JP2011517407A - アレルギーの治療に用いるための、主要グループ1ダニアレルゲンおよび主要グループ2ダニアレルゲンの低アレルゲン性ハイブリッドタンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
− ワクチンと効果細胞に固定されたIgE抗体との反応性に起因する重大な逆反応。
− 免疫療法開始後の、ワクチンに存在する他のアレルゲンへの新たな感作の発生。
− いくつかのアレルゲン抽出物における、標準化された生産の困難。
節足動物門
クモ綱
ダニ亜綱
コナダニ目
Glycyphaginae 亜科
Blomia 属
B. freemani
B. kulagini
B. tropicalis
Glycyphagus 属
G. domesticus
Lepidoglyphus 属
L. destructor
Labidophorinae 亜科
Gohieria 属
G. fusca
Dermatophagoidinae 亜科
Dermatophagoides 属
D. evansi
D. farinae
D. microceras
D. pteronyssinus
D. siboney
D. neotropicalis
Hirstia 属
H. domicola
Malayoglyphus 属
M. carmelitus
Pyroglyphinae 亜科
Euroglyphus 属
E. maynei
Acarus 属
A. siro
Tyrophagus 属
T. longior
T. putrescentiae
Chortoglyphus 属
C. arcuatus
生化学名: システインプロテアーゼ、28kDa(SDS−PAGE)、アレルギー過程においてアジュバント効果を引き起こす可能性のあるタンパク質分解活性を有する。
アレルゲン性: RIAおよびRAST(r=0.82、p<0.001、n=30)による測定によると、血清において、Der p 1 に対するIgEと D. pteronyssinus の抽出物に対するIgEとの間に正の相関関係がある。検査した11人の患者のすべてが、Der p 1 への応答において陽性の皮膚試験結果を示した(<10-2μg/ml)。42人のダニアレルギー患者の92%がRASTにおいて rDer p 1 に特異的なIgEを有していた。
生化学名: NPC2ファミリーに属する、15kDa(SDS−PAGE)。
アレルゲン性: 12人のダニアレルギー患者のうち9人(75%)が Der p 2 への応答において陽性の皮膚試験結果を示した(<10-3μg/ml)。65人のダニアレルギー患者のうち59人(90.7%)がRASTにおいて Der p 2 に特異的なIgEを有していた。45人のダニアレルギー患者のうち32人(71%)がRASTにおいて Der p 2 に特異的なIgEを有していた。35人のダニアレルギー患者の100%がRASTにおいて Der p 2 に特異的なIgEを有していた。
生化学名: トリプシン、31kDa(SDS−PAGE)。
アレルゲン性: 55人のダニアレルギー患者の100%がRASTにおいて Der p 3 に特異的なIgEを有していた。35人のダニアレルギー患者の97%がRASTにおいて Der p 3 に特異的なIgEを有していた。
生化学名: α−アミラーゼ、60kDa(SDS−PAGE)。
アレルゲン性: 精製した Der p 4 を用いたイムノブロットを行ったとき、27人の大人のダニアレルギー患者の46%が Der p 4 に特異的なIgEを有しており、20人の子どものダニアレルギー患者の25%が Der p 4 に特異的なIgEを有していた。検査した10人のダニアレルギー患者のうち3人がドットブロットにおいて Der p 4 に特異的なIgEを有していた。
サイズ: 14kDa(SDS−PAGE)のタンパク質、記載された他のタンパク質に対して有意の相同性を示さない。
アレルゲン性: 19人のダニアレルギー患者のうち6人(31%)がRIAにおいて Der p 5 に特異的なIgEを有していた。20人のダニアレルギー患者のうち7人(37%)が皮膚プリック試験において Der p 5 に対して10-4〜10-2μg/mlの範囲の陽性反応性を示した。イムノブロットを行ったとき、ダニアレルギー患者の38個の血清のうち21個が Der p 5 を認識した。
生化学名: ケモトリプシン(chemotrypsin)、25kDa(SDS−PAGE)。
アレルゲン性: 41%(88人のうちの36人)のダニアレルギー患者がRASTにおいて Der p 6 に特異的なIgEを有していた。44%(18人のうちの8人)のダニアレルギー患者が Der p 6 を用いた皮下内皮膚試験において陽性反応を示した。35人のダニアレルギー患者の65%がRASTにおいて Der p 6 に対して陽性であった。
・Der p 7
サイズ: 26kDa、30kDa、31kDa(SDS−PAGE)のタンパク質の群、記載された他のタンパク質に対して有意の相同性を示さない。
アレルゲン性: 53%(30人のうちの16人)のダニアレルギー患者が rDer p 7 を用いた皮下試験において陽性反応を示した(1μg/ml)。38人の子どものうち14人(37%)が rDer p 7 に特異的なIgEを有していた。41人のダニアレルギー患者のうち19人(46%)がRIAにおいて rDer p 7 に特異的なIgEを有していた。
生化学名: グルタチオンS−トランスフェラーゼ、27kDa(SDS−PAGE)。
アレルゲン性: イムノブロットにおいて、ダニアレルギー患者の40%が rDer p 8 を認識した。
生化学名: コラーゲン分解性セリンプロテアーゼ、29kDa(SDS−PAGE)。
アレルゲン性: 35人のダニアレルギー患者の92%がRASTにおいて Der p 9 に特異的なIgEを有していた。
生化学名: トロポミオシン、36kDa(SDS−PAGE)。
アレルゲン性: 35人のダニアレルギー患者の5.6%がRASTにおいて組換え Der p 10 に特異的なIgEを有していた。
生化学名: パラミオシン、103kDa(SDS−PAGE)。
アレルゲン性: イムノドットによって測定した、Der p 11 に特異的IgE血清の存在は、患者群に依存して、41.7%〜66.7%の範囲で変動した。しかし、非アトピー性の蕁麻疹患者の場合や正常な人の場合では低かった(それぞれ18.8%、8%)。
生化学名: アポリポホリン、177kDa(SDS−PAGE)。
アレルゲン性: Der p 14 は有意のIgE応答とT細胞の刺激を誘導する。
生化学名: アルギニンキナーゼ、分子量は記載されていない。
生化学名や分子量は記載されていない。
上記の背景に留意しながら、本発明者らは、アレルギーの治療、特にダニによって引き起こされるアレルギーの治療のための新規な有利な方法を研究した。広範な研究の結果、本発明者らは、D. pteronyssinus の2種類のアレルゲン(Der p 1 および Der p 2)の断片を結合させることによって形成される新規なハイブリッドタンパク質に基づくダニアレルギー治療のための新規で効果的な方法、および、それらのタンパク質を得るための各種の方法・手段を発見した。本発明の低アレルゲン性ハイブリッドタンパク質は、個々の天然のアレルゲンやそれらの混合物に比べて有意に低いアレルゲン性を有することができる。たとえば、本発明のハイブリッドタンパク質は、個々の天然のアレルゲン及び/又はそれらの混合物のIgE結合能の60%未満の、好ましくは50%未満の、さらに好ましくは40%未満、さらに好ましくは20%未満の、さらに好ましくは10%未満の、さらに好ましくは2%未満の結合能を有することができる。本発明のハイブリッドタンパク質は、i)D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清のプールを用いた in vitro ELISA、ELISA−阻害およびイムノブロッティング試験、ii)D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者を対象とする in vivo 皮膚反応性試験、iii)D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血液から単離した好塩基球の ex vivo 活性化試験、およびiv)D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の個々の血清を用いた in vitro EAST試験、に基づいてより低いIgE結合能を有することが示されるので、「低アレルゲン性」ということができる。さらに、本発明のハイブリッドタンパク質は、i)T細胞反応性を示す D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す23人の患者から採取した抹消血単核球(PBMC)を用いたリンパ球増殖研究によって実証されているように、免疫原性を維持し、ii)マウスをハイブリッドタンパク質で免疫化した後の野生タンパク質よりも免疫原性が高く、iii)マウスに「ブロッキング」抗体、即ち Der p 1−特異的IgGおよび Der p 2−特異的IgG(これらは、チリダニアレルギー患者のIgEが天然アレルゲンである Der p 1 および Der p 2 に結合するのを阻害する)を誘導する能力を有する。
本発明の微生物の株は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に基づき、バレンシア大学の Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) (Universidad de Valencia, Edificio de Investigacion, Campus de Burjasot, 46100 BURJASOT, Valencia) に、下記の参照番号で寄託した。
CECT 7317 Escherichia coli QM1
CECT 7318 Escherichia coli QM2
寄託日は2007年10月3日である。
本発明の低アレルゲン性ハイブリッドタンパク質は、QM1の場合には、両方のタンパク質(Der p 1 および Der p 2)の融合とジスルフィド架橋(8番〜119番残基)の1つの除去によって得られ、QM2の場合には、Der p 2の73番残基と74番残基との間にタンパク質 Der p 1 を挿入することによって得られる。驚くべきことに、これらの変化にもかかわらず、本発明のハイブリッドタンパク質(QM1およびQM2)は、より高いT細胞刺激活性を示し(図13)、分離された野生の分子よりも強い免疫原性を示した(図14A)。
D. pteronyssus(スペイン国、マドリード、Laboratorios Leti 社製)の凍結乾燥体と糞の混合物を出発物質として用い、1mmのPMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド)を添加した10容量(p/v)のPBS(リン酸緩衝食塩水)において4℃で急速撹拌しながら15分間抽出した。次に3,800×gで4℃で15分遠心分離した。抽出上清をAP(Millipore 社製)で濾過し、361g/lの60%硫酸アンモニウムを30分かけてゆっくりと加えた。4℃で1時間撹拌した後、17,000×gで4℃で15分遠心分離した。
遠心分離後に得られたペレットをpH8.0の20mM Trisの2mlに再懸濁し、0.22μmで濾過した。PBSで平衡させた Superdex S200 16/60カラム(スウェーデン国、ウプサラ、GE-Healthcare 社製)に前工程で得た2mlの再懸濁物を注入して、分子篩クロマトグラフィーを行なった。排除容量から3mlの画分を回収し、非還元条件でSDS−PAGEで分析し、24kDaの画分と合わせた。次に、pH8.5の20mM Trisで平衡させた HighTrap Q カラム(GE-Healthcare 社製)でアニオン交換クロマトグラフィーを行なった。前工程で得た陽性画分を5リットルの蒸留水で120分間透析し、pH8.5の20mM Trisに加えた。得られたサンプルを1ml/分で注入し、pH8.5の20mM Tris中の200〜1000 mM NaClの勾配で溶出させた。
239g/lの60%硫酸アンモニウムを沈殿上清に加えて濃度を95%とし、4℃で一晩撹拌した。それから、17,000×gで4℃で15分遠心分離し、得られたペレットを25mlの MilliQ 水に再懸濁した。次に、pH8.0の50mM Trisで平衡させた HighFlow Q 16/20 カラム(GE-Healthcare 社製)でアニオン交換クロマトグラフィーを行なった。得られたサンプルを5リットルの水で一晩透析し、その間に水を3回取り替えた。その後、pH8.0の20mM Trisに加えた。得られたサンプルを5ml/分で注入し、非結合画分を回収した。第3精製工程として、pH5.5の20mM AcNaで平衡させた HighTrap SP カラム(GE-Healthcare 社製)でカチオン交換クロマトグラフィーを行なった。前工程で得た非結合画分を5リットルの水で3時間透析し、pH5.5の20mM AcNaに加えた。得られたサンプルを1ml/分で注入し、pH5.5の20mM AcNa中の200〜1000 mM NaClの勾配で溶出させた。最終精製工程として、PBSで平衡させた Superdex S75/300カラム(GE-Healthcare 社製)で分子篩クロマトグラフィーを行なった。前工程で得た、200 mM NaClで溶出した画分を Amicon Ultra 4(Millipore社製)で濃縮し、0.4ml/分で注入し、0.5mlの画分を回収した。画分をSDS−PAGEで分析した。16kDaのタンパク質を含む画分(Der p 2 に対応する)をプールした。
逆転写を行なった後、Dermatophagoides から単離したmRNAからなるテンプレートと、特定のプライマーとを用いるPCR増幅を行なうことにより、アレルゲン Der p 1 と Der p 2 の相補的DNA(cDNA)をクローニングした。mRNAは、D. pteronyssus(スペイン国、マドリード、Laboratorios Leti社製)の100mgから Quick Prep MicroRNA Purification キット(GE-Healthcare 社製)を用いて単離した。cDNAは、First-Strand cDNA 合成キット(GE-Healthcare 社製)を用いてmRNAの逆転写を行って得た。
Der p 1 をコードするcDNAの領域を、公知の配列(GenBank アクセス番号: P08176)に基づいて設計したプライマーを用いるPCRで増幅した。直接プライマー 5’-ACTGACAGGCCTCGTCCATCATCGATCAAAAC-3’(配列番号5)は酵素 StuIの切断配列(下線部)を含み、逆プライマー 5’-CGGAATTCCTAGGTTAGAGAATGACAACATATGG-3’(配列番号6)はエンドヌクレアーゼ EcoRI の切断配列(下線部のうち5’側の6塩基 GAATTC)とエンドヌクレアーゼ AvrII の切断配列(下線部のうち3’側の5塩基 CTAGG)とを含む。増幅条件は以下の通り。94℃で1分(1サイクル);94℃で30秒、48℃で1分、72℃で1分(35サイクル);72℃で10分(1サイクル)。得られたPCR産物を単離し、pGEM(Promega 社製)ベクターでクローニングし、配列決定した。
Der p 2 をコードするcDNAの領域を、公知の配列(AAF86462)に基づいて設計したプライマーを用いるPCRで増幅した。直接プライマー 5’-CGGGATCCGATCAAGTCGATGTCAAAG-3’(配列番号7)は制限酵素BamHIの切断配列を含み、逆プライマー 5’-CGGAATTCTTAATCGCGGATTTTAGC-3’(配列番号8)は制限酵素 EcoRI の切断配列を含む。増幅条件は以下の通り。94℃で1分(1サイクル);94℃で30秒、48℃で1分、72℃で1分(35サイクル);72℃で10分(1サイクル)。得られたPCR産物を単離し、pBluescript II KS ベクター(Stratagene 社製)でクローニングし、配列決定した。Der p 2のcDNAをコードするプラスミドDNAを、制限酵素 BamHI/EcoRI で消化して単離し、pKN172 ベクターでサブクローンした[(20) Way, M., Pope, B., Gooch, J., Hawkins, M., Weeds, A.G. (1990) Identification of a region in segment 1 of gelsolin critical for actin binding. EMBO J. 9; 4103-4109 and pTrcHis A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)]。
Hanahan法 [(21) Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580] を用いて、対応するプラスミドで形質転換した E. coli BL21 (DE3)の細胞を、200μg/mlのアンピシリンを加えたLB培地を含むペトリ皿に広げた。細胞コロニーで50mlの同培地を予備接種し、37℃で撹拌(260rpm)しながら一晩インキュベートした。1リットルの同培地に該予備接種物を接種し、光学密度(600nm)を0.2とした。これを37℃で撹拌しながら、光学密度(600nm)が0.6に達するまでインキュベートし(約90分)、この時点で、イソプロピル−チオ−β−ガラクトシド(IPTG)を最終濃度0.6mMで用いて誘導を行なった。3時間の誘導の後、細胞を遠心分離で回収した。
Der p 2 のプラスミドDNAを、以下のプライマーを用いるPCRで増幅した。プライマー 5’-CGGGATCCGTCAAAGATAGTGCCAATC-3’ とプライマー 5’-ACGGATCTGCAGGTAGCAATAGCACTGGCCAA-3’ であり、前者は制限酵素 BamHI の切断配列(下線部)を含み、後者は制限酵素 PstI の切断配列(下線部)を含む。増幅条件は以下の通り。94℃で1分(1サイクル);94℃で30秒、56℃で30秒、72℃で1分(35サイクル);72℃で10分(1サイクル)。得られた断片を、BamHI/PstI で切断した pBluescript KS ベクター(Stratagene 社製)に連結し、配列決定した。この構築物を酵素 PstI/EcoRI で消化し、Der p 1 の初期配列を酵素 PstI/EcoRI で消化して得られた Der p 1 の成熟タンパク質の部分配列を連結挿入した。得られた融合タンパク質を発現ベクター pKN172 と pTrcHis の BamHI/EcoRI 部位にサブクローンした。
以下の3つの断片を結合して融合タンパク質2を構築した。
対応するプラスミドで形質転換した E. coli BL21 (DE3)の細胞コロニーを200μg/mlのアンピシリンを加えたLB培地から単離し、細胞コロニーで50mlの同培地を予備接種し、37℃で撹拌(260rpm)しながら一晩インキュベートした。1リットルの同培地に該予備接種物を接種し、光学密度(600nm)を0.2とした。これを37℃で撹拌しながら、光学密度(600nm)が0.6に達するまでインキュベートし(約90分)、この時点で、イソプロピル−チオ−β−ガラクトシド(IPTG)を最終濃度0.6mMで用いて誘導を行なった。3時間の誘導の後、細胞を遠心分離で回収した。
組換えバクテリアの溶解条件と、尿素を除去する段階的透析によるリフォールディングは、rDer p 2 の精製(実施例3)と同様に行なった。最終的に透析による酸化的フォールディングを、pH8.0の50mM Tris中の1リットルの5mM システイン/1mM シスチンを用いて4℃で一晩行なった。最後に3,800×gで4℃で10分遠心分離した。得られた上清をAP(Millipore 社製)で濾過し、pH8.5の2mM リン酸塩で2時間透析し、18,000×gで15分遠心分離して沈殿物を除去した。精製の最終収率は培地1リットル当たり120mgであった。
組換えバクテリアの溶解条件は、rDer p 2 の精製(実施例3)と同様に行なった。50mM DTTを、10mlの6M グアニジンクロリド中のタンパク質135mgに加え、室温で1時間インキュベートした。次に、0.2M 2−ヨードアセトアミドを加えて、室温で1時間インキュベートした。最後に、0.2M β−メルカプトエタノールを加えて、室温でさらに1時間インキュベートし、6M 尿素を加えて50mlとした。次に、rDer p 2 の精製(実施例3)と同様に、フォールディングを透析により段階的に行って尿素を除去し、3800×gで15分遠心分離して沈殿物を除去した。次の段階の精製では、pH10.0の20mM エタノールアミンで平衡させた HighFlow Q 16/20 カラムでアニオン交換クロマトグラフィーを行なった。サンプルを5ml/分の速度で流し、非結合物質を回収してAmicon Ultra 4(Millipore 社製)で濃縮した。3800×gで15分遠心分離し、APと0.45μmフィルターで濾過して沈殿物を除去した。最後に、200mM NH4HCO3で平衡させた Superdex SX200 16/60カラムにて1ml/分の速度で分子篩クロマトグラフィーを行なった。タンパク質自体の凝集性により、タンパク質が溶出液中に析出した。純粋調製物を同じバッファー中で凍結乾燥して4℃で保存した。精製の最終収率は培地1リットル当たり42.4mgであった。
キメラQM1とキメラQM2のIgE結合活性の初期評価を、イムノトランスファー技法を用いて、D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物について行なった。タンパク質抽出物と精製タンパク質をポリアクリルアミドゲルに乗せ、Towbin et alの方法によりエレクトロトランスファーを行なった [Towbin, H., Staehelin, I., and Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354]。SDS−PAGEで分離したタンパク質をPVDF(ポリビニリデン ジフルオライド)Hybond-P シート(GE-Healthcare 社製)へ エレクトロトランスファーした。シートを室温で1時間ブロッキングした後、1次抗体と共に4℃で一晩インキュベートし、同じ洗浄バッファーで何回も洗浄し、シートを、ペルオキシダーゼを結合した2次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。バンド検出を、ECL化学ルミネセンス法(GE-Healthcare 社製)(製造者の表現)を用いて、シートをフィルム(Hyperfilm.ECL、GE-Healthcare 社製)に暴露することにより行った。
D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清を個別に用いて、2つのキメラのIgE反応性をELISA技法で分析した。純粋タンパク質 nDer p 1 と純粋タンパク質 nDer p 2 の等モル混合物をPBSバッファー(10mM リン酸塩 pH7.2; 137mM NaCl、2.7mM KCl)に加えて得た試験液を、ポリスチレン製プレート(Greiner 社製)に0.1μg/ウェルの量で乗せて、室温で一晩インキュベートした。これらに、1% BSA−0.05% Tween 20を加えたPBSを200μl/ウェルの量で加えてブロックし、37℃で1時間静置した。次に、D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物を1/4に希釈したものを100μl/ウェルの量で加えて、37℃で90分間静置した。200μl/ウェルの量のPBS−T(PBS+0.05% Tween 20)で3回洗浄した後、ペルオキシダーゼを結合した抗ヒトIgEイムノグロブリン坑血清(Dako 社製)(希釈率1:1000)を100μl/ウェルの量で加えて、37℃で90分間インキュベートした。PBS−Tでさらに3回洗浄した後、製造者の指示書にしたがい、o−フェニレンジアミン(Sigma 社製、Sigma-Fast Tablet Sets)の溶液を200μl/ウェルの量で加えて、プレートを30分間暗所に静置した。3M H2SO4を50μl/ウェルの量で加えて反応を停止し、492nmでの吸収を ELISA Easy Reader EAR-400 AT プレートリーダー(SLT-Lab Instruments 社製)で測定した。
D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物を用いて、2つのキメラへのIgE反応性をELISA阻害技法で分析した。この技法は、D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物を1/10に希釈したものを所定濃度(0.025〜2500ng/ml)の阻害性タンパク質と共に4℃で一晩プレインキュベートする以外は、前記の技法と同じである。IgEに結合した抗体を、直接ELISAの場合と同様に検出する。
低アレルゲン性分子を免疫療法において用いるためには、該分子の抗原性(Tエピトープ)が維持されることが絶対に必要である。したがって、IgEを結合しないことに加えて、ハイブリッドタンパク質が抗原性を保持し続けるかどうかを調べるために、実験で用いた様々なタンパク質によって刺激された抹消血単核球(PBMC)に基づいてリンパ球増殖研究を行った。実験は、フルオレセイン誘導体を精製リンパ球の培養物に導入することによって行った。この誘導体(カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル(CFSE)は、細胞膜を通過することはできたが、細胞エステラーゼによって分解されて、細胞膜を通過できない蛍光性化合物に転換されるまでは蛍光性ではなかった。CFSEの導入は、BD FACSCalibur フローサイトメーター(米国、ニュージャージー州、フランクリンレイクス、Becton-Dickinson 社製)を用いたフローサイトメトリーによって分析した。
この目的のために、ハイブリッドタンパク質によってマウスを免疫した。6週齢のメスのBALB/cマウス(スペイン国、バルセロナ、Haarlam 社製)に、精製した nDer p 1および nDer p 2 の等モル混合物(nD1D2)、または水酸化アルミニウムに吸着させたQM1若しくはQM2を10μgの量で、15日毎に5回、腹腔内投与することにより、該マウスを免疫した。各タンパク質につき6匹のマウスを使用し、顎下静脈からの出血による最後の追加免疫(boost)の10日後に血清を得、使用まで−20℃でプール、保管した。
本発明は、哺乳類の除感作治療における、上記した低アレルギー誘発性キメラまたは該キメラ由来の合成ペプチドの使用を含む。除感作法は、問題のアレルゲンの非経口(皮下、静脈内または筋肉内)、吸入、経口、舌下、経鼻、または直腸経路に繰り返し投与することを含む。該キメラは、現行の法規と利用できる製薬過程に基づき、単独で投与することも、他の薬理学的に許容される希釈剤または賦形剤と共に投与することもできる。
配列番号2: タンパク質QM1
配列番号3: QM2
配列番号4: タンパク質QM2
配列番号5: PCR
配列番号6: PCR
配列番号7: PCR
配列番号8: PCR
Claims (26)
- グループ1ダニアレルゲンのアミノ酸配列の断片およびグループ2ダニアレルゲンのアミノ酸配列の断片を包含する、アレルゲン活性の低減したポリペプチドであって、該配列は1つまたは2つ以上のIgE抗体結合エピトープを欠失し、該断片は少なくとも50個の長さのアミノ酸残基を含むことを特徴とするポリペプチド。
- グループ2のアレルゲンの配列のIgE抗体結合エピトープの少なくとも1つが、少なくとも1つのジスルフィド架橋の除去によって欠失していることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
- 少なくとも1つのジスルフィド架橋が、該ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基の少なくとも1つが代わりのアミノ酸残基で置換されることによって欠失していることを特徴とする、請求項2に記載のポリペプチド。
- グループ2アレルゲンである全長成熟タンパク質の8番および119番の位置におけるシステイン残基の少なくとも1つが置換されていることを特徴とする、請求項3に記載のポリペプチド。
- 少なくとも1つのジスルフィド架橋が、追加的アミノ酸配列の挿入によるグループ2アレルゲンの配列の破壊によって欠失していることを特徴とする、請求項2に記載のポリペプチド。
- グループ2アレルゲンのアミノ酸配列が、グループ1アレルゲンのアミノ酸配列の断片の挿入によって破壊されていることを特徴とする、請求項5に記載のポリペプチド。
- グループ1アレルゲンのアミノ酸配列の断片が、成熟したグループ1アレルゲンの5番〜222番残基からなる断片であることを特徴とする、請求項6に記載のポリペプチド。
- グループ1ダニアレルゲンが D. pteronyssinus アレルゲン(Der p 1)であり、グループ2ダニアレルゲンが D. pteronyssinus アレルゲン(Der p 2)であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載のポリペプチド。
- 配列番号2の配列に少なくとも70%の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 配列番号4の配列に少なくとも70%の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号1の配列に少なくとも70%の相同性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号3の配列に少なくとも70%の相同性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項11〜13のいずれかに記載のポリヌクレオチドの配列を含む発現ベクター。
- 請求項14に記載の発現ベクターで形質変換した宿主細胞。
- 真核細胞であることを特徴とする、請求項15に記載の宿主細胞。
- 原核細胞であることを特徴とする、請求項15に記載の宿主細胞。
- E. coli 属に属することを特徴とする、請求項17に記載の宿主細胞。
- 請求項15〜18のいずれかに記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞によって生産されたポリペプチドを単離し精製することを含むことを特徴とする、ポリペプチドを生産するための方法。
- アレルギーの治療または予防に用いるための、請求項1〜10のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項14に記載の発現ベクター。
- アレルギーの治療または予防に用いる組成物の製造における、請求項1〜10のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項14に記載の発現ベクターの使用。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項14に記載の発現ベクターを含み、場合によってはさらに、薬理学的に許容される賦形剤またはアジュバントを含むことを特徴とする薬剤。
- 請求項22に記載の薬剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、アレルギーを治療または予防するための方法。
- 冷凍乾燥体、積層体、溶液、懸濁液または乳化液の形であることを特徴とする、請求項20に記載の薬剤。
- 皮下投与、舌下投与、経口投与、経鼻投与、直腸投与、局所投与、吸引投与または非経口投与のための、請求項20に記載の薬剤。
- 置換されたシステイン残基の少なくとも1つがセリン残基で置換されていることを特徴とする、請求項4に記載のポリペプチド。
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