CN108265059A - 一种重组粉尘螨2类变应原蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

一种重组粉尘螨2类变应原蛋白及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组粉尘螨2类变应原及其编码基因和制备方法，发明人将Der f2基因在毕赤酵母表达系统中进行了优化，并在分子设计时加入了提高Der f2表达的作用原件。经过基因优化后Der f2与现有技术相比具有更高的表达量，且经过本专利纯化工艺获得的重组Der f2与天然蛋白相比具有相似的生物学活性。

Description

一种重组粉尘螨2类变应原蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组粉尘螨2类变应原及其编码基因和表达纯化方法。
背景技术
尘螨种类繁多，广泛存在于人类生活和工作环境中，其排泄物、代谢物及螨体均具有较强的变应原型，据统计全球约10％的人口尘螨过敏，约80％的外源性哮喘由尘螨引起。
目前，临床上主要采用尘螨变应原粗提液治疗尘螨引起的变态反应性疾病，例如2006年上市的浙江我武生物的“畅迪”粉尘螨滴剂即为粉尘螨代谢培养物的提取液。尘螨变应原主要存在于排泄物和螨体中，采用提取方法耗时长，过程繁琐，成本较高；此外天然变应原提取液的组成非常复杂，恒定其组分非常困难，且容易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染。长期使用尘螨变应原粗提液易导致红晕、肿胀、硬结、坏死等局部反应和休克、水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应。此外，采用粗提液进行诊断，无法明确患者对变应原各组分的反应程度，易致误诊。
变应原的质量对变态反应疾病的诊断和治疗至关重要，用于免疫诊治的变应原应该是纯品而不宜为粗提取液。重组变应原与粗提液相比具有以下优势：(1)重组变应原具有更高的纯度，与粗提液相比不含非变应原成分、酶类、酶抑制剂和毒性蛋白等；(2)重组蛋白成分单一、具有较好的特异性，粗提液中成分复杂，患者可能只与其中部分成分反应，特异性差；(3)重组变应原与天然提取液相比减少了IgE结合的抗原表位，有效降低IgE介导的过敏反应，同时保留变应原T细胞识别所必须的结构域，具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，提高脱敏治疗的效果。
尘螨变应原组成复杂，约有30余种，其中1类和2类变应原是最主要的变应原组分。在尘螨过敏患者血清中，70-80％的患者的IgE结合粉尘螨的2类变应原(Der f2)，并呈现强阳性反应。Der f2前体由146个氨基酸组成，经过去除信号肽加工处理后为129个氨基酸，分子量为14KD，无糖基化位点。目前针对Der f2重组表达比较具有代表性的是胡友莹等2011年在原核表达系统中进行的研究，以及2012年崔玉宝等申请的“一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法”(中国专利号：CN102676568A)，但原核表达系统无翻译后修饰的功能，得到的Der f2蛋白结构不正确，与血清反应性较弱，且后期分离纯化困难。
发明内容
为了克服以上缺点，发明人将Der f2基因在毕赤酵母表达系统中进行了优化，并在分子设计时加入了提高Der f2表达的作用原件，发明人惊喜地发现，经过基因优化后Derf2与现有技术相比具有更高的表达量，且与天然蛋白相比具有相似的生物学活性。
本发明的一个目的是提供一种编码Der f2蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ IDNO:1所示。该序列针对毕赤酵母表达系统进行了密码子优化，其更利于Der f2在毕赤酵母中表达。
本发明的另一个目的是提供一种Der f2蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明的另一个目的是提供一种含有上述编码优化后Der f2基因的载体，优选的，所述的载体为pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZ A、B、C或pGAPZ A、B、C，更优选为pPIC3.5K，pPICZ A或pGAPZ A。
本发明的另一个目的是提供一种包含上述所述载体的毕赤酵母菌株，优选的，所述毕赤酵母菌株为SMD1168、GS115、KM71、X33或KM71H，更优选为KM71或X-33菌株。
作为优选，编码Der f2蛋白的DNA序列与毕赤酵母上AOX1的ATG仅相差242bp；编码Der f2蛋白的DNA序列前加入Kozak序列GCCACCATGG。
本发明的另一个目的是提供一种Der f2蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：
A.构建含有上述编码Der f2基因的载体；
B.将步骤A的载体线性化后转入毕赤酵母菌株中，并在合适的条件下培养；
C.回收纯化蛋白质。
上述所述载体优选为pPIC3.5K，pPICZ A或pGAPZ A。
上述所述毕赤酵母菌株优选为KM71或X33菌株。
更优选的，上述所述载体为pPICZA，并且上述所述毕赤酵母菌株为X33菌株。
本发明的另一个目的是提供一种重组Der f2蛋白纯化方法，所述纯化方法如下：
A.将Der f2发酵液低温高速离心收集上清，50mM乙酸钠，pH＝4.0缓冲液超滤，0.45μm滤膜过滤。
B.第一步阳离子层析，用平衡缓冲液平衡层析柱，接着运用纯化系统将步骤A中预处理的发酵液通过分离填料，然后运用洗脱缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰，平衡缓冲液为50mM乙酸钠，pH＝4.0，洗脱缓冲液为50mM乙酸钠，1.0M氯化钠，pH＝4.0。
C.第二步首先将B中收集得到的Der f2蛋白峰用20mM磷酸盐，pH＝6.0溶液超滤，平衡缓冲液平衡层析柱，将超滤的Der f2蛋白溶液上阴离子层析填料，收集穿透峰，平衡缓冲液为20mM磷酸盐，pH＝6.0。
D.第三步将C中穿透峰加入硫酸铵至终浓度1.5M，pH＝6.0，平衡缓冲液平衡层析柱，Der f2样品上疏水层析填料，洗脱缓冲液梯度洗脱，平衡缓冲液为1.5M硫酸铵，20mM磷酸盐，pH＝6.0，洗脱缓冲液为20mM磷酸盐，pH＝6.0。
本发明的另一个目的是提供重组Der f2蛋白在制备治疗尘螨变态反应性疾病药物中的应用。所述变态反应性疾病为过敏性鼻炎、过敏性哮喘等。
本发明的重组Der f2蛋白具有较高的表达量，且与天然蛋白具有相似的生物学活性。
附图说明
图1表示优化前后重组Der f2基因序列对比图。
其中优化前序列对应的为天然Der f2基因核苷酸序列；优化后序列对应的为本发明的重组Der f2的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。
图2-a，图2-b为优化前后Der f2基因在毕赤酵母表达系统中的CAI指数。
其中，图2-a表示天然Der f2基因核苷酸序列在毕赤酵母表达系统中CAI指数经程序计算为0.80；图2-b表示优化后的本发明的Der f2密码子在毕赤酵母表达系统中CAI指数经程序计算为0.90。
图3-a，3-b为密码子优化前后Der f2基因在毕赤酵母表达宿主中最优密码子频率分布区域图。
其中图3-a表示Der f2天然基因核苷酸序列在毕赤酵母系统中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：Der f2天然基因核苷酸序列的低利用率密码子出现百分比为5％；图3-b表示优化后的本发明的Der f2密码子在毕赤酵母系统中最优密码子频率分布区域图，优化后的本发明的Der f2密码子序列低利用率密码子出现为0。
图4-a，4-b为密码子优化前后Der f2基因在毕赤酵母表达系统中平均GC碱基含量分布区域图。
其中，图4-a表示Der f2天然基因核苷酸序列在毕赤酵母表达系统中平均GC碱基含量为：39.37％；图4-b表示优化后的本发明的Der f2密码子在毕赤酵母表达系统中平均GC碱基含量为：44.93％。
图5为密码子优化后Der f2基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
其中，泳道1为500bp DNA Ladder；泳道2为两端含有EcoRI和XhoI酶切位点的重组Der f2基因PCR产物。
图6为密码子优化后Der f2表达质粒pPICZ-Der f2构建过程图。
图7为密码子优化后Der f2基因在宿主工程菌中的表达鉴定图。
其中，图7-a为密码子优化后Der f2基因宿主工程菌株通过甲醇诱导表达一周后，菌液上清SDS-PAGE凝胶电泳图。其中泳道2为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker；其余泳道为通过Zeocin筛选出来的Der f2基因各阳性单克隆宿主工程菌株培养菌液上清。
图7-b为密码子优化后Der f2基因宿主工程菌株通过甲醇诱导表达一周后，菌液上清蛋白免疫印迹图。其中泳道1为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker；泳道2-9为通过Zeocin筛选出来的Der f2基因各阳性单克隆宿主工程菌株培养菌液上清。
图8为Der f2发酵液上清第一步阳离子层析色谱图和凝胶电泳图。
其中，图8-a为Der f2发酵液上清第一步阳离子层析色谱图；图8-b为Der f2发酵液上清第一步阳离子层析纯化鉴定结果，泳道1为11-100KD非预染蛋白Marker，泳道2为Derf2发酵液纯化前上清，泳道3为穿透液，泳道4-10为各洗脱分管。
图9为Der f2蛋白第二步阴离子层析色谱图和凝胶电泳图。
其中，图9-a为Der f2蛋白阴离子层析色谱图；图9-b为Der f2蛋白上清阴离子层析纯化鉴定结果，泳道2为11-100KD非预染蛋白Marker，泳道1为Der f2蛋白纯化前上清，泳道2为穿透液，泳道3-6为各洗脱分管。
图10为Der f2蛋白第三步疏层析色谱图和凝胶电泳图。
其中，图10-a为Der f2蛋白第三步疏水层析色谱图；图10-b为Der f2蛋白疏水层析纯化鉴定结果，泳道1为Der f2疏水层析纯化前蛋白，泳道2为Der f2疏水层析穿透液，泳道3为11-100KD非预染蛋白Marker，泳道4-10为各洗脱分管。
图11为Der f2蛋白N端氨基酸测序结果。
图12为重组Der f2与天然Der f2比较与血清反应性，其中nDer f2表示天然Derf2蛋白，rDer f2表示重组Der f2蛋白，NC为pH＝7.4PBS溶液。
图13为PCR扩增GAP基因琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为250bp DNA Ladder，泳道2为GAP基因。
图14为PCR鉴定GAP基因T载体阳性克隆琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为250bpDNA Ladder，泳道2-11为蓝白斑筛选获得的阳性克隆，泳道12为蓝白斑筛选获得的阴性克隆。
图15为PCR扩增Der f2基因琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为500bp DNA Ladder，泳道2为Der f2基因。
图16为PCR鉴定Der f2基因T载体克隆琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为500bp DNALadder，泳道2-10为蓝白斑筛选获得的阳性克隆，仅有泳道9，10为阳性克隆，其余为假阳性，泳道17为阳性对照(Der f2基因)。
图17为标准质粒扩增曲线图。
其中图17-a为T-GAP标准质粒扩增曲线图，图17-b为T-Der f2标准质粒扩增曲线图。
图18为标准质粒熔解曲线图。
其中图18-a为T-GAP标准质粒熔解曲线图，图18-b为T-Der f2标准质粒熔解曲线图。
图19为标准质粒标准曲线图。
其中图19-a为T-GAP标准质粒标准曲线图，图19-b为T-Der f2标准质粒标准曲线图。
图20为待测样品扩增曲线图。
其中图20-a为待测样品以GAP-1，GAP-2引物扩增时得到的扩增曲线图，图20-b为待测样品以5’AOX，3’AOX引物扩增得到的扩增曲线图。
图21为待测样品熔解曲线图。
其中图21-a为待测样品以GAP-1，GAP-2引物扩增时得到的熔解曲线图，图21-b为待测样品以5’AOX，3’AOX引物扩增得到的熔解曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1重组Der f2密码子优化
发明人根据GenBank已公开的Der f2的DNA序列(GenBank登录号：EF139432.1)，如SEQ ID No：2所示，对该基因进行密码子优化后得到本发明的Der f2基因，核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。下面是对Der f2密码子优化前后各参数对比如下：
1.密码子适应指数(CAI)
由图2-a可知，密码子没有优化前，Der f2原始基因在毕赤酵母表达系统中密码子适应指数(CAI)为0.80。由图2-b可知，通过密码子优化，Der f2基因在毕赤酵母表达系统中CAI指数为0.90。通常CAI＝1时被认为该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差，因此可以看出经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高Der f2基因在毕赤酵母表达系统中的表达水平。
2.最优密码子使用频率(FOP)
由图3-a可知，基于毕赤酵母表达载体，密码子没有优化前，Der f2基因序列的低利用率密码子(利用率低于40％的密码子)出现百分比为5％。这条未进行优化的基因采用串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-b可知，通过密码子优化后，Der f2基因在毕赤酵母系统中出现低利用率密码子的频率为0。
3.GC碱基含量(GC curve)
GC含量理想分布区域为30％-70％，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a、图4-b的Der f2基因的GC碱基平均含量分布区域图对比可知，由图4-a中显示Der f2基因GC碱基平均含量为39.37％，由图4-b中显示出优化后去除在30％-70％区域外出现的GC含量峰值，最终得到优化后Der f2的GC碱基平均含量为44.93％。
实施例2：含有重组Der f2基因的表达质粒构建
将密码子优化后的Der f2在5’端引入EcoRI酶切位点序列，在3’端引入XhoI酶切位点序列，并进行全基因合成，将合成的基因片段，构建到pUC57质粒(由南京金斯瑞科技有限公司提供)中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-Der f2质粒。
以pUC57-Der f2质粒为模板，进行PCR扩增，所用引物序列如下：
上游引物(SEQ ID No：4)：
M13F:TGT AAA ACG ACG GCC AGT
下游引物(SEQ ID No：5)：
M13R:CAG GAA ACA GCT ATG AC
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶为Q5(#M0491L，购自New England BioLabs公司)，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃5秒、55℃45秒、72℃30秒，25个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(bp)一致(结果如图5所示)。分别用EcoRI(#R0101S，购自NewEngland BioLabs公司)和Xho I(#R0189S，购自New England BioLabs公司)双酶切后，1％琼脂糖电泳，得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒(DP214，购自北京天根生化科技有限公司)纯化。用T4连接酶(#M0202S，购自New England BioLabs公司)连接到pPICZ A质粒(购自Invitrogen公司)中，转化到DH5α感受态细胞(CB101，购自北京天根生化科技有限公司)中，在含有博来霉素(购自Invitrogen公司)的LB固体培养基中37℃培养过夜。第二天挑取阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到Der f2密码子优化后的表达质粒，记为pPICZ-Der f2(质粒构建如图6所示)。
实施例3：含有重组Der f2基因不同毕赤酵母宿主工程菌株的构建
YPDS固体培养基配制：Invitrogen公司Easy SelectPichia Expression Kit说明书提供，其中酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂糖15g/L，山梨醇182g/L。
按照Invitrogen公司Easy SelectPichia Expression Kit说明书的方法制备成电感受态细胞。将实施例2得到的质粒pPICZ-Der f2，用Sac I限制性内切酶(#R0156S，购自New England Biolabs)酶切线性化，乙醇沉淀后将线性化载体，电转化毕赤酵母X33感受态细胞中，涂布于YPDS固体培养基，30℃培养直到转化子长出。
实施例4：含有密码子优化后重组Der f2基因工程菌株诱导表达及鉴定
BMGY培养基配制：Invitrogen公司Easy SelectPichia Expression Kit说明书提供，其中酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43g/L，KH2PO411.8g/L，YNB 13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甘油10g/L。
BMMY培养基配制：Invitrogen公司Easy SelectPichia Expression Kit说明书提供，其中酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43g/L，KH2PO411.8g/L，YNB13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇5mL/L。
密码子优化后Der f2工程菌株甲醇诱导表达
挑取实施例3获得的宿主单克隆工程菌于5mL BMGY培养基中，于50mL无菌离心管中30℃，220rpm培养，至OD600＝1.0-2.0时，取1mL保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移到BMMY中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％。一周后，离心收集菌液上清，通过SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析，观察表达产物条带亮度，图7-a，图7-b为含有Derf2基因工程菌株诱导表达鉴定图。由图7-a和图7-b可知，Der f2蛋白在工程菌株中得到了显著表达。
实施例5：重组Der f2蛋白的纯化
本专利构建的Der f2，主要采用离子交换，疏水层析纯化方法。层析填料选择为HiTrapSP FF，HiTrap Q FF，HiTrap Phenyl HP，具体步骤如下：
1.发酵液的除杂预处理
按实施例4得到Der f2宿主工程菌株发酵液，12000rpm，15min低温离心收集上清，50mM乙酸钠，pH＝4.0平衡缓冲液超滤换液，0.45μm滤膜过滤即得处理后发酵液上清，可进行层析纯化。
2.阳离子交换层析
将上一步处理的发酵液上SP FF阳离子交换层析柱，平衡缓冲液为50mM乙酸钠，pH＝4.0，洗脱缓冲液为50mM乙酸钠，1.0M NaCl，pH＝4.0，按照12％，25％，100％等度洗脱，样品峰主要集中在25％洗脱峰，图8-a为Der f2离子交换纯化色谱图，图8-b为Der f2离子交换层析后SDS-PAGE分析图。
3.阴离子交换层析
收集上一步纯化的Der f2蛋白峰，样品用20mM NaH2PO4，pH＝6.0溶液超滤，上HiTrapQ FF层析填料，平衡缓冲液为20mM NaH2PO4，pH＝6.0，洗脱缓冲液为20mM NaH2PO4，1.0M NaCl，pH＝6.0，收集Der f2穿透峰，图9为Der f2蛋白穿透峰。
4.疏水层析
收集阴离子交换层析Der f2穿透峰，加入硫酸铵至终浓度为1.5M，上述处理后的发酵液上清上Phenyl HP层析柱，平衡缓冲液为20mM NaH2PO4，1.5M(NH4)2SO4，pH＝6.0，
洗脱缓冲液为20mM NaH2PO4，pH＝6.0，按照25％，50％，70％，100％等度洗脱，Derf2蛋白主要集中在75％洗脱峰，图10-a为Der f2疏水层析纯化色谱图，图10-b为Der f2疏水层析SDS-PAGE分析图。经进一步测算可知，每升发酵液目的蛋白产量高达200mg以上。
实施例6：重组Der f2N端氨基酸序列分析
蛋白质多肽类药物分子N端序列的测定是医药工业质量控制的重要环节之一。本试验主要采用基于经典的Edman降解法的N端序列分析，利用岛津全自动蛋白质多肽测序仪(PPSQ-33A，SHIMADZU)对实施例5纯化后收集得到的Der f2蛋白的N端序列进行分析，结果由图11所示，N端前五个氨基酸为DQVDV，这表明我们构建和表达纯化的重组Der f2蛋白的N端前五个氨基酸序列与天然蛋白完全一致。
实施例7：重组Der f2蛋白活性的分析
将纯化得到的Der f2蛋白用pH＝7.4PBS缓冲液透析，BCA蛋白浓度测定试剂盒(Cat No:23225，购自Pierce公司)测定蛋白浓度，倍比稀释至250ng，125ng，62.5ng，31.25ng，15.625ng，与天然蛋白比较与粉尘螨病人血清反应性；图12所示为重组Der f2(rDer f2)和天然Der f2(nDer f2，购自Indoor公司)，结果说明重组Der f2与天然Der f2相比与血清反应性基本一致，说明重组Der f2与天然蛋白相比具有相似的生物学活性。
实施例8：重组Der f2工程菌株基因拷贝数的测定
1.接种X33菌株：于YPD培养基中培养24h，基因组提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)提取X33基因组，以X33基因组为模板，GAP-1,GAP-2引物扩增GAP基因，所用引物序列如下：
上游引物(SEQ ID No：6)
GAP-1：GGTATTAACGGTTTCGGACGTATTG
下游引物(SEQ ID No：7)
GAP-2：GATGTTGACAGGGTCTCTCTCTTGG
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶为Taq DNA Polymerase(#M0267S，购自New England BioLabs公司)，2U/μL，加0.5μL。反应条件为94℃10分钟，94℃30秒、55℃30秒、68℃30秒，68℃5分钟，30个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(400bp)一致(结果如图13所示)。得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒(DP214，购自北京天根生化科技有限公司)纯化，连接到pGM-T载体试剂盒(VT202-01，购自北京天根生化科技有限公司)中，转化到Top10感受态细胞(CB104，购自北京天根生化科技有限公司)中，在蓝白斑筛选培养基上37℃培养过夜。第二天挑取白色克隆菌PCR鉴定，所用引物为GAP-1，GAP-2，PCR反应条件与上述条件一致，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(400bp)一致(结果如图14所示)，取阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，比对，与预期序列完全一致，即得到GAP基因的T载体克隆，记为T-GAP，接种测序正确的T-GAP克隆于LB液体培养基37℃培养过夜，抽提质粒(质粒小提试剂盒DP103，购自北京天根生化科技有限公司)，即得到作为实时定量PCR的标准质粒。
2.以实施例2中pPICZ-Der f2质粒为模板，5’AOX，3’AOX引物扩增Der f2基因，所用引物序列如下：
上游引物(SEQ ID No：8)：
5’AOX:GACTGGTTCCAATTGACAAGC
下游引物(SEQ ID No：9)：
3’AOX:GGCAAATGGCATTCTGACAT
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶为Taq DNA Polymerase(#M0267S，购自New England BioLabs公司)，2U/μL，加0.5μL。反应条件为94℃10分钟，94℃30秒、49℃30秒、68℃60秒，68℃5分钟，30个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(750bp)一致(结果如图15所示)。得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒(DP214，购自北京天根生化科技有限公司)纯化，连接到pGM-T载体试剂盒(VT202-01，购自北京天根生化科技有限公司)中，转化到Top10感受态细胞(CB104，购自北京天根生化科技有限公司)中，在蓝白斑筛选培养基上37℃培养过夜。第二天挑取白色克隆菌PCR鉴定，所用引物为5’AOX，3’AOX，PCR反应条件与上述条件一致，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(750bp)一致(结果如图16所示)，取阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，比对，与预期序列完全一致，即得到Der f2的T载体克隆，记为T-Der f2，接种测序正确的T-Derf2克隆于LB液体培养基37℃培养过夜，抽提质粒(质粒小提试剂盒DP103，购自北京天根生化科技有限公司)，即得到作为实时定量PCR的标准质粒。
3.基因拷贝数的计算：
微量核酸分析仪(Nanodrop2000，购自ThermoFisher公司)测定标准质粒浓度(ng/μL)。根据以下公式计算GAP和Der f2的拷贝数：
Copies/u＝(6.02×1023)×(ng/μl×10-9)/(DNA length×660)
4.待测样品处理
接种pPICZ-Der f2-X33工程菌株于YPD液体培养基中30℃培养过夜，第二天抽提基因组，并用微量核酸定量仪测定其浓度(ng/μL)及纯度。
5.标准曲线的建立
将已知拷贝数的标准质粒T-GAP和T-Der f2分别梯度稀释至108，107，106，105，104，
103copies/μL，分别以GAP-1和GAP-2、5’AOX和3’AOX为引物进行荧光定量PCR，图17-a为T-GAP标准质粒扩增曲线图，17-b为T-Der f2标准质粒扩增曲线图，图18-a为T-GAP标准质粒熔解曲线图，18-b为T-Der f2标准质粒熔解曲线图，每个梯度重复测定3次，以验证标准曲线的重复性,以Ct值为纵坐标、起始模板拷贝数为横坐标建立标准曲线，图19-a为T-GAP标准质粒的的标准曲线图，图19-b为T-Der f2标准质粒的的标准曲线图。
6.Der f2基因在重组工程菌株中的拷贝数测定
取抽提的pPICZ-Der f2-X33基因组样品，将其依次进行10倍稀释，得到原液、10-1、10-2、10-3四个梯度。以GAP-1和GAP-2、5’AOX和3’AOX为引物进行荧光定量PCR，每个梯度重复测定3次，图20-a为以GAP-1，GAP-2为引物待测样品的扩增曲线图，图20-b为以5’AOX和3’AOX为引物待测样品的扩增曲线图，图21-a为以GAP-1，GAP-2为引物待测样品的熔解曲线图，图21-b为以5’AOX和3’AOX为引物待测样品的熔解曲线图。GAP基因在毕赤酵母中以单拷贝的形式存在，因此用GAP基因的拷贝数可以表征模板中基因组的起始拷贝数，Der f2基因的拷贝数于GAP基因的拷贝数比值即为Der f2基因在毕赤酵母基因组中的起始拷贝数；表1所示为Der f2基因在毕赤酵母基因工程菌株中拷贝数检测结果，测定的拷贝数在5.58-6.42之间，消除系统误差取平均值，最终确定Der f2基因在重组工程菌株中的拷贝数为6。
表1.实时荧光定量PCR法检测Der f2在基因组中拷贝数结果
实施例9：Der f2基因组中作用原件的分析
毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整体整合于染色体中以实现外源基因的表达；典型的毕赤酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括AOX启动子、多克隆位点、转录终止和polyA姓曾基因序列(TT)、筛选标记等。启动子是基因表达调控的顺式原件，也是基因工程表达载体的重要原件，启动子在转录水平上的重要作用决定了基因的表达水平。
按照实施例8中方法提取Der f2基因组，按照实施例8步骤2中方法从基因组中扩增得到Der f2基因，以5’AOX和3’AOX为引物，送样到南京金斯瑞生物科技有限公司测定Derf2基因插入基因组中前后位置的作用原件。基因组测序结果表明Der f2基因表达框架在毕赤酵母染色体中的整合方式为单一交叉插入，使得Der f2基因可利用酵母染色体上的AOX启动子进行基因表达，因此表达量更高。
通常外源编码序列的第一个ATG与AOX1的ATG距离越近、表达效果越好；在基因构建时发明人选用了与AOX1的ATG距离最近的酶切位点，通过基因组测序发现Der f2基因与AOX1的ATG仅相差242bp；此外在Der f2基因前加入Kozak序列GCCACCATGG，在真核生物中极大地提高转录和翻译效率，提高Der f2基因的表达效率。
序列表
<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 常州京森生物医药研究所有限公司
<120> 一种重组粉尘螨2类变应原蛋白及其制备方法与应用
<130> 一种重组粉尘螨2类变应原蛋白及其制备方法与应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 444
<212> DNA
<213> Dermatophagoides farinae
<400> 1
atgatctcta agatcttgtg tttgtctttg ttggttgctg ctgttgttgc tgaccaggtt 60
gacgttaagg actgtgctaa caacgagatc aagaaagtta tggttgacgg ttgtcacggt 120
tccgacccat gtattattca cagaggtaag ccattcactt tggaggcttt gttcgacgct 180
aaccagaaca ctaagactgc taagatcgag attaaggctt ccttggacgg tttggagatt 240
gacgttccag gtatcgacac taacgcttgt cactttatga agtgtccatt ggttaagggt 300
cagcagtacg acatcaagta cacttggaat gttccaaaga tcgctccaaa gtccgagaac 360
gttgttgtta ctgttaagtt gatcggtgac aacggtgttt tggcttgtgc tattgctact 420
cacggtaaga tcagagatta atag 444
<210> 2
<211> 441
<212> DNA
<213> Dermatophagoides farinae
<400> 2
atgatttcca aaatcttgtg cctttcattg ttggtagcag ccgttgttgc cgatcaagtc 60
gatgttaaag attgtgccaa caatgaaatc aaaaaagtaa tggtcgatgg ttgccatggt 120
tctgatccat gcatcatcca tcgtggtaaa ccattcactt tggaagcctt attcgatgcc 180
aaccaaaaca ctaaaaccgc taaaattgaa atcaaagcca gcctcgatgg tcttgaaatt 240
gatgttcccg gtatcgatac caatgcttgc cattttatga aatgtccatt ggttaaaggt 300
caacaatatg atatcaaata tacatggaat gtgccgaaaa ttgcaccaaa atctgaaaac 360
gttgtcgtta cagtcaaact tatcggtgat aatggtgttt tggcttgcgc tattgctacc 420
catggtaaaa tccgtgatta a 441
<210> 3
<211> 146
<212> PRT
<213> Dermatophagoides farinae
<400> 3
Met Ile Ser Lys Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Val
1 5 10 15
Ala Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys
20 25 30
Val Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg
35 40 45
Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr
50 55 60
Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile
65 70 75 80
Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro
85 90 95
Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro
100 105 110
Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Ile
115 120 125
Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Gly Lys Ile
130 135 140
Arg Asp
145
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 4
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 5
caggaaacag ctatgac 17
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 6
ggtattaacg gtttcggacg tattg 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 7
gatgttgaca gggtctctct cttgg 25
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 8
gactggttcc aattgacaag c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 9
ggcaaatggc attctgacat 20

Claims (8)

1.编码Der f2蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
2.重组Der f2蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.含有权利要求1所述编码Der f2基因的载体，所述的载体为pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZ A、B、C或pGAPZ A、B、C。
4.包含权利要求3所述载体的毕赤酵母菌株，所述毕赤酵母菌株为SMD1168、GS115、KM71、X33或KM71H。
5.权利要求4所述毕赤酵母菌株，其特征在于编码Der f2蛋白的DNA序列与毕赤酵母上AOX1的ATG相差242bp；编码Der f2蛋白的DNA序列前加入Kozak序列GCCACCATGG。
6.重组Der f2蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：
A.构建含有如权利要求1所述编码Der f2基因的载体；
B.将步骤A的载体线性化后转入毕赤酵母菌株中，并在合适的条件下培养；
C.回收纯化蛋白质。
7.重组Der f2蛋白纯化方法，所述纯化方法如下：
A.将如权利要求6所述的Der f2发酵液低温高速离心收集上清，50mM乙酸钠，pH＝4.0缓冲液超滤，0.45μm滤膜过滤。
B.第一步阳离子层析，用平衡缓冲液平衡层析柱，接着运用纯化系统将步骤A中预处理的发酵液通过分离填料，然后运用洗脱缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰，平衡缓冲液为50mM乙酸钠，pH＝4.0，洗脱缓冲液为50mM乙酸钠，1.0M氯化钠，pH＝4.0。
C.第二步首先将B中收集得到的Der f2蛋白峰用20mM磷酸盐，pH＝6.0溶液超滤，平衡缓冲液平衡层析柱，将超滤的Der f2蛋白溶液上阴离子层析填料，收集穿透峰，平衡缓冲液为20mM磷酸盐，pH＝6.0。
D.第三步将C中穿透峰加入硫酸铵至终浓度1.5M，pH＝6.0，平衡缓冲液平衡层析柱，Der f2样品上疏水层析填料，洗脱缓冲液梯度洗脱，平衡缓冲液为1.5M硫酸铵，20mM磷酸盐，pH＝6.0，洗脱缓冲液为20mM磷酸盐，pH＝6.0。
8.如权利要求2所述的重组Der f2蛋白在制备治疗尘螨变态反应性疾病药物中的应用。
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