ID No.: 2, y tiene alergenicidad, según se mide por capacidad de unión a IgE, aproximadamente 2500 veces menor que aquella de la mezcla de las proteínas de alérgenos Der p 1 y Der p 2 naturales individuales.
Description
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fragmentos tienen por lo menos 50 residuos de aminoácidos en longitud, caracterizados porque el polipéptido tiene por lo menos 95% de homología con la SEQ ID No.: 2, y tiene alergenicidad, según se mide por la capacidad de unión a IgE, aproximadamente 2500 veces menor que aquella de la mezcla de las proteínas de alérgenos Der p 1 y Der p 2 naturales individuales.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de acuerdo con el cebador aspecto.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia de polinucleótidos del segundo aspecto.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona una célula anfitriona transformada con el vector de expresión del tercer aspecto.
En un quinto aspecto, la invención proporciona un método para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende cultivar una célula anfitriona de acuerdo con el cuarto aspecto y aislar y purificar el polipéptido producido por la célula anfitriona.
En un sexto aspecto, la invención proporciona un polipéptido de acuerdo con el cebador aspecto, o un vector de expresión del tercer aspecto, para uso en el tratamiento o prevención de alergia.
En un séptimo aspecto, la invención se refiere a el uso de un polipéptido del cebador aspecto, o un vector de expresión del tercer aspecto, para la preparación de una composición para uso en el tratamiento o prevención de alergia.
En un octavo aspecto, la invención proporciona una preparación farmacéutica caracterizada porque comprende un polipéptido del cebador aspecto o vector de expresión del tercer aspecto, y opcionalmente, un excipiente o adyuvante farmacológicamente aceptable.
Las proteínas híbridas hipoalergénicas pueden haber reducido significativamente la alergenicidad en comparación con aquella de los alérgenos nativos individuales y/o a con mezclas de los mismos. Las proteínas híbridas de acuerdo con la presente invención pueden ser llamadas hipoalergénicas ya que tienen una menor capacidad de anticuerpos IgE de unión con base en: i) ELISA in vitro, inhibición de ELISA y pruebas de inmunotransferencia utilizando mezclas de suero de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus; ii) pruebas de reactividad cutánea in vivo en pacientes alérgicos a D. pteronyssinus; iii) pruebas de activación ex vivo de basófilos aislados de sangre de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus y iv) pruebas EAST in vitro con sueros individualizados de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus. Adicionalmente, las proteínas híbridas de acuerdo con la presente invención: i) mantienen su capacidad inmunogénica, como se demuestra por estudios de linfoproliferación con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de 23 pacientes alérgicos a D. pteronyssinus que muestra la reactividad de células T; ii) de hecho tener mayor inmunogenicidad que las proteínas de tipo silvestre después de inmunización de ratones con proteínas híbridas; y iii) tienen la capacidad de inducir anticuerpos de 'bloqueo' en ratones, es decir, inducir IgG específico a Der p 1 y Der p 2, que inhiben la unión de IgG de pacientes alérgicos a ácaros de polvo domésticos a los alérgenos naturales.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a proteínas híbridas (o quimeras) (un ejemplo de las cuales se menciona en adelante como QM1) compuestas de fragmentos de los alérgenos Der p 1 y Der p 2, en las que por lo menos uno de los dos β hojas de Der p 2, en las que se ha interrumpido el puente disulfuro entre C8 y C119 de Der p 2 por sustitución de uno o ambos de los residuos de cisteína en las posiciones 8 y 119 de la proteína nativa madura mostrada en la Figura 2, por ejemplo con un residuo de serina. También se divulga aquí una proteína híbrida de comparador (denominada en adelante como QM2) que no es parte de la invención. La QM2 se compone de fragmentos de los alérgenos Der p 1 y Der p 2, en la que por lo menos una de las dos β hojas de Der p 2, en las que se ha interrumpido el puente disulfuro entre C8 y C119 de Der p 2 mediante inserción de secuencia adicional de aminoácidos, tal como un fragmento od Der p 1 por ejemplo, residuos 5 a 222 de la proteína madura (es decir, sin la pre-región mostrada en la Figura 1). Preferiblemente se inserta la secuencia de aminoácidos adicional entre el residuo 73 y 74 de la secuencia de proteína nativa madura de Der p 2 mostrada en la Figura 2. Sin embargo, se ha reducido la reactividad alérgica, sorprendentemente sin detrimento de su capacidad inmunogénica. De hecho, las proteínas híbridas han demostrado una mayor inmunogenicidad en algunas pruebas y, adicionalmente, pueden estimular la producción de anticuerpos IgG.
Por lo tanto la invención proporciona secuencias de péptidos que comprenden o que consisten de secuencias de aminoácidos de por lo menos 95%, o más preferiblemente 100% de homología de secuencia con la SEQ ID No 2.
Dichas proteínas se pueden producir por cualquier método de síntesis de proteínas estándar, por ejemplo síntesis química, síntesis semiquímica o mediante el uso de sistemas de expresión. De acuerdo con lo anterior, la presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que comprenden o que consisten del ADN que codifica dichas proteínas quiméricas, sistemas de expresión, por ejemplo, vectores que comprenden dichas secuencias
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Descripción detallada
Las proteínas híbridas de baja alergenicidad de acuerdo con la presente invención (QM1) y la proteína de comparador (QM2) se obtienen, en el caso de QM1, por la fusión de ambas proteínas (Der p 1 y Der p 2) y la eliminación de uno de los puentes disulfuro (residuos 8-119) y, en el caso de QM2, por la inserción de la proteína Der p 1 entre los residuos 73 y 74 de Der p 2. Sorprendentemente, a pesar de estos cambios las proteínas híbridas (QM1 y QM2) exhibieron mayor capacidad de estimulación de células T (Figura 13) e inmunogenicidad inducida más fuerte que las moléculas de tipo silvestre separadas (Figura 14A).
Los fragmentos de péptidos que constituyen las proteínas híbridas se pueden sintetizar a partir de secuencias de nucleótidos que las codifican por una persona calificada y entrenada mediante por ejemplo, amplificación de reacción de cadena de polimerasa (PCR) de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica tales como aquellos descritos por ejemplo, en Sambrook et al [Sambrook, J., Russell, D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA]. Dichas secuencias de nucleótidos, que habían sido digeridas por las enzimas de restricción adecuadas, se pueden incorporar en un vector de expresión mediante ligación. Las diferentes secuencias de nucleótidos que codifican los fragmentos de péptidos se unen utilizando ligadores formados con secuencias reconocidas por enzimas de restricción diferentes, y por lo tanto algunos residuos aparecen en la molécula de péptido híbrido final que no existían en la secuencia original del alérgeno natural. Estos nuevos residuos no interfieren con la traducción correcta de la proteína y se han marcado en la secuencia en la Figura 6 por un doble subrayado.
La presente invención cubre el uso de las quimeras de acuerdo con la presente invención, QM1, o péptidos sintéticos derivados de estas a partir de tratamientos de desensibilización en animales, en particular mamíferos, tales como humanos. Los métodos de desensibilización implican la administración repetida por ruta parenteral (subcutánea, intravenosa o intramuscular), oral, sublingual, nasal o por rectal. Estas proteínas híbridas se pueden administrar solas o en combinación con excipientes, adyuvantes y/o diluyentes farmacéuticos y, de acuerdo con la actual legislación y procedimientos galénicas aplicables.
Las características inmunológicas de las proteínas híbridas de acuerdo con la presente invención (QM1) y la proteína comparador (QM2) se exponen a continuación.
Las proteínas híbridas QM1 y QM2 descritas aquí son hipoalergénicas: como se muestra en las Figuras 8, 9, 10 y
12. Tienen menor reactividad al suero de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus que el extracto completo o las proteínas naturales combinadas, y, en particular para la quimera QM2, menor capacidad para activar basófilos en pruebas "ex vivo".
Este hipoalergenicidad también se ha demostrado en pruebas de la piel in vivo (Figura 11).
La Figura 8 muestra un ensayo de inmunodetección que indica que las quimeras QM1 y QM2 tienen una menor capacidad de unión a IgE en los pacientes alérgicos en comparación con la reactividad de la proteína natural Der p
2. Esta reducción de la alergenicidad se cuantificó por medio de inhibición de ELISA con una mezcla de sueros de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus (Figura 10). 2500 veces más de la proteína QM1 se requirió para conseguir una inhibición del 50% de de la mezcla de las dos proteínas naturales. Por lo tanto, se puede deducir que era 2500 veces menos alergénica que las proteínas naturales, lo que indicaría una reducción en la capacidad de unión a IgE a la mezcla de las dos proteínas naturales de más de 99%.
Una medida más directa de la hipoalergenicidad de las quimeras QM1 y QM2 se obtuvo mediante mediciones directas de la reactividad cutánea en 107 pacientes alérgicos a D. pteronyssinus. Los datos en la Figura 11 muestran que la quimera QM2 había reducido notablemente la reactividad de la piel. La quimera QM2 por otra parte sólo produjo reactividad positiva en 5 pacientes. Una comparación de cada distribución muestra que la quimera QM1 tiene un tamaño de pápula media 50 veces más bajo que aquel observado para nDer p 2 y 10 veces inferior a la observada para nDer p 1, lo que indicaría una reducción en la actividad alergénica de 90-98%. Esto a pesar de las dosis más altas utilizadas para las proteínas híbridas.
La capacidad de unión a IgE baja de la proteína híbrida QM2 también se demostró con el suero de otros 107 pacientes alérgicos a D. pteronyssinus medidos por EAST (Figura 12). En todos los pacientes la unión de IgE fue prácticamente inexistente para QM2 en comparación con la mezcla de proteínas naturales, DPT, y a las proteínas individuales, ya sea en forma recombinante o nacional.
Esta gran reducción en la capacidad para unirse a IgE y provocar reacciones adversas fue acompañada de mantenimiento de la capacidad inmunógena. Las proteínas QM1 y QM2 mostraron un índice de linfoproliferación similar a aquel inducido por la mezcla de las dos proteínas puras, Der p 1 y Der p 2 en combinación (en ambas formas natural y recombinant) como se muestra en la Figura 13. Esto demuestra que las proteínas híbridas QM1, construidas como una fusión del Der p2 de polipéptido mutado (C8-C119) y Der p 1, y QM2, construidos con 2
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fragmentos de Der p 2 y Der p 1, contienen menos epítopos de unión a IgE conformacionales pero conserva suficientes epítopos T para inducir una respuesta inmunitaria protectora.
Otra característica deseable de las moléculas hipoalergénicas cuando se utilizan como candidatos para la SIT, aparte de tener una actividad de unión a IgE reducida en comparación con los alérgenos correspondientes y que contiene epítopos de células T, es que deben tener capacidad de inducir anticuerpos de 'bloqueo' que impidan la desgranulación y liberación de histamina. La inmunización de ratones con las proteínas híbridas QM1 y QM2 indujo más fuerte respuesta de IgG que la mezcla de proteínas de tipo silvestre. Estos anticuerpos IgG específicos a Der p 1 y Der p 2 inhibieron la unión a IgG de de pacientes alérgicos a ácaros de polvo domésticos a los alérgenos naturales, mejorando aún más la prevención de los síntomas alérgicos.
La invención se entenderá mejor a partir de los siguientes ejemplos que se refieren a las etapas experimentales para preparar la invención y demostrar sus cualidades. Estos ejemplos son solo ilustrativos y no limitantes de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Purificación de alérgenos naturales Der p 1 y Der p 2 de los cuerpos de ácaros
Una mezcla de cuerpos liofilizados y heces de D. pteronyssus (Laboratorios Leti, Madrid, España) se utilizó como material de partida, se extrajo con 10 volúmenes (p/v) de PBS (salina reguladora de fosfato) complementado con 1 mm de PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) durante 15 minutos con agitación rápida a 4ºC. A continuación, se centrifugó a 3800 xg durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante de extracción se filtró a través de AP (Millipore) y se agregó lentamente 60% de sulfato de amonio 361 g/l) durante 30 min. Después de agitar durante 1 hora a 4ºC se centrifugó durante 15 minutos a 17.000 xg y 4ºC.
• Purificación de Der p 1 natural,
El sedimento obtenido después de centrifugación se resuspendió en 2 ml de Tris 20 mM pH 8.0 y se filtró a través de
0.22 μm. Se llevó a cabo cromatografía de tamiz molecular en una columna 16/60 Superdex S200 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) para lo cual la columna se equilibró con PBS y se inyectaron los 2 ml de la etapa anterior. Las fracciones de 3 ml se recolectaron del volumen de exclusión que se analizaron por SDS-PAGE en condiciones no reductoras, que se combinaron con fracciones de 24 kDa. Luego se llevó a cabo cromatografía de intercambio aniónico en una columna Hightrap Q (GE-Healthcare) para lo cual la columna se equilibró con Tris 20 mM pH 8.5. Las fracciones positivas de la etapa anterior se dializaron contra 5 l de agua destilada durante 120 min, y se tomaron en Tris 20 mM pH 8.5. La muestra se inyectó a 1 ml/minuto y se eluyó con un gradiente de NaCl 200-1000 mM en Tris 20 mM pH 8.5. Se recogió la fracción no unida.
La pureza de la preparación se comprobó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). Básicamente, se siguió la técnica descrita por Laemmli [(19) Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277, 680-685], utilizando un aparato de electroforesis MINI-PROTEAN (Bio-Rad). Los geles, que miden 10x10 cm y con una concentración de poliacrilamida del 12.5%, fueron sometidos a una corriente de 200 voltios durante 45 minutos en regulador Tris-glicina. Las proteínas utilizadas como marcadores fueron aquellas del kit Bio-Rad para pesos moleculares bajos. El cálculo de los pesos moleculares y el análisis densitométrico de los geles se llevaron a cabo utilizando un analizador de imágenes (Diversity, BioRad).
El resultado de la purificación de Der p 1 natural, fue una proteína con una pureza de más del 98% y un tamaño de
29.07 kDa cuando el SDS-PAGE se realizó en condiciones reductoras (Figura 7).
• Purificación de Der p 2 natural
Se agregaron 239 g/l de sulfato de amonio al sobrenadante de la precipitación con sulfato de amonio al 60% para obtener una concentración de 95% y se dejó que se agitara durante la noche a 4ºC. Se centrifugó durante 15 minutos a 17.000 xg y 4ºC, y el sedimento se resuspendió en 25 ml de agua MilliQ. Luego se llevó a cabo cromatografía de intercambio aniónico en una columna 16/20 HighFlow Q (GE-Healthcare) equilibrada con Tris 50 mM pH 8.0. La muestra se dializó frente a 5 l de agua durante la noche con tres cambios de agua y se tomó en Tris 50 mM pH 8.0. La muestra se inyectó a 5 ml/minuto y se recogió la fracción no unida. La tercera etapa de purificación consistió en cromatografía de intercambio catiónico en una columna Hightrap SP (GE-Healthcare) equilibrada con AcNa 20 Mm pH 5.5. La fracción no unida de la etapa anterior se dializó frente a 5 l de agua durante 3 horas y se tomó en AcNa 20 Mm pH 5.5. La muestra tenía un índice de flujo de 1 ml/minuto y se eluyó con un gradiente de NaCl 200-1000 mM en AcNa 20 Mm pH 5.5. Como la etapa de purificación final, la cromatografía en tamiz molecular se realizó en una columna Superdex S75/300 (GE-Healthcare) equilibrada con PBS. La fracción de la etapa anterior se eluyó con NaCl 200 mM, se concentró en Amicon Ultra 4 (Millipore) y tenía un indice de flujo de
0.4 ml/min, y se recolectaron fracciones de 0.5 ml. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE. Aquellas que contenían una proteína de 16 kDa correspondiente a Der p 2 se combinaron juntas.
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La purificación de Der p 2 natural dio como resultado una proteína con una pureza de más del 95% y un tamaño de
16.63 kDa cuando el SDS-PAGE se realizó en condiciones reductoras (Figura 7).
Ejemplo 2: Clonación de los alérgenos Der p 1 y Der p 2
El ADN complementario (ADNc) codificado para los alérgenos Der p 1 y Der p 2 se clonó mediante transcripción inversa seguida de amplificación por PCR utilizando ARNm como una plantilla aislada de Dermatophagoides y cebadores específicos en cada caso. El ARNm se aisló de 100 mg de cuerpos de D. pteronyssinus (Laboratiorios Leti, Madrid, España) utilizando el kit de purificación Prep Quick microARN (GE-Healthcare). El ADNc se obtuvo mediante transcripción inversa del ARNm utilizando el Kit de Síntesis de ADNc de primera hebra (GE-Healthcare).
Los cebadores consistían de la zona de hibridación, diversos sitios de división para diferentes endonucleasas de restricción (subrayados adelante), y nucleótidos de anclaje. La reacción de amplificación PCR tenía los siguientes componentes en un volumen de reacción de 50 μl: regulador de amplificación x 10, 5 μl; 200 μm de dNTPs; 100 pm de cada cebador de oligonucleótido; 2.5 unidades de Taq polimerasa (ADN polimerasa Pfx, Invitrogen); 1 ng de plantilla de ADN y agua estéril destilada hasta 50 μl. La reacción de amplificación se llevó a cabo en un termociclador RoboCycler (Stratagene) bajo condiciones específicas que se describieron en cada caso. El producto de la reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa (2%) y la banda de interés se aisló del gel mediante Geneclean (Bio101), utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los fragmentos aislados se ligaron en el vector pGEM (Promega). La mezcla de ligación se utilizó para transformar células competentes de E. coli DH5 (obtenibles a través de Invitrogen, Paisley, Reino Unido). Las colonias resultantes se cultivaron para aislar su ADN plásmido, que fue digerido con enzimas adecuadas para liberar el fragmento de interés. Se seleccionaron los clones positivos para su secuenciación. El ADN insertado en pBluescript se secuenció por el método de Sanger modificado para su uso con didesoxinucleótidos fluorescentes y amplificados en el termociclador utilizando el kit de secuenciación de terminación de reacción DyeDeoxy PRISM Ready (Perkin Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante.
• ADNc de Der p 1
La región de ADNc que codifica Der p 1 se amplificó mediante PCR utilizando cebadores diseñados de acuerdo con las secuencias publicadas (número de acceso GenBank: P08176). El cebador directo 5’-ACTGACAGGCCTCGTCCATCATCGATCAAAAC-3’ incluye la secuencia de división de la enzima StuI (subrayada) y el cebador inverso 5’-CGGAATTCCTAGGTTAGAGAATGACAACATATGG-3’ incluye las zonas de división de endonucleasas de EcoRI (subrayado) y AvrII (cursiva). Las condiciones de amplificación fueron: 94ºC-1' (1 ciclo); 94ºC-30", 48ºC-1', 72ºC-1' (35 ciclos); 72ºC-10' (1 ciclo). El producto de PCR obtenido se aisló, se clonó en vector pGEM (Promega) y se secuenció.
El ADN de plásmido de Der p 1 codificó una proteína de 302 aminoácidos que incluía una preproteína de 80 y una proteína madura de 222 aminoácidos (Figura 1). Esta secuencia mostró una diferencia (His152-> Asn) en comparación con la secuencia descrita para Der p 1.0105 (P08176). El peso molecular calculado de la proteína fue
24.97 kDa con un punto isoeléctrico de 5.49.
• ADNc de Der p 2
La región de ADNc que codifica Der p 2 se amplificó mediante PCR utilizando cebadores diseñados de acuerdo con las secuencias publicadas (AAF86462). 5’-CGGGATCCGATCAAGTCGATGTCAAAG-3’ se utilizó como un cebador directo, que incluyó la secuencia de división de la enzima de restricción BamHI y 5’-CGGAATTCTTAATCGCGGATTTTAGC-3’ como el cebador inverso con la secuencia de división de la enzima de restricción EcoRI. Las condiciones de amplificación fueron: 94°C-1’ (1 ciclo); 94°C-30", 48°C-1’, 72°C-1’ (35 ciclos); 72°C-10’ (1 ciclo). El producto PCR obtenido se aíslo, clonó en el vector pBluescript II KS (Stratagene) y se secuenció. El ADN de plásmido que codifica Der p 2 se aíslo después de digestión con la enzima de restriccións BamHI/EcoRI y se subclonó en los vectores pKN172 [(20) Way, M., Pope, B., Gooch, J., Hawkins, M., Weeds, A.G. (1990) Identification of a region in segment 1 of gelsolin critical for actin binding. EMBO J. 9; 4103-4109] y pTrcHis A (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.)].
La secuencia de Der p 2 obtenido codifica para un polipéptido de 129 aminoácidos (Figura 2) que incluía un cambio de aminoácido (Leu127-> Ile) con respecto a la secuencia Der p 2.0102 (AAF86462). Sin embargo Der p 2 (P49278) y otras isoformas descritas también tenían una isoleucina en esta posición. La proteína tenía un peso molecular teórico de 14.106 kDa y un punto isoeléctrico de 7.10.
Ejemplo 3: Expresión y purificación de Der p 2 recombinante
Las células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con el plásmido correspondiente por el método de Hanahan [(21) Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580] se dispersaron sobre las placas de Petri que contenían medio LB complementado con 200 μg/ml de ampicilina. A partir de una colonia de células, se preinocularon 50 ml del mismo medio, y se incubaron durante la noche a 37ºC con
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ligación. La digestión con PstI aseguró que este segundo fragmento incluyó solo una secuencia parcial de la proteína madura de Der p 1. La nueva construcción que incluía los fragmentos 1 y 2 a su vez fue digerida con AvrII y EcoRI y ligada a un fragmento 3. El ADN de plásmido que codifica la proteína de fusión se secuenció, y se subclonó en los vectores pKN172 y pTrcHis a para expresión de los mismos.
El ADN de la fusión QM2 fue formado a partir de la secuencia que codifica la proteína completa de Der p 2, en la que se había insertado entre las bases que determinaron los aminoácidos 73 y 74 una secuencia que se codifica desde el aminoácido 5 hasta el residuo final de la proteína madura de Der p 1 (Figura 5). La unión de Der p 1 con el segundo fragmento de Der p 2 implica la inclusión de 6 bases adicionales del núcleo de AvrII y que codifica prolina y arginina. Los cebadores diseñados para la construcción de los fragmentos 1 y 3 incluyen algunas diferencias con respecto a la secuencia original: cambios en los aminoácidos 72 (Ala-> Gly) y 78 (Cys-> Ser) de Der p 2 (Figura 6). El aminoácido 342 de la proteína resultó ser una valina en lugar de la alanina de la secuencia original de Der p 2. La proteína final destruyó completamente la estructura tridimensional de Der p 2 cuando la secuencia de Der p 1 se introdujo en su aminoácido 73. La proteína híbrida final se compuso de 349 aminoácidos con un peso molecular calculado 38.92 kDa y un punto isoeléctrico teórico de 6.22.
Ejemplo 6: Expresión y purificación de la proteína híbrida de la invención QM1, y proteína híbrida de comparador QM2
A partir de una colonia de células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con el plásmido correspondiente aislado de una placa de LB complementada con 200 µg/ml de ampicilina, un preinoculación de 50 ml del mismo medio se llevó y se incubó durante la noche a 37ºC con agitación (260 rpm). 1 litro del mismo medio se inoculó con dicha preinoculación comenzando con una densidad óptica (600 nm) de 0.2. Se incubó a 37ºC con agitación hasta que se alcanzó una densidad óptica (600 nm) de 0.6 (aprox. 90 minutos), en la que se llevo a cabo inducción de tiempo con isopropil-tio-β-galactósido (IPTG) a una concentración final de 0.6 mM. Después de un período de inducción de 3 horas las células se recolectaron mediante centrifugación.
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- Purificación de la proteína de la invención QM1
Las condiciones de lisis de las bacterias recombinantes y el replegamiento mediante diálisis en etapas para eliminar la urea fueron como para la purificación de rDer p 2 (Ejemplo 3). Finalmente se llevó a cabo plegamiento oxidativo mediante diálisis a 4ºC contra 1 l de cisteína 5 mM/cistina 1 mM en Tris 50 mM pH 8.0 durante la noche. Por último, se centrifugó a 3.800 xg y 4ºC durante 10 minutos y el sobrenadante se filtró a través de AP (Millipore) y se dializó contra fosfato 2 mM pH 8.5 durante 2 horas y se centrifugó a 18000 xg durante 15 minutos para eliminar el posible material precipitado. El rendimiento final de la purificación fue de 120 mg por litro de medio de cultivo.
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- Purificación de la proteína de comparador QM2
Las condiciones de lisis de las bacterias recombinantes fueron como para la purificación de rDer p 2 (Ejemplo 3). Se agregó DTT 50 mM a 135 mg de proteína en 10 ml de cloruro de guanidina 6 M y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se agregó 2-yodoacetamida 0.2 M y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se agregó β-mercaptoetanol 0.2 M, se incubó durante una hora más a temperatura ambiente y se tomó en 50 ml con urea 6 M. Luego se llevó a cabo plegamiento en etapas mediante diálisis para eliminar la urea como para la purificación de rDer p 2 (Ejemplo 3) y se centrifugó a 3800 xg durante 15 minutos para eliminar cualquier material precipitado. La siguiente etapa de purificación consistió en cromatografía de intercambio aniónico en una columna 16/20 HighFlow Q equilibrada con etanolamina 20 mM pH 10.0. La muestra se hizo pasar a 5 ml/min y el material no unido se recogió y se concentró en Amicon Ultra 4 (Millipore). Se centrifugó a 3800 xg durante 15 minutos y se filtró a través de filtro de AP y 0.45 µm para eliminar cualquier material precipitado. Finalmente se realizó cromatografía de tamiz molecular en una columna Superdex 16/60 SX200 equilibrada con NH4HCO3 200 mM a 1 ml/min. La proteína salió en el eluyente debido a su tendencia a formar agregados. La preparación pura se liofilizó en el mismo regulador y se mantuvo a 4ºC. El rendimiento final de la purificación fue 42.4 mg por litro de medio de cultivo.
Ambas proteínas se encontraron en la fracción insoluble como cuerpos de inclusión, pero que no se podían solubilizar en urea. La purificación de QM1 y QM2 resultó en proteínas con una pureza de más del 95% y un tamaño de 34.91 y 39.67 kDa, respectivamente cuando el SDS-PAGE se realizó en condiciones reductoras (Figura 7).
Ejemplo 7: Pruebas inmunológicas para demostrar la baja reactividad de fijación a IgE de proteínas híbridas a una mezcla de sueros de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus
A) Inmunodetección
Una evaluación inicial de las actividades de unión a IgE por las quimeras QM1 y QM2 se llevó a cabo mediante la técnica de inmunotransferencia utilizando una mezcla de sueros de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus. Después de que los extractos de proteínas y las proteínas purificadas se aplicaron a geles de poliacrilamida, se realizó electrotransferencia utilizando el método de Towbin et al [Towbin, H., Staehelin, I., and Gordon, J. (1979).
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Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354]. Las proteínas separadas por SDS-PAGE se electrotransfirieron a hojas de Hybond-P con PVDF (difluoruro de polivinilideno) (GE-Healthcare). Después de que las hojas se habían bloqueado durante 1 hora a temperatura ambiente, se incubaron durante la noche a 4ºC con un anticuerpo primario y después de varios lavados con el mismo regulador de lavado, las hojas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario combinado con peroxidasa. La detección de banda se llevó a cabo utilizando el método quimioluminiscente ECL (GE-Healthcare) como se mencionó por el fabricante mediante exposición de la hoja a una película (Hyperfilm.ECL, GE-Healthcare).
Las pruebas de inmunodetección no fueron cuantitativas pero mostraron una capacidad de unión a IgE diferentes entre los dos quimeras; por lo tanto, sólo en el caso de QM1 hubo un ligero reconocimiento de anticuerpos IgE, mientras que en el caso la quimera QM2 el reconocimiento fue cero (Figura 8).
B) ELISA directa
La reactividad IgE de las dos quimeras se analizó mediante la técnica de ELISA con sueros individuales de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus. Las placas de poliestireno (Greiner) se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con 0.1 µg por taza pequeña de mezcla equimolecular de proteínas puras de nDer p 1 y nDer p 2 en regulador PBS (fosfato 10 mM pH 7.2; NaCl 137 mM KCl 2.7 mM). Se bloquearon con 200 µl/pequeña taza de PBS complementado con BSA al 1% Tween 20 al 0.05% y se mantuvo durante 1 hora a 37ºC. Luego se agregó 100 µl/taza pequeña de la mezcla de sueros de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus a dilución 1/4, y se dejó a 37ºC durante 90 min. Después de 3 lavados con 200 µl/pequeña taza de PBS-T (PBS + Tween 20 al 0.05%), se agregaron 100 µl/taza pequeña de un antisuero contra inmunoglobulinas IgE humanas (Dako) combinado con peroxidasa (dilución 1:1000) y se incubaron durante 90 minutos a 37ºC. Después de tres lavados más con PBS-T, se agregaron 200 µl/taza pequeña de una solución de o-fenilendiamina (Sigma-Fast Tablet Sets, Sigma) preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las placas se mantuvieron en la oscuridad durante 30 minutos. La reacción se detuvo con 50 µl/taza pequeña de H2SO4 3 M y se midió la absorbencia a 492 nm en un lector de placas ELISA Easy Reader EAR-400 AT (Instrumentos SLT-Lab).
La reactividad de IgE a la quimera QM1 se muestra sólo en algunos pacientes, mientras que la QM2 no se reconoció por prácticamente ninguna de los anticuerpos IgE del suero de pacientes (Figura 9).
C) Inhibición de ELISA
La reactividad de IgE para las dos quimeras se analizó mediante la técnica de ELISA de inhibición con una mezcla de sueros individuales de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus. La técnica fue la misma que la anterior excepto que la mezcla de sueros de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus se preincubó a una dilución de 1/10 con concentraciones particulares de inhibidor de proteínas (de 0.025 a 2500 ng/ml), durante la noche a 4°C. Los anticuerpos unidos a IgE luego se detectaron como para ELISA directa.
En los ensayos de inhibición de ELISA, la quimera QM1 mostró un menor grado de inhibición de la mezcla equivalente de nDer p 1-nDer p 2. De este modo la cantidad de nDer p 1-nDer p 2 necesaria para lograr una inhibición del 50% fue de 1 ng/ml, mientras que se tuvo que agregar 2500 ng/ml para lograr el mismo efecto con la quimera QM1 (Figura 10). Esto indicaría que la QM1 tiene 2500 veces menos capacidad de unión a IgE específicos de pacientes y por lo tanto su alergencidad se reduciría en 99.96%. La quimera QM2 es incapaz de unir IgE específicos de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus, y por lo tanto su comportamiento en las pruebas de inhibición de ELISA no varió de aquel obtenido con un control negativo, tal como albúmina de suero bovino.
Ejemplo 8: Experimentos in vivo para demostrar la baja reactividad cutánea de las proteínas híbridas QM1 y QM2.
Las pruebas in vivo de punción cutánea se llevaron a cabo en 107 pacientes alérgicos a ácaros para evaluar la hipoalergenicidad de las quimeras QM1 y QM2
Las pruebas cutáneas se llevaron a cabo con un extracto de D. pteronyssinus, nDer p 1 y nDer p 2 aislado de los ácaros; rDer p 2 expresado en E. coli, y las quimeras QM1 y QM2. Todas las muestras se diluyeron en fenolado al 0.5% y solución salina fisiológica glicerinada al 50%. Las concentraciones utilizadas fueron 1, 10, y 100 µg/ml para las proteínas purificadas no modificadas (nDer p 1, nDer p 2, y rDer p 2) y 5, 50 y 500 µg/ml para las quimeras. Se utilizaron NaCl al 0.9% y clorhidrato de histamina (10 mg/ml) como controles negativos y positivos, respectivamente.
En el experimento, una gota de cada alérgeno se colocó para la prueba sobre la parte interna del antebrazo que después se pincha a través de la gota con una lanceta. Cada prueba se duplicó en filas para la comparación de aumento y disminución de concentraciones. Después de 15 min, las pápulas se rodearon con un fino punto de rotulador negro. Se colocaron tiras de esparadrapo hipoalergénico en la pápula y se prensan suavemente para transferir el rastro de tinta sobre la tira, que se transfirió a las hojas de registro de pápula. Las áreas de pápula se midieron por medio de entradas digitalizadas, utilizando el panel de escritura de digitalización Summasketch y un programa de diseño asistido por ordenador (Autocad v. 11).
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Las células de sangre situadas en la capa por encima de los eritrocitos se recolectaron mediante centrifugación y se resuspendieron en regulador HEPES-Ca2+ (HEPES 20 mM, NaCl 133 mM, KCl 5 mM, CaCl2 7 mM, MgCl2 3.5 mM, 1 mg/ml de BSA, pH 7.4) que contenía IL3 (2 ng/ml) y 10 µl de heparina (5000 UI/ml). Los alérgenos y soluciones de control (50 µl) se agregaron a tazas pequeñas en placas de poliestireno con fondo en forma de U (Greiner Microlon, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) a concentraciones que variaban entre 2 µg/ml y 0.02 pg/ml, mezcladas con 50 µl de la suspensión de células de pacientes y se incubaron a 37ºC durante 40 minutos. La reacción se detuvo al agregar 100 µl de regulador HEPES sin Ca2+ o Mg2+, pero que contiene EDTA 0.27 mM (regulador de lavado), y se centrifugaron las placas. Los basófilos del sedimento de células se marcaron con anticuerpos anti-CD63 marcados con PE (ficoeritrina) y anticuerpos anti-IgE marcados con FITC (isotiocianato de fluoresceína) (diluciones
1:80 y 1:60, respectivamente Caltag, Burlingame, EE.UU.) y se incubaron durante 30 minutos a 4ºC, se agregaron, posteriormente, 4 ml de reactivo de eritrolítico (Ortho Diagnostic System, Madrid, España). La lisis celular se detuvo al agregar regulador de lavado y después centrifugar las células, los sobrenadantes se diluyeron con 500 µl del mismo regulador. Los marcadores de superficie de los basófilos se analizaron mediante citometría de flujo a 488 nm utilizando un aparato de citometría de flujo FACScan equipado con un láser de argón nW 15 (Becton Dickinson, San José, EE.UU.) y se analizaron los datos utilizando el paquete de ordenador CellQuest. En cada prueba, los marcadores anti-IgE y anti-CD63 se estudiaron en por lo menos 500 basófilos.
El anticuerpo monoclonal anti-IgE, Le27 (1 µl/ml; Bühlmann, Allschwil, Suiza) se utilizó como un control positivo y los valores basales sin estimulación fueron evaluados con regulador HEPES-Ca2+. Las respuestas de activación se consideraron positivas cuando el índice de estimulación (% de basófilos activados con extracto de D. pteronyssinus
o proteína purificada/% de basófilos activados en condiciones basales) fue ≥2 en cualquiera de las concentraciones del extracto de D. pteronyssinus o proteína purificada utilizada) y la activación específica debido al alérgeno fue >10%.
Ninguno de los sujetos de control mostró un resultado positivo para cualquiera de las quimeras QM1 o QM2. De los 33 pacientes alérgicos a D. pteronyssinus estudiados, QM1 dio una respuesta positiva en 28, mientras que con QM2 hubo una respuesta positiva en sólo 10 casos y siempre a concentraciones mucho más bajas que aquellas en las que QM1 dio una respuesta positiva.
Ejemplo 12: Experimentos de linfoproliferación inducida para demostrar la capacidad inmunógena de la proteína híbrida de la invención QM1, y la proteína híbrida de comparador QM2
Un requisito esencial para el uso de una molécula hipoalergénica en la inmunoterapia es que se mantendrá la antigenicidad de la misma (epítopos T). Por lo tanto para comprobar si los anticuerpos IgE no de unión, las proteínas híbridas continuan siendo antigénicas, un estudio de linfoproliferación se llevó a cabo en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimuladas por las diferentes proteínas utilizadas en los experimentos. Se llevaron a cabo mediante la incorporación de un derivado de fluoresceína en cultivos de linfocitos purificados. Este derivado (éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE)) podría pasar a través de la membrana celular, pero no fue fluorescente hasta que había sido degradado por las esterasas celulares que se convirtió en un compuesto fluorescente incapaz de pasar a través de la membrana celular. La incorporación de CFSE se analizó por citometría de flujo en un citómetro de flujo BD FACSCalibur (Becton-Dickinson, Franklin Lakes NJ, EE.UU.).
Las PBMC de 23 pacientes alérgicos a D. pteronyssinus se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando una solución de separación de linfocitos (Lymphoprep, Nycomed). Las PBMC se resuspendieron luego en 1-2x106 células viables/ml en medio de cultivo (RPMI 1640, Sigma Chemical Co.) y se probó la viabilidad de las mismas con 0.25% de azul de tripano en PBS (Sigma Chemical Co.). Las PBMC preparadas con la viabilidad superior al 90% se utilizaron inmediatamente para pruebas de proliferación in vitro. 10x106 PBMCs en medio RPMI1640 se marcaron con CFSE (concentración final 5 µM) durante 10 min a 37ºC y en una atmósfera humidificada de 5% de CO2. El marcado se detuvo con suero de ternera fetal al 50% durante 5 min y se lavaron dos veces con RPMI-1640 complementado con suero de ternera fetal al 10% y se resuspendieron a 1-2x106 células/ml en Medio Completo (RPMI-1640, 50 µg/ml de gentamicina, y glutamina 2 mM) complementado con suero AB humano al 5%. Se colocaron en microplacas de fondo plano con 24 tazas pequeñas (Nunclon, NUNC), 1-2x106 células en un volumen final de medio de 1 ml y los antígenos (extracto de D. pteronyssinus y las diferentes proteínas purificadas) se agregaron a una concentración final de 10 µg/ml y se incubaron durante 7 días a 37ºC y en una atmósfera humidificada de 5% de CO2. El análisis por citometría de flujo se llevó a cabo en un citómetro de flujo (BD FACSCalibur Becton-Dickinson) con capacidad para fluorescencia de cuatro colores. Los resultados se expresaron como porcentaje de los eventos registrados evaluados por el paquete de programas de Software Cell Quest (Becton-Dickinson). Se incluyeron controles por triplicado de cultivos no estimulados en todos los casos. Las proteínas utilizadas en la prueba fueron las dos proteínas híbridas (QM1 y QM2), dos mezclas equimoleculares de las proteínas purificadas nDer p 1 y nDer p 2 de D. pteronyssinus (mezcla natural) y las proteínas recombinantes rDer p 1 y rDer p 2 aisladas de E. coli (mezcla recombinante). El extracto de D. pteronyssinus también se utilizó como control.
En la primera etapa se llevó a cabo un barrido de concentraciones de proteína de inmunógeno para determinar la concentración óptima para la posterior realización de la prueba. En todos los casos se observó que la concentración de proteína que mostró la proliferación máxima (IE%) fue 10 µg/ml.
15
25
35
45
55
Los resultados de proliferación con los 23 pacientes alérgicos a D. pteronyssinus se analizaron mediante análisis de diagrama de cajas estadístico y pruebas no paramétricas para las dos muestras emparejadas. Se podría ver a partir del análisis estadístico que el extracto de D. pteronyssinus (promedio 12%, intervalo de confianza del 95%: 8-20), utilizado como control, tenía una capacidad de estimulación antigénica no significativamente diferente de aquella de las quimeras QM1 (promedio del 15%, intervalo de confianza del 95%: 10-25) y QM2 (promedio 13%, intervalo de confianza del 95%: 8-17) (P=0.121 y P=0.304, respectivamente). Sin embargo, la inmunogenicidad de QM1 fue significativamente mayor (P<0.05) que aquella obtenida con la mezcla natural (promedio 9%, intervalo de confianza del 95%: 5-13) o la mezcla recombinante (P<0.005) (promedio 9%, intervalo de confianza de 95%: 57-14.5). Cuando las dos quimeras se compararon entre sí, se observó que la capacidad de inducir immunoproliferación fue significativamente mayor en el caso de QM1 (P<0.005) (Figura 13).
A partir de los resultados obtenidos se pudo ver que tanto QM1 y QM2 continuaron manteniendo la capacidad de inducción de immunoproliferación y esto fue incluso mayor en las proteínas fusionadas en comparación con las proteínas de tipo silvestre.
Ejemplo 13: Los anticuerpos inducidos por proteína híbrida de la proteína invención QM1 y proteína híbrida de comparador QM2 inhiben la unión a IgE de pacientes a alérgenos naturales
Para este propósito se realizó la inmunización de ratones con híbridos. Se inmunizaron ratones hembra BALB/c de seis semanas de edad (Haarlam, Barcelona, España) por vía intraperitoneal, cinco veces cada quince días, con 10 µg de la mezcla equimolar purificada de nDer p 1 y nDer p 2 (nD1D2), QM1 o QM2 adsorbidas en hidróxido de aluminio. Se utilizaron seis ratones para cada proteína y se obtuvieron sueros 10 días después del último refuerzo a través de la hemorragia de la vena submandibular, se agruparon y almacenaron a -20ºC hasta uso.
En primer lugar, se comprobó si los antisueros obtenidos mediante inmunización de ratones con nD1D2, QM1 y QM2 fueron reactivos a nD1D2 utilizando experimentos de titulación ELISA. Los experimentos de ELISA se realizaron como se describió en el Ejemplo 7B, pero se agregaron diluciones de dos veces de los antisueros de ratones y después los pozos se incubaron con anticuerpo IgG anti-ratón de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma Chemical, St. Louis, Mo, EE.UU.) diluido 1/2000. Después de tres lavados, se midió la actividad de peroxidasa agregando 200 µL/pozo de una solución de o-fenilendiamina (Sigma). Después de 30 min, la reacción de color se detuvo al agregar 50 µl/pozo de H2SO4 3 M, y se leyó la densidad óptica a 492 nm.
Los antisueros obtenidos mediante inmunización de ratones con una mezcla equimolar de nDer p 1 y nDer p 2 purificados (nD1D2), QM1 y QM2 reaccionaron a nD1D2, que muestra que la inmunización con ambos híbridos conducen a mayores niveles de anticuerpos IgG específicos a nD1D2en comparación con inmunización con nD1D2 (Figura 14A).
Con el fin de investigar si los ratones IgG contra moléculas híbridas podrían inhibir la unión de IgE de suero de pacientes a nD1D2, se llevó a cabo ELISA competitivo con sueros individuales de nueve pacientes alérgicos a ácaros del polvo doméstico (HDM) o un conjunto de sueros (diluido 1/50) de 30 pacientes alérgicos a HDM. Las placas de ELISA (Greiner) se recubrieron (100 ng/pozo) durante la noche con nD1D2 en PBS, se preincubaron con una dilución 1/20 de conjuntos de suero de anti-nD1D2, anti-QM1, y anti-QM2 de 6 ratones. Un conjunto de suero preinmune se utilizó como control de la inmunización. Después del lavado, las placas se incubaron con sueros individuales (diluido 1/20 y 1/50) o un conjunto de sueros (diluido 1/50) de pacientes alérgicos a HDM. Los anticuerpos IgE unidos se detectaron con un mAb de IgE anti-humano etiquetado con peroxidasa de rábano (HRP) (Southern, Birmingham, AL) diluido 1/2000 y o-fenilendiamina (Sigma). La capacidad de bloqueo se expresó como una señal de porcentaje de los pozos sin suero de ratón agregado.
Los anticuerpos específicos de ratón obtenidos por proteínas híbridas de inmunización fueron capaces de bloquear la unión de nueve IgE de pacientes alérgicos a ácaros a la mezcla equimolar de nDer p 1 y nDer p 2 purificado (nD1D2) de una manera diferente. La inhibición obtenida con anticuerpos anti-nD1D2 de ratón fue de entre 41 y 72% (media 56%) mientras que los anticuerpos anti-QM1 y anti-QM2 de ratón inhibieron la unión a IgE de suero a nD1D2 entre 43 y 82% (media 60%) y entre 0 y 45% (media 20%), respectivamente (Tabla I). La inhibición obtenida con los anticuerpos anti-nD1D2 ratón fue ligeramente inferior (aunque no estadísticamente diferente; P=0.139) que aquella obtenida con los anticuerpos anti-QM1 de ratón. La inhibición obtenida en el grupo de anti-QM2 ratón fue estadísticamente diferente (P<0.01) a aquella obtenida en los grupos anti-nD1D2 y anti-QM1.
Tabla I: Porcentaje de inhibición de la unión a IgE de pacientes a nD1D2 por anticuerpos de IgG de ratón específicos a nD1D2, QM1 y QM2.
Paciente anti-nD1D2 anti-QM1 anti-QM2
#6 51% 56% 0% #28 52% 57% 19% #34 69% 77% 36%
18
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