CN101977929B - 用于治疗变态反应的主要1类和2类螨变应原的低变应原性杂合蛋白 - Google Patents
用于治疗变态反应的主要1类和2类螨变应原的低变应原性杂合蛋白 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及重组DNA，其编码可用于治疗和预防变态反应、更特别地由螨导致的变态反应的、来自欧洲尘螨的不同变应原的杂合多肽。具体而言，本发明描述了由变应原Derp p 1 y Derp p 2的片段组成的杂合蛋白，其具有低变应原性并维持免疫原性，对于变态反应的治疗特别有用。本发明还描述了这些多肽在异源表达系统中的产生方法。此外，本发明描述了这些杂合蛋白的有效纯化方法。
Description
发明领域
本发明涉及生产用于预防和治疗变态反应，特别地由屋尘螨导致的变态反应，和更特别地由尘螨属(genus Dermatophagoides)的螨引起的变态反应和更具体地由于对1类和2类变应原致敏而引起的变态反应的杂合蛋白的领域。
背景技术
变态反应是对异物反应的能力的特异性遗传性或获得性障碍，所述异物通常是有害的(变应原)。变态反应与受累器官(皮肤，结膜，鼻，咽，支气管粘膜，胃肠道)的炎性反应有关。该疾病的即时症状包括鼻炎，结膜炎，皮炎，哮喘和过敏性休克；而该疾病的慢性表现包括哮喘的迟发型反应和特应性皮炎。I型变态反应是发达国家中的一个重要的健康问题。此型变态反应由针对空气播散的抗原的IgE抗体的形成而导致。这些IgE抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞相互作用，释放生物介质诸如组胺，其在发达国家25％以上的人群中产生变应性鼻炎、结膜炎和支气管哮喘。[Floistrup，H.，Swartz，J.，Bergstrom，A.，Alm，J.S.，Scheynius，A.，van Hage，M.，Waser，M.，Braun-Fahrlander，C.，Schram-Bijkerk，D.，Huber，M.，Zutavern，A.，von Mutius，E.，Ublagger，E.，Riedler，J.，Michaels，K.B.，Pershagen，G.，The Parsifal Study Group(Parsifal研究小组).(2006).Allergicdisease andsensitization in Steiner school children(Steiner学龄儿童中的变应性疾病和致敏).J Allergy Clin Immunol.117，59-66]。
目前，对变态反应仅有的针对病因的治疗方法是变应原特异性免疫疗法(SIT)。SIT是由特异性变应原导致的变应性疾病的有效治疗方法，并且基本上包括通过以递增浓度的产生变态反应的蛋白质(变应原提取物)规律地给药而调节患者的免疫应答。尽管多个研究已经证明此变应原特异性免疫疗法的临床有效性，但其免疫学机制没有完全地阐明。
至今已知的是高剂量注射的变应原通过抗原呈递细胞，例如树突状细胞诱导IL-12的合成增加，所述抗原呈递细胞优先地促进天然辅助T细胞(nTH)发育称为TH1和TH0细胞。这使得与TH2细胞相关的变应性免疫应答转换为 TH1/TH0应答，后者诱导产生高水平的IFN-γ[Akdis，C.A.和Blaser，K.(2000).Mechanisms of allergen-specific immunotherapy(变应原特异性免疫疗法的机制).Allergy 55，522-530]。此免疫转换通过在调节性T细胞(TR1)的影响下诱导TH2记忆细胞的耐受(克隆无反应性或克隆缺失)而被强化，所述调节性T细胞产生免疫抑制性细胞因子IL-10和TGF-β[Akdis，C.A.，Joss，A.，Akdis，M.，和Blaser，K.(2001).Mechanism of IL-10 induced cell inactivation in allergicinflammation andnormal response to allergens(在变应性炎症和对变应原的正常应答中IL-10诱导的细胞失活的机制).Int.Arch Allergy Immunol.124；180-182]。TH2细胞的激活和增殖的减少导致B细胞产生较少的IL-4和IgE。在鼻和支气管粘膜中TH2细胞的激活和浸润减少导致IL-5的合成减少，使得嗜酸细胞的浸润减少，导致炎性介质诸如MBP(主要碱性蛋白)和ECP(嗜酸细胞阳离子蛋白)的释放的大量减少。具有优势表型TH0的T细胞的新变应原特异性克隆产生TH1和TH2细胞因子的混合物，促进B细胞产生大量的变应原特异性IgG抗体。另外，高水平的IL-10诱导变应原特异性IgG4抗体的合成增加。这两种类型的特异性抗体可用作阻断抗体，阻止锚定在肥大细胞上的IgE结合受体的交联，并且由此抑制脱颗粒和组胺的释放[Moverare，R.(2003).Immunological mechanisms ofspecificimmunotherapy with pollen vaccines：implications for diagnostics andthedevelopment of improved vaccination strategies(使用花粉疫苗的特异性免疫治疗的免疫学机制：对诊断学和开发改进的疫苗接种策略的潜在意义).Expert Rev.Vacc.2，85-97；Wachholz，P.A.，Soni，N.K.，Till，S.，和Durham，S.R.(2003).Inhibition ofallergen-IgE binding to B cells by IgG antibodies after grasspollenimnunotherapy(在青草花粉免疫治疗后IgG抗体抑制变应原-IgE与B细胞的结合).J.Allergy Clin.Immuno1.112；915-922]。它们还通过抗原呈递细胞阻断IgE介导的抗原捕获，并且这抑制对变应原的免疫反应。
分离自天然来源的变应原提取物是蛋白质和其他分子的复杂混合物。该组成并且因此其变应原性取决于使用的材料，其在花粉的情况下根据环境条件、在真菌的情况下根据成熟期、螨的生长条件等而变化。另外，一些提取物可含有不充足浓度的主要变应原，它们可被不需要的成分污染，患者对这些成分不过敏，或两种问题均可存在。目前的免疫治疗使用专门的完全变应原提取物，并且此具有一些缺点如：
-由于疫苗与锚定在效应器细胞上的IgE抗体的反应性而导致严重的不良 反应。
-免疫治疗开始后，对疫苗中存在的其他变应原出现新的致敏。
-难以标准化地生产一些变应原提取物。
所有这些均导致免疫治疗不是如所期望的那样安全和有效的治疗方法。
对变态反应的发病机制和特异性免疫治疗的机制的较好理解已经使得能够对上面提到的问题获得解决方案。对IgE介导抗原的呈递在变应原特异性TH2应答中的影响的理解已经增加了产生不结合IgE的变应原的尝试。此变应原将通过基于吞噬作用/胞饮作用的抗原捕获机制而针对T细胞，避免IgE交联和IgE依赖性抗原的呈递。这诱导T细胞产生的TH0或TH1细胞因子的平衡，并且诱导B细胞产生较少的IgE和较多的IgG；这都将导致诱导TH2型T细胞的耐受，而没有过敏反应的风险。
获得变应原和变应原衍生物的重组技术的进展已经促进了开发用于治疗变态反应的新型疫苗的能力的极大增加。面对此领域中那些工作的困难是减少抗原的IgE结合，同时保留其被T细胞的识别。具有较低IgE结合能力但保持其对T细胞的反应性的变应原分子，可以较高的剂量施用，使得能够进行使用较少次注射的更快的和更安全的免疫治疗。另外，可在发酵罐中使用微生物表达系统大规模地生产重组变应原，并且其纯化比其天然等效物更有效。
螨属于节肢动物类群，并且具有小于0.3mm的大小；它们可以见于不同的环境中，包括屋尘。自二十世纪60年代后期它们就已经被认为是屋尘变态反应的原因。
负责产生变态反应症状的主要螨类包括在无气门目(order Astigmata)中，并且其分类学的分布如下：
动物界
节肢动物门
蛛形纲
蜱蹒亚纲
无气门目
·食甜螨科
食甜螨亚科
无爪螨属(Genus Blomia)
弗氏无爪螨(B.freemani)
B.kulagini
热带无爪螨(B.tropicalis)
食甜螨属
家甜食螨(G.domesticus)
嗜鳞螨属(Genus Lepidoglyphus)
害鳞嗜螨(L.destructor)
钳爪螨亚科(subfamily Labidophorinae)
脊足螨属(Genus Gohieria)
棕脊足螨(G.fusca)
·蚍螨科(Family Pyroglyphidae)
尘螨亚科(subfamily Dermatophagoidinae)
尘螨属(Genus Dermatophagoides)
伊凡尘螨(D.evansi)
粉尘螨(D.farinae)
微角尘螨(D.microceras)
欧洲尘螨(D.pteronyssinus)
丝泊尘螨(D.siboney)
新热带尘螨(D.neotropicalis)
多毛螨属(Genus Hirstia)
舍赫尘螨(H.domicola)
马尘螨属(Genus Malayoglyphus)
卡美马尘螨(M.carmelitus)
蚍螨亚科(Subfamily Pyroglyphinae)
欧尘螨属(Genus Euroglyphus)
埋内欧螨(E.maynei)
·粉螨科(Family Acaridae)
粉螨属(Genus Acarus)
粗脚粉螨(A.siro)
食酪螨属(Genus Tyrophagus)
长食酪螨(T.longior)
腐食酪螨(T.putrescentiae)
·嗜渣螨科(Family Chortoglyphidae)
嗜渣螨属(Genus Chortoglyphus)
拱殖嗜渣螨(C.arcuatus)
最常产生变态反应的物种是尘螨属的那些。其最佳生长条件为约20℃的温度和70％以上的相对湿度。湿度小于50-60％的环境很大程度地限制其存在；因此它们在气候温和的沿海地区大量存在，并且极少地存在于干燥的多山地带，特别是海拔1500m以上。因此，在季节变动(春天和秋天)时有雨和温和的温度下在住宅内螨浓度也增加，并且通常在夏天(热，干燥气候)和冬天(冷，干燥气候)期间减少。
屋尘螨是复杂的生物体，其产生上千种不同蛋白质和其他的大分子。它们是变态反应的最普遍的来源之一，并且已经估计欧洲5000万人患有变态反应，15％对螨过敏，估计大概1000-1500万人没有被正确地诊断。其他数据表明至多80％的哮喘儿童可能对螨过敏[de Blay F等，Influence of mite exposure onsymptoms of mite-sensitive patientswith asthma(螨接触对螨过敏的哮喘患者的症状的影响).J Allergy Clin Immunol1994；93：136-138]。
迄今为止，已经阐明了来自最常见的屋螨——欧洲尘螨和粉尘螨的14种变应原，各种在变态反应患者之间具有非常不同的患病率。在国际免疫学联合会(I.U.I.S.)的变应原命名小组委员会(Allergen Nomenclature Sub-Committee)(http://www.allergen.org/Allergen.aspx)于2007年7月3日的变应原官方列表中所述的欧洲尘螨的变应原为：
·Der p 1
生化名称： 半胱氨酸蛋白酶，28kDa(SDS-PAGE)，具有可导致
变态反应过程中的辅助效应的蛋白水解活性。
变应原性： -在血清中，在IgE与Der p 1以及与欧洲尘螨的
提取物之间存在正相关，如通过RIA和RAST测量
(r＝0.82，p＜0.001，n＝30)。
-研究的所有11名患者具有响应于Der p 1(＜10-2
μg/ml)的阳性皮肤测试结果。
-在RAST中92％的42名螨过敏患者具有针对
rDer p 1的特异性IgE。
·Der p 2
生化名称： 属于NPC2家族，15kDa(SDS-PAGE)。
变应原性： -12名螨过敏患者中的9名(75％)具有响应于Der p
2(＜10-3μg/ml)的阳性皮肤测试结果。
-在RAST中65名螨过敏患者中的59名(90.7％)
具有针对Der p 2的特异性IgE。
-在RAST中45名螨过敏患者中的32名(71％)具
有针对Der p 2的特异性IgE。
-在RAST中35名螨过敏患者中的100％具有针对
Der p 2的特异性IgE。
·Der p 3
生化名称： 胰蛋白酶，31kDa(SDS-PAGE)。
变应原性： -在RAST中55名螨过敏患者中的100％具有针对
Der p 3的特异性IgE。
-在RAST中35名螨过敏患者中的97％具有针对
Der p 3的特异性IgE。
·Der p 4
生化名称： α-淀粉酶，60kDa(SDS-PAGE)。
变应原性： -在与纯化的Der p 4的免疫印迹上，27名成人螨
过敏患者中的46％和20名对螨过敏的儿童的25％具
有针对Der p 4的特异性IgE。
-在研究的10名螨过敏患者中，在斑点印迹上3
名具有针对Der p 4的IgE。
·Der p 5
大小： 14kDa(SDS-PAGE)的蛋白质，与所述的其他蛋白质
没有显著的同源性。
变应原性： -在RIA中，19名螨过敏患者中的6名(31％)具有
对Der p 5的特异性IgE。
-在皮肤点刺试验中，20名螨过敏患者中的7名
(37％)具有对10-4～10-2μg/ml Der p 5的阳性反应
性。
-在免疫印迹上，38名螨过敏患者中的血清中21
个识别Der p 5。
·Der p 6
生化名称： 胰凝乳蛋白酶(Chemotrypsin)，25kDa(SDS-PAGE)。
变应原性： -在RAST中41％(88名中的36名)的螨过敏患
者具有针对Derp 6的特异性IgE。
-在使用Der p 6的皮下皮内试验中，44％(18名
中的8名)的螨过敏患者具有阳性反应。
-在RAST中35名螨过敏患者的65％对Der p 6
呈阳性。
·Der p 7
大小： 26、30和31kDa(SDS-PAGE)的蛋白质组，与所描
述的其他蛋白质没有显著的同源性。
变应原性： -在使用rDer p 7(1μg/ml)的皮下试验中，53％(30
名中的16名)的螨过敏患者具有阳性反应。
-38名儿童中的14名(37％)具有对rDer p 7的特异
性IgE。
-在RIA中，41名螨过敏患者中的19名(46％)具
有对rDer p 7的特异性IgE。
·Der p 8
生化名称： 谷胱甘肽S-转移酶，27kDa(SDS-PAGE)。
变应原性： -在免疫印迹上，40％的螨过敏患者识别rDer p 8。
·Der p 9
生化名称： 溶胶原的丝氨酸蛋白酶29kDa(SDS-PAGE)。
变应原性： -在RAST中35名螨过敏患者的92％具有针对Der
p 9的特异性IgE。
·Der p 10
生化名称： 原肌球蛋白，36kDa(SDS-PAGE)。
变应原性： -5.6％的螨过敏患者具有针对重组Der p 10的特
异性IgE。
·Der p 11
生化名称： 副肌球蛋白，103kDa(SDS-PAGE)。
变应原性： -如在免疫斑点上所测量，针对Der p 11的血清
IgE的发生率为41.7％-66.7％，取决于患者群，尽管
其在患有荨麻疹的非变应性患者(18.8％)或正常个体
(8％)中非常低。
·Der p 14
生化名称： 家蚕体液低分子蛋白(Apolipophorin)，177kDa
(SDS-PAGE)。
变应原性： -Der p 14诱发显著的IgE应答并刺激T细胞。
·Der p 20
生化名称： 精氨酸激酶，大小没有说明。
·Der p 21
对生化名称或分子大小没有数据。
Der p 1和Der p 2与80-100％的螨过敏患者反应[Thomas，W.R.，Smith，W-E，Hale，B.，Mills，K.L.，O′Brien，R.M.(2002).Characterization and immunobiologyofhouse dust mite allergens(屋尘螨变应原的表征和免疫生物学).Int.Arch.AllergyImmunol.129；1-8]并且能够抑制几乎所有对欧洲尘螨全提取物的IgE反应性[Van der Zee，J.S.，van Swieten，P.，cansen，H.M.，Aalbersen，R.C.(1988).Skintestsand histamine release with P1-depleted D.pteronyssinus body extracts andpurifiedP1(使用P1缺失的欧洲尘螨身体提取物和纯化的P1的皮肤试验和组胺释放).J.Allergy Clin.Immunol.81；884-895；Meyer，C.H.，Bond，J.F.，Chen，M.C.，Kasaian，M.T.(1994).Comparison of the levels of the allergens Der p I and Der p IIinstandardised extract of the house dust mite D.pteronyssinus(在屋尘螨欧洲尘螨的标准化提取物中变应原Der p I和Der p II的水平的比较).Clin.Exp.Allergy 24；1041-1048]。
1类变应原(Der p 1)是具有半胱氨酸蛋白酶活性的蛋白质，并与木瓜蛋白酶和肌动蛋白-半胱氨酸蛋白酶属于相同的家族。成熟蛋白具有222个残基和80个前蛋白残基。其在螨的消化道中产生，因此见于粪便中，并且似乎参与食物的消化。其具有3个二硫桥：C4-C117、C31-C71以及C64-C103并且其三维结构由两个球形结构域组成：一个在氨基端处(残基21-90)形成，另一个在羧基端 处(残基131-200)形成。它们通过柔性环(flexible loop)(101-131位处)相连[Meno，K.，Thorsted，P.B.，Ipsen，H.，Kristensen，O.，Larsen，J.N.，Spangfort，M.D.，Gajhede，M.，Lund，K.(2005).The crystal structure of recombinantproDer p 1，amajor house dust mite proteolytic allergen(重组proDer p 1，一种主要的屋尘螨蛋白水解变应原的晶体结构).J.Immunol.175，3835-3845]，其中已经证明了高的T细胞刺激活性[Kircher，M.F.，Haeusler，T.，Nickel，R.，Lamb，J.R.，Renz，H.，Beyer，K.(2002).Vb 18.1and Va 2.3+T-cell subsets are associated with house dustmiteallergy in human subjects(Vb 18.1和Va 2.3+T-细胞亚群与人受试者中的屋尘螨变态反应有关).J.Allergy Clin.Immunol.109，517-523]。在中性和碱性pH条件下Der p 1蛋白趋于形成二聚体。B细胞表位沿整个分子分布，一些是构象表位[De Halleux，S.，Stura，E.，VanderElst，L，Carlier，V.，Jacquemin，M.，Saint-Remy，J.M.(2006).Three-dimensional structure and IgE-binding properties of mature fullyactive Der p1，a clinically relevant major allergen(成熟的完全活性的Der p 1，一种临床上相关的主要变应原的三维结构和IgE结合特性).J.Allergy Clin.Immunol.117，571-576]。
2类变应原(Der p 2)含有3个二硫桥(C8-C119、C21-C27和C73-C78)，并且由两个反平行的β折叠组成。Der p 2的T细胞表位遍及整个蛋白中。然而，肽111-129常常被T细胞识别[O′Brien，R.M.，Thomas，W.R.，Nicholson，I.，Lamb，J.R.，Tait，B.D.(1995).Animmunogenetic analysis of the T-cell recognition of the majorhouse dust miteallergen Der p 2：identification of high-and low-responder HLA-DQalleles andlocalization of T-cell epitopes(T细胞识别主要屋尘螨变应原Der p 2的免疫遗传分析：高和低应答个体HLA-DQ等位基因的鉴定和T细胞表位的定位).Immunology.86，176-182]。B细胞表位似乎是构象性的，因为IgE结合高度依赖于三级结构。
变应原螨提取物是蛋白质和非蛋白分子的复杂混合物。用于寻找相对于提取物的组分的特异性IgE水平的技术的不断应用使得能够证明变应性疾病患者通常与各种组分反应。有少数变应性疾病患者与单一的变应原反应。使用全螨提取物的免疫治疗研究已经证明在用螨提取物进行免疫治疗期间可发生危险的全身不良反应[ N.，Hassanzadeh，A.， Y.， H.(2000).Local and systemic reactionsduring immunotherapy with adsorbed extracts of housedust mite in children(在儿童中使用屋尘螨的吸附提取物进行免疫治疗期间的局 部和全身反应)Ann.AllergyAsthma Immunol.85；317-321]和诱发新的对贝类的IgE反应性[van Ree，R.，Antonicelli，L.，Akkerdaas，J.H.，Garritani，M.S.，Aalberse，R.C.，Bonifazi，F.(1996).Possibleinduction of food allergy during miteimmunotherapy(螨免疫治疗期间可能诱发食物变态反应).Allergy 51；108-113]。由此显示目前已知的变应原提取物在实现螨变态反应的最佳治疗中具有明显的缺点。
发明内容
考虑到上面提到的背景技术，本发明人致力于研究抗变态反应治疗的新的有利方式，特别是治疗由螨产生的变态反应。作为广泛研究的结果，本发明人已经发现了治疗螨变态反应的新的和有效的方式，该方式基于通过结合欧洲尘螨的两种变应原(Der p 1和Derp 2)的片段形成的新的杂合蛋白，以及获得它们的各种方法和手段。低变应原性杂合蛋白可以具有与单个天然变应原和/或其混合物相比显著减小的变应原性。例如，杂合蛋白可以具有小于60％，优选小于50％，更优选小于40％，更优选还小于20％，最优选小于10％或甚至小于2％的单个天然变应原和/或其混合物的IgE结合能力。根据本发明的杂合蛋白可以称作低变应原性的，因为它们基于下列具有较低的结合IgE抗体的能力：i)使用来自对欧洲尘螨过敏的患者的混合血清(serum pool)的体外ELISA、ELISA-抑制和免疫印迹试验；ii)在对欧洲尘螨过敏的患者上的体内皮肤反应性试验；iii)分离自对欧洲尘螨过敏的患者血液的嗜碱性粒细胞的离体激活试验以及iv)使用来自对欧洲尘螨过敏的患者的个体化血清的体外EAST试验。此外，根据本发明的杂合蛋白：i)保持其免疫原性，如通过使用来自23名对欧洲尘螨过敏的患者的显示T细胞反应性的外周血单核细胞(PBMC)的淋巴细胞增殖研究证明；ii)实际上在用该杂合蛋白免疫接种小鼠后具有比野生型蛋白更高的免疫原性；以及iii)具有在小鼠中诱导“阻断”抗体的能力，即，诱导Der p 1和Der p 2-特异性IgG，其抑制屋尘螨过敏患者的IgE与天然变应原的结合。
因此本发明涉及由变应原Der p 1和Der p 2的片段组成的杂合蛋白(或嵌合体)(此后称为QM1和QM2)，其中在Der p 2的两个β折叠的至少一个中，Der p2的C8和C119之间的二硫桥已经通过例如，用丝氨酸残基置换图2中显示的成熟天然蛋白的8位和119位处的半胱氨酸残基之一或两个而被破坏，或通过插入附加的氨基酸序列，诸如Der p 1的片段，例如，成熟蛋白的5-222残基(即， 没有图1中显示的前-区(pre-region)而被破坏。优选地，附加的氨基酸序列在图2中显示的Der P2成熟天然蛋白序列的73和74残基之间插入。已经减小了变态反应性，然而令人惊奇地是对其免疫原能力没有损害。事实上，在一些试验中杂合蛋白已经显示了增加的免疫原性，另外其可刺激IgG抗体的产生。
本发明因此提供了包含与SEQ ID No 2或4具有至70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％、或最优选100％的序列同源性的氨基酸序列或由其组成的肽序列。
所述蛋白质可通过任何标准的蛋白质合成法，例如，化学合成，半化学合成，或通过使用表达系统来产生。因此，本发明还涉及包含编码所述嵌合蛋白的DNA或由其组成的核苷酸序列，表达系统例如载体，所述载体包含所述序列，伴有用于表达和表达控制的必需序列，并且还涉及由所述表达系统转化的宿主细胞和宿主生物体。
本发明因此提供了包括与SEQ ID No 1或3具有至70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％、或最优选100％的序列同源性的核苷酸序列或由其组成的多核苷酸。
表达载体可根据其中可以插入本发明的多核苷酸的宿主细胞来选择。宿主细胞的此类转化涉及常规技术诸如Sambrook等[Sambrook，J.，Russell，D.(2001)MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南)，Cold SpringHarbor LaboratoryPress，NY，USA]中所教导的那些。适当载体的选择是本领域专业技术人员所公知的。适当的载体包括质粒、噬菌体、粘粒和病毒。
产生的杂合蛋白可从宿主细胞中通过任何适当的方法分离和纯化，所述方法例如，沉淀或层析分离，例如亲和层析。
本发明还涉及这些嵌合多肽的临床应用，并且涉及用于治疗变态反应，特别是对尘螨——欧洲尘螨的变态反应的特异性免疫治疗。如上所述，特异性免疫治疗是一种通过施用有效量的本发明的一种或多种杂合蛋白来治疗和预防变态反应的方法。优选地，该治疗是哺乳动物，特别是人的治疗。变态反应本身可表现为鼻炎，结膜炎，哮喘，荨麻疹，血管性水肿，湿疹，皮炎和/或过敏性休克。因此，本发明所涵盖的治疗和预防性治疗可包括这些病症的一种或多种的治疗。
如通过所述方法制备的杂合蛋白可配制成为用于治疗变态反应的药物。本 发明还涉及包含这些杂合蛋白的可能组合物以及施用它们的不同方式。本发明的一个具体实施方案涉及疫苗组合物。主要组分是杂合蛋白，其优选地与佐剂一起施用。有几种适用于人类应用的佐剂，例如，氢氧化铝。疫苗的制备描述在Vaccine Design(疫苗设计)(“Thesubunit and adjuvant approach(亚基和佐剂方法)”)，MF Powell & MJ Newman编辑，Plenum Press，New York，1995中。
给药的优选形式包括对于通常疫苗接种和特别是变态反应免疫治疗所描述和建议的所有标准给药方法(以口服，舌下，经皮，静脉内，鼻内，粘液形式，等)。
本发明的杂合蛋白的低变应原特性在下面讨论。由本发明人使用ELISA和ELISA抑制试验所进行的免疫学测试表明QM2嵌合体显示在对欧洲尘螨过敏的患者的血清中没有IgE识别(图9)。尽管含有两种变应原蛋白的大部分序列，然而嵌合体QM1的IgE结合能力比两种天然蛋白的混合物的IgE结合能力低2500倍，如图10中所示。QM1含有两种蛋白的大多数序列，但在Der p 2的两个半胱氨酸(8和119残基)中有突变。
通过使用皮肤点刺试验在107名患者上的体内试验确证了这些低变应原性数据。嵌合体QM1的变应原性(例如，通过风团大小所指示的IgE结合能力)比使用两种单独的天然蛋白所获得的变应原性低约50倍(图11)。QM2的变应原性实际上为0。
当用来自107名对欧洲尘螨过敏的患者的血清测量嵌合体QM2的反应性时，此分子的低变应原性得到确证(图12)。此变应原性的减小伴随着嵌合体QM1和QM2的免疫原性的保持，该免疫原性出人意料地高于单个天然蛋白的总和所观察到的免疫原性(图13和图14A)。这些特性允许这些嵌合体用作现有技术的全变应原提取物的替代物，但其具有更高的安全性。
菌株的保藏
根据本发明的微生物的菌株已经根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Treaty of Budapest on the International Recognition of the DepositofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure)保藏在巴伦西亚大学(Universidad de Valencia，Edificio de Investigación，Campus de Burjasot，46100BURJASOT，Valencia)的Colección de Cultivos Tipo(CECT)，其具有下列参考资料：
CECT 7317大肠杆菌(Escherichia coli)QM1
CECT 7318大肠杆菌QM2
于2007年10月3日保藏。
附图说明
图1显示了从前面提及的相应前蛋白proDer p 1推导的核苷酸和氨基酸的序列，其中前-区已经加框，并且二硫桥通过连接相关被环绕的半胱氨酸残基的线来指示。
图2显示从前面提及的相应成熟蛋白Der p 2推导的核苷酸和氨基酸的序列，其中二硫桥通过连接相关被环绕的半胱氨酸残基的线来指示。
图3显示QM1构建图。*表示被置换的残基的位置。
图4显示QM1的氨基酸和核苷酸的序列。Der p 2的引入残基以阴影显示，并且Derp 1的那些加框显示。被置换的残基通过双框显示。
图5显示QM2构建图。*表示被置换的残基的位置。
图6显示QM2氨基酸和核苷酸的序列。Der p 2的引入残基以阴影显示，并且Der p1的那些加框显示。嵌合体构建期间被置换的残基通过双下划线显示。
图7显示电泳后考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶，其中出现天然和重组变应原(Der p 1和Der p 2)以及QM1和QM2融合体。
图8显示与来自对欧洲尘螨过敏的患者的混合血清的IgE抗体温育的免疫印迹，其中出现天然和重组变应原(Der p 1和Der p 2)以及QM1和QM2融合体。泳道M指示标准分子量标记物。
图9显示使用来自19名对欧洲尘螨过敏的患者的血清(1/4稀释液)，IgE抗体与nDer p 1、nDer p 2、QM1和QM2的结合。
图10显示来自ELISA抑制试验的结果，所述ELISA抑制试验显示来自对欧洲尘螨过敏的患者的混合血清与固相中nDer p 1+Der p 2的等摩尔混合物的IgE结合活性。使用的抑制剂分子为：nDer p 1+Der p 2、QM1、和QM2。各值对应于从三个试验获得的平均抑制，标准差小于10％。
图11显示来自单个患者(n＝107)的、使用欧洲尘螨提取物(DPT)、nDer p 1和nDerp 2(均为10和100μg/mL)、以及QM1和QM2(均为50和500μg/mL)皮肤试验的结果。以mm2计的单个值作为在两臂上测量的两个(一式两份)风团表面积的均数给出。结果显示为箱形图，其中各个箱的边缘标记25和75百 分位数，并且直线表示中位值。从各个箱上下延伸的棒显示非离群值的最大观测值。空心圆和星号代表各患者组的离群值和极值。Wi1coxon秩检验分析后的P值被包括在内。
图12显示来自单个患者血清(n＝107)的两个(一式两份)特异性IgE均值的与欧洲尘螨提取物(DPT)、nDer p 1、nDer p 2、nD1D2、QM1和QM2的箱形图图示。结果显示为箱形图，其中各个箱的边缘标记25和75百分位数，并且直线表示中位值。从各个箱上下延伸的棒显示非离群值的最大观测值。空心圆和星号代表各患者组的离群值和极值。Wilcoxon秩检验分析后的P值被包括在内。
图13显示使用10μg/ml欧洲尘螨提取物(DPT)、两种杂合蛋白以及Der p 1和Der p2的天然和重组形式的等摩尔混合物(分别为NAT MIX和REC MIX)获得的T淋巴细胞的增殖。显示的值是刺激指数(％)。仅当差异显著时显示P值。
图14：(A)通过用nD1D2、QM1和QM2免疫小鼠生成的抗血清的滴定。对不同稀释度的抗血清检测对nDer p 1和nDer p 2的天然等摩尔混合物(nD1D2)的反应性。对每个血清稀释度显示与结合的IgG抗体对应的光密度均值(OD)。(B)用nD1D2-、QM1-和QM2-特异性小鼠IgG抗体预温育后人IgE结合nD1D2及其组分Der p 1和Der p 2的抑制。
详述
在QM1的情况下，通过两种蛋白质(Der p 1和Der p 2)的融合和去除一个二硫桥(残基8-119)，并且在QM2的情况下，通过在Der p 2的残基73和74之间插入蛋白Der p 1，获得了根据本发明的低变应原性杂合蛋白。出人意料地，尽管有这些变化，杂合蛋白(QM1和QM2)仍显示比单独的野生型分子更高的T细胞刺激能力(图13)和诱导更强的免疫原性(图14A)。
组成杂合蛋白的肽片段可以由合格的和受过训练的人根据本领域公知的方法诸如例如Sambrook等[Sambrook，J.，Russell，D.(2001)Molecular Cloning：ALaboratoryManual(分子克隆：实验室指南)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA]中所述的那些方法通过例如聚合酶链式反应(PCR)从编码它们的核苷酸序列合成。已经通过适当的限制性酶消化的所述的核苷酸序列可以通过连接反应而合并入表达载体中。编码肽片段的不同核苷酸序列使用接头连接，所述接头用被不同的限制性酶识别的序列形成，并且因此一些残基出现在最终的杂 合肽分子中，它们不存在于天然变应原的原始序列中。这些新的残基不干扰蛋白质的正确翻译，并且已经通过双下划线标记在图6中的序列中。
本发明涵盖根据本发明的嵌合体，QM1和QM2，或由它们衍生的合成肽在动物，特别是哺乳动物诸如人的脱敏治疗中的应用。脱敏方法涉及通过胃肠外(皮下，静脉内或肌内)，口服，舌下，经鼻或经直肠途径的反复给药。这些杂合蛋白可根据当前法律和适用的临床程序单独施用或与药物赋形剂、佐剂和/或稀释剂联合施用。
根据本发明的杂合蛋白的免疫学特征展示如下。
本发明所述的QM1和QM2杂合蛋白是低变应原性的：如图8、9、10和12中所示。它们对欧洲尘螨过敏患者的血清的反应性低于全提取物或合并的天然蛋白，并且特别地对于QM2嵌合体，在“离体”试验中激活嗜碱性粒细胞的能力较低。在体内皮肤试验中也已经证明了此低变应原性(图11)。
图8显示了免疫检测试验，该试验表明QM1和QM2嵌合体与天然蛋白Derp 2的反应性相比在变态反应患者中具有较低的IgE结合能力。此变应原性的减小通过使用欧洲尘螨过敏患者的血清混合物的ELISA抑制来定量(图10)。与两种天然蛋白的混合物相比，需要2500倍的QM1蛋白来达到50％的抑制。因此可以推断其变应原性比天然蛋白低2500倍，表明与两种天然蛋白的混合物的IgE结合能力减小了99％以上。
QM1和QM2嵌合体的低变应原性的更直接的测量方式通过直接测量107名欧洲尘螨过敏患者中的皮肤反应性来获得。图11中的数据显示嵌合体QM2具有显著降低的皮肤反应性。另一方面嵌合体QM2仅在5名患者中产生阳性反应性。各个分布的比较显示嵌合体QM1的风团大小均值比对nDer p 2观察到的均值小50倍，并且比对nDer p 1观察到的均值小10倍，表明变应原活性减小了90-98％。不管对杂合蛋白使用的剂量更高，结果仍然如此。
通过EAST测量，使用107名其他的欧洲尘螨过敏患者的血清还证明了杂合蛋白QM2的低IgE结合能力(图12)。在所有患者中，与天然蛋白的混合物DPT，以及重组或天然任一形式的单一蛋白相比，QM2的IgE结合实际上是不存在的。
此结合IgE并导致不良反应的能力的大量减小伴随着免疫原性的保持。如图13中所示，蛋白QM1和QM2显示的淋巴增殖指数与两种纯蛋白Der p 1和 Der p 2的混合物组合(以天然和重组两种形式)所诱导的淋巴增殖指数相似。这证明作为突变多肽Der p 2(C8-C119)和Der p 1的融合体构建的杂合蛋白QM1和用Der p 2的2个片段和Der p 1的一个片段构建的QM2含有较少的构象IgE结合表位，但保留了足够的T表位以诱导保护性免疫应答。
当用作SIT的候选物时低变应原性分子的另一所需特征，除了当与相应的变应原比较具有较低的IgE结合活性和含有T细胞表位以外，是它们应当具有诱导“阻断”抗体的能力，该“阻断”抗体阻止脱颗粒和组胺的释放。用杂合蛋白QM1和QM2免疫小鼠诱导出比野生型蛋白混合物更强的IgG应答。这些Der p 1和Der p 2特异性IgG抗体抑制屋尘螨过敏患者的IgE与天然变应原的结合，进一步改善了变态反应症状的预防作用。
从与为准备本发明并证明其特性的实验阶段相关的下列实施例中将更好地理解本发明。这些实施例仅是说明性地，并不限制本发明。
实施例
实施例1：从螨身体纯化天然变应原Der p 1和Der p 2
使用欧洲尘螨的冻干身体和粪便的混合物(Laboratorios Leti，Madrid，Spain)作为起始原料，用10体积(p/v)添加1mm PMSF(苯甲磺酰基氟化物)的PBS(磷酸盐缓冲盐水)在4℃下快速搅拌提取15分钟。然后以3,800xg在4℃下离心15分钟。提取上清液通过AP(Millipore)过滤，并且缓慢地加入60％硫酸铵361g/l)30min。在4℃下搅拌1小时后，其以17,000xg和在4℃下离心15分钟。
·天然Der p 1的纯化
离心后获得的沉淀重新悬浮在2ml 20mM Tris pH 8.0中，并通过0.22μm过滤。在Superdex S20016/60柱(GE-Healthcare，Uppsala，Sweden)中进行分子筛层析，该柱用PBS平衡，并且注入来自前一步骤的2ml样品。从排斥体积中收集3ml级分，其与24kDa级分合并，通过SDS-PAGE在非还原条件下分析。下一步，在HighTrap Q柱(GE-Healthcare)中进行阴离子交换层析，该柱用20mMTris pH 8.5平衡。来自前一步骤的阳性级分针对51蒸馏水透析120min，并且转至20mM Tris pH 8.5。样品以1ml/分钟加样并用20mM Tris pH 8.5中的200-1000mM NaCl的梯度洗脱。收集未结合的级分。
通过在使用SDS的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中电泳来检查制剂的纯度。使用MINI-PROTEAN(Bio-Rad)电泳仪，基本上遵循由Laemmli所述的技术[(19) Laemmli，U.K.(1970).Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead ofbacteriophage T4(在细菌噬菌体T4的头部组装期间结构蛋白的切割).Nature 277，680-685]。在Tris-甘氨酸缓冲液中向测定为10x10cm并且使用12.5％的聚丙烯酰胺浓度的凝胶施加200伏特电流45分钟。用作标记物的蛋白质是用于低分子量的Bio-Rad试剂盒。使用图像分析仪(Diversity，BioRad)进行分子量的计算和凝胶的密度计分析。
当在还原条件下进行SDS-PAGE时天然Der p 1的纯化结果为纯度为98％以上、大小为29.07kDa的蛋白质(图7)。
·天然Der p 2的纯化
239g/l硫酸铵加入至沉淀上清液中，使用60％硫酸铵获得95％的浓度，在4℃下搅拌留置过夜。其在17,000xg和4℃下离心15分钟，沉淀物重新悬浮在25ml MilliQ水中。下一步，用50mM Tris pH 8.0平衡的HighFlow Q 16/20柱(GE-Healthcare)中进行阴离子交换层析。样品针对51水透析过夜，换3次水并转至50mM Tris pH 8.0中。样品以5ml/分钟加样，并且收集未结合的级分。第三个纯化步骤由下列组成：在用20mM AcNa pH 5.5平衡的HighTrap SP柱(GE-Healthcare)中进行阳离子交换层析。来自前一步骤的未结合的级分针对51水透析3小时，并转至20mM AcNa pH 5.5中。样品的流速为1ml/分钟，并用20mM AcNapH 5.5中200-1000mM NaCl的梯度洗脱。作为最终的纯化步骤，在用PBS平衡的SuperdexS75/300柱(GE-Healthcare)中进行分子筛层析。来自前一步骤的用200mM NaCl洗脱的级分在Amicon Ultra 4(Millipore)中浓缩，流速为04ml/min，并且收集0.5ml级分。该级分使用SDS-PAGE分析。将含有对应于Der p 2的16kDa蛋白的那些级分合并在一起。
当在还原条件下进行SDS-PAGE时天然Der p 2的纯化获得了纯度为95％以上且大小为16.63kDa的蛋白质(图7)。
实施例2：Der p 1和Der p 2变应原的克隆
编码变应原Der p 1和Der p 2的互补DNA(cDNA)，在各自的情况下，通过使用从尘螨分离的mRNA作为模板和特异性引物进行逆转录、接着使用PCR扩增而被克隆。mRNA使用Quick Prep MicroRNA纯化试剂盒(GE-Healthcare)分离自100mg欧洲尘螨身体(Laboratiorios Leti，Madrid，Spain)。使用第一链cDNA合成试剂盒(GE-Healthcare)通过mRNA的逆转录获得cDNA。
引物由杂交区、不同限制性内切酶的各种切割位点(下面加下划线的)和锚定核苷酸组成。PCR扩增反应具有50μl的反应体积中的下列组分：扩增缓冲液x10，5μl；200μmdNTP；100pm各种寡核苷酸引物；2.5单位Taq聚合酶(PfxDNA聚合酶，Invitrogen)；1ng DNA模板和补足至50μl的无菌蒸馏水。在RoboCycler热循环仪(Stratagene)中在各种情况下说明的特定条件下进行扩增反应。反应的产物在琼脂糖凝胶(2％)中进行电泳，并且使用由生产厂商说明的实验方案通过Geneclean(Bio101)从凝胶中分离目的条带。分离的片段连接进pGEM载体(Promega)中。连接反应混合物用来转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(可通过Invitrogen，Paisley，United Kindom获得)。将得到的集落生长以分离其质粒DNA，用适当的酶消化质粒DNA以释放目的片段。选择阳性克隆用于测序。通过改良的使用荧光双脱氧核苷酸的Sanger法对插入至pBluescript中的DNA测序并且在热循环仪中使用PRISM简便反应染色脱氧终止循环测序试剂盒(PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Termination CycleSequencing Kit)(PerkinElmer)遵循生产厂商的说明书进行扩增。
·Der p 1的cDNA
使用根据已发表的序列(GenBank登记号：P08176)设计的引物通过PCR扩增编码Der p 1的cDNA区。正向引物5′-ACTGACAGGCCTCGTCCATCATCGATCAAAAC-3′包括酶StuI的切割序列(下划线)，反向引物5′-CGGAATTCCTAGGTTAGAGAATGACAACATATGG-3′包括EcoRI(下划线)和AvrII(斜体)核酸内切酶的切割区。扩增条件为：94℃-1′(1个循环)；94℃-30″，48℃-1′，72℃-1′(35个循环)；72℃-10′(1个循环)。分离获得的PCR产物，克隆在pGEM(Promega)载体中并测序。
Der p 1的质粒DNA编码具有302个氨基酸的蛋白质，包括80个氨基酸的前蛋白和222个氨基酸的成熟蛋白(图1)。此序列显示与对Derp 1.0105(P08176)所述的序列相比有差异(His152-＞Asn)。该蛋白质的计算分子量为24.97kDa，等电点为5.49。
·Der p 2的cDNA
使用根据已发表的序列(AAF86462)设计的引物通过PCR扩增编码Der p 2的cDNA区。5′-CGGGATCCGATCAAGTCGATGTCAAAG-3′用作正向引物，其包括限制性酶BamHI的切割序列， 5′-CGGAATTCTTAATCGCGGATTTTAGC-3′用作反向引物，具有限制性酶EcoRI的切割序列。扩增条件为：94℃-1′(1个循环)；94℃-30″，48℃-1′，72℃-1′(35个循环)；72℃-10′(1个循环)。分离获得的PCR产物，克隆在pBluescript II KS载体(Stratagene)中并测序。在用限制性酶BamHI/EcoRI消化后分离编码Der p 2的质粒DNA，并且亚克隆进pKN172载体[(20)Way，M.，Pope，B.，Gooch，J.，Hawkins，M.，Weeds，A.G.(1990)Identification of a regionin segment 1of gelsolincritical for actin binding(鉴定钙结合微丝蛋白的节段1中对肌动蛋白结合重要的的区).EMBO J.9；4103-4109]和pTrcHis A(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)]中。
获得的Der p 2序列编码129个氨基酸的多肽(图2)，其包括相对于Der p2.0102(AAF86462)序列的一个氨基酸改变(Leu127-＞Ile)。然而，Der p 2(P49278)和所述的其他亚型在此位置中也具有异亮氨酸。该蛋白质的理论分子量为14.106kDa，等电点为7.10。
实施例3：重组Der p 2的表达和纯化
用相应的质粒通过Hanahan法[(21)Hanahan，D.(1983).Studiesontransformation of Escherichia coli with plasmids(对用质粒转化大肠杆菌的研究).J.Mol.Biol.166，557-580]转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞铺在含有添加了200μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的培养皿(Petri plate)上。从细胞集落预先接种50ml相同培养基，在37℃下温育过夜并搅拌(260rpm)。用所述预接种物接种在1升相同的培养基中，从0.2的光密度(600nm)开始。其在37℃下温育并搅拌直至达到0.6的光密度(600nm)(约90分钟)，此时使用异丙基-硫代-β-半乳糖苷(IPTG)以0.6mM的终浓度进行诱导。3小时的诱导期后，通过离心收集细胞。
细胞在4℃下以10000rpm离心15分钟，并且重新悬浮在50ml裂解缓冲液(50mMTris pH 8.0；1mM DTT(二硫苏糖醇))中。重悬浮液用溶菌酶(0.1mg/ml的终浓度)在37℃下处理30分钟并搅拌。下一步其在冰浴中超声处理5分钟，加入1％Triton X-100，并且将其放置在室温下温育30分钟并轻轻搅拌。在8000xg下离心15分钟后，沉淀物重新悬浮在20ml 2M尿素和0.2％Triton X-100中，并且在室温下温育30分钟并轻轻搅拌。其在冰浴中超声处理1分钟，并且在8000xg和4℃下离心15分钟。沉淀物重新悬浮在10ml 6M氯化胍和0.5％β-巯基乙醇中。将其保持在4℃下磁力搅拌1小时并且针对200ml处于25mM Tris pH8.0中的6M尿素透析过夜。为了改善其折叠，然后样品用6M尿素稀释至1-2 mg/ml，并且针对如下各溶液在4℃下逐步进行透析：400ml 3M尿素/111.5M尿素/0.75M尿素/0.37M尿素/0.18M尿素，每90分钟进行更换。最后，其在4℃下针对51蒸馏水透析过夜。在用25mM AcNa pH 5.5平衡的HighFlow SP16/20柱(Healthcare)中采用阴离子交换层析完成纯化。样品转至25mM AcNapH5.5并且以3800xg离心10分钟以及通过AP(Millipore)和0.45μm(Millipore)滤器过滤后，其以5ml/min通过柱。以处于25mM AcNa pH 5.5中的1000mM NaCl进行洗脱。
纯化的收率为每升培养液3.8mg。当在还原条件下进行SDS-PAGE时，重组Der p 2的纯化得到纯度超过95％和大小为17.05kDa的蛋白质(图7)。
实施例4：QM1融合体的构建
此以Der p 2的质粒DNA开始，该质粒DNA使用引物5′-CGGGATCCGTCAAAGATAGTGCCAATC-3′和5′-ACGGATCTGCAGGTAGCAATAGCACTGGCCAA-3通过PCR扩增而成，该引物分别包括酶BamHI和PstI的切割序列(下划线)。扩增条件为：94℃-1′(1个循环)；94℃-30″，56℃-30″，72℃-1′(35个循环)；72℃-10′(1个循环)。获得的片段被连接进用BamHI/PstI切割的pBluescript KS载体(Stratagene)中并测序。此构建体用PstI/EcoRI消化，并且在用相同的酶PstI/EcoRI消化初始序列后已经获得的Der p 1的成熟蛋白的部分序列通过连接反应掺入。获得的融合蛋白亚克隆进表达载体pKN172和TrcHis中的BamHI/EcoRI处。
融合蛋白1来自两个片段的结合(图3)。第一个片段由编码Der p 2的氨基酸5-123的序列形成。设计用于再扩增此序列的寡核苷酸包括碱基变化，所述碱基变化包括原始蛋白的8和119位的半胱氨酸被丝氨酸置换。第二个片段编码Derp 1的成熟蛋白的氨基酸4-222。第二个片段与第一个片段通过位于Der p 1的成熟蛋白的氨基酸3和5之间的酶Pst1的核心结合。得到的质粒DNA编码338个氨基酸的蛋白质(图4)，其分子量为37.56kDa，理论等电点为6.16。
实施例5：QM2融合体的构建
融合蛋白2通过三个片段的结合而构建：
·对应于Der p 2的N-末端的片段1使用包括酶BamHI的核心的正向引物5′-CGGGATCCGATCAAGTCGATGTCAAAG-3′和包括EcoRI、AvrII和PstI的 核心的反向引物5′-CCGAATTCCCTAGGCTGCAGCCATTTGGATCGAT-3′扩增。扩增条件为：94℃-1′(1个循环)；94℃-30″，56℃-30″，72℃-1′(35个循环)；72℃-10′(1个循环)。
·Der p 1的片段2用下列的寡核苷酸扩增：5′-ACTGACAGGCCTCGTCCATCATCGATCAAAAC-3′和5′-CACCTAGGGAGAATGACAACATATGG-3′。正向引物包括StuI的切割序列，反向引物包括AvrII的切割序列。扩增条件为：94℃-1′(1个循环)；94℃-30″，56℃-30″，72℃-1′(35个循环)；72℃-10′(1个循环)。
·片段3使用Der p 2作为模板以及引物5′-CA CCTAGGCATTACATGAAAAGCCCA-3′和5′-CGGAATTCTTAATCGCGGATTTTAGC-3′(分别具有酶AvrII和EcoRI的识别序列)通过PCR获得。扩增条件为：94℃-1′(1个循环)；94℃-30″，52℃-30″，72℃-1′(35个循环)；72℃，10′(1个循环)。分离所需片段并在下列条件下进行再扩增：94℃-1′(1个循环)；94℃-30″，56℃-30″，72℃-1′(35个循环)；72℃-10′(1个循环)。片段1克隆进pBluescript KS载体(Stratagene)中的BamHI/EcoRI处。此第一构建体用PstI和AvrII消化，并且之前用相同酶消化的片段2通过连接反应掺入。使用PstI的消化确保此第二片段仅包括Der p1成熟蛋白的部分序列。此包括片段1和2的新构建体再用AvrII和EcoRI消化，并且与片段3结合。将编码融合蛋白的质粒DNA测序，并且亚克隆进pKN172和pTrcHis A载体中用于其表达。
由编码Der p 2的完整蛋白的序列形成QM2融合体的DNA，该序列中编码从Der p 1的成熟蛋白的氨基酸5至最后残基的序列已经插入至决定氨基酸73和74的碱基之间(图5)。Der p 1结合至Der p 2的第二个片段，涉及加入AvrII的核心和编码脯氨酸和精氨酸的6个额外碱基。设计用于构建片段1和3的引物包括相对于原始序列的一些差异：Der p 2的氨基酸72(Ala-＞Gly)和78(Cys-＞Ser)的改变(图6)。蛋白质的氨基酸342证明是缬氨酸而非Der p 2的原始序列的丙氨酸。当Der p 1的序列被引入至Der p 2的氨基酸73中时，最终的蛋白完全地破坏了Der p 2的三维结构。最终的杂合蛋白由349个氨基酸构成，其计算的分子量为38.92kDa，理论等电点为6.22。
实施例6：杂合蛋白QM1和QM2的表达和纯化
以使用从添加了200μg/ml氨苄青霉素的LB平板分离的相应质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞的集落开始，取50ml相同培养基的预接种物，并且在37℃下温育过夜并搅拌(260rpm)。从0.2的光密度(600nm)开始，在1升相同的培养基中接种所述预接种物。其在37℃下温育并搅拌直至其达到0.6的光密度(600nm)(约90分钟)，此时使用异丙基-硫代-β-半乳糖苷(IPTG)以0.6mM的终浓度进行诱导。3小时的诱导期后，通过离心收集细胞。
·QM1纯化
重组细菌的裂解条件以及在去除尿素的阶段中通过透析重折叠与rDer p 2的纯化(实施例3)一样。最后通过透析的氧化折叠在4℃下针对11处于50mMTris pH 8.0中的5mM半胱氨酸/1mM胱氨酸过夜进行。最后，其在3800xg和4℃下离心10分钟，上清液通过AP(Millipore)过滤，和针对2mM磷酸盐pH 8.5透析2小时，并以18000xg离心15分钟以去除可能沉淀的物质。纯化的最终收率为120mg/升培养基。
·QM2纯化
重组细菌的裂解条件与rDer p 2的纯化(实施例3)一样。50mM DTT加入至10ml 6M氯化胍中的135mg蛋白中并在环境温度下温育1小时。下一步，加入0.2M 2-碘乙酰胺，并且在环境温度下温育1小时。最后，加入0.2M β-巯基乙醇，在环境温度下再温育1小时，并用6M尿素使之达到50ml。下一步在通过透析去除尿素的阶段中进行折叠，与rDer p 2的纯化(实施例3)一样，并且以3800xg离心15分钟以去除任何沉淀的物质。纯化的下一阶段由下列组成：在用20mM乙醇胺pH 10.0平衡的HighFlow Q 16/20柱中进行的阴离子交换层析。样品以5ml/min通过，收集未结合的物质，并在Amicon Ultra 4(Millipore)中浓缩。其以3800xg离心15分钟，并通过AP和0.45μm滤器过滤以去除任何沉淀的物质。最后，在用200mM NH4HCO3平衡的Superdex SX20016/60柱中以1ml/min进行分子筛层析。蛋白质由于其形成聚集体的倾向而出现在洗脱液中。纯制剂在相同的缓冲液中冻干，并保持在4℃。纯化的最后收率为42.4mg/升培养基。
在作为包涵体的不溶级分中发现两种蛋白质，但它们不能溶解在尿素中。当在还原条件下进行SDS-PAGE时，QM1和QM2的纯化得到了纯度超过95％，大小分别为34.91和39.67kDa的蛋白质(图7)。
实施例7：证明杂合蛋白与来自欧洲尘螨过敏患者的血清混合物的低IgE固定反应 性的免疫学实验
A)免疫检测
使用来自欧洲尘螨过敏患者的血清混合物通过免疫转移技术进行QM1和QM2嵌合体的IgE结合活性的初步评价。将蛋白质提取物和纯化蛋白质施加至聚丙烯酰胺凝胶上后，使用Towbin等的方法[Towbin，H.，Staehelin，I.，and Gordon，J.(1979).Electrophoretictransfer of proteins from polyacrylamide gels tonitrocellulose sheets：Procedure and some applications(蛋白从聚丙烯酰胺凝胶至硝酸纤维素片的电泳转移：程序和一些应用).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，4350-4354]进行电转移。通过SDS-PAGE分离的蛋白质被电转移至PVDF(聚偏二氟乙烯)Hybond-P片(GE-Healthcare)。该片在环境温度下封闭1小时后，将它们与一抗在4℃下温育过夜，并且在用相同的洗涤缓冲液洗涤多次后，将该片与与过氧化物酶混合的二抗在环境温度下温育1小时。使用ECL化学发光法(GE-Healthcare)如生产厂商所提及的那样通过将该片与膜(Hyperfilm.ECL，GE-Healthcare)接触而进行条带检测。
免疫检测试验不是定量的，但显示在两个嵌合体之间不同的IgE结合能力；因此仅在QM1的情况下有IgE抗体的轻微识别，而在QM2嵌合体的情况下识别为0(图8)。
B)直接ELISA
使用来自欧洲尘螨过敏患者的个体血清通过ELISA技术分析两种嵌合体的IgE反应性。聚苯乙烯平板(Greiner)与每小杯0.1μg的纯蛋白nDer p 1和nDer p2在PBS缓冲液(10mM磷酸盐pH 7.2；137mM NaCl 2.7mM KCl)中的等摩尔混合物在环境温度下温育过夜。它们用200μl/小杯添加了BSA 1％-Tween 200.05％的PBS封闭并在37℃下保持1小时。下一步，以1/4稀释度加入100μl/小杯来自欧洲尘螨过敏患者的血清混合物，并在37℃下放置90分钟。用200μl/小杯的PBS-T (PBS+Tween 200.05％)洗涤3次后，加入100μl/小杯的与过氧化酶(稀释度1∶1000)混合的针对人IgE免疫球蛋白的抗血清(Dako)，并且在37℃下温育90分钟。用PBS-T又洗涤3次后，加入200μl/小杯的根据生产厂商的说明书制备的邻苯二胺溶液(Sigma-Fast Tablet Sets，Sigma)，并将平板在暗处保持30分钟。用50μl/小杯的3MH2SO4终止反应，并且在ELISA Easy ReaderEAR-400AT平板读数仪(SLT-Lab Instruments)中在492nm处测量吸光度。
仅在一些患者中显示对QM1嵌合体的IgE反应性，而实际上患者血清的IgE抗体的任一种均不识别QM2(图9)。
C)ELISA抑制
使用来自欧洲尘螨过敏患者的个体血清的混合物，通过ELISA抑制技术分析对两种嵌合体的IgE反应性。该技术与前面的技术相同，不同之处在于来自欧洲尘螨过敏患者的血清混合物以1/10的稀释度与特定浓度的抑制剂蛋白(0.025-2500ng/ml)在4℃下预温育过夜。然后与直接ELISA一样，检测IgE结合的抗体。
在ELISA抑制试验中，QM1嵌合体显示的抑制程度比nDer p 1-nDer p 2的当量混合物低。因此，达到50％抑制的nDer p 1-nDer p 2所需的量为1ng/ml，而使用QM1嵌合体需要加入2500ng/ml以达到相同的效应(图10)。这表明QM1与患者特异性IgE的结合能力低2500倍，并且因此其变应原性将降低99.96％。QM2嵌合体不能结合欧洲尘螨过敏患者的特异性IgE，因此其在ELISA抑制试验中的行为与使用阴性对照诸如牛血清白蛋白所获得的行为相比没有变化。
实施例8：证明QM1和QM2杂合蛋白的低皮肤反应性的体内试验
在107名螨过敏患者上进行体内皮肤点刺试验(skin prick tests)以评价QM1和QM2嵌合体的低变应原性。
使用欧洲尘螨提取物，从螨分离的nDer p 1和nDer p 2；在大肠杆菌中表达的rDer p 2，以及QM1和QM2嵌合体进行皮肤试验。所有样品在0.5％含酚的和50％含甘油的生理盐水溶液中稀释。对于未修饰的纯化蛋白(nDer p 1、nDer p2和rDer p 2)使用的浓度为1、10和100μg/ml，对于嵌合体为5、50和500μg/ml。NaCl 0.9％和盐酸组胺(10mg/ml)分别用作阴性和阳性对照。
在试验中，放置一滴各种变应原用于在前臂内侧上测试，然后用小刀刺穿该液滴。每个试验成排地重复用于比较增加和降低的浓度。15min后，用细笔尖黑色标记笔将风团画图。低变应原胶布条置于风团上并轻轻按压，从而将墨水的痕迹转移至条上，这将其转移至风团记录片上。使用数字化书写纸Summasketch和计算机辅助设计程序(Autocad v.11)通过数字化输入测量风团面积。
在测量的反应性和采用的变应原浓度之间观察到相关性。QM2嵌合体稍有 反应性，因为在研究的107名患者的5名(4.7％)中仅在最高浓度(500μg/ml)下观察到反应性。QM1嵌合体反应性较高，86名患者(80.4％)对500μg/ml具有阳性反应，16名(16.8％)对50μg/ml有阳性反应，但反应性比野生型蛋白小得多。进行统计学研究，通过将结果显示在箱形图中并对两个相关变量使用Wilcoxon检验以比较性地解释获得的结果(图10)。在这些图示中可见当处于500μg/ml的最高浓度的QM1(中位数40.33mm2，置信区间95％：35.05-47.88)与处于100μg/ml的nDer p 1、nDer p 2和rDer p 2比较时皮肤反应值(作为以mm2计的风团面积所测量的)的分布有显著的差异(P＜0.001)，对nDer p 1、nDer p 2和rDer p 2的反应性比QM1所诱导的反应性大，中位值分别为52.96；78.86；和75.72mm2。
然而，QM1的反应性与处于10μg/ml的nDer p 2(中位数41.91mm2，置信区间95％：28.27-49.71)没有显著差异(P＝0.067)。当与全螨提取物的反应性(中位数39.55mm2，置信区间95％：34.10-44.40)比较时也没有显著差异(P＝0.872)。就此而言，值得注意的是：与QM1中存在500μg/ml的蛋白质相比，用于点刺诊断的螨提取物制剂分别含有7.96和2.22μg/ml Der p 1和Der p 2。
在这些图示中也可看到QM2与螨提取物(DPT)、nDerp 1和nDerp 2相比分布有显著差异(P＜0.001)。
实施例9：嵌合体的比较SPT值
比较了产生与10mg/ml组胺所产生的风团类似的风团的变应原浓度值。为此，采用Nordic指南(Nordic Guidelines)中所述的方法[(24)Registration ofallergenpreparations(变应原制剂的注册).Nordic Guidelines(1989).NLNPublication 23，Uppsala，Sweden]。对每个患者从不同浓度的各种蛋白所获得的风团的几何平均数计算产生类似于组胺产生的风团的蛋白浓度，然后对研究的每组患者计算这些值的均值。
观察到对于nDer p 1和nDer p 2，产生类似于组胺所产生的风团的蛋白浓度分别为20.5和17.4μg/ml，而对于QM1嵌合体，其浓度高达182.4μg/ml。
实施例10：证明杂合蛋白QM1和QM2的低IgE抗体结合能力的试验
除了体内试验，使用EAST直接技术通过测定特异性IgE进行体外试验。
根据Ceska等[(25)Ceska，M.和Lundkvist，U.(1972).A new andsimpleradioimmunoassay method for the determination of IgE(一种新型和简单的测定IgE 的放射免疫测定法).Immunochemistry 9，1021-1030]通过将天然和重组蛋白(50μg/ml)结合到用溴化氰活化的皿中，并且还结合欧洲尘螨提取物(500μg/ml)，测定特异性IgE。下一步，加入50μl来自患者的血清并且在环境温度下温育1小时。洗涤后，将这些皿与50ul与碱性磷酸酶结合的人抗IgE抗体在37℃下温育30分钟，并且根据生产厂商所述的使用说明以Hytec特异性IgE EIA试剂盒(Hycor BiomedicalInc.)的试验方案进行定量。
获得的结果简单地重新确认了体内获得的结果。QM2嵌合体结合IgE抗体的能力非常低，因为107个研究的血清中仅有7个(6.5％)具有能够结合QM2的IgE抗体。具有QM1特异性IgE的血清数目为88(82.2％)。QM1的IgE结合能力(中位数17.01U/ml，置信区间95％：9.92-27.16)有显著的差异(P＜0.001)，并且低于全提取物(中位数39.35U/ml，置信区间95％：18.80-50.90)(图11)。
实施例11：证明杂合蛋白QM1 QM2的嗜碱性粒细胞激活能力的试验
使用通过流式细胞术测量的嗜碱性粒细胞刺激试验(流式细胞术细胞变应原刺激实验)来进行实验，所述嗜碱性粒细胞刺激实验如Sanz等[(26)Sanz，M.L，.Sgnchez，G.，Gamboa，P.，Vila，L.，Uasuf，C.，Chazot，M.(2001)Allergen-inducedbasophilactivation：CD63 cell expression detected by flow cytometry inpatientsallergic to D.pteronyssinus and Lolium perenne(变应原诱导的嗜碱性粒细胞激活：在对欧洲尘螨和黑麦草过敏的患者中通过流式细胞术检测CD63细胞表达).Clin.Exp.Allergy 31，1007-1013]中所述进行。
通过离心收集位于红细胞上的层中的血细胞并且重新悬浮在含有IL3(2ng/ml)和10μl肝素(5000UI/ml)的HEPES-Ca2+缓冲液(20mM HEPES，133mMNaCl，5mM KCl，7mM CaCl2，3.5mM MgCl2，1mg/ml BSA，pH 7.4)中。向U形底聚苯乙烯平板(Greiner Microlon，Greiner-Bio One，Frickenhausen，Germany)的小杯中加入浓度为2μg/ml-0.02pg/ml的变应原和对照溶液(50μl)，其与50μl来自患者的细胞悬液混合并在37℃下温育40分钟。通过加入无Ca2+或Mg2+但含有0.27mM EDTA的100μl HEPES缓冲液(洗涤缓冲液)终止反应，并将平板离心。细胞沉淀的嗜碱性粒细胞用标记以PE(藻红蛋白)的抗CD63抗体和标记以FITC(异硫氰酸荧光素)的抗IgE抗体(稀释度分别为1∶80和1∶60，Caltag，Burlingame，USA)进行标记，并在4℃下温育30分钟，随后加入4ml红细胞溶解试剂(erythrolytic reagent)(Ortho Diagnostic System，Madrid，Spain)。通过加入洗 涤缓冲液终止细胞裂解，离心细胞后，上清液用500μl相同的缓冲液稀释。使用装有15nW氩激光的FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，USA)在488nm下通过流式细胞术分析嗜碱性粒细胞的表面标志物，并使用CellQuest计算机软件包分析数据。在每个实验中，在至少500个嗜碱性粒细胞中研究抗IgE和抗CD63标记。
单克隆抗IgE抗体Le27(1μl/ml；Bühlmann，Allschwil，Switzerland)用作阳性对照，使用HEPES-Ca2+缓冲液评价无刺激的基线值。当在使用的欧洲尘螨提取物或纯化蛋白的任何浓度下刺激指数(用欧洲尘螨提取物或纯化蛋白激活的％嗜碱性粒细胞/基础条件下激活的％嗜碱性粒细胞)≥2时认为激活反应呈阳性，并且由于该变应原引起的特异性激活＞10％。
对于嵌合体QM1或QM2，没有一个对照受试者显示阳性结果。在33名研究的欧洲尘螨过敏患者中，QM1在28名中产生阳性反应，而QM2仅在10例中存在阳性反应，并且在总是以大大低于QM1的浓度产生阳性反应。
实施例12：证明杂合蛋白QM1和QM2的免疫原性能力的诱导性淋巴细胞增殖实验
低变应原性分子在免疫治疗中的应用的一种基本要求是保持其抗原性(T表位)。因此为了检查除了不结合IgE抗体以外，杂合蛋白是否持续具有抗原性，在通过实验中使用的不同蛋白刺激的外周血单核细胞(PBMC)上进行淋巴细胞增殖研究。通过在纯化淋巴细胞的培养物中掺入荧光素衍生物来进行实验。此衍生物(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE))可通过细胞膜，但直至其被细胞酯酶降解转变为不能通过细胞膜的荧光素化合物才发出荧光。在BD FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson，Franklin Lakes NJ，USA)中通过流式细胞术分析CFSE掺入。
使用淋巴细胞分离溶液(Lymphoprep，Nycomed)通过密度梯度离心分离23名欧洲尘螨过敏患者的PBMC。然后PBMC以1-2x106活细胞/ml重新悬浮在培养基(RPMI 1640，SigmaChemical Co.)中，并且其活力用PBS中的0.25％台盼蓝(Sigma Chemical Co.)来检测。制备的活力大于90％的PBMC立即用于体外增殖试验。RPMI-1640中的10x106PBMC用CFSE(终浓度5μM)在37℃和5％CO2的潮湿气氛中标记10min。用50％的胎牛血清终止标记5min，将它们用添加了10％胎牛血清的RPMI-1640洗涤2次，并以1-2x106细胞/ml重新悬浮在添加了 5％人AB血清的完全培养基(RPMI-1640，50μg/ml庆大霉素和谷氨酰胺2mM)中。将它们置于具有24个小杯的平底微量滴定板(Nunclon，NUNC)中，在1ml的最终体积的培养基中有1-2x106细胞，并以10μg/ml的终浓度加入抗原(欧洲尘螨提取物和不同的纯化蛋白)，并在37℃和5％CO2的潮湿气氛中温育7天。在具有四色荧光性能的BD FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson)中进行流式细胞分析。结果表示为通过Cell Quest软件程序包(Becton-Dickinson)所评价的记录事件的百分比。在所有情况下均包括未刺激培养物的对照一式三份。试验中使用的蛋白质为两种杂合蛋白(QM1和QM2)，欧洲尘螨的纯化蛋白nDer p 1和nDer p 2(天然混合物)和分离自大肠杆菌的重组蛋白rDer p 1和rDer p 2(重组混合物)的两种等摩尔混合物。欧洲尘螨提取物也用作对照。
在第一步骤中，进行一定范围的免疫原蛋白浓度以确定用于随后进行试验的最佳浓度。在所有情况下均观察到显示最大增殖(IE％)的蛋白浓度为10μg/ml。
通过统计学箱形图分析和两个匹配样品的非参量检验分析23名欧洲尘螨过敏患者的增殖结果。从统计学分析可见，用作对照的欧洲尘螨提取物(均值12％，置信区间95％：8-20)的抗原刺激能力与嵌合体QM1(均值15％，置信区间95％：10-25)和QM2(均值13％，置信区间95％：8-17)没有显著的差异(分别为P＝0.121和P＝0.304)。然而，QM1的免疫原性稍高于(P＜0.05)使用天然混合物(均值9％，置信区间95％：5-13)或重组混合物(均值9％，置信区间95％：57-14.5)获得的免疫原性(P＜0.005)。当两种嵌合体彼此比较时，观察到QM1诱导免疫增殖的能力稍高(P＜0.005)(图13)。
从获得的结果可以看出，QM1和QM2两者均一直保持免疫增殖诱导能力，并且与野生型蛋白相比在融合蛋白中甚至更高。
实施例13：QM1和QM2诱导的抗体抑制患者的IgE与天然变应原的结合
为此目的，用杂合蛋白免疫小鼠。6周龄雌性BALB/c小鼠(Haarlam，Barcelona，Spain)经腹膜内使用10μg纯化的nDer p 1和nDer p 2(nD1D2)的等摩尔混合物，吸附至氢氧化铝的QM1或QM2的任一种进行免疫，每15天5次。对于各种蛋白质，使用6只小鼠，并在最后一次强化免疫后10天经颌下静脉放血获得血清，混合并在-20℃下保存备用。
首先，使用ELISA滴定试验检查用nD1D2、QM1和QM2免疫小鼠产生的 抗血清是否对nD1D2有反应性。如实施例7B中所述进行ELISA试验，但加入小鼠抗血清的2倍稀释液，然后各孔与1/2000稀释的辣根过氧化物酶偶联的小鼠抗小鼠IgG抗体(Sigma Chemical，St.Louis，Mo，USA)温育。三次洗涤后，加入200μL/孔的邻苯二胺溶液(Sigma)测量过氧化物酶活性。30min后，通过加入50μl/孔3M H2SO4终止显色反应，在492nm处读取光密度。
用纯化nDer p 1和nDer p 2的等摩尔混合物(nD1D2)、QM1和QM2免疫小鼠产生的抗血清与nD1D2反应，显示用两种杂合蛋白免疫与用nD1D2免疫相比导致较高的nD1D2特异性IgG抗体水平(图14A)。
为了研究针对杂合分子的小鼠IgG是否能够抑制患者血清IgE与nD1D2的结合，使用九个来自屋尘螨(HDM)过敏患者的个体血清或来自30名HDM过敏患者的混合血清(1/50稀释)进行竞争ELISA。ELISA滴定板(Greiner)用PBS中的nD1D2包被(100ng/孔)过夜，用6只小鼠的抗nD1D2、抗QM1和抗QM2混合血清的1/20稀释液预温育。使用免疫前混合血清作为免疫对照。洗涤后，滴定板与来自HDM过敏患者的个体血清(1/20和1/50稀释)或混合血清(1/50稀释)温育。结合的IgE抗体用1/2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgEmAb(Southern，Birmingham，AL)和邻苯二胺(Sigma)检测。阻断能力表示为不加入小鼠血清的孔的信号百分比。
杂合蛋白免疫产生的特异性小鼠抗体能够以不同的方式阻断9名螨过敏患者的IgE与纯化的nDer p 1和nDer p 2的等摩尔混合物(nD1D2)的结合。用小鼠抗nD1D2抗体获得的抑制为41-72％(均数56％)，而小鼠抗QM1和抗QM2抗体对血清IgE与nD1D2的结合的抑制分别为43-82％(均数60％)以及0-45％(均数20％)(表I)。使用小鼠抗nD1D2抗体获得的抑制稍低于(尽管没有统计学差异；P＝0.139)使用小鼠抗QM1抗体获得的抑制。小鼠抗QM2组中获得的抑制与在抗nD1D2和抗QM1组中获得的抑制有显著的差异(P＜0.01)。
表I：nD1D2-、QM1-和QM2-特异性小鼠IgG抗体对患者IgE与nD1D2结合的抑制百分比。
§与抗nD1D2组没有统计学上显著的差异(P＝0.139)。
*与抗nD1D2和抗QM1组有统计学上显著的差异(P＜0.01)。
另外，使用来自30名HDM过敏患者的混合血清评价小鼠阻断抗血清(图14B)。针对QM1和QM2产生的小鼠IgG抑制血清IgE与nD1D2结合分别达71％和26％，而使用小鼠抗nD1D2抗体或免疫前血清获得的抑制分别为65％和17％(图6B)。QM2诱导的IgG对IgE反应性的部分抑制是由于特异性IgE对Der p 2的抑制非常小而引起的。抗QM2IgG抗体干扰患者IgE与Der p 2结合的能力大大低于抗QM1血清(分别为13和85％)。相反，在两种小鼠抗血清中对IgE与Der p 1结合的抑制是相当的(抗QM2的抑制：52％；抗QM1的抑制：52％)(图14B)。
用各种杂合蛋白诱导的IgG抑制HDM过敏患者血清的IgE与nD1D2的结合，尽管QM1诱导的IgG显示的抑制能力高于用QM2诱导的IgG。
如使用QM2诱导的抗血清所见到的这种仅部分抑制IgE反应性也见于Phl p2-同源嵌合体[(30)Mothes-Luksch，N.，Stumvoll，S.，Linhart，B.，Focke，M.，Krant，M-T.，Hanswirth，A.，Valent，P.，Verdino，P.，Keller，W.，Grote，M.，Valenta，R.(2008).Disruption of allergenic activity of the major grass pollen allergen Phl p2byreassembly as mosaic protein(通过再组装为嵌合蛋白破坏主要青草花粉变应原Phlp 2的变应原活性).J Immunol 181，4864-4873]。在该文中，作者认为可能由于IgE表位的破坏，导致因此不能诱导针对原始IgE表位的IgG。对于QM2可能是这种情况，因为IgE与Derp 2结合的IgG阻断活性非常低，并且此杂合蛋白的IgE反应性几乎消失。
小鼠抗nD1D2抗体抑制IgE与其自身的结合的低能力(60-65％；表I和图14B)类似于对Der p 2特异性IgE的报道[Chen，K-W.，Fuchs，G.，Sonneck，K.， Gieras，A.，Swoboda，I.，Douladiris，N.，Linhart，B.，Jankovic，M.，Pavkov，T.，Keller，W.，Papadopoulos，N.G.，Valent，P.，Valenta，R.，Vrtala，S.(2008).Reduction of thein vivoallergenicity of Der p 2，the major house-dust mite，by genetic engineering(通过遗传工程减小主要屋尘螨Der p 2的体内变应原性).Mol Immunol.45，2486-2498]。鼠IgG和人IgE对螨变应原的应答的特异性之间的这些差异可部分地受不同的免疫方式的影响，如之前由Chapman等(1987)所报道的那样[Chapman，M.D.，Heymann，P.W.，Platts-Mills，T.A.E.(1987).Epitope mapping oftwo major inhalant allergens，Der p 1 andDer p 2，from mites of the genusDermatophagoides(来自尘螨属螨的两种主要吸入性变应原Der p 1和Der p 2的表位作图).J Immunol.139，1479-1484]。在通过含有佐剂的IP注射液免疫的小鼠中，抗原被很大程度地加工，而在通过吸入微量的变应原而无佐剂致敏的人中，进行有限的变应原加工或不同形式的加工。QM1和QM2两者均显示很高的T细胞刺激能力，并且与单独分子相比诱导较强的保护性抗体应答。
从上可以得出结论，杂合蛋白QM1和QM2是两种低变应原性分子，能够开发出针对欧洲尘螨过敏的令人满意的免疫治疗。
施用方法
本发明涵盖上述低变应原性嵌合体或由其衍生的合成肽在哺乳动物中的脱敏治疗中的应用。脱敏方法涉及通过胃肠外(皮下、静脉内或肌内)、吸入、口服、舌下、经鼻或经直肠途径反复施用所讨论的变应原。嵌合体可根据当前法律和适用的临床程序单独施用或与药学可接受的稀释剂和赋形剂联合施用。
序列表
<110>Bial Industrial Farmac éutica，S.A.
<120>用于治疗变态反应的主要1类和2类螨变应原的低变应原性杂合蛋白
<130>杂合蛋白
<160>8
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>1017
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>QM1
<400>1
gtcaaagata gtgccaatca tgaaatcaaa aaagttttgg taccaggatg ccatggttca 60
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caaaactcaa aaaccgctaa aattgaaatc aaagcttcaa tcgatggttt agaagttgat 180
gttcccggta tcgatccaaa tgcatgccat tatatgaaat gtccattggt taaaggacaa 240
caatatgata ttaaatatac atggaatgtt ccgaaaattg caccaaaatc tgaaaatgtt 300
gtcgtcactg ttaaagttat gggtgataat ggtgttttgg ccagtgctat tgctacctgc 360
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Claims (15)
1.由氨基酸序列SEQ ID No.:2组成的多肽。
2.由编码权利要求1的多肽的核苷酸序列组成的多核苷酸。
3.根据权利要求2的多核苷酸，其由核苷酸序列SEQ ID No.:1组成。
4.包含权利要求2或3所述的多核苷酸的表达载体。
5.用根据权利要求4所述的表达载体转化的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，所述细胞是真核细胞。
7.根据权利要求5所述的宿主细胞，所述细胞是原核细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其属于大肠杆菌(E.coli)属。
9.用于产生多肽的方法，其特征在于其包括培养权利要求5-8中任一项所述的宿主细胞，并且分离和纯化由所述宿主细胞产生的多肽。
10.权利要求1所述的多肽或权利要求4所述的表达载体在制备用于治疗或预防变态反应的组合物中的应用。
11.药物制剂，其特征在于其包含权利要求1所述的多肽，或权利要求4所述的表达载体，和任选地包含药理学可接受的赋形剂或佐剂。
12.根据权利要求11所述的药物制剂，其具有冻干、层压、溶液、混悬液或乳液的形式。
13.根据权利要求11所述的药物制剂，其用于皮下、舌下、口服、经鼻、经直肠或吸入给药。
14.根据权利要求11所述的药物制剂，其用于局部给药。
15.根据权利要求11所述的药物制剂，其用于胃肠外给药。
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