CN1780852A - 组1螨多肽变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组1螨多肽的变体，其中变体的成熟多肽在如下位置或相应于如下的位置含有一个或多个突变：SEQ ID NO：1的A10、A12、E13、G29、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、S67、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98、R99、E100、Q101、R104、R105、P106、Q109、R110、F111、G112、I113、A132、I144、K145、D146、D148、R151、I158、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208或成熟Der p1多肽的10、12、13、29、30、32、46、47、54、55、64、66、67、73、75、I80、84、86、87、92、Y93、96、98、99、100、101、104、105、106、109、110、111、112、113、132、144、145、146、148、151、158、159、160、161、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208位。

Description

组1螨多肽变体
发明领域
本发明涉及与亲本组1多肽过敏原相比具有改变的抗原谱的组1螨多肽抗原过敏原的变体、制备此类变体的方法、包含变体的组合物和变体在诸如过敏反应接种和/或脱敏作用的免疫治疗中的用途。
发明背景
与人和动物异源的抗原多肽，例如组1螨多肽过敏原，存在于诸如灰尘螨屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)(Der p1)或粉尘螨(Dermatophagoides farinae)(Der f1)的粪便中，这些抗原多肽能够在人和动物的易感个体中诱导免疫反应，如特异反应性过敏反应。过敏反应可以包括花粉症、鼻结膜炎、鼻炎和哮喘，并且当致敏个体受到诸如蜂蜇或虫咬时，甚至会产生全身性过敏反应和死亡。
通过吸入、直接与皮肤或眼睛接触、摄食或注射可以使个体变得对此类称为过敏原的多肽敏感。过敏反应之后的一般机制可分为致敏期和症状期。致敏期包括个体首先暴露于过敏原。该事件激活特异的T-和B-淋巴细胞，并且导致产生过敏原特异性抗体，如免疫球蛋白E(IgE)。特异性IgE抗体结合至肥大细胞和嗜碱性粒细胞，或者其它细胞上的IgE受体，并且当第二次暴露于相同或同源过敏原时则开始进入症状期。过敏原将结合至细胞结合的IgE，并且抗体的多克隆特性导致IgE受体的桥接和聚集，并且随后导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞激活。该种激活作用导致释放多种化学递质，例如组胺、肝素、蛋白酶、前列腺素D2和白三烯类，这些化学递质参与过敏反应症状期的早期和晚期反应。
对于某些形式的IgE-介导的过敏反应，存在称为特异性过敏反应接种(SAV)或免疫治疗(IT)的治疗，该治疗包括重复胃肠外或粘膜(例如舌下)施用按配方制成疫苗的过敏原制剂(Int.Arch.Allergy Immunol.，1999，119卷，1-5页)。这导致减轻过敏反应症状，最可能是由于诱导了保护性、不基于lgE的免疫反应，这可能通过调节现有的Th2反应和/或使免疫反应重定向到免疫保护(Th1)途径(Int.Arch.Allergy Immunol.，1999，119卷，1-5页)。
与其它类型接种疫苗相比，过敏患者体内存在的和正在发生的免疫反应使过敏反应接种复杂化。在受影响组织中诸如肥大细胞和嗜碱性粒细胞的效应细胞上存在过敏原特异性IgE抗体可以导致当暴露于抗原时产生过敏反应状。因此，有害事件或副反应的固有危险限制了能够进行施用的抗原的剂量，并且当递送剂量随着时间缓慢增加时使得延长(12-36个月)且繁杂的治疗方案成为必需。
因此需要提供具有诱导有害事件较低固有危险的修饰的过敏原，该种过敏原能够用于特异性过敏反应接种。这些修饰的过敏原将具有降低的结合，特别是交联抗原特异IgE分子的能力。同时重要的是它们保留了亲本过敏原的三级结构并且某种程度上保留了免疫原性，以使得能够在患者体内引起保护性(基于IgG)免疫反应。
为了产生此类修饰的蛋白质，首先期望鉴定分子上最小B细胞表位。表位是复杂抗原上能够结合抗体的结构区域，而最小表位包含直接参与抗体结合的氨基酸。
在天然情况下B-细胞表位可以是连续的、间断的或其组合，但是必须包含大约10个氨基酸以引起抗体反应。人们可以鉴定包含表位或最小表位的分子的更大区域或范围，但是当期望通过在分子中导入突变来改变多肽的免疫原特性时，人们将认识到首先鉴定最小表位的重要性，因为如果有可能进行突变的氨基酸超过5-10个氨基酸时，则通过突变氨基酸制备修饰的多肽几乎是不可能的。这是因为随着参与突变策略的氨基酸数量增加，可能的变体的数量也急剧增加(许多可能的排列)，并且还因为修饰非表位部分的氨基酸可能用途较小。
一些研究已经致力于鉴定组1粉尘螨过敏原中的表位：
Green等人，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.，92卷，30-38页，1990；Green等人，J.Immunol.，147卷，3768-3773页，1991和Green和Thomas，Mol.Immunol.，卷29(2)，257-262页，1992公开了Der p1的抗体结合片段。所公开的抗体结合区域非常大(11-56个氨基酸残基)并且合在一起它们几乎覆盖分子的全部氨基酸。
Lombardero等人，J.Immunol.，卷144(4)，1353-1360页，1990，揭示Der p1上的B细胞表位是构象表位，即表位由分子的非连续部分组成并因此高度依赖正确的三级结构，并且揭示抗体结合对蛋白质变性敏感。
Collins等人，Clin.Exp.Allergy，卷26(1)，36-42页，1996，得出结论：Der p1和Der f1的IgE结合表位天然情况下是不连续的。
Jeannin等人，Mol.Immunol.，卷29(6)，739-749页，1992，使用对Der p1三维模型上氨基酸残基疏水性和溶剂可接近性的预测鉴定出4种假定的抗体结合肽：N52-C71、C117-Q133、G176-1187和V188-Y199。这四种肽能够在40-60％粉尘螨患者的嗜碱性粒细胞中诱导低水平释放组胺。组胺释放需要至少2个IgE分子的交联并且作者推测这些肽必定非特异地结合至血清成分，并因此可充当半抗原。
Furmonaviciene等人，Clin.Exp.Allergy，卷29，1563-1571页，1999，提出Der p1的L147-Q160是由单克隆小鼠抗-Der p1抗体潜在识别的表位。
Pierson-Mullany等人，Mol.Immunol.，37，613-620页，2000，报道代表Der p1的残基T1-T21、E59-Y93、Y155-W187和I209-I221的肽能够部分抑制人血清结合至Der p1。
WO 99/47680(ALK-ABELLO)公开过敏原可以进行修饰以使得这些多肽变应原性降低。该公开主要涉及白桦花粉蛋白质Bet v1和蛇毒过敏原Ves V5的修饰。
WO 02/40676(ALK-ABELLO)公开了修饰的过敏原，所述修饰据说引起了过敏原的变应原性降低。在该公开中根据其溶剂可接近性选择了适于进行修饰的氨基酸，即如果它们存在于过敏原表面或者选择相对相同分类群的同源过敏原是保守的那些氨基酸。
WO01/29078(HESKA)描述组1螨蛋白质的重组表达、编码这些蛋白质的核苷酸序列和进行了修饰使得能够在某些微生物中表达蛋白质的核苷酸序列。该公开的组1螨多肽叙述为结合IgE，IgE也结合天然组1螨多肽。
EP-A-1 219 300叙述了施用过敏反应疫苗的方法。
在该文献中提出了关于诸如Der p1的组1螨多肽抗体结合表位的各种建议。然而，文献涉及(1)线性表位，其中大多数在过敏反应中具有低相关性，(2)一些区域，这些区域非常大以致含有参与抗体识别的特定氨基酸的信息，(3)通过选择具有较高溶剂可接近性的区域所选择的表位，而没有考虑这些表位是否事实上参与抗体结合，(4)非人表位或者(5)(1)-(4)中一项或多项的组合。
例如Der p1中表位鉴定不充分可能是在不同文献中报导的例如Der p1非常不同的潜在表位的原因。例如在WO 02/40676中，残基E13、P24、R20、Y50、S67、R78、R99、Q109、R128、R156、R161、P167和W192被选择为对于Der p1的变应原性是重要的，而在Pierson-Mullany等人的文章中认为表位是T1-T21、E59-Y93、Y155-W187和I209-I221，在Furmonaviciene等人的文章中主要表位确定为L147-Q160，并且在Jeannin等人的文章中(其中使用了与WO 02/40676中几乎完全相同的方法)鉴定为N52-C71、C117-Q133、G176-I187和V188-Y199。
另外，两个研究试图通过在活性位点、成熟位点或半胱氨酸键形成位点的残基中进行突变降低活性或‘过敏原活性’：
WO 99/25823(Smith Kline Beecham)公开了Der p1的变体，其中a)C34是突变的，b)前肽位点是修饰的，例如通过NAET序列的缺失修饰或者c)H170是突变的。
WO 03/016340(Smith Kline Beecham)公开了Der p1的变体，其中六个半胱氨酸(C4、C31、C65、C71、C103或C117)中的任何一个是突变的。
本领域关于例如Der p1的表位的含糊性表明关于组1螨多肽的表位目前没有得到结论性的和可靠的数据，并且包含于所述表位内的适于进行突变以降低这些多肽的抗原性的氨基酸的结论性和可靠数据更少。
发明概述
已经开展了降低多肽过敏原的变应原性的尝试。发现表位中小的改变可以影响结合至抗体的能力。这可以改变此种表位的特性，例如将其从对抗体的高亲和力转化为低亲和力的表位，或者甚至导致表位丧失，即表位不足以结合抗体以引起抗原反应。
为了产生作为疫苗剂的具有改善特性的经修饰的组1螨多肽，首先鉴定分子上最小B细胞表位是有利的。表位是能够结合抗体的复杂抗原上的最小结构区域。天然情况下B-细胞表位可以是连续的或不连续的。最小表位由直接参与抗体结合的特定氨基酸组成。
本发明涉及包括Der p1的组1螨多肽抗原的变体，包含最小表位中的突变并因此在所暴露的动物(包括人)中具有改变的免疫原谱。
申请人已经鉴定了组1螨多肽中参与抗体结合表位的氨基酸并且其中的突变对抗体结合，特别是多肽的IgE结合具有改变的，优选地为降低的影响。因此，本发明首先一方面提供了组1螨多肽的变体，其中变体的成熟多肽在如下位置或者相应于如下位置上含有一个或多个突变：SEQ IDNO：1的A10、A12、E13、G29、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、S67、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98-Q101、R104-P106、Q109-1113、A132、I144-D146、D148、R151、I158-Q166、N179、A180、G182-D184、A205、I208位或备选地成熟Der p1多肽的10、12、13、29、30、32、46、47、54、55、64、66、67、73、75、80、84、86、87、92、93、96、98-101、104-106、109-113、132、144-146、148、151、158-166、179-180、182-184、205、208的位。
具体而言，所述变体具有降低的IgE-结合，更加具体而言是与保守的免疫原性相结合以诱导保护性反应(见上)。仍然更加优选地是，与天然组1螨多肽相比，变体在所暴露的动物(包括人)中具有改变的免疫原谱。
在本发明的另一方面，提供了编码本发明变体的核苷酸序列；包含编码所述变体的核苷酸序列的核苷酸构建体，所述核苷酸序列有效连接至指导宿主细胞中变体产生的一个或多个控制序列；包含本发明核苷酸构建体的重组表达载体和包含本发明核苷酸构建体的重组宿主细胞。
在本发明的另一方面还提供了制备本发明变体的方法，其包括：
(a)在有助于产生本发明变体的条件下培养本发明的重组宿主细胞和
(b)回收变体。
在本发明另一方面还提供了包含本发明变体和可药用载体的组合物和制备此种药物组合物的方法，其包括将本发明变体与可药用载体相混合。
在本发明另一方面还提供了用作药物的本发明的变体或组合物。
在本发明另一方面还提供了本发明的变体或组合物用于制备治疗免疫性疾病的药物的用途。
在本发明另一方面还提供了本发明的变体或组合物用于治疗疾病的用途。
在本发明另一方面还提供了本发明的变体或组合物用于治疗免疫性疾病的用途。
在本发明另一方面还提供了包含固定化于固体支持物上的本发明变体的试剂盒。
附图简述
图1显示一个典型供体一供体1-应答用组1螨多肽(nDerp1)和组1螨多肽变体rec-proDer p1、rec-Der p1和DP070刺激时的组胺释放。
图2显示归一化的组胺释放，对于组1螨多肽变体计算了EC50。绘制了从14个患有粉尘螨过敏反应的患者中分离的nDer p1-特异IgE血清中的剂量反应曲线并拟合为S形曲线，并且计算了组1多肽变体的EC50并对组1螨多肽(nDer p1)归一化。
序列表
本申请包括序列表形式的信息，序列表附于本申请后面并且与本申请一起以数据载体提交。数据载体的内容此处全部引用作为参考。
发明详述
定义
用于文中的术语“天然多肽”可以理解为基本上以其天然形式存在的多肽。例如天然多肽可以是野生型多肽，即从天然来源分离的多肽、通过遗传工程在不同于天然来源的宿主生物体中表达所获得的以其天然存在形式的多肽或通过多肽合成获得的多肽。
如上下文中所使用的“表位”或者“B-细胞表位”是复杂抗原上能够与抗体组合或结合的抗原决定簇和结构区域。在天然情况下它可能是不连续的，但是一般而言其大小为1kD或更小(大约10个氨基酸或更少)。大小可以是3-10个氨基酸或5-10个氨基酸或者甚至7-10个氨基酸，这依赖于表位和多肽。
如文中所使用的术语“表位模式”可以理解为抗体结合肽的共有序列。实例是表位模式ARR*R。注释中的符号“*”表示对齐的抗体结合肽在第二个和第三个精氨酸之间包括非共有部分。该部分可以是任意氨基酸或者几个氨基酸或者无氨基酸。表位模式用于鉴定复杂抗原上的表位和最小表位。
如文中所使用术语“锚定氨基酸”可以理解为在由定义该模式的单特异性抗体结合的全部肽中重复出现的表位模式的保守的各个氨基酸。锚定氨基酸通常还是完全多肽上最小表位的氨基酸。
在上下文中，多肽的“抗原性”表示其结合如IgE和/或IgG和/或其它免疫球蛋白类型抗体的能力。文中所使用的多肽‘IgE-抗原性’表示其结合IgE抗体的能力。
多肽的‘免疫原性’表示其在所暴露动物，包括人中刺激抗体产生和免疫反应的能力。
多肽的“变应原性”表示其在所暴露动物，包括人中刺激IgE抗体产生和过敏原致敏反应的能力。
术语“亲本”或“亲本组1螨多肽”可以理解为根据本发明导入突变前的组1螨多肽(也称作组1螨过敏原)。具体而言亲本组1螨多肽是天然组1螨多肽。
组1螨多肽
如诸如WO 01/29078的文献中所叙述，螨产生几类或几组过敏原，其中之一已知是组1过敏原。呈现重要交叉反应的组1过敏原已经发现于屋尘螨、粉尘螨、丝泊尘螨(Dermatophagoides siboney)、Dermatophagoidesmicroceaus、热带无爪螨(Blomia tropicalis)和埋内欧螨(Euroglyphusmaynei)，参见例如Thomas等人，1998，Allergy 53，821-832。
组1螨过敏原与半胱氨酸蛋白酶家族(包括actinidin、木瓜蛋白酶、组织蛋白酶H和组织蛋白酶B)具有显著的同源性，这就是它们通常被称为组1螨半胱氨酸蛋白酶的原因。组1螨过敏原通常发现于螨的排泄物并且认为其在螨肠道内具有消化酶的功能。
来自不同螨的组1过敏原是高度同源的，大约25千道尔顿(kD)的分泌糖蛋白，它们是由细胞合成的将加工成成熟形式的前蛋白原。例如粉尘螨、屋尘螨和埋内欧螨组1蛋白质具有大约80％的同一性。具体而言，来自粉尘螨和屋尘螨的组1过敏原，还分别称为Der f1和Der p1蛋白质，在结合IgE和IgG方面显示广泛的交叉反应性。在螨过敏的患者中，大约80％-90％的患者具有与组1过敏原反应的IgE(Thomas，Adv.Exp.Med.Biol.，409，85-93页，1996)。
因此组1螨过敏原包括本领域中已知的天然多肽，如从屋尘螨获得的Der p1(NCBI登录号：P08176，SEQ ID NO：1)、从粉尘螨获得的Der f1(NCBI登录号：P16311，SEQ ID NO：2)、从埋内欧螨获得的Eur m1(NCBI登录号：P25780，SEQ ID NO：3)、从Dermatophagoides microceaus获得的Der m1(NCBI登录号：P16312，SEQ ID NO：4)和从热带无爪螨获得的Blo t1(NCBI登录号：Q95PJ4，SEQ ID NO：5)。因此，在该专利的上下文中，术语组1螨过敏原具体而言不仅包括天然组1螨过敏原，而且还包括天然组1过敏原的同系物，例如通过本文中所描述的家族改组所产生的具有破坏的N-糖基化基序的重组变体和上述螨过敏原的杂合体(J.E.Ness等人，Nature Biotechnology，卷17，893-896页，1999)。
组1螨多肽中表位模式和表位的计算机(insilico)鉴定
使用描述于WO 00/26230和WO 01/83559中的专有的计算机表位作图工具可以对组1螨多肽进行表位作图。简而言之，该工具包括表位模式数据库(从所输入的已知特异性结合至抗蛋白质抗体的肽序列确定)和针对表位模式数据库分析所给定蛋白质的3-D结构的算法。这将确定该蛋白质上可能的表位，和蛋白质序列中每个氨基酸为表位部分的偏好性。
鉴定抗体结合肽：
通过多种不同的方法能够鉴定抗体结合肽。一种方法是合成许多已知序列的多肽，并测试其结合目的抗体的能力，例如在ELISA或其它免疫化学测定中测试。在文献中可获得大量此类数据。
特别有效的方法是制备许多不同随机肽序列的文库并通过实验仅选择很好且特异地结合抗体的肽序列即能够胜过针对其产生抗体的蛋白质。噬菌体展示技术非常适合该种发现抗体结合肽的方法：
在噬菌体展示系统中，编码预期氨基酸序列的序列整合入编码展示于噬菌体表面上的蛋白质的噬菌体基因。因此，噬菌体将在其表面上产生并展示杂合蛋白质，在那里该杂合蛋白质能够与特异靶试剂相互作用。由于每个噬菌体含有一种确定长度的特异序列的密码子，一般的噬菌体展示文库能够表达108-1012个不同的随机序列。如果所展示的序列类似表位，通过表位特异抗体能够选择噬菌体。因此，有可能从大量噬菌体群体中选择特异噬菌体，每个噬菌体表达其一种杂合蛋白质。
重要的是由噬菌体展示系统所提呈的(寡)肽的氨基酸序列具有足够的长度以提呈所要鉴定的表位的重要部分。寡肽可以具有5-25个氨基酸，优选地为至少8个氨基酸，例如9个氨基酸。
用于与寡肽反应的抗体可以是多克隆或单克隆的。具体而言，它们可以是IgE抗体以保证所鉴定的表位是IgE表位，即诱导和结合IgE的表位。抗体还可以是单特异性的，意思是根据其对某种蛋白质的特异性将它们进行分离。多克隆抗体优选地用于积累关于用于计算机作图工具的抗体结合肽的数据以获得关于多肽表位的更广泛的知识。
这些反应性多肽，通过其针对抗体的反应性，在某种程度上类似完整多肽上的表位的表现。
从反应性肽鉴定表位模式
将例如通过噬菌体展示所鉴定的反应性(寡)肽进行比较和比对以鉴定共同表位模式，然后其能够用于三维多肽上抗体结合表位的鉴定。
在比对中，对于氨基酸的保守选择例如天冬氨酸和谷氨酸、赖氨酸和精氨酸、丝氨酸和苏氨酸，认为是一个或相等的。因此，比对导致大量模式，这依赖于肽残基的选择数。使用例如7聚体肽，模式可以具有形式：
XX**XXX，
这里式中的“*”表示非一致部分，该部分可以是任意氨基酸或一组氨基酸或非氨基酸，而X是以下13个残基类型之一：AG、C、DE、FY、H、IL、KR、M、NQ、P、ST、V和W，其中AG、DE、FY、IL、KR、NQ、ST对是保守选择并认为是相等的。因此，3肽例如
AKSN NKR
AKSM NKR
AKTP NKK
将产生[AG][KR][ST]*[NQ][KR][KR]模式，其中残基AG KR ST和NQKR KR是全部3个肽的共有残基，并且因此表位模式将是AG KR ST*NQKR KR。对模式进行选择以用最少可能的模式描述完整的一套反应性(寡)肽(例如通过噬菌体展示和抗体反应获得)。
可以直接从反应性肽确定表位模式；例如如果制备7聚体反应性肽文库，考虑到保守性选择，人们能够使用每种不同的反应性7聚体肽作为如下所述表位作图方法中的表位模式。
如本领域已知通过去除多余模式和/或通过应用实验设计还有可能降低在表位作图中检测的表位模式的数目(见实施例1)。
在所鉴定的表位模式内一些氨基酸是保守的，称为锚定氨基酸。这些锚定氨基酸重复出现于全部或大部分反应性肽中。
表位作图算法
当表位模式已经进行鉴定时，随后将它们与目的多肽氨基酸序列的三维坐标相比较，以鉴定相应共有序列或表位模式的多肽表面上残基的组合。以这种方式，能够鉴定对于抗体结合重要的氨基酸残基。
一旦已经鉴定了一个或多个表位模式，可以分析三维结构已知的任意多肽与表位模式相匹配的表位。通过以以下方式搜索多肽表面完成了多肽上表位的寻找：
(1)对于多肽中的全部氨基酸，检测是否(a)氨基酸类型与表位模式的第一个氨基酸相匹配和(b)表面可接近性大于或等于允许氨基酸免疫相互作用的所选择的阈值。选择满足1(a)和1(b)的氨基酸。
(2)对于在步骤1中所选择氨基酸的所选距离(例如10埃)内的全部氨基酸，检测是否(a)氨基酸类型与模式的第二个氨基酸相匹配和(b)表面可接近性大于或等于允许氨基酸免疫相互作用的所选择的阈值。选择满足2(a)和2(b)的那些氨基酸。
(3)对于在步骤2中所选择氨基酸的所选距离(例如10埃)内的全部氨基酸，检测是否(a)氨基酸类型与模式的第三个氨基酸相匹配和(b)表面可接近性大于或等于允许氨基酸免疫相互作用的所选择的阈值。选择满足3(a)和3(b)的那些氨基酸。
对表位模式共有序列中的全部氨基酸重复该步骤(步骤3)。其C-α原子的坐标定义氨基酸的空间位置。对于特定残基类型以平均数百分比形式给出表面溶剂可接近性阈值(见实施例2)。
如果在多肽结构中能够发现表位模式中全部氨基酸的匹配氨基酸，则非常强烈地表明已经发现了表位。
然而，也还要检测表位的大小是否是令人满意的，即任意两个残基之间的距离低于给定的阈值，通常为25。
根据其总的可及表面积可以对发现的表位进行排位和加权以进一步提高工具的预测能力。
最后，当对于目的蛋白质已经对全部可能的表位进行作图时，通过将每个氨基酸在表位模式中出现的次数相加人们能够提供蛋白质中每个氨基酸的分值。该分值将是导致变体具有较低抗原性的氨基酸修饰(替换、插入、缺失、糖基化或化学结合)可能性的指示。然后根据该分值能够将蛋白质的全部氨基酸进行排序并且那些具有最高分值的氨基酸能够选择用于诱变。
表位作图工具可以进行调整，从而使仅已知反应肽的子集包含于用于建立表位模式的数据组，并因此用于进行表位作图。例如，可以选择仅包括对IgE抗体(而不是IgG或其它抗体)反应的肽的子集，或者可以仅包括对人抗体等反应的肽的子集。可以选择仅针对靶蛋白反应的肽的子集以获得更加特异的反应；然而，通常，包括又针对任意蛋白质产生的抗体反应的肽。
如果对于目的蛋白质不能获得三维结构坐标，人们能够直接将表位模式直接定位在目的蛋白质的一级序列上。
从全部上述信息很明显，使用该表位作图工具可以方便地确定表位。
另外，计算机表位作图工具能够用于预测是否突变一个氨基酸残基将导致新变体将总体具有较少表位。因此，能够在给定位置对一些或全部19个可能的替换进行测试，对这些提出的变体的每一个的模型结构重复表位作图步骤，并且通过突变能够构建最好的变体并通过实验测试。
组1螨多肽的所鉴定的表位
使用表位作图工具本发明者已经令人惊奇地发现对应SEQ ID NO：1的A10、A12、E13、G29、G30、G32、A46、Y47、L55、D64、A66、S67、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98-Q101、R104-P106、Q109-I113、A132、I144-D146、D148、R151、I158-Q166、N179、A180、G182-D184、A205、I208位置或者备选地为具体而言SEQ ID NO：1的成熟Der p1多肽的10、12、13、29、30、32、46、47、55、64、66、67、73、75、80、84、86、87、92、93、96、98-101、104-106、109-113、132、144-146、148、151、158-166、179-180、182-184、205、208位置的氨基酸包含于天然组1螨多肽的表位内。如上所述组1螨多肽是高度同源的并且通过将此类多肽与SEQ ID NO：1进行比对可以容易地发现多种来源的组1螨多肽中的相应位置。
组1螨多肽变体
突变位置的选择
一旦已经确定了多肽的表位，通过突变包含于表位中的一个或多个氨基酸残基能够制备具有修饰的抗原特性的多肽变体。在该上下文中突变包括氨基酸残基的缺失和/或替换和/或该残基之前或之后一个或多个氨基酸的插入。
当提供适于作为疫苗剂的多肽变体时，对于过敏反应的治疗，特别期望改变IgE表位以降低IgE的结合，而同时保持变体在人和动物中引发免疫反应的能力，因此期望多肽保留亲本多肽的三维构象。另外，特别期望变体能够充分刺激T-细胞，优选的为亲本多肽水平或更高水平。然而还期望变体能够在人和动物体内引发IgG反应。
通过替换表位的至少一个氨基酸可以突变所鉴定的表位。在特定的实施方案中突变了至少一个锚定氨基酸。突变通常是用不同大小、亲水性、极性和/或酸性的氨基酸替换，例如小氨基酸替换大氨基酸、亲水氨基酸替换疏水氨基酸、极性氨基酸替换非极性氨基酸以及碱性氨基酸替换酸性氨基酸。
其它突变可以是插入或缺失表位的至少一个氨基酸，特别是缺失锚定氨基酸。此外，通过替换一些氨基酸和缺失和/或插入其它氨基酸可以突变表位。
通过本领域技术人员众所周知的标准技术可以进行突变，所述技术为例如定点诱变(见，例如Sambrook等人(1989)，Molecular Cloning.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)。
诱变可以是掺加(spiked)诱变，它是定点诱变的一种形式，其中在一个或多个位置已经使用寡核苷酸混合物合成了所使用的引物。
核苷酸替换的一般描述可以见于例如Ford等人，1991，ProteinExpression and Purification 2，95-107页。
本发明的多肽变体涉及含有亲本多肽一个或多个突变的亲本组1螨多肽的变体，其中所述突变存在于或相应于SEQ ID NO：1的A10、A12、E13、G29、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、S67、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98、R99、E100、Q101、R104、R105、P106、Q109、R110、F111、G112、I113、A132、I144、K145、D146、D148、R151、I158、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208位置或者成熟Der p1多肽的10、12、13、29、30、32、46、47、54、55、64、66、67、73、75、I80、84、86、87、92、Y93、96、98、99、100、101、104、105、106、109、110、111、112、113、132、144、145、146、148、151、158、159、160、161、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208的位置。
在另一个上面的特定实施方案中，本发明的变体涉及含有亲本多肽一个或多个突变，其中所述突变存在或相应于SEQ ID NO：1的A10、A12、G29、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、G73、T75、180、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98、E100、Q101、R104、R105、P106、R110、F111、G112、I113、A132、I144、K145、D146、I158、I159、Q160、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208位置或者成熟Der p1多肽的10、12、29、30、32、46、47、55、64、66、73、75、I80、84、86、87、92、Y93、96、98、100、101、104、105、106、110、111、112、113、132、144、145、146、158、159、160、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208的位置。
在另一个特定实施方案中，本发明的变体涉及含有亲本多肽一个或多个突变，其中所述突变存在于或相应于SEQ ID NO：1的A10、A12、G29、G30、G32、A46、S54、L55、D64、A66、G73、T75、Q84、N86、G87、S92、Y96、E100、Q101、R104、R105、P106、R110、I113、A132、I144、K145、D146、D162、N163、G164、Y165、N179、A180、G182、V183、D184和A205位置或者成熟Der p1多肽的10、12、29、30、32、46、55、64、66、73、75、84、86、87、92、96、100、101、104、105、106、110、113、132、144、145、146、162、163、164、165、179、180、182、183、184和205的位置。
特别地与亲本组1螨多肽相比变体具有改变的抗体结合谱，更加特别地变体具有降低的IgE-结合，更加特别地还具有保守免疫原性以诱导保护反应(见上)。仍然更加优选地，与亲本组1螨多肽相比变体在所暴露动物，包括人中具有改变的免疫原性谱。
进一步具体而言，与亲本组1螨多肽相比变体具有改变的IgE-抗原性。
进一步具体而言，如在实施例6方法中所测量，与亲本组1螨多肽相比变体具有至少相同的T-细胞刺激效应。
进一步，与亲本组1螨多肽相比变体在暴露动物包括人中诱导改变的免疫原性反应。
进一步具体而言，与亲本组1螨多肽相比变体在人中诱导改变的免疫原性反应。
在另一个特定的实施方案中，本发明的变体多肽含有亲本多肽一个或多个突变，其中所述突变存在于或相应于SEQ ID NO：1的A10、A12、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、S67、G87、S92、A98、R99、E100、Q101、R105、R110、F111、G112、I113、I144、K145、D146、D148、R151、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208位置或者成熟Der p1多肽10、12、30、32、46、47、54、55、64、66、67、87、92、98、99、100、101、105、110、111、112、113、144、145、146、148、151、159、160、161、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208位置。
在另一个上面的特定实施方案中，本发明的变体多肽含有亲本多肽一个或多个突变，其中所述突变存在于或相应于SEQ ID NO：1的A10、A12、G32、S54、L55、A66、S67、G87、A98、R99、F111、G112、I113、I144、D146、D148、I159、R161、G164、Q166、A180、D184、A205和I208位置或者成熟Der p1多肽10、12、32、54、55、66、67、87、98、99、111、112、113、144、146、148、159、161、164、166、180、184、205和208位置。
直接提供降低抗原性的突变
当所提供的突变具有降低的抗原性时，用具有不同特性的氨基酸替代亲本组1螨多肽表位中的氨基酸是特别有趣的。因此，在一个特定的实施方案中，本发明的变体多肽包含选自下列的突变：
10由选自V、Y、Q、N、E和D的残基替代；
12由选自V、Y、Q、N和F的残基替代；
32由选自V、Y、E、D、N和Q的残基替代；
54由选自N、A、T、V和Q的残基替代；
55由选自V、N和Q的残基替代；
66由选自V、H、Y、D、E、N和Q的残基替代；
67由选自V、H、Y、D、E、N和Q的残基替代；
87由选自V、Y、D和E的残基替代；
98由选自V、N、Q、D或E的残基替代；
99由选自H、Y、V、N、Q、E和D的残基替代；
111由选自V、H和W的残基替代；
112由选自V、H、N、Q、E、D和Y的残基替代；
113由选自V、H、N、Q、E、D和Y的残基替代；
144由选自A、G、Y、N、Q或V的残基替代；
146由选自Y、H、V、I、L、N和Q的残基替代；
148由选自Y、V、I和L的残基替代；
159由选自V、Y、A和G的残基替代；
161由选自A、G、V和Y的残基替代；
164由选自V、H和W的残基替代；
166由选自S、W、Y和F的残基替代；
180由选自V、N、Q和Y的残基替代；
184由选自V、M和Y的残基替代；
205由选自V、W和H的残基替代；
208由选自A、G、V、W和H的残基替代；
所述的编号是成熟Derp1多肽位置或对应于成熟Derp1多肽的位置。
在另一个特定的实施方案中，本发明的变体多肽包含选自下列的突变：
A10由选自V、Y、Q、N、E和D的残基替代；
A12由选自V、Y、Q、N和F的残基替代；
G32由选自V、Y、E、D、N和Q的残基替代；
S54由选自N、A、T、V和Q的残基替代；
L55由选自V、N和Q的残基替代；
A66由选自V、H、Y、D、E、N和Q的残基替代；
S67由选自V、H、Y、D、E、N和Q的残基替代；
G87由选自V、Y、D和E的残基替代；
A98由选自V、N、Q、D或E的残基替代；
R99由选自H、Y、V、N、Q、E和D的残基替代；
F111由选自V、H和W的残基替代；
G112由选自V、H、N、Q、E、D和Y的残基替代；
I113由选自V、H、N、Q、E、D和Y的残基替代；
I144由选自A、G、Y、N、Q或V的残基替代；
D146由选自Y、H、V、I、L、N和Q的残基替代；
D148由选自Y、V、I和L的残基替代；
I159由选自V、Y、A和G的残基替代；
R161由选自A、G、V和Y的残基替代；
G164由选自V、H和W的残基替代；
Q166由选自S、W、Y和F的残基替代；
A180由选自V、N、Q和Y的残基替代；
D184由选自V、M和Y的残基替代；
A205由选自V、W和H的残基替代；
I208由选自A、G、V、W和H的残基替代；
所述的编号是SEQ ID NO：1的位置或对应于SEQ ID NO：1的位置。
在另一实施方案中，亲本组1螨多肽以其成熟形式具有表现为与SEQID NO：1至少80％同一性；具体而言至少90％同一性；具体而言至少95％同一性；更加具体98％同一性；更加具体100％同一性或者与Der p1100％同一性的序列。
在另一实施方案中，变体组1螨多肽以其成熟形式具有表现为与SEQID NO：1至少80％同一性；具体而言至少90％同一性；具体而言至少95％同一性；更加具体98％同一性；更加具体100％同一性或者与Der p1100％同一性的序列。
在另一实施方案中，亲本组1螨多肽以其成熟形式具有表现为与SEQID NO：2至少80％同一性；具体而言至少90％同一性；具体而言至少95％同一性；更加具体98％同一性；更加具体100％同一性或者与Eur m1100％同一性的序列。
在另一实施方案中，变体组1螨多肽以其成熟形式具有表现为与SEQID NO：2至少80％同一性；具体而言至少90％同一性；具体而言至少95％同一性；更加具体98％同一性；更加具体100％同一性或者与Eur m1100％同一性的序列。
在另一实施方案中，亲本组1螨多肽以其成熟形式具有表现为与SEQID NO：3至少80％同一性；具体而言至少90％同一性；具体而言至少95％同一性；更加具体98％同一性；更加具体100％同一性或者与Der f1 100％同一性的序列。
在另一实施方案中，变体组1螨多肽以其成熟形式具有表现为与SEQID NO：3至少80％同一性；具体而言至少90％同一性；具体而言至少95％同一性；更加具体98％同一性；更加具体100％同一性或者与Der f1 100％同一性的序列。
在另一实施方案中，亲本组1螨多肽以其成熟形式具有表现为与Derm1至少80％同一性；具体而言至少90％同一性；具体而言至少95％同一性；更加具体98％同一性；更加具体100％同一性的序列。
在另一实施方案中，变体组1螨多肽以其成熟形式具有表现为与Derm1至少80％同一性；具体而言至少90％同一性；具体而言至少95％同一性；更加具体98％同一性；更加具体100％同一性的序列。
在另一实施方案中，亲本组1螨多肽以其成熟形式具有表现为与SEQID NO：5至少80％同一性；具体而言至少90％同一性；具体而言至少95％同一性；更加具体98％同一性；更加具体100％同一性或者与Blo t1 100％同一性的序列。
在另一实施方案中，变体组1螨多肽以其成熟形式具有表现为与SEQID NO：5至少80％同一性；具体而言至少90％同一性；具体而言至少95％同一性；更加具体98％同一性；更加具体100％同一性或者与Blo t1 100％同一性的序列。
通过将所计划的突变在目的蛋白质3-维结构的特定位置针对所发现的表位模式进行测试由此鉴定出对于得到多肽的目的特性可行的每一位置上的突变，降低了为了消除表位而采取的蛋白质工程会产生新的表位或者复制现有表位的危险。
在本发明的一个特定实施方案中，建立多样化突变体的文库是有利的，其中每一突变体具有所引入的一个或多个改变了的氨基酸并且选择那些作为疫苗剂效果最好而副作用最小的变体。通过多种本领域技术人员已知的技术可以建立多样化文库(Reetz MT；Jaeger KE，在Biocatalysis-fromDiscovery to Application，Fessner WD著，第200卷，31-57页(1999)；Stemmer，Nature，第370卷，389-391页，1994；Zhao和Arnold，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，第94卷，7997-8000页，1997；或Yano等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，第95卷，5511-5515页，1998)。在一个更加优选的实施方案中，通过包括下列步骤的方法发现了替代：1)列出包含几个表位的一系列替代、加入和/或缺失，2)设计将氨基酸序列中这些变化的随机子集引入靶基因(例如通过掺加诱变)的文库，3)表达文库并且选择优选的变体。在最优选的实施方案中，该方法对第一轮筛选的命中物进行了额外几轮的筛选和/或家族改组(J.E.Ness等，Nature Biotechnology，vol.17，pp.893-896，1999)。
提供表位区氨基酸增加的糖基化的突变
以另一种方法设计突变从而在表位区引入翻译后修饰的识别位点，并且蛋白质变体在能够进行相应翻译后修饰的适当宿主生物体内进行表达。这些翻译后修饰可以屏蔽表位并因此蛋白质变体相对于蛋白质主链具有较低的免疫原性。翻译后修饰包括糖基化、磷酸化、N-末端加工、酰化、核糖基化和sulfatation。一个好的实例是N-糖基化。N-糖基化发现于序列Asn-Xaa-Ser、Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Cys的位点，其中Xaa残基和三肽共有序列随后的氨基酸都不是脯氨酸(T.E.Creighton，Proteins-Structures and Molecular Properties，第2版，W.H.Freeman和Co.，New York，1993，91-93页)。因此在主链蛋白质序列中引入此种识别位点是所希望的。糖基化蛋白质变体糖链的特异性质可以是直线的或者分枝的，这取决于蛋白质和宿主细胞。另一个实例是磷酸化：蛋白质序列可以修饰以致于引入具有被cAMP-依赖激酶磷酸化的识别序列arg-arg-(xaa)n-ser(其中n＝0，1或2)的丝氨酸磷酸化位点或者具有通常被酪氨酸特异激酶磷酸化的识别序列-lys/arg-(xaa)3-asp/glu-(xaa)3-tyr的酪氨酸磷酸化位点(T.E.C reighton，″Proteins-Structures and molecularproperties″，第2版，Freeman，NY，1993)。
提供共价结合表位区氨基酸的聚合物的突变
进行能够改变多肽抗原特性的突变的另一种方式是与表位内或表位附近的氨基酸反应或缀合上聚合物，从而阻断或屏蔽对锚定氨基酸的接近并从而阻断或屏蔽抗体和/或受体缀合到那些氨基酸上。如果在亲本多肽中不存在适于缀合聚合物的氨基酸，适于的突变是插入一个或多个氨基酸作为与聚合物缀合的附着位点和/或基团和/或氨基酸。
替换和/或插入哪些氨基酸原则上取决于所应用的偶联化学。制备共价生物缀合物的化学反应可以见“Bioconjugate Techniques”，Hermanson，G.T.(1996)，Academic Press Inc.，此处引用作为参考。
在一个特定的实施方案中，活化的聚合物缀合到表位内或附近的氨基酸上。
当多肽不得不进行缀合时，优选在多肽中进行保守替代，因为保守替代保证替代对多肽结构的影响是有限的。
在提供额外的氨基的情况下，这可以将精氨酸用赖氨酸替代实现，这两个残基都带有正电荷，但是只有赖氨酸具有适宜作为附着基团的游离氨基。
在提供额外的羧酸基团的情况下，保守替代例如天冬酰胺到天冬氨酸或者谷氨酰胺到谷氨酸的替代。除了在酸性残基上具有羧酸基团外，这些残基在大小和形状上彼此相似。
在提供SH-基团的情况下，保守替代通过苏氨酸或丝氨酸到半胱氨酸的替代实现。
具有改变的抗原特性变体的证实
包含于表位内氨基酸的突变会导致多肽的抗原特性发生变化，如通过表位的计算机确定所预测的那样。然而，突变对变体抗原性即抗体结合性和免疫原性的定量影响可以使用多种体内或体外模型系统进行适当决定。为了那种用途，目的多肽变体进行较大规模表达并且通过常规技术进行纯化。于是通过半胱氨酸蛋白酶活性测定测试功能性和比活以便保证变体保持三维结构。
体外系统包括测量粉尘螨过敏患者或暴露的动物血清中结合到IgE的测定法、来源于粉尘螨过敏患者初级T-细胞或从粉尘螨过敏患者(Currentprotocols in Immunology，第7和9章)或暴露动物产生的T细胞克隆或T细胞系的细胞因子表达谱或增殖反应、和来源于粉尘螨过敏患者的嗜碱性粒细胞的组胺释放。
使用例如直接或竞争ELISA(C-ELISA)、对过敏患者嗜碱性粒细胞或者用来源于过敏患者的包含IgE的血清孵育的全血的IgE-条纹嗜碱性粒细胞(IgE-stripped basophil)的组胺释放测定法、或者通过其他固相免疫测定法或细胞测定法(见实施例9)可以详细地检测IgE抗体的结合。来源于全血的条纹嗜碱性粒细胞的用途描述于Knol EF，Kuijpers TW，Mul FP，Roos D.Stimulation of human basophils results in homotypic aggregation.A response independent of degranulation.J Immunol.1993 11月1日；151(9)：4926-33；和Budde IK，Aalbers M，Aalberse RC，van der Zee JS，KnolEF.Reactivity to IgE-dependent histamine-releasing factor is due tomonomeric IgE.Allergy.2000七月；55(7)：653-7。
在特定的实施方案中，多肽变体结合IgE的能力与原始的或亲本组1螨多肽的结合能力相比降低了3倍，优选地降低了5倍，更加优选地降低了10倍，或者更加优选地降低了50倍。
在另一特定的实施方案中，多肽变体诱导来源于对粉尘螨过敏的受试者嗜碱性粒细胞释放组胺的能力与亲本组1螨多肽相比降低至少3倍，优选地降低10倍，更加优选地降低50倍。
在进一步的实施方案中，测量了多肽变体引起先前暴露于原始或亲本组1螨过敏原的动物包括人的淋巴细胞中记忆T-细胞反应，优选地是反应的强度与亲本组1螨过敏原相当或者高于亲本组1螨过敏原。
在一个特定的实施方案中，体内证实包含皮肤针刺试验(SPT)，其中对粉尘螨过敏的受试者/个体进行组1螨多肽的皮内或皮下注射并且将对本发明多肽反应的IgE反应性(测量为水庖及潮红反应的直径)与对亲本组1螨多肽做出反应的IgE反应性进行比较(Kronquist等，Clin.Exp.Allergy，2000，第30卷，670-676页)。
过敏和SIT的动物模型-用每种组合物对动物进行实验性免疫
本发明多肽变体的体内免疫原特性可以在动物试验中适当测定，其中将试验动物暴露于接种变应原多肽并且测定了反应并与靶变应原或其他适当参考进行比较。免疫反应测定包括比较来源于用靶多肽和多肽变体接种的试验动物的血清IgG、IgE或T-细胞的反应性。动物免疫可以至少以两种不同的方式进行：对首次进行实验的动物进行和对预先致敏的动物进行(以更好地刺激疫苗状况)。在本发明的背景情况下测试了免疫球蛋白对靶抗原的亲和力。
在特定的实施方案中，测试了施用变体分子后动物IgG和/或IgG1和/或IgG4的亲和力。
在本发明的方法中，测试动物可以是首次进行实验的动物或者是预先致敏的动物。
许多模型系统是基于对首次进行实验动物的使用：
在一个特定实施方案中，体内证实包括通过鼻内途径将小鼠暴露于亲本靶过敏原。有用的体内动物模型包括小鼠鼻内测试(MINT)模型(Robinson等，Fund.Appl.Toxicol.34，15-24页，1996)。
在另一特定的实施方案中，体内证实包括通过气管内途径将试验动物暴露于多肽变体。有用的体内动物模型包括豚鼠气管内(GPIT)模型(Ritz等，Fund.Appl.Toxicol.，21，31-37页，1993)和大鼠气管内(大鼠-IT)模型(WO 96/17929，Novo Nordisk)。
在另一特定实施方案中，体内证实包括将试验动物皮下暴露于靶过敏原和接种过敏原变体。适宜的模型是小鼠皮下(小鼠-SC)模型(WO98/30682，Novo Nordisk)。
在另一特定的实施方案中，方法包括将试验动物以腹膜内方式进行暴露。ALK-Abell ó公开(WO02/40676)了评价当免疫小鼠时过敏原变体(桦木花粉过敏原bet v1)诱导IgG抗体的能力：用相关的过敏反应变体或对照腹膜内免疫BALB/C小鼠，以14天的剂量间隔免疫4次。将蛋白质结合到1.25mg/mL铝胶上(AIOH胶，1,3％，pH8-8.4，Superfos Biosector)。用1或10ug蛋白质/剂量免疫小鼠。在第0、14、21、35、49和63天抽出血液样本并且使用rBet v1包被的微量滴定板和作为检测抗体的生物素化的兔抗小鼠IgG抗体通过直接ELISA进行分析。
在进一步的实施方案中，方法包括使用能够利于产生供体特异免疫的转基因小鼠作为试验动物。此种小鼠由Genencor International所公开(WO 01/15521)。
同样，许多研究评价了过敏反应疫苗接种组合物在动物模型内的效应，其中在暴露于疫苗接种组合物之前将动物用相关的过敏原致敏：
小鼠：Li等(J.Allergy Clin.Immunol.第112卷，159-167页，2003)公开了评价过敏反应疫苗有效性的基于小鼠的系统。将小鼠用食物过敏原进行胃内致敏，并且以直肠内注射进行处理。在单独的过敏反应疫苗接种系统中，Hardy等(AM J.Respir.Crit Care Med，第167卷，1393-1399页，2003)表明通过腹膜内注射可以使小鼠致敏，并且可以将过敏反应疫苗接种化合物气管内施用于麻醉的动物。Sudowe等(Gene Therapy，第9卷，147-156，2002)表明可以对小鼠进行腹膜内注射以产生TH1或TH2反应。
大鼠：Wheeler等(Int.Arch.Allergy Immunol，第126卷，135-139页，2001)公开了大鼠过敏反应模型，其中与佐剂一起对大鼠进行皮下注射。当接受随后的试验疫苗组合物注射时，这些“过敏”大鼠可以进行过敏反应-疫苗样反应。
豚鼠：Nakamoto等(Clin Exp.Allergy，第27卷，1103-1108页1997)证明可以使用豚鼠作为SIT的模型系统。将豚鼠腹膜内注射并且强化注射两次，并且然后将它们暴露于疫苗化合物以通过测量作为化合物、制剂或应用方式的函数的抗体效价来记录变应原性的降低。
核苷酸构建体、载体、宿主细胞、蛋白质变体和用于缀合的聚合物的制备
根据本发明，可以使用本领域技术人员熟知的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此种技术在文献中有全面的解释。见例如Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(文中为“Sambrook等，1989”)；DNA Cloning：A Practical Approach，第I和II卷(D.N.Glover著，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait著，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins著，(1985))；Transcription And Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins著，(1984))；Animal Cell Culture(R.I.Freshney著，(1986))；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，(1986))；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)。
在特定的实施方案中实施这些方法以便作为大肠杆菌(E.coli)中包含体或者在甲基营养酵母如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中以可溶形式表达组1粉尘螨蛋白质，如在WO 01/29078(HESKA)中所描述，其中描述了组1螨蛋白质的重组表达，所述蛋白质包括经修饰以便能够使多肽在微生物中进行表达的核苷酸序列。
优选的方法是如Chua等(J.Allergy Clin Immunol.1992，第89卷，95-102页)所描述的在酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞中表达组1粉尘螨蛋白质。
另一个优选的方法是在昆虫细胞例如果蝇(Jacquet等，Clin Exp.Allergy，2000，第30卷，677-84页)或者用杆状病毒系统感染的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞(Shoji等，Biosci.Biotech.Biochem，1996，第60卷，621-25页)中表达组1粉尘螨蛋白质。
核苷酸序列
本发明还包含编码本发明多肽变体的核苷酸序列。如所描述，对通过核苷酸替代进行核苷酸序列的标准突变以编码多肽变体的描述可见于例如Ford等，1991，Protein Expression and Purification 2，95-107页。其他的标准方法例如定点诱变描述于Sambrook等(1989)，Molecular Cloning.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY。
“核苷酸序列”从5’到3’末端阅读的脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。核苷酸序列包括RNA和DNA，并且可以是从天然来源分离的、体外合成的、或从天然和合成分子组合制备的。
用于分离或克隆核苷酸序列(别名编码多肽的核苷酸序列)的技术是本领域已知的并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。从此种基因组DNA克隆本发明的核苷酸序列可以通过例如使用众所周知的聚合酶链式反应(PCR)或用于检测具有共有结构特征的所克隆DNA片段的表达文库的抗体筛选来完成。见例如Innis等，1990，A Guide toMethods and Application，Academic Press，New York。可以使用其他核苷酸扩增方法例如连接酶链式反应(LCR)、连接的活化转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。核苷酸序列可以从产生多肽的株系克隆或者从另一种相关的生物体中克隆并且因此例如可以是核苷酸序列多肽编码区的等位基因变体或物种变体。
如文中所使用术语“分离的”核苷酸序列是指基本上没有其他序列的核苷酸序列，例如通过琼脂糖凝胶电泳所确定的至少大约20％的纯度，优选地至少大约40％的纯度，更加优选地大约60％的纯度，甚至更加优选地大约80％的纯度，最优选地大约90％的纯度，并且甚至最优选地大约95％的纯度。例如，通过在遗传工程中使用的标准克隆方法可以得到分离的核苷酸序列，所述标准克隆方法将核苷酸序列从天然位置重置到不同位置，所述核苷酸序列可以在所述不同位置增殖。克隆方法涉及切除和分离包含编码多肽的核苷酸序列的目的核苷酸片段、将片段插入载体分子中、和重组载体整合到宿主细胞，核苷酸序列的多拷贝或克隆将在宿主细胞中复制。核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的或者它们的组合。此种分离的分子是那些与它们的天然环境分离的分子并且包括cDNA和基因组克隆。本发明分离DNA分子不合有通常与其相结合的其他基因，并且可以包括天然存在的5′和3′非翻译区，例如启动子和终止子。对相关区域的鉴定对本领域普通技术人员而言是显而易见的(见例如Dynan和Tijan，Nature 316：774-78，1985)。
核苷酸构建体
如文中所使用术语“核苷酸构建体”意在指cDNA、基因组DNA、人工合成DNA或RNA来源的任意核苷酸分子。术语“构建体”意在指单链或双链的并且基于编码目的多肽的全部或部分天然存在核苷酸序列的核苷酸片段。构建体任选地包含其他核苷酸片段。
目的DNA可以适宜地是基因组或cDNA来源的，例如通过制备基因组或cDNA文库并通过使用合成寡核苷酸探针依照标准技术(参考Sambrook等，见上)杂交筛选编码全部或部分多肽的DNA序列而得到。
还可以通过已建立的标准方法例如Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1869描述的亚磷酸胺(phosphoamidite)方法或者Matthes等，EMBO Journal 3(1984)，801-805描述的方法合成性制备核苷酸构建体。根据亚磷酸胺方法，将寡核苷酸在例如自动DNA合成仪上合成、纯化、退火、连接并克隆到适当载体中。
此外，核苷酸构建体可以是按照标准技术通过连接合成、基因组或者cDNA来源的片段(如适当地)，即对应于全部核苷酸构建体多个部分的片段制备的混合合成和基因组来源的、混合合成和cDNA来源的或者混合基因组和cDNA来源的。
核苷酸构建体还可以通过聚合酶链式反应使用特异引物制备，例如在US 4,683,202或Saiki等，Science 239(1988)，487-491中所描述。
当核苷酸构建体包含本发明编码序列表达所需的全部控制序列时，术语核苷酸构建体与术语表达盒是同义的。
如文中所定义术语“编码序列”是指当置于上述控制序列的控制之下时能够转录成mRNA并翻译成本发明多肽的序列。编码序列的边界常常通过位于5′末端的翻译起始密码子ATG和位于3′末端的翻译终止密码子来确定。编码序列可以包括但不限于DNA、cDNA和重组核苷酸序列。
文中对术语“控制序列”进行定义以包括对于核苷酸序列的编码序列的表达是必要的或有利的所有成分。每种控制序列相对于编码多肽的核苷酸序列是天然的或外来的。此种控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最小的控制序列包括启动子、转录和翻译终止信号。可以为控制序列提供连接体，其用于引入特异限制性位点以促进控制序列和编码多肽的核苷酸序列的编码区的连接。
转录和翻译控制序列是DNA调节序列，例如启动子、增强子、终止子等等，它们提供编码序列在宿主细胞内的表达。在真核细胞中，多聚腺苷酸信号是控制序列。
本发明的核苷酸构建体还可以包含编码对多肽表达有利的一种或多种因子的一种或多种核苷酸序列，所述因子为例如激活剂(例如反式作用因子)、分子伴侣和加工蛋白酶。在所选择的宿主细胞内有功能的任何因子可以用于本发明。编码一种或多种这些因子的核苷酸没必要与编码所述多肽的核苷酸序列串联。
前肽
控制序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽已知为酶原(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下为酶原(zymogen))。
多肽原通常是无活性的并且通过从催化或自催化多肽原切割下前肽可以转变成成熟的活性多肽。在本发明中，枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶证明对于前肽的活化是有用的。可以将枯草杆菌蛋白酶加入到粗细胞上清液、filtron浓缩上清液或者通过柱层析纯化的材料中。通过额外的层析步骤可以将枯草杆菌蛋白酶去除或者用大麦糜蛋白酶抑制剂(Ci-2A)使其失活。孵育时间可以从1至21或24小时。可以将der p1原或相应的变体前肽在天然加工位点切割(如通过Edman降解和N-末端测序证实)从而给出N-末端序列TNACSIN。
优选的枯草杆菌蛋白酶是SavinaseTM(从克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)得到的枯草杆菌蛋白酶，Novozymes商业产品)、BPN′(从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)得到的枯草杆菌蛋白酶Novo，SwissProt：SUBTBACAM见Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737)、PD498(从芽孢杆菌属得到的枯草杆菌蛋白酶，GeneSeqP：AAW24071；WO9324623A1)和B34(从嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)得到的枯草杆菌蛋白酶，专利WO 0158275)。最优选地是BPN′(BASBPN)(Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737))，其剂量为终浓度范围0.25-165μg/ml，优选地为16.5-165μg/ml。
前肽编码区可以从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)α因子基因或者Myceliophthora thermophilum漆酶基因(WO95/33836)得到。
激活剂
激活剂是能够激活编码多肽核苷酸转录的蛋白质(Kudla等，1990，EMBO Journal 9：1355-1364；Jarai和Buxton，1994，Current Genetics 26：2238-244；Verdier，1990，Yeast 6：271-297)。编码激活剂的核苷酸序列可以从编码嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)NprA(nprA)、酿酒酵母血红素激活蛋白1(hap1)、酿酒酵母半乳糖代谢蛋白4(gal4)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)氨调节蛋白(areA)的基因得到。进一步的实例见Verdier，1990，同上和MacKenzie等，1993，Journal of GeneralMicrobiology 139：2295-2307。
分子伴侣
分子伴侣是帮助其他多肽正确折叠的蛋白质(Hartl等，1994，TIBS 19：20-25；Bergeron等，1994，TIBS 19：124-128；Demolder等，1994，Journal ofBiotechnology 32：179-189；Craig，1993，Science 260：1902-1903；Gething和Sambrook，1992，Nature 355：33-45；Puig和Gilbert，1994，Journal ofBiological Chemistry 269：7764-7771；Wang和Tsou，1993，The FASEBJournal 7：1515-11157；Robinson等，1994，Bio/Technology 1：381-384)。编码分子伴侣的核苷酸序列可以从编码枯草芽孢杆菌GroE蛋白质、米曲霉(Aspergillus oryzae)蛋白质二硫键异构酶、酿酒酵母钙联接蛋白、酿酒酵母BiP/GRP78和酿酒酵母Hsp70的基因中得到。进一步的实例见Gething和Sambrook，1992，见上，和Hartl等，1994，见上。
加工蛋白酶
加工蛋白质是切割前肽以产生成熟生物化学活性多肽的蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak，1994，Yeast 10：67-79；Fuller等，1989，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 86：1434-1438；Julius等，1984，Cell 37：1075-1089；Julius等，1983，Cell 32：839-852)。编码加工蛋白酶的核苷酸序列可以从编码黑曲霉(Aspergillus niger)Kex2、酿酒酵母二肽基氨肽酶、酿酒酵母Kex2和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)二元加工内切蛋白酶(xpr6)的基因得到。
启动子
控制序列可以是适当的启动子序列，即宿主细胞表达核苷酸序列所识别的核苷酸序列。启动子序列包含介导多肽表达的转录和翻译控制序列。启动子可以是在所选择宿主细胞内有活性的任何核苷酸序列并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因得到。
文中使用的术语“启动子”以其本领域所理解的意思是指包含能够提供RNA聚合酶结合和转录起始的DNA序列的基因的部分。启动子序列通常但不总是发现于基因5’非编码区。
用于指导本发明核苷酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞内转录的适宜启动子的实例为从大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)garase基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、解淀粉芽孢杆菌BAN淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：3727-3731)得到的启动子以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA80：21-25)或者短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因或者噬菌体λPR或PL启动子或者大肠杆菌lac、trp或tac启动子。进一步的启动子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria”Scientific American，1980，242：74-94；和Sambrook等，1989，同上。
用于指导本发明核苷酸构建体在丝状真菌宿主细胞内转录的适宜启动子的实例有从编码米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus Awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶基因得到的启动子(如美国专利号4,288,627中描述，文中引用作为参考)和它们的杂合体。特别优选的在丝状真菌宿主细胞中使用的启动子是TAKA淀粉酶、NA2-tpi(从编码黑曲霉中性淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因来源的启动子的杂合体)和glaA启动子。用于丝状真菌宿主细胞的进一步适宜的启动子是ADH3启动子(McKnight等，The EMBO J.4(1985)，2093-2099)或者tpiA启动子。
在酵母宿主细胞中使用的适宜启动子的实例包括来源于酵母糖酵解基因(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255(1980)，12073-12080；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1(1982)，419-434)或者乙醇脱氢酶基因(Young等，在Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender等著)，Plenum Press，New York，1982)的启动子，或者TPI1(US 4,599,311)或ADH2-4c(Russell等，Nature 304(1983)，652-654)启动子。
其他有用的启动子是从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因得到的启动子。用于酵母宿主细胞的其他有用的启动子描述于Romanos等，1992，Yeast 8：423-488。在哺乳动物宿主细胞中，有用的启动子包括病毒启动子，例如来源于猿病毒40(SV40)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、腺病毒和牛乳头瘤病毒(BPV)的那些启动子。
指导编码本发明多肽DNA在哺乳动物细胞中转录的适宜启动子的实例是SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell Biol.1(1981)，854-864)，MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等，Science 222(1983)，809-814)或者腺病毒2主要晚期启动子。
在昆虫细胞中使用的适宜启动子的实例是多角体蛋白启动子(US4,745,051；Vasuvedan等，FEBS Lett.311，(1992)7-11)、P10启动子(J.M.Vlak等，J.Gen.Virology 69，1988，765-776页)、苜蓿银纹夜蛾多角体病毒碱性蛋白质启动子(EP 397 485)、杆状病毒即时早期基因1启动子(US5,155,037；US 5,162,222)或者杆状病毒39K延迟早期基因启动子(US5,155,037；US 5,162,222)。
终止子
控制序列还可以是适当的转录终止序列，即宿主细胞终止转录识别的序列。终止序列子有效连接到编码多肽的核苷酸序列的3’末端。在所选择宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子是从编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α葡糖苷酶和用于真菌宿主的尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶基因得到的终止子和TPI1(Alber和Kawasaki，前面引用)或ADH3(McKnight等，前面引用)终止子。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子是从编码酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因得到的终止子。用于酵母细胞的其他有用的终止子描述于Romanos等，1992，同上。
多聚腺苷酶信号
控制序列还可以是多聚腺苷酸序列，即有效连接到核苷酸序列3’末端的并且当转录时可以由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加多聚腺苷酸残基信号的序列。在所选择宿主细胞中有功能的任何多聚腺苷酸序列可用于本发明。
优选的用于丝状真菌宿主细胞的多聚腺苷酸序列是从编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶和黑曲霉α葡糖苷酶的基因得到的。
对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸序列描述于Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990。
在哺乳动物宿主细胞中的多聚腺苷酸序列是众所周知的，例如SV40或腺病毒5Elb区。
信号序列
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码的氨基酸序列连接到多肽的氨基末端并且指导所表达的多肽进入宿主细胞的细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列的5’末端可以内在地包含信号肽编码区，其天然连接到具有编码分泌多肽的编码区片段的翻译阅读框。备选地，编码序列的5’末端可以包含对编码分泌多肽的编码区部分是外来的信号肽编码区。在编码序列正常情况下不包含信号肽编码区的情况下需要外来信号肽编码区。备选地，为了得到相对于正常情况下与编码序列相结合的天然信号肽编码区相比增强的分泌，可以用外来信号肽编码区简单地替换天然信号肽编码区。信号肽编码区可以从来源于曲霉种的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、来源于根毛霉种的脂肪酶或蛋白酶基因、来源于酿酒酵母α因子的基因、来源于芽胞杆菌种的淀粉酶或蛋白酶基因或者牛preprochymosin基因得到。然而，能够指导所表达多肽进入所选择宿主细胞分泌途径的任何信号肽编码区可用于本发明。
“分泌信号序列”是编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，该多肽作为更大多肽的组分指导更大的多肽通过合成其的细胞的分泌途径。在通过分泌途径的运送中更大的多肽通常进行剪切以除去分泌肽。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从芽胞杆菌NCIB 11837的麦芽糖淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌PrsA基因得到的信号肽编码区。进一步的信号肽描述于Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews 57：109-137。
丝状真菌宿主细胞中的有效信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因、Humicola lanuginosa纤维素酶或脂肪酶基因或Rhizomucor miehei脂肪酶或淀粉酶基因、曲霉属淀粉酶或葡糖淀粉酶、编码Rhizomucor miehei脂肪酶或蛋白酶的基因得到的信号肽编码区。信号肽优选地来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉酸稳定淀粉酶或者黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。
用于酵母宿主细胞中有用的信号肽可以从酿酒酵母a-因子和酿酒酵母转化酶基因得到。其他有用的信号肽编码区描述于Romanos等，1992，同上。
为了从酵母细胞分泌，分泌信号序列可以编码能够保证有效指导所表达多肽进入细胞分泌途径的任意信号肽序列。信号肽可以是天然存在的信号肽或者其功能部分，或者它可以是合成的肽。发现适宜的信号肽是a-因子信号肽(参见US 4,870,008)、小鼠唾液淀粉酶信号肽(参见Hagenbuchle等，Nature 289，1981，643-646页)、修饰的羧肽酶信号肽(参见L.A.Valls等，Cell 48，1987，887-897页)、酵母BAR1信号肽(参见WO 87/02670)或酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani等，Yeast6，1990，127-137页)。
为了在酵母中有效地分泌，编码前导肽的序列还可以插入到信号序列的下游和编码多肽的DNA序列的上游。前导肽的功能是允许指引所表达的多肽从内质网到高尔基体并且进一步进入分泌小泡以分泌到培养基中(即多肽跨细胞壁输出或者至少通过细胞膜进入酵母细胞的周质间隙)。前导肽可以是酵母a-因子前导肽(其用途描述于例如US 4,546,082，EP 16201，EP 123 294，EP 123 544和EP 163 529)。备选地，前导肽可以是合成的前导肽，也就是说该前导肽没有在自然界发现。合成的前导肽是例如如WO 89/02463或WO 92/11378中所述进行构建。
为了在昆虫细胞中使用，信号肽可以方便地来源于昆虫基因(参见WO 90/05783)，例如鳞翅目烟草天蛾(Manduca sexta)激脂激素前体信号肽(参见US 5,023,328)。
其他调节子序列
还可以按需要加入调节序列，该调节序列允许相对于宿主细胞的生长进行多肽表达的调节。调节系统的实例是那些对化学或物理刺激，包括调节化合物存在下导致基因表达打开或关闭的系统。在原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAα淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可以用作调节序列。调节序列的其他实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲喋呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和在重金属存在下扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列可以串联地放置在调节序列处。
包含核苷酸构建体的重组表达载体
本发明还涉及包含本发明核苷酸序列、启动子和转录和翻译终止信号的重组表达载体。上述的多种核苷酸和控制序列可以结合在一起产生重组表达载体，其中所述的表达载体可以包括一个或多个方便的限制性位点以便允许编码多肽的核酸序列在此位点插入或替换。备选地，可以通过将核苷酸序列或包含该序列的核苷酸构建体插入到用于表达的适当的载体中，表达本发明的核苷酸序列。在创建表达载体中，编码序列位于载体中以至于编码序列与用于表达和可能的分泌的适当的控制序列有效连接。
当涉及到DNA片段时，“有效连接”是指片段如此排列以至于与其预期目的相一致地作用，例如转录在启动子起始并继续经过编码片段到达终止子。
“表达载体”是包含编码目的多肽的片段的线性或环状的DNA分子，其有效连接到提供其转录的额外片段。此种额外的片段可以包括启动子和终止子序列和任选的一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多聚腺苷酸信号等等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或者包含两者的成分。
重组表达载体可以是能够方便地进行重组DNA操作和能够导致核苷酸序列表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与载体将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或者闭合环状质粒。载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含保证自我复制的任何方法。备选地，载体可以是当其导入宿主细胞后可以整合进入基因组并且与所整合染色体一起复制的那种载体。载体系统可以是一种载体或质粒或者一起包含欲导入宿主细胞基因组的总DNA的两种或以上载体或质粒或者转座子。
本发明的载体优选地包含允许对已转化细胞进行容易的选择的一种或多种选择标记。选择标记是一种基因，其产物能够提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、营养缺陷型的原养型等等。细菌选择标记的实例是来源于枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因、或赋予抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤抗性的标记。时常使用的哺乳动物标记是二氢叶酸还原酶基因(DHFR)。对于酵母宿主细胞适当的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记选自但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)和glufosinate抗性标记以及来源于其他物种的等效物。优选地用于曲霉细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar标记。此外，可以通过例如WO 91/17243中所描述的共转化实现选择，，其中选择标记在不同的载体上。
本发明的载体优选地包含允许载体稳定整合进入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于细胞基因组自主复制的载体。
当导入宿主细胞后本发明的载体可以整合到宿主细胞基因组上。对于整合，载体可以依赖编码多肽的核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组将载体稳定整合进入基因组的载体的任何其他元件。备选地，载体包含用于指导通过同源重组整合进入宿主细胞基因组的额外的核苷酸序列。额外的核苷酸序列能够使载体在染色体上的精确位置整合到宿主细胞基因组中。为了提高在精确位置整合的可能性，整合元件应该优选地包含足够数目的核苷酸，例如100-1,500个碱基对，优选地400-1,500碱基对，并且最优选地800-1,500碱基对，其中所述核苷酸与相应的靶序列高度同源以至于增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或者编码核苷酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。这些核苷酸序列可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列并且，此外，可以是非编码或者编码序列。
为了自主复制，载体可以进一步包含能够使载体在所讨论宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的实例是质粒pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2micron复制起点、CEN6和ARS4的组合、和CEN3和ARS1的组合。复制起点可以是含有使其功能在宿主细胞中温度敏感的突变的一种复制起点(见例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1433)。
可以将编码本发明多肽的核苷酸的一个以上的拷贝插入到宿主细胞中以增强核苷酸序列的表达。通过使用本领域众所周知的方法将序列的至少一个额外拷贝整合到宿主基因组中并且对转化体进行筛选得到核苷酸序列的稳定扩增。
用于将上述元件进行连接以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员众所周知的(见例如Sambrook等，1989，同上)。
包含核苷酸构建体的宿主细胞
本发明还涉及包含本发明核苷酸序列或核苷酸构建体或重组表达载体的重组宿主细胞，其有利地用于产生本发明多肽变体重组产物。术语“宿主细胞”包含亲本宿主细胞和其任何后代，其中所述的后代由于在复制过程中的突变而与亲本宿主细胞不同。
细胞优选地用包含本发明核苷酸序列的载体转化随后载体整合到宿主染色体上。“转化”意思是将包含本发明核苷酸序列的载体导入宿主细胞以至于载体作为染色体整合体或者作为自我复制的染色体外载体得以保持。通常认为整合是有利的，因为核苷酸序列更可能在细胞中稳定保持。载体整合到宿主染色体上可以通过上述的同源或非同源重组发生。
宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因和其来源。宿主细胞可以是单细胞生物，例如原核生物或者是非但细胞生物，例如真核生物。有用的单细胞是细菌细胞，例如包括但不限于芽胞杆菌细胞或链霉菌细胞的革兰氏阳性细菌或例如大肠杆菌和假单胞菌的革兰氏阴性细菌，其中所述的芽胞杆菌为例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，链霉菌为例如变铅青链霉菌(c)或者鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌杆菌细胞。细菌宿主细胞的转化例如可以通过原生质体转化(见例如Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，通过使用感受态细胞(见例如Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或者Dubnar和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)，通过电穿孔(见例如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)，或者通过接合(见例如Koehler和Thorne，1987，Journal ofBacteriology 169：5771-5278)实现。
宿主细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。
有用的哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、或者任何从例如美国典型培养物保藏中心可得到的任意数目的其他永生化细胞系。
适宜哺乳动物细胞系的实例是COS(ATCC CRL 1650和1651)，BHK(ATCC CRL 1632、10314和1573，ATCC CCL 10)，CHL(ATCC CCL39)或者CHO(ATCC CCL 61)细胞系。转染哺乳动物细胞和在细胞内表达所导入DNA序列的方法描述于例如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159(1982)，601-621；Southern和Berg，J.Mol.Appl.Genet.1(1982)，327-341；Loyter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982)，422-426；Wigler等，Cell 14(1978)，725；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7(1981)，603，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons公司，N.Y.，1987，Hawley-Nelson等，Focus 15(1993)，73；Ciccarone等，Focus15(1993)，80；Graham和van der Eb，Virology 52(1973)，456；和Neumann等，EMBO J.1(1982)，841-845。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。如文中所使用“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门(如Hawksworth等，在Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi，第八版，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK所定义)以及卵菌门(如在Hawksworth等，1995，同上，171页所引用)和所有的有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，同上)。子囊菌门的代表种群包括例如脉孢菌属(Neurospora)、正青霉属(Eupenicillium)(＝青霉属)、裸孢壳属(Emericella)(＝曲霉属)、散囊菌属(Eurotium)(＝曲霉属)和上面列出的真酵母。担子菌门的实例包括蘑菇、锈菌和黑粉菌。壶菌门的代表种群包括例如异水霉属、小芽枝霉属、雕蚀菌属和水生真菌。卵菌门的代表种群包括例如Saprolegniomycetous水生真菌(水霉)例如绵霉属。有丝分裂孢子真菌的实例包括曲霉属、青霉属、念珠菌属和链格孢属。接合菌门的代表种群包括例如根霉属和毛霉属。
在一个优选的实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。文中所使用的“酵母”包括产子囊酵母(endomycetales)、产担孢子(basidiosporogenous)酵母和属于半知菌类(芽生菌)的酵母。产子囊酵母分为蚀精霉科和酵母菌科。后者由四个亚科组成：裂殖酵母亚科(例如裂殖酵母属)、Nadsonioideae、Lipomycoideae和复膜孢酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如毕赤酵母属、克鲁维酵母属和酵母菌属)。产担孢子酵母包括白冬孢酵母属、红冬孢酵母属、锁掷酵母属、Filobasidium和Filobasidiella。属于半知菌类的酵母分为掷孢酵母科(例如Sorobolomyces和布勒弹孢酵母属)和隐球酵母科(例如假丝酵母属)两个科。由于酵母的分类在将来会变化，所以为了本发明的目的将酵母定义为如在Biology and Activities ofYeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，著，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所描述。酵母的生物学和酵母遗传学操作是本领域众所周知的(见例如，Biochemistry and Genetics ofYeast，Bacil，M.，Horecker，B.J.，和Stopani，A.O.M.著，第二版，1987；The Yeasts，Rose，A.H.，和Harrison，J.S.著，第二版，1987；和TheMolecular Biology of the Yeast Saccharomyces，Strathern等著，1981)。
酵母宿主细胞可以是选自假丝酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、Hansehula或耶氏酵母属(Yarrowia)的细胞。在优选的实施方案中，酵母宿主细胞是卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Saccharomycesdiastaticus、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomycesoviformis细胞。其他有用酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、Hansehula polymorpha、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、Ustilgo maylis、麦芽糖假丝酵母(Candida maltose)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)和Pichia methanolio细胞(参见Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132，1986，3459-3465页；US 4,882,279和US 4,879,231)。
在优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括细分的真菌门和卵菌门(如Hawksworth等，1995，同上，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌的特征是由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖组成的营养菌丝体。营养生长是通过菌丝延长进行并且碳代谢是专性需氧的。与此相对照，酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽并且碳代谢是发酵。在更加优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是属于但不限于枝顶孢属、曲霉属、镰孢霉属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属、青霉菌属、梭孢壳属、Tolypocladium和木霉属的细胞或者其有性型或类似物。在更加优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是曲霉细胞。在另一个甚至更加优选的实施方案中丝状真菌宿主细胞是枝顶孢属细胞。在另一个甚至更加优选的实施方案中丝状真菌宿主细胞是镰孢霉属细胞。在另一个甚至更加优选的实施方案中丝状真菌宿主细胞是腐质霉属细胞。在另一个甚至更加优选的实施方案中丝状真菌宿主细胞是毛霉属细胞。在另一个甚至更加优选的实施方案中丝状真菌宿主细胞是毁丝霉属细胞。在另一个甚至更加优选的实施方案中丝状真菌宿主细胞是脉孢菌属细胞。在另一个甚至更加优选的实施方案中丝状真菌宿主细胞是青霉菌属细胞。在另一个甚至更加优选的实施方案中丝状真菌宿主细胞是梭孢壳属细胞。在另一个甚至更加优选的实施方案中丝状真菌宿主细胞是Tolypocladium细胞。在另一个甚至更加优选的实施方案中丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞。在最优选的实施方案中丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉、构巢曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中丝状真菌宿主细胞是Discolor的镰孢霉属细胞(也已知为镰孢霉属部分)。例如丝状真菌亲本细胞可以是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cereals、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)或者Fusarium trichothecioides细胞。在另一个优选的实施方案中，丝状真菌亲本细胞是Elegans部分的镰孢霉属菌株例如尖镰孢(Fusarium oxysporum)。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens或Humicola lanuginosa细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是米赫毛霉(Mucormiehei)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Myceliophthora thermophilum细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是产紫青霉(Penicillium purpurogenum)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Thielaviaterrestris细胞或产黄头孢(Acremonium chrysogenum)细胞。在另一个最优选的实施方案中，木霉属细胞是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或者绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。曲霉属在蛋白质表达中的用途描述于如EP272 277，EP 230 023。
可以将本发明的核苷酸序列即DNA进行修饰从而对于其在其中表达的优选的具体宿主细胞的密码子选择进行优化。公开了酵母(Woo JH，等，Protein Expression and Purification，第25(2)卷，270-282页，2002)、真菌(Te′o等，FEMS Microbiology Letters，第190(1)卷，13-19页(2000))和其他生物以及在哺乳动物细胞表达的Der p1(Massaer M，等，InternationalArchives of Allergy and Immunology，第125(1)卷，32-43页，2001)的此种实例。
在特定的实施方案中宿主细胞是昆虫细胞和/或昆虫细胞系。用作宿主的昆虫细胞系适当地是鳞翅目细胞系，例如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(参见US 5,077,214)。适当的培养条件描述于例如WO 89/01029或者或WO 89/01028，任何上述文献。
植物
本发明还涉及用编码本发明多肽(即变体)的核酸序列转化的以至于表达和生产可回收量多肽的转基因植物、植物部分或植物细胞。多肽可以从植物或植物部分回收。备选地，包含重组多肽的植物或植物部分可以用作疫苗的目的。
在一个特定的实施方案中，多肽靶向了种子中的胚乳贮存泡。这可以通过将该多肽作为具有适当信号肽的前体合成而得到，见Horvath等，在PNAS，二月，15，2000，第97卷，第4期，1914-1919页。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)或者其工程变种。单子叶植物的实例是草，例如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)、饲草，例如羊茅属、黑麦草属、温带草，例如Agrostis和谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉米(玉米)。双子叶植物的实例是烟草、豆类，例如羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，和十字花科植物(十字花科)例如花椰菜、油菜籽和密切相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。低肌醇六磷酸植物描述于例如美国专利号5,689,054并且在美国专利号6,111,168中是工程植物的实例。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎。特定植物组织例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也认为是植物部分。此外，任何植物细胞不管其组织来源都被认为是植物部分。
也包含在本发明范围内的是此种植物、植物部分或植物细胞的后代。
按照本领域已知的方法构建了表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简言之，通过将一个或多个编码本发明多肽的表达构建体掺入到植物宿主基因组中并且繁殖所得到的修饰植物或植物细胞成为转基因植物或植物细胞建立植物或植物细胞。
方便地，表达构建体是核酸构建体，其包含编码本发明多肽的核酸序列，其有效连接到对于核酸序列在所选植物或植物部分表达所需的恰当调节序列。此外，表达构建体可以包含对于鉴定表达构建体整合进入的宿主细胞有用的选择标记和对于将构建体导入所讨论植物所必需的DNA序列(后者取决于所使用的DNA导入方法)。
对调节序列例如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列的选择要基于例如多肽打算何时、何地和如何表达作出决定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或者可诱导的，或者发育、阶段或组织特异的并且基因产物可以靶向特定组织或植物部分例如种子或叶。调节序列例如描述于Tague等，1988，Plant Physiology 86：506。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV启动子(Franck等，1980，Cell21：285-294)。器官特异的启动子可以是例如从贮存库组织例如种子、马铃薯块茎和果实(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)或者代谢库组织例如分生组织(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)来源的启动子，种子特异的启动子例如来源于稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39：885-889)、来源于蚕豆(Vicia faba)豆球蛋白B4和未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152：708-711)、来源于种子油体蛋白质的启动子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology39：935-941)、来源于甘蓝型油菜(Brassica napus)的贮存蛋白质napA启动子或者本领域已知的其他任意种子特异启动子，例如WO 91/14772中所述。此外，启动子可以是叶特异启动子，例如来源于稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant MolecularBiology 26：85-93)或者来源于稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)或者创伤可诱导启动子，例如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。
还可以使用启动子增强元件实现本发明变体在植物中更高的表达。例如，启动子增强元件可以是置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如Xu等，1993，同上，公开了稻肌动蛋白1基因第一内含子在增强表达中的用途。
此外，可以对所述植物物种优化密码子选择以促进表达(见Horvath等参考上面)。
选择标记基因和表达构建体的任何其他部分可以从本领域可得的那些选择。
按照本领域已知的常规技术将核酸构建体掺入到植物基因组中，所述技术包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature 338：274)。
当前，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移是产生转基因双子叶植物所选择的方法(对于综述见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)))))))))))。然而，根癌农杆菌介导的基因转移也可用于转化单子叶植物，虽然其他转化方法对于这些植物通常是优选的。当前，用于产生转基因单子叶植物所选择的方法是胚胎愈伤组织或发育胚胎的粒子轰击(用转化DNA包被的微小的金或钨颗粒)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的备选的方法是基于如Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所描述的原生质体转化。
转化后，按照本领域众所周知的方法筛选其中掺入表达构建体的转化体并再生完整植物。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其中该方法包括(a)将包含编码本发明变体的核酸序列的转基因植物或植物细胞在有助于产生所述变体的条件下培养；和(b)回收变体。
制备组1螨多肽变体的方法
本发明的多肽变体可以通过下列步骤制备(a)用本发明核苷酸构建体转化适宜的宿主细胞；(b)在有助于产生本发明变体的条件下培养包含本发明核苷酸构建体的重组宿主细胞和(c)回收变体。在特定的实施方案中所述方法可以如在WO01/29078(HESKA)所述实施，其中在WO01/29078(HESKA)中描述了包括经修饰能够表达多肽的核苷酸的组1螨蛋白质在微生物中的重组表达。
转化
通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身已知的方式对真菌细胞进行转化。转化曲霉宿主细胞的适宜的方法描述于EP238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81：1470-1474。转化镰孢霉属物种的适宜的方法描述于Malardier等，1989，Gene 78：147-156或共同待决的美国系列号08/269,449。其他真菌细胞的实例是丝状真菌，例如曲霉属、链孢霉属、镰刀菌属或者木霉属，具体而言是米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉的细胞。曲霉属用于蛋白质表达的用途描述于例如EP 272 277和EP 230 023。对尖镰孢菌(F.oxysporum)的转化如Malardier等，1989，Gene 78：147-156所述的进行。
使用描述于Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.著，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，第194卷，182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journalof Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：1920的方法对酵母进行转化。通过使用Graham和Van der Eb(1978，Virology 52：546)的磷酸钙沉淀法通过直接吸收可以转化哺乳动物细胞。
如在US 4,745,051；US 4,775,624；US 4,879,236；US 5,155,037；US5,162,222；EP 397,485(全部公开文中引用作为参考)中所述对昆虫细胞进行转化和产生文中的异源多肽。
培养
在允许产生目的分子的条件下将上述转化或转染的宿主细胞在适当的营养培养基中培养，之后将目的分子从细胞或培养基中回收。
用于培养细胞的培养基可以是适宜宿主细胞生长的任何常规培养基，例如基本培养基或者包含适当添加剂的复合培养基。适当的培养基可以从供应商得到或者根据公开的方法制备(例如在美国典型培养物保藏中心目录中)。使用本领域已知的方法制备培养基(例如关于细菌和酵母的参考文献见Bennett，J.W.和LaSure，L.著，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)。
回收
在特定的实施方案中，本发明的多肽变体是分离的和纯化的形式。因此，本发明多肽变体以大于20％w/w的纯度，特别是大于50％w/w的纯度，更加特别的是大于75％w/w的纯度，更加特别的是大于90％w/w的纯度和甚至更加特别的是大于95％w/w的纯度的制备物提供的。在本上下文中纯度理解为制备物中总的多肽物质中本发明多肽变体的量。
当应用于多肽时，术语“分离的”是指多肽处于其天然环境外的条件下，例如离开了血液和动物组织。在一种优选的形式中，多肽基本上没有其他蛋白质，特别是动物来源的其他蛋白质。优选地是以高度纯化形式，即大于95％的纯度，更加优选地大于99％的纯度提供多肽。
如果分子是分泌到营养培养基中的，则可以从培养基中直接回收分子。如果分子不是分泌的，则可以从细胞裂解物中回收分子。通过常规的方法可以从培养基中回收分子，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞、通过盐例如硫酸铵沉淀上清液或过滤液中的蛋白质成分。蛋白质可以是在体外成熟的，例如通过酸化诱导自催化加工(Jacquet等，ClinExp Allergy，2002，卷32 1048-53页)，并且通过多种层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等等可以将蛋白质纯化，层析方法的选择取决于所述分子的类型(见例如Protein Purification，J-C Janson和Lars Ryden著，VCH Publishers，New York，1989)。
聚合物的活化
在本发明变体缀合有一个或多个聚合物并且如果缀合所述多肽的聚合物分子是没有活性的情况下，则必须通过适当的技术活化聚合物。本发明还关注到通过连接物将聚合物分子偶联到多肽上。适当的连接物对技术人员是众所周知的。
在文献中深入描述了活化聚合物分子以及多肽缀合的方法和化学作用。活化不溶性聚合物通常使用的方法包括用溴化氰、高碘酸、戊二醛、二环氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳化亚胺、磺酰基卤化物、三氯三嗪等等官能团活化(见R.F.Taylor，(1991)，″Protein immobilisation.Fundamental and applications″，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，″Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking″，CRC Press，BocaRaton；G.T.Hermanson等，(1993)，″Immobilized Affinity LigandTechniques″，Academic Press，N.Y.)。虽然一些方法用于活化不溶性的聚合物但是也可以应用于可溶性聚合物例如高碘酸、三氯三嗪、磺酰基卤化物、二乙烯基砜、碳二亚胺等。官能团可以是聚合物上的氨基、羟基、硫醇、羧基、醛基或巯基并且蛋白质上所选择的附着基团认为是选择进行活化和缀合化学作用的，其中活化和缀合化学作用常常由i)聚合物活化，ii)缀合，和iii)残留活性基团的封闭组成。
在下面简要地描述多种适宜的聚合物活化方法。然而应该理解还可以使用其他的方法。
借助于二酰亚胺和例如氨基-PEG或者肼基-PEG(Pollak等，(1976)，J.Amr.Chem.Soc.，98，289-291)或者重氮基醋酸酯/酰胺(Wong等，(1992)，″Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking″，CRC Press)可以实现将聚合物分子缀合到多肽的游离酸性基团上。
将聚合物分子缀合到羟基基团上通常是十分困难的，因为必须在水中进行。通常水解作用比与羟基基团的反应占优势。
将聚合物分子偶联到巯基上可以通过与特定基团如马来酰亚胺基或正吡啶基二硫化物(ortho-pyridyl disulfide)反应实现。乙烯基砜(美国专利号5,414,135，(1995)，Snow等)对于巯基基团也有选择性，但是选择性不如马来酰亚胺基或正吡啶基二硫化物的强。
也是优选的但是不选择它用于所述的其他基团。
多肽链上可接近精氨酸残基可以由包含两个相邻羰基基团靶定。
涉及将亲电子活化的PEG偶联到赖氨酸的氨基上的技术也是有用的。醇的许多通常的离去基团可以形成胺键。例如可以使用烷基磺酸盐，如tresylates(Nilsson等，(1984)，Methods in Enzymology第104卷，Jacoby，W.B.著，Academic Press：Orlando，56-66页；Nilsson等，(1987)，Methods inEnzymology第135卷；Mosbach，K.著；Academic Press：Orlando，65-79页；Scouten等，(1987)，Methods in Enzymology第135卷，Mosbach，K.著，Academic Press：Orlando，1987；79-84页；Crossland等，(1971)，J.Amr.Chem.Soc.1971，93，4217-4219页)、甲磺酸盐(Harris，(1985)，同上；Harris等，(1984)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22，341-352页)、芳基磺酸盐，如甲苯磺酸盐，和对硝基苯磺酸盐。
有机磺酰氯，例如Tresyl chloride有效地将多种聚合物例如PEG中的羟基转变成良好的离去基团(磺酸盐)，当离去基团与多肽中亲核试剂如氨基反应时允许在聚合物和多肽之间形成稳定的键。除了高的缀合产率外，反应条件通常是温和的(中性或稍碱性pH，避免变性和活性破坏较小或没有破坏)并且满足对多肽非破坏性的要求。
甲苯磺酸盐比甲磺酸盐更具有反应性并且也更加不稳定地分解成PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky，(1995)，Bioconjugate Chem.，6，150-165)。环氧化物还可以用于产生胺键但是与上述基团相比反应性更差。
用光气将PEG转化成氯甲酸酯可以形成连接赖氨酸的氨基甲酸酯键。在许多用N-羟基琥珀酰亚胺(美国专利号5,122,614，(1992)；Zalipsky等，(1992)，Biotechnol.Appl.Biochem.，15，100-114页；Monfardini等，(1995)，Bioconjugate Chem.，6，62-69)、咪唑(Allen等，(1991)，Carbohydr.Res.，213，309-319页)、对硝基苯酚、DMAP(EP 632 082A1，(1993)，Looze，Y.)等取代氯的变体中采用了该方法。通过氯甲酸酯与目的离去基团反应通常产生衍生物。所有这些基团产生连接肽的氨基甲酸酯键。
此外，采用异氰酸酯和异硫氰酸酯分别产生尿素和硫脲。
使用与上述相同的离去基团和cyclic imid thrones可以从PEG酸得到酰胺(美国专利号5,349,001，(1994)，Greenwald等)。这些化合物的反应性是十分高的但是使得水解反应很快。
还可以使用与琥珀酸酐反应形成的PEG琥珀酸酯。据此包含的酯基团使得缀合更易受到水解(美国专利号5,122,614，(1992)，Zalipsky)。该基团可以用N-羟基琥珀酰亚胺活化。
此外，可以引入特定连接物。最古老的是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，J.Biol.Chem.，252，3578-3581；美国专利号4,179,337，(1979)，Davis等；Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
将PEG偶联到芳香族胺上然后再重氮化得到反应性很强的能够在原位与肽反应的重氮。酰胺键还可以通过PEG的二氢唑酮衍生物的反应得到(美国专利号5,321,095，(1994)，Greenwald，R.B.)从而引入了额外酰胺键。
由于一些多肽不包含许多赖氨酸，所以有利地是在同一个赖氨酸上附着一个以上PEG。这可以通过例如使用1，3-二氨基-2-丙醇实现。
还可以通过氨基甲酸酯键将PEG附着在多肽的氨基上(WO 95/11924，Greenwald等)。赖氨酸残基还可以用作主链。
在实例中使用的偶联技术是在WO 90/13590(Enzon)中描述的N-琥珀酸亚胺基碳酸酯缀合技术。
组合物
本发明还涉及包含本发明变体和任选的可药用载体和/或佐剂的组合物和制备这种组合物的方法，该方法包括混合本发明变体和可药用载体和/或佐剂。在特定的实施方案中组合物适于例如作为疫苗治疗免疫性疾病如动物或人的过敏反应。
可药用载体和/或佐剂包括盐水、甘油、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、皂苷(例如Q21和Quill A)、基于鲨烯的乳剂(例如MF59)、单磷酰脂质A(和合成的模拟物)、聚丙交酯共乙交酯(PLG)颗粒、ISCOMS、脂质体、壳聚糖、细菌DNA(例如包含未甲基化CpG的序列)。适宜的载体还包括可药用溶剂和/或压片助剂/辅助物。
接种疫苗抗原多肽变体和包含它们的组合物的用途
在进一步的方面，本发明提供了本发明变体或组合物的用途，用作药物，特别是治疗免疫疾病，例如动物和人过敏反应的药物和/或用于制备治疗此种免疫疾病的药物。
通常，过敏反应疫苗接种是以增加的剂量在相当长的一段时间通过肠胃外、鼻内或舌下施用来进行并且导致了患者的所称作的脱敏。虽然确切的免疫学机制还是未知，但是所诱导的过敏原特异T和B细胞表型的不同被认为是特别重要的。
与常规类型的疫苗接种相比，在过敏反应患者中存在正在进行的免疫反应使得过敏反应疫苗接种复杂化。此种免疫反应的特征是存在过敏原特异的IgE，其介导释放过敏介质的释放，由此当暴露于过敏原时诱导产生过敏症状。因此，使用天然和/或天然存在的过敏原进行过敏反应疫苗接种具有产生副作用的内在危险，该副作用最后可威胁患者的生命。
避开该问题的方法可以分为三类。在实践中采取的措施是通常将一种以上的方法组合使用。第一类措施包括施用几次小剂量并在长期内增加剂量以达到相当的积累剂量。其理论是在施用潜在的过敏剂量的过敏原之前允许缓慢启动保护性免疫反应。第二类措施包括通过将过敏原掺入到例如凝胶制剂如氢氧化铝中对过敏原进行物理修饰。氢氧化铝具有佐剂的作用和缓慢过敏原释放的贮库作用，从而降低了过敏原的组织浓度。第三类措施包括如文中所述的为了降低变应原性的对过敏原进行修饰。
过敏疫苗的免疫治疗效果可以以多种不同的方法评估。一种是测量特异IgE结合，结合的降低表明具有较好的安全性谱(然而不一定具有较好的疫苗潜能)(WO 99/47680，ALK-ABELLO)。同样，可以采用几种细胞测定法来证明修饰的免疫反应，该修饰的免疫反应表明如几种公开中所示的好的过敏疫苗潜能，其全部公开引用作为参考(van Neerven等，“Tlymphocyte responses to allergens：Epitope-specificity and clinicalrelevance”，Immunol Today，1996，第17卷，526-532页；Hoffmann等，Allergy，1999，第54卷，446-454页，WO 99/07880)。嗜碱性粒细胞组胺释放：例如Swoboda等，Eur.J.Immunol.，第32卷，270-280页，2002。还可以采用例如Kronqvist等，Clin Exp Allergy 2000 30卷670-676页所述皮肤针刺试验。
最后，可以使用细胞或临床终点测量对过敏患者进行临床试验(Ebner等，Clin.Exp.All.，1997，第27卷，107-1015页；Int.Arch.AllergyImmunol.，1999，第119卷，1-5页)。
实施例
方法
夹心ELISA
用适当剂量多克隆兔抗Der p1抗体在4℃将免疫板(Nunc Maxisorb；Nunc-Nalgene)包被过夜。然后用含0.05％Tween 20的0.15M磷酸缓冲盐溶液(PBS)(PBST)充分洗涤板子，并用含2％脱脂奶粉的PBS室温封闭剩余的结合位点1小时。加入适当剂量或剂量范围的样品，样品可以是纯化的、半纯化的重组组1螨多肽变体过敏原或者含有目的蛋白质的粗品培养液。然后用0.15M PBST充分洗涤板子，之后通过用生物素化单克隆抗Der p1抗体(INDOOR)室温孵育1小时检测过敏原。再次在0.15M PBST中进行洗涤。与链亲合素：辣根过氧化物酶(Kierkegaard & Perry)室温缀合1小时。重复洗涤步骤并加入3，3′，5，5′-四甲基联苯胺过氧化氢(TMBPlus，Kem-En-Tec)显影并通过加入0.2M H2SO4终止反应。OD450将反映免疫球蛋白与过敏原的结合，并且如果已知浓度的天然Der p1(从Indoorbiotechnologies获得，产品编号：NA-DP1)以剂量范围包含于实验中，则有可能检测并且测定所结合的过敏原的量。
实施例1：寻找具有抗体活性寡肽内的表位模式
对可将随机寡聚肽(六、七、八、九和/或十二肽)表达为其表面蛋白质部分的噬菌体的高度多样性文库筛选结合抗体的能力。从Schafer-N，Copenhagen，丹麦获得噬菌体文库。
通过胃肠外或经粘膜施用每种下面列出的蛋白质在动物(大鼠、兔或小鼠)体内产生抗体样品。将抗体溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。在某些情况下，通过辛酸沉淀(对于总IgG)或者通过使用装载有以下抗体：小鼠抗-大鼠IgG1或大鼠抗-小鼠IgE之一的顺磁免疫珠(Dynal AS)进行亲合层析，从免疫动物的血清纯化特定亚类的抗体。
1)来自芽孢杆菌DSM 12649的淀粉酶AA560，(大鼠IgG)
2)Bacillus halmapalus(WO96/23873)的α-淀粉酶，该酶也称为淀粉酶SP722，(大鼠IgG)
3)残基183和184缺失的SP722变体，称为JE-1(WO96/23873)，(大鼠IgG和兔IgG)
4)Mycelioptora thermopila漆酶(WO 95/33836)(兔IgG)
5)T.lanuginosus脂肪酶(Lipolase TM)(大鼠IgG和兔IgG)
6)来自Humicola insolens的家族45纤维素酶(CarezymeTM)(兔IgG)，
7)迟缓芽胞杆菌(Bacillus lentus)蛋白酶(SavinaseTM)(大鼠IgG、小鼠IgG、小鼠IgE和兔IgG)，
8)来自解淀粉芽胞杆菌的枯草杆菌蛋白酶Novo(BPN′)(大鼠IgG)，
9)枯草杆菌蛋白酶Novo的Y217L变体(大鼠IgG)，
10)枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(AlcalaseTM)(大鼠IgG)，
11)TY145蛋白酶(大鼠IgG)，
12)CDJ31蛋白酶，
13)枯草杆菌蛋白酶147(EsperaseTM)(大鼠IgG)，
14)来自解淀粉芽胞杆菌的Bacillolysin(NeutraseTM)(大鼠IgG和大鼠IgG1)，和
15)枯草杆菌蛋白酶PD498(WO 93/24623)(大鼠IgG和兔IgG)。
用珠包被的抗体孵育噬菌体文库。例如将表达对小鼠IgE抗体具有亲和力的寡肽的噬菌体捕获于大鼠抗小鼠IgE-包被珠上并且通过将这些顺磁珠暴露于磁场进行收集。通过温和酸处理，或者通过用对各自抗体样品特异的完整蛋白质抗原洗脱(例如Savinase用于抗Savinase抗体)，从固定化抗体洗脱所收集的噬菌体。使用本领域已知的方法扩增所分离的噬菌体。备选地，直接用大肠杆菌(E.coli)孵育固定化噬菌体进行感染。简而言之，在存在辅助噬菌体时(例如M13K07)用M13衍生的载体感染F-因子阳性大肠杆菌(例如XL-1 Blue、JM101、TG1)，并通常在含有葡萄糖或IPTG的2xYT中孵育，并用适当抗生素进行筛选。最后，通过离心去除细胞。在各自细胞上清液中重复该循环事件最少2次并且最多5次。筛选2、3、4、和5轮之后，在选择性2xYT琼脂板上孵育感染的大肠杆菌部分，并且通过免疫学评价新出现噬菌体的特异性：将噬菌体转移至硝酸纤维素(NC)膜。对于每个板，制备2个NC-复制品。一个复制品使用筛选抗体进行孵育，另一个复制品使用筛选抗体和免疫原进行孵育，所述免疫原用于作为竞争剂获得抗体。当存在免疫原时缺乏的那些噬菌斑被认为是特异的，并按照上述步骤扩增所述噬菌斑。
当存在聚乙二醇时通过离心从细胞上清液中分离特异噬菌体克隆。全部按照本领域已知的标准步骤分离DNA，通过PCR扩增编码寡肽的DNA序列，并且确定其DNA序列。从DNA序列推导出相应寡肽的氨基酸序列。
用公开于下面文献中的402种反应性肽的信息补充256种实验性确定的反应性肽：
Allergy 38(1983)449-459，
Allergy 56(2001)118-125；
Allergy 56 s67(2001)48-51；
Allergy 54(1999)1048-1057；
Arch Biochem Biophys 342(1997)244-253
B.B.Res.Com.219(1996)290-293；
Biochem J 293(1993)625-632；
Bioinformatics 18(2002)1358-1364；
Clin Exp Allergy 24(1994)100-108；
Clin Exp Allergy 24(1994)250-256；
Clin Exp Allergy 31(2001)331-341；
Clin Exp Med 24(1994)100-108；
Eur J Biochem 245(1997)334-339；
Int Arch Allergy Appl Immunol 89(1989)342-348
Int Arch Allergy Appl Immunol 89(1989)410-415
Int Arch Appl Immunol 103(1994)357-364
Int Arch Appl Immunol 92(1990)30-38
J Allergy Clin Immunol 106(2000)150-158
J Allergy Clin Immunol 107(2001)1069-1076
J Allergy Clin Immunol 93(1994)34-43
J Biol Chem 271(1996)29915-29921
J Clin Invest 103(1999)535-542
J Immunol 121(1989)275-280
J Immunol 133(1984)2668-2673
J Immunol 140(1988)611-616
J Immunol 147(1991)205-211
J Immunol 151(1993)5354-5363
J Immunol 151(1993)7206-7213
J Immunol Methods 213(1998)1-17
Mol Immunol 25(1988)355-365
Mol Immunol 28(1991)1225-1232
Mol Immunol 29(1992)1383-1389
Mol Immunol 29(1992)257-262
Mol Immunol 30(1993)183-189
Mol Immunol 35(1998)293-305
Mol Immunol 37(2000)789-798
Peptides 21(2000)589-599
Protein Scieince 8(1999)760-770
Scand J Immunol 27(1988)587-591
Science 233(1986)747-753
WO 90/11293
WO 99/38978
WO 01/34186
WO 01/39799
WO 01/39799
WO 01/49834
www.csl.gov.uk/allergen
因此，获得了总共658种对上面所描述的蛋白质特异抗体具有特异性的肽序列。将这些序列收集入数据库，并通过序列比对进行分析以鉴定表位模式，注意保守的备选方案认为是相等的(如上所描述)。
鉴定表位模式
原则上，658种反应性(寡)肽序列的每一条都代表一种表位模式。然而，在这658种反应性(寡)肽序列中，一些表位模式是多余的，并且为了去除表位模式中的多余部分，将反应性(寡)肽序列进行计算机化数据分析。
首先考虑到保守性备选方案，产生了对应132种不同的组合的全部可能的二肽。列出了658种反应性(寡)肽序列中每种二肽的存在和频率。其次产生了对应133种不同的组合的全部可能的三肽并且也列出了658种反应性(寡)肽序列中每种三肽的存在和频率。然后产生所列出的二肽和三肽的全部可能的组合，包括那些在二肽和三肽之间包含1、2、3或4个残基插入的组合，这些残基选自13种可能的残基类型。该过程产生5-10个氨基酸的不同肽组合的列表，其中每种组合包含来自最初列表的至少一个二肽和至少一个三肽和在它们之间的0-4个残基。然后将658种反应性(寡)肽序列中每种肽组合的频率进行排序并且通过一种方法筛选相关表位模式，所述方法中反应性排序和相关表位模式通过这样一种方法进行选择，该方法中首先选择由最高频率组合覆盖的反应性肽并且从将其该组658种反应性肽中分离出来。然后选择由第二高频率组合覆盖的反应性肽并从剩余组中分离出来。然后选择由第三高频率组合覆盖的反应性肽并从剩余组中分离出来。重复该过程直到发现覆盖全部658种反应性肽的组合。通过这种方式发现357种组合(表位模式)覆盖全部658种反应性肽。
实施例2：预测表位
使用以下三维结构作为模板建立Der p1模型：
 PDB条目   蛋白质
 9PAP   木瓜的木瓜蛋白酶
 2ACT   猕猴桃的猕猴桃碱
 1PPO   木瓜的ω蛋白酶
使用ClustalW 1.7(如描述于Higgins等人，Methods Enzymol.，卷266，83-402页，1996，和Thompson等人，Nucleic Acids Research，卷22，4673-4680页，1994)对三个模板和成熟Der p1的序列进行比对。比对显示如下。由于成熟Der p1的前9个残基在任意模板中没有相应残基，这些残基的可靠建模是不可能的，并且因此，这9个N-末端残基不包括于Derp1模型。
“Modeler 5.0”程序(Accelrys Software，San Diego，CA，USA)用于建立Der p1的三维模型。“Modeler 5.0”来自于“Insightll”分子建模软件(Accelrys Software，San Diego，CA，USA)，使用以下参数：模型数：1，优化水平：无，更多选项：是，优化循环：是，循环模型数：2，循环优化水平：低，构建氢(Build hydrogen)：无。
使用“Insightll”，加入氢并将CHARMm潜能和部分电荷分配至模型。使用“CHARMm”(Accelrys Software，San Diego，CA，USA)，应用ABNR最小化的100步以松弛模型。
序列比对：
＞P1：P_1PPO
structureX：P_1PPO：1：：216：：unknown：unknown：-1.00：-1.00
---------LPENVDWRKGAVTPVRHPGSCGSCWAFSAVATVEGINKIETGKLVELSEPELVDCER--RSHGCK
GGYPPYALEYVAKNG-IHLRSKYPYKAKQGTCRAKQVGGPIVKTSGVGRVQPNNEGLLNAIAKQPVSVVVES--
-KGRPFQLYKGGIFEGPCG--TKVDHAVTAVGYGKSGGKGYILIKNSWGTAWGEKYIRIKRAPGNSPGVCGLYK
SSYYPTKN*
＞P1；P_2ACT
structureX：P_2ACT：1：：218：：unknown：unknown：-1.00：-1.00
---------LPSYVKWRSAGAVVDIKSCGECGGCWAFSAIATVEGINKITSGSLISLSEQELIDCGRTQNTRGCD
GGYITDGFQFIINDGGINTEENYPYTACDGDCDVALQOQKYVTIDTYENVPYNNEWALQTAVTYQPVSVALDA--
-AGDAFKQYASGIFTGPCG--TAVDHAVIVGYGTEGGVDYWIVRNSVKNSWDTTWGEEGYMRILGG-AGTCGIAT
MPSYPVKY*
＞P1；P_9PAP
structureX：P_9PAP：1：：212：：unknown：unknown：-1.00：-1.00
---------IPEYVDWRQKGAVTPVKNQGSCGSCWAFSAVVTIEGIIKIRTGNLNQYSEQELLKCDR--RSYGCN
GGYPWSALQLVAQYG-IHYRNTYPYEGVQRYCRSREKGPYAAKTDGVRQVQPYNCGALLYSIANQPVSVVLQA--
-AGKDFQLYRGGIFVGFCG--NKVDHAVAAVGYGPN----YILIKNSWGTGWNGGYIRIKRGTGWSYGVVCGLYT
SSFYPVKN*
＞P1：DER_P_1_MATURE
sequence：DER_P_1_MATURE：1：：222：：unknown：unknown：-1.00：-1.00
TNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVKCAS---QHGCH
GDTIPRGIEYIQHNG-VVQESYYRYVAREQSCE--RPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQTKSAIAVIIGI
KDLDAFRHYDGRTIIQRLNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGKNGYGYFAANIDLNNIEEYPYV
VIL-----*
使用DSSP程序(见W.Kabsch和C.Sander，Biopolymers 22(1983)2577-2637)测定SEQ ID NO：1中每个氨基氨基酸的表面可接近性，表示为该氨基酸标准值的百分数。按照所建立的方法，使用DSSP程序通过分析螺旋形式20聚体同源肽中氨基酸的平均表面可接近性产生标准值。对于20种不同残基的每一种，平均表面可接近性如下：
  残基  可接近性2
  A   62
  C   92
  D   69
  E   156
  F   123
  G   50
  H   130
  I   84
  K   174
  L   97
  M   103
  N   85
  P   67
  Q   127
  R   211
  S   64
  T   80
  V   81
  W   126
  Y   104
通过计算机程序使用发现于实施例1中的表位模式如下预测Der p1(SEQ ID NO：1)3-维模型上的表位：
(1)对于SEQ ID NO：1中的全部氨基酸，测定是否(a)氨基酸类型与表位模式的第一个氨基酸相匹配和(b)溶剂表面可接近性大于或等于预定值，例如20％。选择满足1(a)和1(b)的那些氨基酸。
(2)对于在步骤1中距离所选氨基酸10距离内的全部氨基酸，检测是否(a)氨基酸类型与所述表位模式的第二个氨基酸相匹配和(b)表面可接近性大于或等于预定值，例如20％。选择满足2(a)和2(b)的那些氨基酸。
(3)对于在步骤2中距离所选氨基酸10距离内的全部氨基酸，检测是否(a)氨基酸类型与所述表位模式的第三个氨基酸相匹配和(b)表面可接近性大于或等于预定值，例如20％。选择那些满足3(a)和3(b)的氨基酸。
(4)对于表位模式中全部氨基酸重复步骤3。而且，设置25的界限作为任意两个表位残基之间的最大距离。
对于全部357个表位模式使用下面的表面可接近性截断值：30、40、50、60、70和80％的每一种进行该步骤。将按照该步骤在SEQ ID NO：1的三维结构上发现匹配的表位模式预测为表位。
最后，对于溶剂可接近性的七种设置的每一种，产生了全部Der p1氨基酸的表格，其中通过将每个氨基酸在表位之一中出现的次数(在该溶剂设置下)相加给出每个氨基酸残基的得分。该得分将指出该氨基酸的修饰(替换、插入、缺失、糖基化或化学缀合)将导致较低抗原性变体的可能性。然后根据该得分对蛋白质全部氨基酸进行排序并且可以选择那些具有最高分值的氨基酸用于诱变。
在每种溶剂可接近性设置下，10％最高得分氨基酸(即22种最高得分氨基酸)显示于下表(然而对于70和80％的溶剂可接近性设置，少于22个残基具有得分，因此在这两种情况下列出了全部得分的残基)。忽略了半胱氨酸，因为它们经常参与维持三维结构。
  最小溶剂可接近性   最高得分10％的氨基酸
  20％   G32，A46，Y47，L55，D64，A66，S67，G73，T75，I80，Q84，N86，G87，A98，R105，Q109，R110，F111，G112，I113
  30％   G30，G32，D64，A66，S67，Q84，N86，G87，Y93，A98，R99，Q101，R105，P106，F111，G112，I113，I158，A205
  40％   G29，G30，G32，L55，A66，S67，Q84，S92，Y93，Y96，A98，R99，E100，Q101，R104，Q109，F111，I113，I144，K145，D146，N163
  50％   G29，G30，G32，S67，R99，E100，I144，K145，D146，D148，R151，I159，Q160，R161，D162，N163，G164，Y165，Q166，A180，V183，D184
  60％   A10，A12，E13，A132，I144，K145，D146，D148，R151，I159，Q160，R161，D162，N163，G164，Y165，Q166，N179，A180，G182，D184，I208
  70％   A10，A12，I144，K145，D146，D148，I159，R161，G164，Y165，Q166，D184，I208
  80％   D146，D148，G164，Y165，Q166
从该过程发现了SEQ ID NO：1的残基A10、A12、E13、G29、G30、G32、A46、Y47、L55、D64、A66、S67、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98、R99、E100、Q101、R104、R105、P106、Q109、R110、F111、G112、I113、A132、I144、K145、D146、D148、R151、I158、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208，每个残基在至少一个溶剂可接近性设置处属于最高排位残基前10％。
SEQ ID NO：1的残基A10、A12、G30、G32、A46、Y47、L55、D64、A66、S67、G87、S92、A98、R99、E100、Q101、R105、R110、F111、G112、I113、I144、K145、D146、D148、R151、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166，每个残基在至少一个溶剂可接近性设置处属于最高排位残基前5％。
通过研究在Der p1三维模型上前10％得分氨基酸的位置，有可能确定分子上包含这些区域的5个表位。然后选择每个区域内50％最高得分氨基酸作为突变的最佳候选者：SEQ ID NO：1的残基A10、A12、G32、L55、A66、S67、G87、A98、R99、F111、G112、I113、I144、D146、D148、I159、R161、G164、Q166、A180、D184、A205和I208。
实施例3：比对组1螨多肽
比对了5种不同天然组1螨前多肽原的序列：
               -90       -80       -70       -60       -50       -40
          --+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+--
Eur_m1    MKIILAIASLLVLSAVYARPASIKTFEEFKKAFNKTYATPEKEEVARKNFLESLKYVESN
Der_f1    MKFVLAIASLLVLSTVYARPASIKTFEEFKKAFNKNYATVEEEEVARKNFLESLKYVEAN
Der_p1    MKIVLAIASLLALSAVYAPPSSIKTFEEYKKAFNKSYATFEDEEAARKNFLESVKYVQSN
Blo_t1    ------------------------------------------------------------
Der_m1    ------------------------------------------------------------
               -30       -20       -10         0         10        20
          --+----+----+----+----+----+----+----+----+-----+----+----+-
Eur_m1    KGAINHLSDLSLDEFKNQFLMNANAFEQLKTQFDLNAETYACSINSVSLPSELDLRSLRT
Der_f1    KGAINHLSDLSLDEFKNRYLMSAEAFEQLKTQFDLNAETSACRINSVNVPSELDLRSLRT
Der_p1    GGAINHLSDLSLDEFKNRFLMSAEAFEHLKTQFDLNAETNACSIN-GNAPAEIDLRQMRT
Blo_t1    ------------------------------------------------IPANFDWRQKTH
Der_m1    --------------------------------------TQACRINSGNVPSELDLRSLRT
                 30        40        50        60                70
          ---+----+----+----+----+----+----+----+----+------------+---
Eur_m1    VTPIRMQGGCGSCWAFSGVASTESAYLAYRNMSLDLAEQELVDCASQN--------GCHG
Der_f1    VTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQH--------GCHG
Der_p1    VTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQH--------GCHG
Blo_t1    VNPIRNQGGCGSCWAFAASSVAETLYAIHRHQNTILSEQELLDCTYHLYDPTYKCHGCQS
Der_m1    VTPIRMQG----------------------------------------------------
               80        90       100        110       120       130
          -+----+----+----+----+----+-----+----+----+----+----+----+--
Eur_m1    DTIPRGIEYIQQNGVVQEHYYPYVAREQSCHR-PNAQRYGLKNYCQISPPDSNKIRQALT
Der_f1    DTIPRGIEYIQQNGVVEERSYPYVAREQRCRR-PNSQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALT
Der_p1    DTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRR-PNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALA
Blo_t1    GMSPEAFKYMKQKGLLEESHYPYKMKLNQCQANARGTRYHVSSYNSLRYRAGDQEIQAAI
Der_m1    ------------------------------------------------------------
               140       150       160       170       180       190
          --+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+--
Eur_m1    QTHTAVAVIIGIKDLNAFRHYDGRTIMQHDNGYQPNYHAVNIVGYGNTQGVDYWIVRNSW
Der_f1    QTHTAIAVIIGIKDLRAFQHYDGRTIIQHDNGYQPNYHAVNIVGYGSTQGDDYWIVRNSW
Der_p1    QTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSW
Blo_t1    MNHGPVVIYIHGTEA-HFRNLRKGILRGAGYNDAQIDHAVVLVGWGTQNGIDYWIVRTSW
Der_m1    ------------------------------------------------------------
               200       210       220
          --+----+----+----+----+----+--
Eur_m1    DTTWGDNGYGYFAANINLMMIEQYPYVVML
Der_f1    DTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM
Der_p1    DTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL
Blo_t1    GTQWGDAGYGFVERHHNSLGINNYPIYASL
Der_m1    ------------------------------
Der p1具有18个氨基酸的信号肽和80个氨基酸的前肽，而成熟Derp1是222个氨基酸的分子。在比对中，在Der p1的8位产生了缺口，因为与其它组1螨多肽相比在该位置缺少一个氨基酸。对Eur m1进行了相似的描述，而对Der fl仅显示了成熟多肽并且对于Der m1仅鉴定了部分序列。
比对证实组1螨多肽之间具有高度同源性和所鉴定的与表位有关的氨基酸中格外高的同源性。因此，似乎可以稳妥地说对于Der p1所建议的表位和由此进行的突变也适合于组1螨多肽的剩余成员。
实施例4：酶变体的构建和表达
通过克隆使用包含预期突变的寡聚体进行PCR所产生的DNA片段(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor，1989)，制备了包含特定替换的本发明Der p1变体。
将其上具有Der p1前肽的重组Der p1和全部变体进行了表达并且它们全部具有S54N突变，该突变破坏成熟序列内唯一的N-糖基化基序。
模板质粒DNA可以是pSteD212，或者该DNA包含Der p1或Der p1变体的类似物。通过oligo定向诱变将突变导入变体结构内。如Becker和Guarente(1991，Methods Enzymology，194：182-187)所描述将Der p1质粒构建体转化入酿酒酵母(S.cerevisiae)，JG169株。
本发明的Cystein蛋白酶或该酶的变体定位于载体pSteD212，该载体来自酵母表达载体pYES 2.0(Kofod等，1994 J.Biol.Chem.269：29182-29189和Christgau等，1994，Biochem.Mol.Biol.Int.33：917-925)。
该质粒在大肠杆菌和酿酒酵母中都能复制。在酿酒酵母中从该质粒表达根据本发明的Der p1或其变体。
实施例5：发酵
在回转式摇床(250转/分钟)上含有100ml SC培养基的500ml带挡板锥形瓶内30℃下发酵5天以产生Der p1酶/Der p1变体。
结果，为了制备例如2升发酵液，同时在20个锥形瓶中进行发酵。
SC培养基(每升)：
不含氨基酸的酵母氮源(Yeast Nitrogen Base)    7.5g
琥珀酸                                       11.3g
不含维生素的酪蛋白氨基酸                     5.6g
色氨酸                                       0.1g
加入H2O。高压灭菌并冷却，然后加入葡萄糖和L-苏氨酸至终浓度分别为4％和0.02％。
对于琼脂平板，高压灭菌之前将20g细菌培养用琼脂加入培养基。
实施例6：筛选Der p1变体
为了筛选表达Der p1或Der p1变体的酵母转化体，将转化液铺在SC琼脂平板上在30℃放置3天以形成菌落。将菌落接种于96微量滴定孔板中，每个孔含有200微升SC培养基。在30℃，以250转/分钟将板发酵5天。
用0.15M磷酸缓冲盐水(PBS)以1∶1稀释50微升培养液，之后用夹心ELISA在OD450测定。将用不含Der p1基因的质粒转化的酵母的培养液用作本底值，其平均OD450值为0.55。将在夹心ELISA中测试的OD450＞0.55的变体进行测序并证实为正确折叠和酵母表达的Der p1变体。
通过夹心ELISA技术用天然Der p1作为标准直接测定培养液中部分变体的浓度。
通过OD450＞0.55和在定量夹心ELISA中所鉴定和确定的Der p1变体(所给浓度为μg/mL)显示于下表。
  变体编号   突变   浓度
  DP003   S54N   11
  DP009   G32E，S54N，A66V   0,2
  DP010   G32D，S54N，A66V   2,9
  DP017   S54N，G87V   0,016
  DP018   S54N，G87E，I113E   0,032
  DP019   S54N，I113V   7,05
  DP020   S54N，G87E，I113V   0,032
  DP021   S54N，I113D   0,032
  DP024   S54N，T75D   5,4
  DP025   S54N，T75A   8
  DP026   S54N，T75V   7,3
  DP033   S54N，D184A   1,62
  DP034   S54N，D184A，A205D   0,027
  DP035   S54N，A205D   0,048
  DP049   A10Y，A12Y，S54N   0,81
  DP050   A10N，A12N，S54N   0,027
  DP054   S54N，I159V   0,97
  DP065   S54N，R99G   3,9
  DP067   S54N，I144L   0,1
  DP068   S54N，R161S   0,1
  DP070   S54N，F111I   0,6
  DP071   S54N，G87V，G112D   1,5
  变体编号   突变 OD450＞0.55
  DP073   G32V，S54N，A66V，S67C，A98G   1,20
  DP074   G32D，S54N，A98V，I144T   1,01
  DP075   S54N，D64N，A66D   0,66
  DP077   A66D，R99G   0,72
  DP078   G32V，S54N，A66G，A98V，R99D   1,15
  DP079   S54N，S67H，A98V   0,69
  DP080   S54N，I144L，D148Y   0,64
  DP081   S54N，I144L，D148N，R161S，G164D   1,10
DP082   S54N，D148N，I159L，R161G，G164D，Q166L 0,62
  DP083   S54N，D148Y，R161S，G164V   0,62
  DP084   S54N，I144V，D148Y，R161G   1,19
  DP085   S54N，D148N，R161S，G164V   1,53
  DP086   S54N，D148H，I159F，R161S，Q166R   1,16
  DP087   S54N，D148H   0,66
  DP088   S54N，A180V   1,12
  DP089   S54N，D184H   1,27
  DP090   S54N，A180G   1,30
  DP091   S54N，A180V，D184H   0,65
  DP092   S54N，A180G，D184N   0,67
  DP094   S54N，L55V，F111W，G112D   1,15
  DP095   S54N，G112V，I113L   1,24
  DP096   S54N，F111I，G112D   1,36
实施例7：前形式和成熟形式Der P1抗原的纯化方法
Der P1和前-Der P1检测测定法
用于Der P1和前-Der P1检测的定量ELISA(酶联免疫吸附测定)。
在兔子中产生针对购自Indoor technologies的天然Der P1的多克隆抗体。如文献中所描述的通过硫酸铵沉淀和蛋白质A柱子纯化多克隆抗体并且最后对50mM硼酸盐pH 8缓冲液透析。
使用NHS-生物素，如Pierce Chemicals 3747 N.Meridian Rd.POBox117.Rockford，1161105 USA所描述的产品说明中所述，用生物素标记针对Der P1的纯化的抗体，并将所标记的抗体用作检测抗体。
快速定性检测Der P1或原Der P1的方法如下。
免疫吸附微量滴定板购自NUNC并用100微升每毫升10微克针对DerP1的未标记多克隆抗体包被微量滴定孔，4摄氏度包被过夜。然后如文献中所描述用PBS Tween缓冲液洗涤微量滴定孔。然后用200微升包含每毫升10毫克BSA和0.05％Tween 20的PBS缓冲液饱和微量滴定孔并且在室温孵育30分钟。
然后用含0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗涤微量滴定孔三次。
然后用100微升包含Der P1或原Der P1的组分包被微量滴定孔并温和振荡孵育20分钟。然后用含0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗涤微量滴定孔三次。然后用100微升以大约1微克每毫升稀释于含0.05％Tween20的PBS缓冲液的生物素标记的多克隆抗体包被微量滴定孔并在室温和振荡孵育20分钟。
然后用PBS缓冲液洗涤微量滴定孔三次并用100微升适当稀释的免疫纯抗生物素蛋白辣根过氧化物酶缀合物(购自Pierce chemicals)进行包被。室温孵育20分钟后用含0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗涤微量滴定孔。
将购自Kem EN Tec的100微升辣根过氧化物酶底物TMB One加入微量滴定孔中并孵育几分钟并如KEM EN TEC所描述通过加入磷酸终止反应。对于空白，进行完全相同的过程，但孔中不含抗原。
该方法能够用作检测Der P1或原DerP1的定性分析。
用于Der P1或原DerP1纯化的方法
将表达于酵母或米曲霉中的Der P1抗原前形式(屋尘螨)的1升发酵上清液进行离心并丢弃含细胞碎片的沉淀。然后将细胞上清液在压力下通过从Pall Corporation(Pall Seitz Schenk Filter system GmbHPianiger Str.137D Cad Kreuznach Germany)得到o.22μ的无菌过滤器Seitz-EKS无菌过滤。
然后使用超滤技术使用购自Millipore Corporation，Bedford.MA01730USA的10kDa截留膜浓缩含有预期蛋白质的无菌过滤细胞上清液：然后通过使用50mM硼酸盐pH 8作为缓冲液透析过滤去除10kDa以下的小分子。
在温和搅拌情况下将固体硫酸铵加入到浓缩且透析过滤的含有预期蛋白质的上清液中至终浓度为1M硫酸铵且将pH调节至8。
在购自Amersham-Pharmacia的50ml XK26柱上进行疏水相互作用层析，该柱子用购自TOSOH Bioscience GmbH Zettacchring 6，70567Stuttgart，德国的Toyopearl Phenyl-650基质填充。
然后用溶于50mM硼酸盐pH 8的1M硫酸铵洗涤并平衡柱子。
然后将浓缩的发酵上清液应用于柱子，流速每分钟20mL。然后用溶于硼酸盐pH 8缓冲液(缓冲液A)的1M硫酸铵洗除未结合物质。当全部未结合物质从柱子上洗掉时，可以使用连接到购自Amesham Pharmacia的部分收集器上的UV检测器监视。
然后用缓冲液B洗脱结合蛋白质，缓冲液B包含不含任意其它盐的50mM硼酸盐pH 8，并收集10ml级分。通过SDS-PAGE检测含有预期蛋白质的级分。然后混合包含分子量在33kDa和22kDa之间的蛋白质并在上述定性实验中发现具有免疫反应性的级分，并进一步通过阴离子交换层析上纯化。
Der P1和原Der P1的阴离子交换层析
用50mM硼酸盐pH 8缓冲液洗涤和平衡由Amersham Pharmacia预装的阴离子交换快速流动Q琼脂糖50ml柱子XK26。
将来自疏水层析的含有Der P1和/或原Der P1的混合物稀释调整至离子强度低于4mSi并且将pH调节至8。然后将该稀释混合物应用于快速流动Q琼脂糖柱，流速为每分钟20ml，并用50mM硼酸盐缓冲液pH 8作为缓冲液A洗涤未结合物质。
使用含有50mM硼酸盐pH 8和1M氯化钠的缓冲液B以线性梯度洗脱结合蛋白质。所使用的总缓冲液为20柱体积。
通过SDS-PAGE和定性ELISA测定分析全部级分。
将分子量大约30kDa的蛋白质合并作为原-Der P1和成熟Der P1，由于观察到稍微加工的蛋白质为20kDa。SDS-PAGE之后分析所纯化蛋白质的N-末端并利用Applied Biosystem设备将其印迹于PVDF膜上。
实施例8：酶变体变应原性的体内评价(MINT测定)
小鼠鼻内(MINT)模型(Robinson等，Fund.Appl.Toxicol.卷34，15-24页，1996)可以用于验证组1螨多肽变体的变应原性。
在实验的第一天和第三天用组1螨多肽变体鼻内施用于小鼠并且此后每周一次施用6周。开始研究后15、31和45天采集血液样品，并且随后血清可以用于分析IgE水平。
通过ELISA测量小鼠血清中特异IgE浓度：
按照以下步骤通过三层夹心ELISA测定来自小鼠的血清样品中特异IgE抗体的相对浓度：
1)用100微升/孔大鼠抗-小鼠IgE重链(以1∶100稀释于0.05M碳酸盐缓冲液pH 9.6的HD-212-85-IgE3)包被ELISA板(Nunc Maxisorp)。4℃孵育过夜。
2)倒空这些孔并用含2％脱脂乳的0.15M PBS缓冲液pH 7.5以200微升/孔在4℃封闭1小时。如前洗涤板子。
3)用小鼠血清稀释液孵育板子(100μL/孔)，以其在含0.5％脱脂乳和0.05％Tween 20的0.15M PBS缓冲液中8-倍稀释液和2-倍稀释液开始。包括阳性和阴性对照血清样品和缓冲液对照的适当稀释液。室温孵育1小时。轻轻振荡。在含0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液中将板子洗涤3次。
4)将以含0.5％脱脂乳和0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液稀释至1μg蛋白质/ml的组1螨多肽变体以100微升/孔加入到板中。在4℃将板孵育1小时。如前洗涤板子。
5)将用于检测结合抗原的特异多克隆抗-组1螨多肽变体抗血清血清(猪)稀释于含0.15％脱脂乳和0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液中。
6)将以1∶1000稀释于含0.5％脱脂乳和0.05％Tween20的0.15MPBS缓冲液中的缀合过氧化物酶的猪抗-兔Ig以100微升/孔加入到板中。在4℃将板孵育1小时。如前洗涤板子。
7)加入100μl/孔TMB(与(即用底物；Kem-En-Tec，目录号：4390A)，并且允许反应进行10分钟。
8)通过加入100微升/孔1M H2SO4终止反应。
9)在450nm处读取板子，以620nm作为参照。
绘制剂量反应曲线，并使用非线性回归拟合为S形曲线，并计算组1螨多肽变体的EC50。
通过ELISA测量小鼠血清中特异IgG1的浓度
按照以下步骤通过三层夹心ELISA测定来自小鼠血清样品中特异IgG1抗体的相对浓度：
1)用在PBS中稀释至10μg/ml的组1螨多肽变体以100微升/孔包被ELISA板(Nunc Maxisorp)。4℃孵育过夜。
2)倒空这些孔并用200微升/孔含2％脱脂乳的0.15M PBS缓冲液pH7.5在4℃封闭1小时。将板子用含0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液洗涤3次。
3)用小鼠血清稀释液孵育板子(100μL/孔)，以其在含0.5％脱脂乳和0.05％Tween 20的0.15M PBS缓冲液中20-倍稀释液和3-倍稀释液开始。包括阳性和阴性对照血清样品和缓冲液对照的适当稀释液。室温孵育1小时。轻轻振荡。如前洗涤板子。
4)将以2000×稀释于含0.5％脱脂乳和0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液中的生物素化大鼠-抗-小鼠IgG1(Serotec，目录号：MCA 336B)以100微升/孔加入到板中。在4℃将板孵育1小时。如前洗涤板子。
5)将以1000×稀释于含0.15％脱脂乳和0.05％Tween20的0.15MPBS缓冲液中的辣根过氧化物酶缀合的链亲和素(Kierkegaard & Perry，目录号：14-30-00)以100微升/孔加入到板中。4℃孵育1小时。如前洗涤板子。
6)加入100μl/孔TMB(和(即用底物；Kem-En-Tec，目录号：4390A)，并且允许反应进行10分钟。
7)通过加入100微升/孔1M H2SO4终止反应。
8)在450nm处读取板子，以620nm作为参照。
绘制剂量反应曲线并使用非线性回归拟合为S形曲线，并计算组1螨多肽变体的EC50。
实施例9：酶变体IgE-抗原性的体外评价
通过直接或竞争ELISA和嗜碱性粒细胞组胺释放体外验证降低的IgE结合。然后通过皮肤针刺针刺试验进一步体内测试具有降低的IgE-抗原性的组1螨多肽变体。
直接ELISA：
使用适当剂量或剂量范围的组1螨多肽过敏原或者用重组组1螨多肽变体过敏原在4℃包被免疫板(Nunc Maxisorp；Nunc-Nalgene)过夜。然后用包含0.05％Tween 20的磷酸缓冲盐溶液(PBS)(PBST)充分洗涤板子，并且用含2％脱脂奶粉(SMP)的PBS封闭剩余的结合位点。然后将来自粉尘虫过敏的患者(基于病史、针刺皮肤针刺试验和确定针对粉尘螨提取物的特异IgE(CAP-RAST测量方法))的血清以1/4稀释于PBST并加入到板中，并在室温(RT)孵育1小时或者4℃孵育过夜。用PBST充分洗涤之后，通过与兔抗-人IgE抗体(DakoCytomation)和偶联辣根过氧化物酶的猪抗兔Ig孵育检测过敏原-IgE复合体。通过加入来自Kem-En-Tec的TMB测定酶活性，并且通过加入等体积0.2M H2SO4终止反应，并且通过在ELISA读数器上测量450nm处的光密度(OD450)定量显色。OD450反映了结合至过敏原的IgE。
首先，用于竞争ELISA的适当供体鉴定为如下：以直接ELISA实验中nDer p1的剂量反应曲线分析从23名粉尘螨过敏原过敏反应患者分离得到的血清中nDer p1-特异IgE-结合。测定了得到500ng/孔过敏原的包被浓度的OD450值，并且OD450没有达到等于或高于0.5的血清不再用于进一步竞争ELISA分析。选择来自供体1、3、6、7、9、13、14、22和23的血清用于竞争ELISA分析。
表1.测定了从23名粉尘螨过敏反应患者分离得到的血清中得到组1螨野生型多肽的包被浓度为500ng/孔时OD450效价，并将值显示于下表。
  nDer p1特异IgE效价
  供体1   0.9741
  供体2   0.1815
  供体3   1.7443
  供体4   0.2672
  供体5   0.2207
  供体6   0.8607
  供体7   1.0819
  供体8   0.2219
  供体9   1.0168
  供体10   0.3519
  供体11   0.4384
  供体12   0.2385
  供体13   1.2593
  供体14   2.3644
  供体15   0.2345
  供体16   0.3490
  供体17   0.1829
  供体18   0.1237
  供体19   0.4820
  供体20   0.1087
  供体21   0.4195
  供体22   1.3897
  供体23   1.9637
在直接ELISA实验中以剂量反应曲线分析从23名粉尘螨过敏原过敏反应患者分离得到的血清中nDer p1-特异IgE-结合。测定了与500ng/孔过敏原的包被浓度相关的OD450值，并且OD450没有达到等于或高于0.5的血清不再用于进一步竞争ELISA分析。基于表x1中所显示的数据，来自选择供体1、3、6、7、9、13、14、22和23的血清用于通过竞争ELISA分析不同变体。来自不同变体浓度的全部剂量反应曲线的数据证实了这种选择(数据未显示)。
竞争ELISA：
如直接ELISA一样进行，具有2个例外：免疫板使用固定浓度(500ng/孔)野生型多肽进行包被，和施用剂量范围的组1螨野生型多肽、重组组1螨多肽野生型或组1螨多肽变体过敏原对来自过敏反应患者的稀释血清进行预孵育。当IgE结合至溶液中的多肽时，结合至板结合野生型多肽的IgE减少，因此降低OD450。使用GraphPad Prism软件解释降低的IgE结合：绘制OD450对变体过敏原剂量的对数曲线，从而产生S形剂量反应曲线拟合。通过使用Prism中四-参数对数(底、顶、log EC50和Hill斜率)S形曲线拟合模型，对用组1螨野生型多肽和变体过敏原孵育所观察的EC50进行比较。结合亲合力的差别表示为获得结合至组1螨野生型多肽的IgE的50％抑制所需变体数量的X-倍增加或降低。
表2：绘制了分离自9名粉尘螨过敏性患者的nDer p1-特异IgE血清中的剂量反应曲线并拟合为S形曲线，并且计算组1螨多肽变体的EC50。
  供体   nDerp1  rec-proDerp1   rec-Derp1   DP019   DP024   DP025   DP026   DP033   DP065   DP071
  1   1  5   2   2   8   2   10   2   3   3
  3   1  2   4   2   11   3   10   3   4   4
  6   1  3   2   1   10   1   5   2   3   3
  7   1  2   2   2   9   1   10   2   4   3
  9   1  2   3   2   10   2   8   2   3   3
  13   1  1   3   2   22   2   39   3   4   4
  14   1  2   1   1   8   1   4   2   2   2
  22   1  1   1   1   9   1   3   2   2   2
  23   1  2   1   1   9   1   9   2   -   2
表3：绘制了分离自6名粉尘螨过敏反应患者的nDer p1-特异IgE血清中的剂量反应曲线并拟合为S形曲线，并且计算组1螨多肽变体的EC50。
  nDer p1   rec-proDerp1   rec-Derp1   DP070
  供体1   1   1   2   46
  供体3   1   2   2   43
  供体7   1   1   2   33
  供体9   1   1   2   26
  供体14   1   2   2   23
  供体23   1   1   2   37
公开于表2和表3中的数据表明与组1螨多肽相比三种变体DP024、DP026和DP070具有高度降低的IgE结合。与nDer p1的反应相比，导入DP024变体的突变使对特异性血清IgE亲合力降低至大约1/8-1/22，导入DP026的突变使对特异性血清IgE亲合力降低至大约1/3-1/39，导入DP070的突变使对特异性血清IgE亲合力降低至大约1/23-1/46。数据进一步表明与nDer p1的反应相比变体DP065和DP071具有降低的IgE结合。
嗜碱性粒细胞组胺释放：
如下进行从嗜碱性白细胞的组胺释放。从每个粉尘螨过敏反应患者抽取肝素化血液(40mL)，贮存于室温，并在24小时内使用。将25微升肝素化血液应用于玻璃纤维包被的微量滴定孔(Reference Laboratory，Copenhagen，丹麦)并与25微升剂量范围野生型多肽、重组野生型、变体过敏原、房尘螨(HDM)提取物或抗-IgE在37℃孵育1小时。在PIPES缓冲液(Reference Laboratory，丹麦)中制备过敏原连续稀释液。之后用水漂洗板并去除干扰物。最后，用荧光分光光度法测量结合至微纤维的组胺。使用以下公式解释结果：
％过敏原诱导的组胺释放＝(过敏原刺激的上清液中组胺-基本值)/(总组胺释放-基本值)×100，
其中，
基本值＝无过敏原刺激物的上清液中自发组胺释放，
并且
总组胺释放＝用2％高氯酸处理后所测定的血液样品中总组胺含量。
特异组胺释放大于10％的认为是阳性。
将上述过程应用于大量组1螨多肽变体过敏原。绘制作为过敏原浓度函数的％组胺释放的曲线(见图1)，并且确定EC50。基于反映诱导组胺释放中的差别的EC50转换至更高浓度，选择了具有降低嗜碱性细胞组胺释放的变体过敏原。
当用组1螨多肽和组1螨多肽变体刺激时，在组胺释放测定中分析了来自23名对粉尘螨过敏的患者和3名阴性供体(使用房尘螨(HDM)提取物(ALK-Abello)刺激时组胺释放阴性)的嗜碱性粒细胞。在23名粉尘螨过敏患者中，发现仅14名患者应答nDer p1刺激而诱导组胺释放，表明大约61％对粉尘螨过敏的患者具有nDer p1-特异IgE抗体(未显示数据)。
公开于图1中的数据显示在一名粉尘螨过敏反应患者的人嗜碱性粒细胞测定中，rec-proDer p1、rec-Der p1和DP070变体诱导组胺释放的潜能。可以看到，与nDer p1、rec-proDer p1和rec-Der p1的释放曲线相比，DP070变体的释放曲线明显偏移到右侧。该偏移表明相对nDer p1，DP070变体诱导组胺释放的潜能降低到大约1/22。在全部14位具有nDer p1-特异IgE介导反应的患者中都发现DP070释放曲线偏移到右侧，相应潜能降低到1/2-1/22。
剩余的9位粉尘螨过敏性患者的嗜碱性粒细胞对使用浓度增加至1.67ug/ml的组1螨多肽的刺激没有反应(数据未显示)。然而，在最高浓度组1螨多肽(20μg/ml)处，观察到来自这些患者的嗜碱性粒细胞的组胺释放。这种在高浓度nDer p1处诱导组胺释放可能是由于商业nDer p1的低水平杂质的原因并因此存在其它粉尘螨过敏原。在应答组1螨多肽变体刺激时，来自这9位患者的嗜碱性粒细胞中没有观察到组胺释放(数据未显示)。
来自3名阴性供体的嗜碱性粒细胞对使用组1螨多肽或组1螨多肽变体刺激没有反应，证明粗提取物没有非特异刺激。
公开于图2中的数据表明如通过组胺释放测定法所测量的IgE抗原性的总体降低。对于9名患者中的每一位中的每种变体，计算了变体EC50值对nDer p1 EC50值的比率。因此，对于用作对照的nDer p1样品，全部供体显示为归一化值1(左列)。包括nDer p1样品的对照系列并作为正常样品处理。该系列的结果显示于最右列，并且表现出相对低的变化性，认为这是相当灵敏的生物反应测定。变体DP024和DP070分别显示大约5和大约6.7的平均提高倍数。另外，在绝大多数供体中，如通过EC50值增加所测量，变体DP071、DP065、DP033和DP026显示基于IgE的抗原性的提高。
嗜碱性粒细胞组胺释放的用途描述于Nolte H、Schiotz O、Skov PS，A new glass microfibre-based histamine analysis for allergy testing inchildren.Results compared with conventional leukocyte histamine releaseassay，skin prick test，bronchial provocation test and RAST.Allergy.1987Ju1；42(5)：366-73；并且描述于：Winther L，Moseholm L，Reimert CM，Stahl Skov P，Kaergaard Poulsen L.Basophil histamine release，IgE，eosinophil counts，ECP，and EPX are related to the severity of symptoms inseasonal allergic rhinitis.Allergy.1999 May；54(5)：436-45。
针刺皮肤针刺试验：
在对组1螨多肽过敏的患者中进行，并且该技术是本领域众所周知的，例如Kronquist等，Clin.Exp.Allergy，2000，卷30，670-676页)。
简而言之，将15μL包含重组野生型或变体过敏原的溶液放置于患者前臂上。之后，用Prick-Lancette(ALK)对皮肤进行针刺。测试位点相距3cm以避免假阳性结果。从重组过敏原最初溶液(例如1mg蛋白质/mL)，在无菌生理盐水溶液中制备成适当连续稀释液(例如从100μg-0.1μg/mL)。根据过敏原浓度选择这些稀释液，这将引起致敏嗜碱性粒细胞显著的组胺释放。已经表明组胺释放测试正性和皮内反应的阈值在相同范围内；并且假定针刺试验的灵敏性是皮内试验的1/102-1/103。使用盐水溶液进行阴性对照测试，并使用例如1mg/mL的组胺进行阳性对照测试。伤痕的直径用作针对变体的过敏原反应性的量度，并且这允许变体过敏原与亲本或天然类型过敏原的比较。
实施例10：评价保留的刺激T细胞的能力
在Lymphoprep(Axix-Shield PoC，挪威)上通过密度梯度离心法纯化来自组1螨多肽过敏患者肝素化血液的淋巴细胞级分，并重悬于AIM-V(Invitrogene)并以2.5×105细胞/孔的细胞密度铺在96孔无菌组织培养板(Nunclon Delta)上。用生长培养基配制野生型组1螨多肽和组1螨多肽变体过敏原的连续稀释液并加入到细胞，同时设置仅含培养基的对照。然后将板子在37℃，5％CO2，100％湿度孵育7天。孵育结束时，通过3[H]-胸苷掺入法测定T细胞增殖。收获前20小时，在每个孔中加入3[H]-胸苷(0.5uCi)。将细胞收获于玻璃纤维过滤器上，并用闪烁计数器测定3[H]-胸苷掺入。增殖表示为一式三份或一式两份孔中3[H]-胸苷掺入的每分钟平均数(cpm)。刺激指数(SI)计算为由过敏原刺激所得cpm和未刺激对照(仅培养基对照)所得cpm的商。在表4中显示了每个供体和一种组1螨多肽变体的SI。供体1-23代表23位粉尘螨过敏患者，而供体24-26代表3名阴性供体。
表4：应答反应组1螨多肽和组1螨多肽变体刺激的T细胞增殖的刺激指数。除非另外在表中声明，用1.0μg/ml组1螨多肽或组1螨多肽变体刺激分析T细胞增殖。
供体1供体2供体3供体4供体5供体6供体7供体8供体9供体10供体11供体12供体13供体14供体15供体16供体17供体18供体19供体20供体21供体22供体23供体24供体25供体26 nDer p1   Rec-proDer 1(0.64μg/ml) Rec-Derp1 DP015 DP019 DP024 DP025   DP026(0.44μg/ml) DP033
  8.93.07.110.427.81.341.31.813.735.94.312.630.942.76.67.03.215.812.22.62.38.83.61.11.03.1   4.01.55.35.31.83.419.50.95.225.81.38.141.19.05.93.12.43.18.61.31.95.03.32.71.96.7   5.01.65.66.743.81.519.80.69.025.28.88.534.013.36.16.13.84.533.71.61.95.53.72.01.522.5   3.90.73.71.11.02.92.70.51.13.40.91.31.65.31.31.76.63.09.81.21.53.12.90.71.60.8   6.6n.da4.8n.d18.20.6n.d0.78.730.711.1n.dn.d14.99.9n.d5.1n.d29.2n.dn.d7.32.6n.d1.45.4   1.90.70.72.19.7D.65.40.51.915.31.99.88.15.95.11.62.91.69.10.40.32.71.11.00.73.3   2.80.21.00.51.70.21.00.20.11.70.72.31.00.71.50.30.60.52.1n.d0.040.50.05n.d0.20.3   2.81.87.83.926.52.77.00.59.413.22.314.133.59.44.06.03.13.523.7n.dn.d8.03.8n.d1.66.7   2.71.44.81.54.05.57.60.52.748.31.25.214.37.82.83.46.13.26.31.22.64.02.11.71.23.1
an.d.未测定
公开于上表中的数据显示组1螨多肽变体能够诱导来自粉尘螨过敏反应患者的原代T细胞增殖。这表明变体能够引发抗体产生所必需的细胞免疫反应。
实施例11：基于人抗-Der p1抗血清的表位作图
筛选实验中用于靶向的对Der p1具有特异性的人IgE珠(抗-Der p1珠)的制备：
将兔抗人IgE(抗-hIgE)抗体共价连接至商业可得的甲苯磺酰基活化的顺磁磁珠上。按照制造商说明失活剩余的连接位点并洗涤磁珠后，用来自Der p1致敏患者的混合血清(血清以3×稀释于稀释缓冲液(PBS pH 6.6))将抗-hIgE-磁珠4℃孵育过夜。用40ml洗涤缓冲液(加入0.05％Tween20的PBS pH6.6)洗涤200微升磁珠3次，然后用添加2％脱脂乳的PBS室温孵育1小时并如前洗涤3次。
从商业可得的噬菌体展示肽库筛选模拟表位：
从商业可得的7mer、限制的7mer或者12mer肽库的噬菌体展示文库(New England Biolabs)分离得到表位模拟肽。用2×1011个文库噬菌体在室温孵育抗-Der p1-磁珠4小时，之后通过充分洗涤去除未结合噬菌体。为了避免结合至单纯磁珠或抗-hIgE抗体的肽的富集，应用了特殊洗脱程序：洗涤之后，首先用添加0.5％脱脂乳的PBS室温孵育磁珠1小时。该额外的洗涤步骤之后，通过用溶于添加了0.5％脱脂乳的PBS的25μM纯化的Der p1孵育从磁珠洗脱噬菌体，再次室温持续1小时。仅该洗脱上清液中的噬菌体进一步进行增殖。使用ER2738细胞首轮筛选之后按照文库制造商的指导(NEB用户手册)扩增所选择的噬菌体。第二轮之后，感染细胞并铺展开以分离噬菌体，随后测试这些噬菌体的结合并测序。
测试结合至血清IgE的噬菌体ELISA：
将溶于100微升包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH 9.0)中的100ng抗-hIgE抗体对96-孔板上4℃包被过夜。用脱脂乳(2(wt/vol)％溶于洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween20，pH6.6)中)室温封闭未占据的结合位点2小时。然后从用血清样品选择性固定化人IgE，所述血清样品用稀释缓冲液(PBS，pH 6.6)稀释50倍至100微升并室温孵育2小时。从用第二轮洗脱液感染的分离细胞获得噬菌体制备物，这些制备物含有展示预测的模拟表位的噬菌体，将所述制备物以不同稀释液采样用于结合。使用小鼠抗M13-噬菌体抗体-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物检测结合的噬菌体，或者当缺乏任意噬菌体制备物检测到与血清的交叉反应时，使用小鼠抗-pIII抗体、绵羊抗-小鼠IgG抗体-HRP夹心检测结合的噬菌体。
序列表
<110>诺和酶股份有限公司
<120>组1螨多肽变体
<130>NZ 10317.000/dk
<160>5
<170>PatentIn版本3.2
<210>1
<211>320
<212>PRT
<213>屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)
<220>
<221>信号
<222>(1)..(18)
<220>
<221>PROPEP
<222>(19)..(98)
<220>
<221>mat_肽
<222>(99)..(320)
<400>1
Met Lys Ile Val Leu Ala Ile Ala Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ala Val
            -95                 -90                 -85
Tyr Ala Arg Pro Ser Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Tyr Lys Lys Ala
        -80                 -75                 -70
Phe Asn Lys Ser Tyr Ala Thr Phe Glu Asp Glu Glu Ala Ma Arg Lys
    -65                 -60                 -55
Asn Phe Leu Glu Ser Val Lys Tyr Val Gln Ser Asn Gly Gly Ala Ile
-50                 -45                 -40                 -35
Asn His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Phe Leu
                -30                 -25                 -20
Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu His Leu Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn
            -15                 -10                 -5
Ala Glu Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile
    -1  1               5                   10
Asp Leu Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly
15                  20                  25                  30
Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala
                35                  40                  45
Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu
            50                  55                  60
Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg
        65                  70                  75
Gly Ile Glu Tyr Ile Gln His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr
    80                  85                  90
Arg Tyr Val Ala Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg
95                  100                 105                 110
Phe Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Val Asn Lys
                115                 120                 125
Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gln Thr His Ser Ala Ile Ala Val Ile Ile
            130                 135                 140
Gly Ile Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile
        145                 150                 155
Ile Gln Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile
    160                 165                 170
Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn
175                 180                 185                 190
Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala
                195                 200                 205
Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile Leu
            210                 215                 220
<210>2
<211>321
<212>PRT
<213>埋内欧螨(Euroglyphus maynei)
<220>
<221>PROPEP
<222>(1)..(98)
<223>含有信号肽的前肽
<220>
<221>mat_肽
<222>(99)..(321)
<400>2
Met Lys Ile Ile Leu Ala Ile Ala Ser Leu Leu Val Leu Ser Ala Val
            -95                 -90                 -85
Tyr Ala Arg Pro Ala Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Phe Lys Lys Ala
        -80                 -75                 -70
Phe Asn Lys Thr Tyr Ala Thr Pro Glu Lys Glu Glu Val Ala Arg Lys
    -65                 -60                 -55
Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys Tyr Val Glu Ser Asn Lys Gly Ala Ile
-50                 -45                 -40                 -35
Asn His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Gln Phe Leu
                -30                 -25                 -20
Met Asn Ala Asn Ala Phe Glu Gln Leu Lys Thr Gln Phe Asp Leu Ash
            -15                 -10                 -5
Ala Glu Thr Tyr Ala Cys Ser Ile Asn Ser Val Ser Leu Pro Ser Glu
    -1  1               5                    10
Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly
15                  20                  25                  30
Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ser Thr Glu Ser
                35                  40                   45
Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Met Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu
            50                  55                  60
Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln Asn Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro
        65                  70                  75
Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Gln Asn Gly Val Val Gln Glu His Tyr
    80                  85                  90
Tyr Pro Tyr Val Ala Arg Glu Gln Ser Cys His Arg Pro Asn Ala Gln
95                  100                 105                 110
Arg Tyr Gly Leu Lys Asn Tyr Cys Gln Ile Ser Pro Pro Asp Ser Asn
                115                 120                 125
Lys Ile Arg Gln Ala Leu Thr Gln Thr His Thr Ala Val Ala Val Ile
            130                 135                 140
Ile Gly Ile Lys Asp Leu Asn Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr
        145                 150                 155
Ile Met Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn
    160                 165                 170
Ile Val Gly Tyr Gly Asn Thr Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg
175                 180                 185                 190
Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala
                195                 200                 205
Ala Asn Ile Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Met
            210                 215                 220
Leu
<210>3
<211>321
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<220>
<221>PROPEP
<222>(1)..(98)
<223>含有信号肽的前肽
<220>
<221>mat_肽
<222>(99)..(321)
<400>3
Met Lys Phe Val Leu Ala Ile Ala Ser Leu Leu Val Leu Ser Thr Val
            -95                 -90                 -85
Tyr Ala Arg Pro Ala Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Phe Lys Lys Ala
        -80                 -75                 -70
Phe Asn Lys Asn Tyr Ala Thr Val Glu Glu Glu Glu Val Ala Arg Lys
    -65                 -60                 -55
Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys Tyr Val Glu Ala Asn Lys Gly Ala Ile
-50                 -45                 -40                 -35
Asn His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Tyr Leu
                -30                 -25                 -20
Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu Gln Leu Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn
            -15                 -10                 -5
Ala Glu Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu
    -1  1               5                   10
Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly
15                  20                  25                  30
Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser
                35                  40                  45
Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu
            50                  55                  60
Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro
        65                  70                  75
Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser
    80                  85                  90
Tyr Pro Tyr Val Ala Arg Glu Gln Arg Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln
95                  100                 105                 110
His Tyr Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys
                115                 120                 125
Gln Ile Arg Glu Ala Leu Thr Gln Thr His Thr Ala Ile Ala Val Ile
            130                 135                 140
Ile Gly Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr
        145                 150                 155
Ile Ile Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn
    160                 165                 170
Ile Val Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Gly Asp Asp Tyr Trp Ile Val Arg
175                 180                 185                 190
Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln
                195                 200                 205
Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile
             210                 215                 220
Met
<210>4
<211>30
<212>PRT
<213>小角尘螨(Dermatophagoides microceras)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(30)
<223>N-末端片段
<400>4
Thr Gln Ala Cys Arg Ile Asn Ser Gly Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp
1               5                   10                  15
Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly
            20                  25                  30
<210>5
<211>221
<212>PRT
<213>热带无爪螨(Blomia tropicalis)
<220>
<221>mat_肽
<222>(1)..(221)
<400>5
Ile Pro Ala Asn Phe Asp Trp Arg Gln Lys Thr His Val Asn Pro Ile
1               5                   10                  15
Arg Asn Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ala Ala Ser Ser
            20                  25                  30
Val Ala Glu Thr Leu Tyr Ala Ile His Arg His Gln Asn Ile Ile Leu
        35                  40                  45
Ser Glu Gln Glu Leu Leu Asp Cys Thr Tyr His Leu Tyr Asp Pro Thr
    50                  55                  60
Tyr Lys Cys His Gly Cys Gln Ser Gly Met Ser Pro Glu Ala Phe Lys
65                  70                  75                  80
Tyr Met Lys Gln Lys Gly Leu Leu Glu Glu Ser His Tyr Pro Tyr Lys
                85                  90                  95
Met Lys Leu Asn Gln Cys Gln Ala Asn Ala Arg Gly Thr Arg Tyr His
            100                 105                 110
Val Ser Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Tyr Arg Ala Gly Asp Gln Glu Ile
        115                 120                 125
Gln Ala Ala Ile Met Asn His Gly Pro Val Val Ile Tyr Ile His Gly
    130                 135                 140
Thr Glu Ala His Phe Arg Asn Leu Arg Lys Gly Ile Leu Arg Gly Ala
145                 150                 155                 160
Gly Tyr Asn Asp Ala Gln Ile Asp His Ala Val Val Leu Val Gly Trp
                165                 170                 175
Gly Thr Gln Asn Gly Ile Asp Tyr Trp Ile Val Arg Thr Ser Trp Gly
            180                 185                 190
Thr Gln Trp Gly Asp Ala Gly Tyr Gly Phe Val Glu Arg His His Asn
        195                 200                 205
Ser Leu Gly Ile Asn Asn Tyr Pro Ile Tyr Ala Ser Leu
    210                 215                 220

Claims (33)

1.亲本组1螨多肽的变体，其中变体的成熟多肽在亲本多肽的如下位置或者相应于如下位置上含有一个或多个突变：SEQ ID NO：1的A10、A12、E13、G29、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、S67、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98、R99、E100、Q101、R104、R105、P106、Q109、R110、F111、G112、I113、A132、I144、K145、D146、D148、R151、I158、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208或成熟Derp1多肽的10、12、13、29、30、32、46、47、54、55、64、66、67、73、75、I80、84、86、87、92、Y93、96、98、99、100、101、104、105、106、109、110、111、112、113、132、144、145、146、148、151、158、159、160、161、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208位。
2.权利要求1的变体，其在亲本多肽的如下位置或者相应于如下位置上含有一个或多个突变：SEQ ID NO：1的A10、A12、G29、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98、E100、Q101、R104、R105、P106、R110、F111、G112、I113、A132、I144、K145、D146、I158，I159、Q160、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、1208或成熟Derp1多肽的10、12、29、30、32、46、47、54、55、64、66、73、75、I80、84、86、87、92、Y93、96、98、100、101、104、105、106、110、111、112、113、132、144、145、146、158、159、160、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208位。
3.权利要求1的变体，其在亲本多肽的如下位置或者相应于如下位置上含有一个或多个突变：SEQ ID NO：1的A10、A12、G29、G30、G32、A46、S54、L55、D64、A66、G73、T75、Q84、N86、G87、S92、Y96、E100、Q101、R104、R105、P106、R110、I113、A132、I144、K145、D146、D162、N163、G164、Y165、N179、A180、G182、V183、D184和A205或成熟Derp1多肽的10、12、29、30、32、46、54、55、64、66、73、75、84、86、87、92、96、100、101、104、105、106、110、113、132、144、145、146、162、163、164、165、179、180、182、183、184和205位。
4.权利要求1-3的变体，与亲本组1螨多肽相比，所述变体具有改变的IgE-抗原性。
5.权利要求4的变体，与亲本组1螨多肽相比，所述变体具有至少相同的T细胞刺激效果。
6.权利要求1-5的变体，与亲本组1螨多肽相比，所述变体在所暴露的包括人的动物中诱导改变的免疫原性应答。
7.权利要求1-6的变体，与亲本组1螨多肽相比，所述变体在人体内诱导改变的免疫原性应答。
8.权利要求1的变体，其在如下位置或者相应于如下位置上含有一个或多个突变：SEQ ID NO：1的A10、A12、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、S67、G87、S92、A98、R99、E100、Q101、R105、R110、F111、G112、I113、I144、K145、D146、D148、R151、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208或成熟Derp1多肽的10、12、30、32、46、47、54、55、64、66、67、87、92、98、99、100、101、105、110、111、112、113、144、145、146、148、151、159、160、161、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208位。
9.权利要求1的变体，其在如下位置或者相应于如下位置上含有一个或多个突变：SEQ ID NO：1的A10、A12、G32、S54、L55、A66、S67、G87、A98、R99、F111、G112、I113、I144、D146、D148、I159、R161、G164、Q166、A180、D184、A205和I208或成熟Derp1多肽的10、12、32、54、55、66、67、87、98、99、111、112、113、144、146、148、159、161、164、166、180、184、205和208位。
10.权利要求1-9的变体，其包含选自以下的突变：
10由选自V、Y、Q、N、E和D的残基替代；
12由选自V、Y、Q、N和F的残基替代；
32由选自V、Y、E、D、N和Q的残基替代；
54由选自N、A、T、V和Q的残基替代；
55由选自V、N和Q的残基替代；
66由选自V、H、Y、D、E、N和Q的残基替代；
67由选自V、H、Y、D、E、N和Q的残基替代；
87由选自V、Y、D和E的残基替代；
98由选自V、N、Q、D或E的残基替代；
99由选自H、Y、V、N、Q、E和D的残基替代；
111由选自V、H、I和W的残基替代；
112由选自V、H、N、Q、E、D和Y的残基替代；
113由选自V、H、N、Q、E、D和Y的残基替代；
144由选自A、G、Y、N、Q或V的残基替代；
146由选自Y、H、V、I、L、N和Q的残基替代；
148由选自Y、V、I和L的残基替代；
159由选自V、Y、A和G的残基替代；
161由选自A、G、V和Y的残基替代；
164由选自V、H和W的残基替代；
166由选自S、W、Y和F的残基替代；
180由选自V、N、Q和Y的残基替代；
184由选自V、M和Y的残基替代；
205由选自V、W和H的残基替代；
208由选自A、G、V、W和H的残基替代；
所述的编号是成熟Derp1多肽位置或对应于成熟Derp1多肽的位置。
11.权利要求10的变体，其包含选自以下的突变：
A10由选自V、Y、Q、N、E和D的残基替代；
A12由选自V、Y、Q、N和F的残基替代；
G32由选自V、Y、E、D、N和Q的残基替代；
L55由选自V、N和Q的残基替代；
S54由选自N、A、T、V和Q的残基替代；
A66由选自V、H、Y、D、E、N和Q的残基替代；
S67由选自V、H、Y、D、E、N和Q的残基替代；
G87由选自V、Y、D和E的残基替代；
A98由选自V、N、Q、D或E的残基替代；
R99由选自H、Y、V、N、Q、E和D的残基替代；
F111由选自V、H、I和W的残基替代；
G112由选自V、H、N、Q、E、D和Y的残基替代；
I113由选自V、H、N、Q、E、D和Y的残基替代；
I144由选自A、G、Y、N、Q或V的残基替代；
D146由选自Y、H、V、I、L、N和Q的残基替代；
D148由选自Y、V、I和L的残基替代；
I159由选自V、Y、A和G的残基替代；
R161由选自A、G、V和Y的残基替代；
G164由选自V、H和W的残基替代；
Q166由选自S、W、Y和F的残基替代；
A180由选自V、N、Q和Y的残基替代；
D184由选自V、M和Y的残基替代；
A205由选自V、W和H的残基替代；
I208由选自A、G、V、W和H的残基替代；
所述的编号是SEQ ID NO：1的位置或对应SEQ ID NO：1的位置。
12.权利要求1-11的变体，其中亲本组1螨多肽在其成熟形式中含有与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的序列。
13.权利要求1-11的变体，其中亲本组1螨多肽在其成熟形式中含有与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性的序列。
14.权利要求1-11的变体，其中亲本组1螨多肽在其成熟形式中含有与SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的序列。
15.权利要求1-11的变体，其中亲本组1螨多肽在其成熟形式中含有与Derm1具有至少80％同一性的序列。
16.权利要求1-11的变体，其中亲本组1螨多肽在其成熟形式中含有与SEQ ID NO：5具有至少80％同一性的序列。
17.权利要求1-16的变体，其中亲本组1螨多肽的突变包括一种大小氨基酸替换为不同大小的氨基酸、一种亲水性氨基酸替换为不同亲水性氨基酸、一种极性氨基酸替换为不同极性氨基酸或者一种酸性氨基酸替换为不同酸性氨基酸。
18.权利要求1-17的变体，其中亲本组1螨多肽的突变包括插入一个或多个用于缀合聚合物的附着基团。
19.权利要求1-17的变体，其中亲本组1螨多肽的突变包括插入一个或多个额外的糖基化位点。
20.权利要求1-19的变体，其中亲本组1螨多肽是天然组1螨多肽。
21.核苷酸序列，其编码权利要求1-20的变体。
22.核苷酸构建体，其包含权利要求21的核苷酸序列，该核苷酸序列有效连接至指导宿主细胞中变体产生的一条或多条控制序列。
23.重组表达载体，其包含权利要求22的核苷酸构建体。
24.重组宿主细胞，其包含权利要求22的核苷酸构建体。
25.制备权利要求1-20的变体的方法，其包括：
(a)在有助于产生所述变体的条件下培养权利要求24的重组宿主细胞和
(b)回收所述变体。
26.组合物，其含有权利要求1-20的变体和可药用载体或佐剂或它们的组合。
27.权利要求26的组合物，其中载体或佐剂选自盐水、甘油、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、皂苷、基于鲨烯的乳剂、单磷酰脂质A、合成的单磷酰脂质A模拟物、聚丙交酯共乙交酯(PLG)颗粒、ISCOMS、脂质体、壳聚糖、细菌DNA。
28.制备权利要求26的组合物的方法，其包括将权利要求1-20的变体与可药用载体或佐剂或它们的混合物相混合。
29.权利要求1-20的变体或权利要求26的组合物的用途，用作药物。
30.权利要求1-20的变体或权利要求26的组合物的用途，用于制备治疗免疫疾病的药物。
31.权利要求1-20的变体或权利要求26的组合物的用途，用于治疗疾病。
32.权利要求1-20的变体或权利要求26的组合物的用途，用于治疗免疫疾病。
33.权利要求30或32的用途，其中免疫疾病是人类的过敏反应。
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