ES2340767T3 - Alergenos de acaros del polvo domestico. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido seleccionado del grupo constituido por: a) polipéptidos que comprenden un fragmento de al menos 18 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1; b) polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1; y c) polipéptidos constituidos por un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1.
Description
Alergenos de ácaros del polvo doméstico.
La presente invención se refiere a nuevos
alergenos de ácaros del polvo doméstico, a polipéptidos derivados
de dichos alergenos y polinucleótidos que codifican los mismos.
Además, la invención proporciona anticuerpos dirigidos contra los
alergenos y el uso de los polipéptidos, polinucleótidos y/o
anticuerpos en el tratamiento y el diagnóstico de trastornos
alérgicos.
Más del 25% de la población sufre de alergias
mediadas por IgE. Los pacientes alérgicos se caracterizan por un
aumento en la producción de anticuerpos IgE contra antígenos per
se inofensivos (es decir, alergenos). Los síntomas inmediatos
de la alergia tipo I (rinoconjuntivis alérgica, asma, dermatitis,
shock anafiláctico) los causa la reticulación inducida por
alergenos de anticuerpos IgE ligados a células cebadas y la
liberación de mediadores biológicamente activos (p. ej. histamina,
leucotrienos).
Los ácaros del polvo doméstico (APD) representan
una de las fuentes de alergenos más importantes en todo el mundo.
Casi el 10% de la población y más del 50% de los pacientes alérgicos
están sensibilizados a los alergenos de ácaros. El APD
Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) representa la
principal fuente de alergenos de interiores en Europa Central (1).
Los alergenos de Der p comprenden más de 30 proteínas o
glicoproteínas que presentan reactividad cruzada con alergenos de
otras especies de ácaros. Hasta la fecha se han caracterizado
diecinueve grupos de alergenos. Entre los 19 grupos de alergenos de
APD descritos, los grupos 1 y 2 (Der p 1 y Der p 2) constituyen los
alergenos más relevantes, pero se ha demostrado que también otros
alergenos de APD (p. ej. Der p 5 y Der p 7) representan alergenos
de Der p importantes que son reconocidos aproximadamente por el 50%
de los pacientes alérgicos a Der p (2).
Pittner et al. (2004) Clin. Exp. Allergy
34: 597 - 603 describen estudios sobre diagnóstico de componentes
alergénicos de la alergia a ácaros del polvo doméstico con alergenos
de ácaro naturales purificados y recombinantes.
Los extractos crudos de APD que se utilizan en
la actualidad para el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes
alérgicos a APD están estandarizados sólo para Der p 1 y Der p 2,
mientras que otros alergenos importantes están presentes en los
extractos de APD sólo en cantidades pequeñas. Por lo tanto, la
inmunoterapia específica de APD parece ser menos eficiente que la
inmunoterapia con alergenos de polen. El uso de alergenos
recombinantes para el diagnóstico y el tratamiento podría soslayar
este problema.
Por lo tanto, un problema técnico que subyace en
la presente invención es identificar y aislar nuevos alergenos
responsables de la alergia o la sensibilización a APD.
La solución al anterior problema técnico la
proporcionan las realizaciones de la presente invención,
caracterizadas en las reivindicaciones.
En particular, los inventores han logrado la
identificación de un nuevo alergeno Der p que es útil para el
diagnóstico y el tratamiento de los pacientes alérgicos a Der p. El
ADNc que codifica este nuevo alergeno de ácaros se aisló a partir
de una biblioteca de ADNc de expresión de Der p, y se expresó en
Escherichia coli (E. coli) como alergeno recombinante. El
nuevo alergeno, con un peso molecular de 14,7 kDa, se une la IgE de
aproximadamente el 30% de los pacientes alérgicos a los ácaros. Se
pudo encontrar una identidad de aproximadamente el 50% entre las
secuencias de aminoácidos del nuevo alergeno Der p y de los
alergenos del grupo 5 de APD y ácaros de almacén (es decir, Der p,
Lepidoglyphus destructor, Blomia tropicalis). Sin embargo,
no pudo detectarse una reactividad cruzada entre el alergeno
recientemente descrito y el Der p 5, demostrando que este nuevo
alergeno representa un nuevo grupo de alergenos de APD. Además, los
inventores demuestran que el alergeno recombinante es activo
biológicamente. En particular, ya a concentraciones de 10 pg/ml el
alergeno liberaba cantidades máximas de histamina de los basófilos
de los pacientes alérgicos a los ácaros y, en ciertos casos, pudo
demostrarse que era incluso más activo que el principal alergeno, el
Der p 1, que liberaba cantidades máximas de histamina sólo a una
concentración de 1 ng/ml.
Se describe en este documento un polipéptido que
muestra reactividad cruzada con los polipéptidos que comprenden la
secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1, en
particular los aminoácidos 20 a 140 de la misma. El término
"reactividad cruzada" significa que una inmunoglubulina
particular, preferentemente un anticuerpo IgE, o un fragmento o
derivado de la misma que presenta propiedades de unión de la
inmunoglobulina completa a epítopos que se unen a la secuencia de
aminoácidos mostrada en SEC ID Nº 1, se une también al polipéptido
en cuestión ya que dicho polipéptido en cuestión tiene una secuencia
de aminoácidos que comprende al menos un epítopo o determinante que
es reconocido por dicha inmunoglobulina particular (preferentemente
IgE) en el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID Nº 1. Esto viene a significar que el
polipéptido con reactividad cruzada puede ser capaz de desencadenar
la reacción alérgica, o al menos la sensibilización, en un
individuo que esté expuesto al polipéptido con reactividad
cruzada.
La presente invención se refiere a un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una
identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID Nº 1. El polipéptido comprende
preferentemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad
de al menos el 75%, más preferentemente una identidad de al menos
el 80%, todavía más preferentemente una identidad de al menos el 90%
y de la manera más preferente una identidad de al menos el 95% con
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1. Tal como se
usa aquí, el término "polipéptido" se refiere a proteínas y/o
péptidos que tienen una longitud de al menos 7 aminoácidos.
El grado de identidad de una secuencia de
aminoácidos con la SEC ID Nº 1 se determina comparando la secuencia
de aminoácidos en cuestión y la SEC ID Nº 1 usando el programa
"BLAST 2 SEQUENCES (blastp)" (Tatusova et al. (1999)
FEMS Microbiol. Lett. 174, 247-250) con los
siguientes parámetros: matriz BLOSUM62; penalizaciones de apertura
de huecos 11 (open gap 11) y extensión de huecos 1 (extension gap
1); gap x_dropoff50; valor de E (expect) 10,0 tamaño de palabra 3;
filtros: ninguno. De acuerdo con la presente invención, la
comparación de secuencias abarca al menos 40 aminoácidos,
preferentemente al menos 80 aminoácidos, más preferentemente al
menos 100 aminoácidos y de la manera más preferente al menos 120
aminoácidos.
De acuerdo con una realización preferida, el
polipéptido de la presente invención comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SED ID NO 1, de manera más preferente los
residuos 20 a 140 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº 1.
Es más, la presente invención proporciona
polipéptidos que comprenden un fragmento de al menos 18 aminoácidos
consecutivos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº
1. La longitud del fragmento es preferentemente de al menos 21
aminoácidos, más preferentemente de al menos 25 aminoácidos, incluso
más preferentemente de al menos 35 aminoácidos y de la manera más
preferente de al menos 50 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID Nº 1.
Otra realización más de la presente invención es
un polipéptido constituido por al menos 7 aminoácidos consecutivos
de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1. La
longitud de dicho polipéptido es de al menos 10 aminoácidos, más
preferentemente de al menos 15 aminoácidos, incluso más
preferentemente de al menos 25 aminoácidos y de la manera más
preferente de al menos 35 aminoácidos. En otras realizaciones
adicionales, el polipéptido de la presente invención consiste en al
menos 8 o al menos 9 o al menos 11 o al menos 12 o al menos 13 o al
menos 14 o al menos 18 o al menos 21 o al menos 30 aminoácidos
contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº
1. En otras realizaciones más, la longitud del polipéptido no es
superior a 100 o 50 o 30 aminoácidos. Los polipéptidos constituidos
por al menos 7 aminoácidos pueden ser reconocidos por linfocitos T
(epítopos de los linfocitos T).
Se describe aquí, además, un polipéptido que
comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos que se
muestra en la SEC ID Nº 1, siendo dicho fragmento capaz de unirse a
anticuerpos IgE procedentes de un individuo que es alérgico o está
sensibilizado frente a los ácaros del polvo doméstico. El término
anticuerpos "IgE" significa una preparación de anticuerpos que
puede obtenerse mediante procedimientos conocidos per se. En
los seres humanos susceptibles, la exposición a alergenos conduce a
una respuesta alérgica (mediada por la IgE) de tipo inmediato, que
comprende dos etapas:
- (i)
- En la primera exposición, las proteínas alergénicas inducen en los linfocitos B la síntesis de IgE (Vercelli and Geha (1989), J. Allergy Clin. Immunol. 9, 75-83). Estos anticuerpos IgE específicos se unen entonces a la superficie de las células cebadas y de los basófilos a través de receptores Fc\varepsilon de alta afinidad (Fc\varepsilonRI).
- (ii)
- En la exposición posterior, los alergenos se unen a estos anticuerpos IgE específicos y los reticulan, dando lugar a la liberación de mediadores inflamatorios preformados y recién sintetizados (p. ej. histamina) y sustancias quimiotácticas (p. ej. factor activador de las plaquetas).
En la etapa (i) anterior, la producción de IgE
específica del alergeno por parte de los linfocitos B requiere la
"ayuda" de los linfocitos T (v. Vercelli and Geha (1989),
supra), que son activados por fragmentos de péptido lineal
del alergeno. Mediante el procesamiento del antígeno, las células
que presentan antígeno crean estos péptidos y los exteriorizan
sobre la superficie de la célula mediante moléculas del complejo
mayor de histocompatibilidad (MHC), donde quedan disponibles para
el reconocimiento y la unión al receptor de la célula T (Schwartz
(1985), Annu. Rev. Immunol. 3, 237-255; Rothbart
et al. (1989) Int. Immunol. 1, 479-486). En
la etapa (ii) anterior, los anticuerpos IgE específicos del alergeno
producidos por las células B circulan y se unen a receptores
Fc\varepsilon de las células cebadas y de los basófilos, sirviendo
de este modo como receptores para el alergeno. La reticulación de
estos anticuerpos IgE fijados a la superficie de la célula por
parte de los alergenos constituye la señal para la liberación de
mediadores inflamatorios preformados y recién sintetizados y de
sustancias quimiotácticas, dando lugar a la típica reacción
inflamatoria alérgica.
Un "individuo sensibilizado frente a los
ácaros del polvo doméstico" es un individuo que presenta
anticuerpos IgE específicos que reconocen proteínas de los ácaros
del polvo doméstico. Un "individuo que es alérgico a los ácaros
del polvo doméstico" presenta además síntomas alérgicos (mediados
por IgE), tales como síntomas inmediatos de la alergia tipo I
mencionada con anterioridad, cuando queda expuesto a APD. Tal como
se ha mencionado ya con anterioridad, las reacciones alérgicas de
este tipo, o al menos la sensibilización, pueden desencadenarse al
quedar expuestos a polipéptidos homólogos que muestran reactividad
cruzada con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID
Nº 1. Los pacientes que son alérgicos a APD presentan típicamente
una prueba de punción en piel (SPT) positiva y una prueba de
radioalergoadsorción (RAST) superior a 0,35 kUA/L.
Un polipéptido es "capaz de unirse a un
anticuerpo" si su afinidad hacia el anticuerpo es
significativamente superior a la de una composición de referencia
que no se une al anticuerpo. La unión de anticuerpos IgE específicos
a un polipéptido o alergeno particulares se puede determinar
mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica, p. ej.
RAST, immunoblot o ELISA, usando sueros de referencia procedentes de
individuos no alérgicos sanos (tal como se determina mediante una
SPT negativa o una RAST negativa) que no presenten anticuerpos IgE
específicos del alergeno.
La presente invención proporciona nuevas
estructuras alergénicas encontradas en Dermatophagoides
pteronyssinus y otros APD. La identificación de estas
estructuras es particularmente útil para la selección y la
producción de alergenos recombinantes que pueden usarse en el
diagnóstico y el tratamiento de la sensibilización y la alergia a
los ácaros del polvo doméstico.
La presente invención proporciona además
derivados, análogos y fragmentos del polipéptido de acuerdo con la
SEC ID Nº 1. Los derivados de este tipo pueden sintetizarse por
medios químicos o de ingeniería genética y se generan, p. ej.,
mediante adición, deleción y/o sustitución de uno o más aminoácidos
en la secuencia que se muestra en la SEC ID Nº 1. De acuerdo con
una realización preferida, los derivados, análogos y fragmentos del
polipéptido de acuerdo con la SEC ID Nº 1 muestran propiedades
hipoalergénicas en comparación con la secuencia de aminoácidos
originaria. Los polipéptidos de este tipo se generan preferentemente
mediante el uso de un ácido nucleico, p. ej. un ADNc o ARNm, que
codifica el polipéptido respectivo. Los ácidos nucleicos de este
tipo (polinucleótidos) tienen una secuencia de nucleótidos que se
deriva de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SED ID
NO 2 por medio de adición, deleción y/o sustitución de uno o más
nucleótidos.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, los polipéptidos son polipéptidos aislados, es
decir, que están en una forma esencialmente pura. La expresión
"esencialmente pura" significa que mediante la separación de
los polipéptidos de los otros componentes, los polipéptidos son
puros al menos en el 75%, preferentemente al menos en el 90% y más
preferentemente al menos en el 95%. La pureza de los polipéptidos
la puede determinar una persona experta usando técnicas conocidas en
la técnica, p. ej. mediante PAGE-SDS seguido de
tinción de la proteína. La cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) y la espectrometría de masas son procedimientos adecuados
para analizar tanto polipéptidos como también péptidos cortos.
Los polipéptidos de la presente invención se
pueden preparar de diversas maneras. Los polipéptidos se pueden
preparar por medio de síntesis química, preferentemente aplicando
procedimientos en fase sólida. Los procedimientos de síntesis
química de péptidos son bien conocidos en la técnica (v. por
ejemplo. Merrifield (1963) J. Am. Soc. 85, 2149; Stewart et
al. (1984) "Solid Phase Peptide Synthesis", 2ª edición,
Pearce Chemical Co., Rockford, IL, EE.UU.; Bayer and Rapp (1986)
Chem. Pept. Prot. 3, 3; Atherton et al. (1989) "Solid Phase
Peptide Synthesis: A Practical Approach", IRL Press, Oxford,
R.U.). Estos procedimientos son particularmente apropiados para la
preparación de polipéptidos cortos que tienen una longitud de, p.
ej., 7 a 50 aminoácidos. Los polipéptidos más largos se pueden
preparar mediante reticulación química o enzimática de fragmentos de
péptido que se han preparado por medio de síntesis química. Tal
como se señaló con anterioridad, los polipéptidos de la presente
invención se pueden preparar también mediante la expresión de
secuencias de ácidos nucleicos, en particular de secuencias de ADN
en células huésped o con la ayuda de extractos libres de
células.
Por lo tanto, la presente invención se refiere
también a polinucleótidos que codifican los polipéptidos mencionados
con anterioridad. Los polinucleótidos pueden ser moléculas de ADN o
de ARN de doble cadena o de cadena simple o bien ácidos nucleicos
derivados de especies de ADN y/o ARN. Así pues, de acuerdo con una
realización, los polinucleótidos de la presente invención codifican
la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1.
Debido a que el código genético es degenerado, pueden imaginarse
muchos polinucleótidos diferentes que codifiquen la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1.
Los polinucleótidos de la presente invención se
puede usar para identificar secuencias similares en cualquier ácaro
u otra especie relacionada con Der p y, por lo tanto, para
identificar y aislar secuencias que tengan una homología suficiente
para hibridar con, p. ej., ADN procedente de ácaros del polvo
doméstico o ácaros de almacén. Esto puede llevarse a cabo, p. ej.,
en condiciones de baja rigurosidad que conducen a la hibridación
con secuencias que tienen una homología suficiente (por lo general
superior al 40%), y que se pueden seleccionar para una evaluación
más amplia. De manera alternativa pueden aplicarse condiciones de
mayor rigurosidad. En general, las condiciones de alta rigurosidad
se seleccionan para que sean de entre aproximadamente 5ºC hasta
aproximadamente 10ºC por debajo de la temperatura de fusión
(T_{M}) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH
definidos. La T_{M} es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un
pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida para
dar una muestra de coincidencia perfecta. Unas condiciones típicas
de alta rigurosidad son aquellas en las que la concentración de sal
es de hasta aproximadamente 15 mM Na^{+} (0,1 x SSC) a un pH 7 y
una temperatura de al menos aproximadamente 60ºC.
De esta manera, los ácidos nucleicos de la
presente invención pueden usarse para identificar en otras especies,
en particular en otros tipos de APD o ácaros de almacén, secuencias
que codifican péptidos o polipéptidos que tienen secuencias de
aminoácidos similares a la del alergeno de 14,7 kDa aquí descrito y,
de esta manera, para identificar alergenos en otras especies de
este tipo. Por lo tanto, la presente invención no sólo incluye la
proteína de 14,6 kDa y otros alergenos de ácaros codificados por los
polinucleótidos que se han descrito aquí, sino también otros
alergenos de ácaros codificados por polinucleótidos que se hibridan
con el polinucleótido de la presente invención.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a polinucleótidos que comprenden una secuencia de
nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 75%,
preferentemente de al menor el 80%, más preferentemente de al menos
el 90% y de manera más preferente de al menos el 95% con la
secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 2. El grado
de identidad de una secuencia de polinucleótidos con la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº 2 se determina comparando dicha
secuencia de polinucleótidos y la SEC ID Nº 1 usando el programa
"BLAST 2 SEQUENCES (blastn)" (Tatusova et al. (1999)
FEMS Microbiol. Lett. 174, 247-250) con los
siguientes parámetros: valoración por cada coincidencia 1;
penalización por cada falta de coincidencia -2; penalizaciones de
apertura de huecos 5 (open gap 5) y extensión de huecos 2 (extension
gap 2); gap x_dropoff 50; valor de E (expect) 10,0 tamaño de
palabra 11; filtros: ninguno. De acuerdo con la presente invención,
la comparación de secuencias abarca al menos 50 nucleótidos,
preferentemente al menos 100 nucleótidos, más preferentemente al
menos 200 nucleótidos y de manera más preferente al menos 300
nucleótidos.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, el polinucleótido comprende la secuencia de
nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 2, preferentemente los
nucleótidos 24 a 434 y más preferentemente los nucleótidos 81 a
434. En otras realizaciones, el polinucleótido de la presente
invención comprende al menos 50 nucleótidos contiguos,
preferentemente al menos 100 nucleótidos, más preferentemente al
menos 200 nucleótidos y de manera más preferente al menos 300
nucleótidos de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC
ID Nº 2.
La invención comprende también polinucleótidos
que se han degenerado para dar los polinucleótidos que se han
descrito con anterioridad. Las respectivas cadenas complementarias
de los polinucleótidos dados a conocer forman también parte de la
presente invención.
Los polinucleótidos de la presente invención son
preferentemente polinucleótidos aislados. Los polinucleótidos son
de manera preferente esencialmente puros, es decir, son al menos
puros al 80%, más preferentemente al menos puros al 90% y de manera
más preferente al menos puros al 95%. Los polinucleótidos de la
presente invención se pueden preparar de diversas manera (véase p.
ej., Glick and Pasternack (1994) Molecular Biotechnology,
Principles and Applications of Recombination DNA, ASM Press,
Wahington D.C.; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem.
53, 323-356; Climie et al. (1990) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87, 633-637). Los polinucleótidos se
pueden sintetizar por medio de los procedimientos químicos que se
usan habitualmente en la síntesis de oligonucleótidos. Para
sintetizar los polinucleótidos de la presente invención, en
particular las moléculas más grandes, se pueden usar procedimientos
basados en la PCR (véase, p. ej., Lee et al. (1997) Nucleid
Acid Amplification Tecnologies, Eaton Publishing, MA; EE.UU.;
McPherson et al. (1996) PCR - A Practical Approach, vol. 2 y
2, IRL Press, Oxford, R.U.). Se pueden preparar también
polinucleótidos más largos por medio de la reticulación química o
enzimática de fragmentos que se hayan sintetizado usando
procedimientos químicos.
Una realización adicional de la presente
invención es un plásmido o vector que comprende el polinucleótido
definido con anterioridad. Los plásmidos pueden contener secuencias
reguladoras que facilitan la replicación de los plásmidos o la
transcripción y/o traducción de las secuencias codificadas. Ejemplos
de secuencias reguladoras de este tipo son promotores, secuencias
de terminación, potenciadores (enhacers), etc. Los plásmidos pueden
contener también secuencias de nucleótidos que codifican secuencias
de aminoácidos, facilitando la purificación de los polipéptidos
codificados al expresarse en una célula huésped o en un sistema de
expresión libre de células. Ejemplos de secuencias de este tipo son
un fargmento marcador 6xHis, un fragmento marcador FLAG y
secuencias que codifican proteínas bacterianas tales como GST. La
purificación del polipéptido codificado se puede conseguir por
medio de cromatografía de afinidad usando anticuerpos dirigidos
contra las respectivas etiquetas o secuencias bacterianas. Otras
matrices de afinidad (p. ej. para purificar polipéptidos que tienen
un fragmento marcador 6xHis) contienen iones metálicos fijados tales
como Ni^{2+}, que son capaces de formar un complejo quelado con
fragmento marcador de expresión. La persona experta en la materia
conoce plásmidos y vectores adecuados que contienen secuencias
reguladoras y de fragmento marcador o secuencias bacterianas.
La invención se refiere además a una célula que
contiene el plásmido o vector definido con anterioridad y/o un
polinucleótido de la presente invención, no siendo la célula una
célula de un ser humano. Las células pueden seleccionarse de entre
células vegetales, células bacterianas, células de levaduras y
otras, p. ej. células de mamíferos. Se prefieren las células que
permiten la expresión de los genes codificados por los
polinucleótidos de la presente invención. Más preferentemente las
células son células de E. coli. El plásmido, vector y/o
polinucleótido conforme a la presente invención puede introducirse
en las células por medio de procedimientos conocidos per se,
p. ej. transformación, transfección, etc. Las células pueden
contener las moléculas de ácido nucleico sólo de modo transitorio o
integradas de forma estable en su genoma. En particular en este
último caso, las moléculas de ácidos nucleicos se pueden truncar o
fragmentar debido al proceso de integración en el genoma. Las
células que contienen versiones truncadas o fragmentadas de este
tipo de las moléculas de ácido nucleico caen dentro del ámbito de
la presente invención.
Las células de la presente invención se pueden
usar para la expresión y la purificación de los polipéptidos de la
invención. Por consiguiente, la invención proporciona también un
procedimiento para la preparación de un polipéptido descrito con
anterioridad, que comprende la etapa de cultivar las células tal
como se han definido con anterioridad en un medio bajo condiciones
apropiadas para la expresión del polipéptido y, opcionalmente, la
posterior recuperación del polipéptido a partir de las células y/o
el medio. Las células se cultivan de manera preferente en un medio
líquido bajo agitación. Si es conveniente, la expresión del
polipéptido diana se induce por medio de un agente inductor tal
como IPTG. Las técnicas para manipular moléculas de ADN clonado e
introducir ácidos nucleicos exógeno en diversas células huésped y
las técnicas para transformar estas células huésped, y para la
expresión de secuencias de nucleótidos extraños clonadas en ellas,
son bien conocidas para la persona experta en la técnica (véase, p.
ej., Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold
Spring Harbour, Nueva York, EE. UU.; Ausubel et al. (eds.)
(1999) Current Protocols in Molecular Biology, 4ª edición, John
Wiley & Sons, Nueva York, EE.UU.).
El cultivo posterior de las células puede
interrumpirse, o en caso contrario iniciarse, usando procedimientos
establecidos y el polipéptido se puede recuperar por medio de
cromatografía de afinidad. Se pueden usar también otros
procedimientos conocidos de purificación de proteínas. Ejemplos de
etapas de purificación pueden incluir hidroxilapatita, exclusión de
tamaño, FPLC y HPLC de fase inversa. Entre los medios
cromatográficos apropiados se incluyen dextranos, agarosa,
celulosa, poliacrilamida, sílices especiales derivatizados y
similares. En una realización preferida, el polipéptido de la
invención se aísla por medio de un procedimiento que comprende una
etapa de cromatografía de afinidad y/o una etapa de cromatografía de
intercambio iónico. Para la cromatografía de afinidad se pueden
inmovilizar en un soporte sólido uno o más anticuerpos dirigidos
contra el polipéptido de la invención. De manera preferente, el
anticuerpo reconoce específicamente el polipéptido de la invención.
Los procedimientos para unir las moléculas de anticuerpo a los
medios de soporte son bien conocidos en la técnica. La elección de
un procedimiento particular es una cuestión del diseño rutinario del
experimento y viene determinada, en parte, por las propiedades del
material de soporte elegido.
Otro procedimiento preferido de cromatografía de
afinidad usa la adsorción de proteínas ricas en histidina, p. ej.
aquellas que contienen fragmentos marcadores
poli-His, sobre matrices que contienen iones
metálicos ligados. En pocas palabras, primero se carga un gel con
iones metálicos divalentes para formar un quelato. Las proteínas
ricas en His se adsorberán en esta matriz con diferentes afinidades,
dependiendo de los iones metálicos que se usen, y se eluirán por
medio de elución competitiva, disminuyendo el pH, o usando agentes
quelantes fuertes. Dentro de otras realizaciones adicionales de la
presente invención, puede construirse una fusión del polipéptido de
interés y un fragmento marcador de afinidad para facilitar la
purificación. Las proteínas de fusión pueden prepararse mediante
procedimientos que conoce una persona experta en la técnica
preparando cada componente de la proteína de fusión y conjugando
químicamente los componentes. De manera alternativa, usando
procedimientos conocidos se puede generar un polinucleótido que
codifica los componentes de la proteína de fusión en el marco de
lectura apropiado y se puede expresar por los procedimientos que se
han descrito aquí.
Otras etapas de purificación cromatográfica
preferidas incluyen cromatografía de intercambio iónico, con
preferencia cromatografía de intercambio aniónico. Entre los
ejemplos de matrices de intercambio aniónico están celulosa,
derivados de celulosa o matrices de dextrano que llevan grupos que
pueden cargarse positivamente tales como dietilaminoetilo (DEAE).
Estos y otros procedimientos de purificación de proteínas se
describen, p. ej., en Deutscher, M.P. (1990) Protein Purification,
Academic Press, Nueva York, EE.UU.; Scopes (1994) Protein
Purification, Springer Verlag, Heidelberg, Alemania; Doonan, S.
(1996) Protein Purification Protocols, Humana Press.
Los polipéptidos de la presente invención se
pueden usar, por ejemplo, como "alergenos purificados". Los
alergenos purificados de este tipo son útiles para la
estandarización de extractos de alergenos que sean reactivos clave
para el diagnóstico y el tratamiento (o la prevención) de la alergia
al polvo doméstico. Además, usando péptidos basados en fragmentos
de la secuencia de aminoácidos que se muestran en la SEC ID Nº 1,
pueden generarse antisueros antipéptido o anticuerpos monoclonales
usando procedimientos estándar. Los sueros o anticuerpos
monoclonales de este tipo, dirigidos contra la proteína de 14,7 kDa
de la presente invención, se pueden usar para estandarizar
extractos de alergeno.
Otra realización más de la presente invención es
un anticuerpo dirigido contra el polipéptido descrito con
anterioridad. El término "dirigido contra un polipéptido"
significa que el anticuerpo es capaz de unirse al respectivo
polipéptido, es decir, que el anticuerpo reconoce uno o más epítopos
determinado por la secuencia de aminoácidos del polipéptido. El
anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Además, el término
"anticuerpo" comprende fragmentos o derivados de anticuerpos
completos siempre que se mantenga la afinidad hacia el polipéptido
diana. Ejemplos son fragmentos de anticuerpo preparados por vía
enzimática así como especies obtenidas por ingeniería genética,
tales como anticuerpos humanizados y anticuerpos de cadena simple,
p. ej. constructos scFv. Los anticuerpos de la presente invención
se pueden preparar con procedimientos conocidos en la técnica, p.
ej. los que se dan a conocer en Harlow and Lane (1988) Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold
Spring Harbour, EE.UU. En una realización preferida, el anticuerpo
está en una forma esencialmente pura, es decir, al menor pura en el
80%, preferentemente al menos pura en el 90%. En el caso de los
anticuerpos policlonales, la composición del anticuerpo contiene una
pluralidad de especies diferentes de moléculas de anticuerpo.
El anticuerpo es preferentemente específico para
un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se
muestra en la SEC ID Nº 1. De acuerdo con una realización preferida
adicional, el anticuerpo de la presente invención está dirigido
contra uno o más epítopos, determinado por los residuos 20 a 140 de
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1.
En una realización preferida particular de la
presente invención, los epítopos de este tipo se usan para el
tratamiento que provoca anticuerpos neutralizantes en el paciente al
que hay que tratar. Los anticuerpos de este tipo protegen al
paciente frente a reacciones alérgicas. Por lo tanto, en una primera
etapa es posible identificar regiones del polipéptido que
representan probablemente un epítopo, p. ej. usando transferencias
de hidrofobicidad. Además, se ensaya si los epítopos de este tipo
tienen un efecto protector en un panel de pacientes alérgicos.
\newpage
Los anticuerpos de la presente invención pueden
usarse para aislar componentes alergénicos adicionales de los
ácaros del polvo doméstico y especies relacionadas, tales como los
ácaros de almacén. Los alergenos adicionales de este tipo pueden
usarse para definir más las características de esta familia de
alergenos. Además, los sueros antipéptido o los anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el polipéptido de la presente
invención se pueden usar para estandarizar y definir el contenido
de los reactivos de las pruebas cutáneas.
Otra realización más de la presente invención es
una composición farmacéutica que comprende un polipéptido y/o un
polinucleótido y/o un anticuerpo y/o un vector o plásmido y/o una
célula huésped de acuerdo con la invención, opcionalmente en
combinación con excipientes y/o diluyentes y/o vehículos y/o
adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Por supuesto, la
composición farmacéutica de la invención puede contener una o más de
las anteriores moléculas/especies.
Los materiales proporcionados por la presente
invención, así como las composiciones que contienen dichos
materiales, se pueden usar en procedimientos de diagnóstico,
tratamiento y prevención de la alergia a APD. Por lo tanto, se
describe aquí el uso de un polipéptido y/o un polinucleótido y/o un
anticuerpo y/o un vector o plásmido y/o una célula huésped de
acuerdo con la presente invención para el tratamiento o la
prevención o el diagnóstico de un trastorno alérgico. Además, la
invención comprende el uso de las realizaciones anteriores de la
presente invención para la preparación de medicamentos para el
tratamiento o la prevención o el diagnóstico de un trastorno
alérgico. Los materiales de la presente invención se usan para el
tratamiento y/o la prevención y/o el diagnóstico (o para la
producción de un medicamento correspondiente) de la sensibilización
o la alergia a ácaros del polvo doméstico o ácaros de almacén.
La composición farmacéutica o el medicamento de
acuerdo con la invención se administra de manera preferente a un
individuo al que haya que desensibilizar.
Por medio del uso de los polipéptidos de la
presente invención (así como de los polinucleótidos que codifican
los correspondientes polipéptidos), se pueden hacer preparaciones de
alergeno de actividad biológica y composición constante y bien
definida y administrarse para fines terapéuticos o preventivos (p.
ej. para modificar la respuesta alérgica de un individuo que está
sensibilizado frente a los ácaros del polvo doméstico y/o especies
relacionadas). Los polipéptidos de este tipo o las versiones
modificadas de los mismos, en particular los derivados
hipoalergénicos (p. ej. mutantes que contienen una o más deleciones,
adiciones y/o sustituciones de aminoácidos en comparación con la
secuencia de tipo salvaje, así como derivados modificados
químicamente) pueden, por ejemplo, modificar la respuesta de los
linfocitos B y/o la respuesta de los linfocitos T frente a APD y
especies relacionadas (p. ej. ácaros de almacén). Tal como se ha
mencionado ya con anterioridad, se pueden usar también alergenos
purificados para diseñar derivados modificados o análogos que sean
más útiles en la inmunoterapia que los péptidos o polipéptidos
presentes de modo natural y sin modificar (naturales).
Las dosis altas de alergenos producen por lo
general un mejor alivio de los síntomas. Sin embargo, muchos
pacientes no toleran dosis altas de alergenos debido a reacciones
alérgicas a los mismos. Por lo tanto, las modificaciones de los
alergenos presentes de modo natural pueden diseñarse de tal manera
que pueden producirse polipéptidos que tienen las mismas o mayores
propiedades terapéuticas que el correspondiente alergeno natural
pero con menores efectos secundarios, en especial propiedades
hipoalérgicas tales como un potencial anafiláctico inferior o nulo.
Alergenos modificados de este tipo pueden ser, por ejemplo, un
polipéptido de la presente invención o un análogo modificado (p.
ej. un polipéptido en el que la secuencia de aminoácidos ha sido
alterada para modificar la inmunogenicidad y/o reducir la
alergenicidad o al que se le ha añadido un componente con los
mismos fines). Por ejemplo, se pueden modificar los polipéptidos
usando el procedimiento del polietilenglicol (PEG) de A. Sehon
et al. La deleción de segmentos cortos o las sustituciones de
aminoácidos de la secuencia del polipéptido dan como resultado una
unión debilitada (es decir, reducida o nula) al anticuerpo. Las
modificaciones de este tipo conducen a una débil unión de la IgE y
son muy útiles en inmunoterapia debido a los menores efectos
secundarios.
La administración de los (poli)péptidos o
composiciones farmacéuticas (medicamentos) de la presente invención
a un individuo, con preferencia un individuo al que hay de
desensibilizar, puede llevarse a cabo usando procedimientos
conocidos. A un individuo se le puede administrar un péptido o una
combinación de diferentes péptidos en una composición que incluya,
p. ej. un diluyente (tal como un tampón apropiado), un excipiente
y/o un adyuvante. Una composición de este tipo se administrará por
lo general mediante inyección, administración por vía oral,
inhalación, aplicación transdérmica o administración por vía rectal.
Usando la información estructural que proporciona la presente
invención es posible diseñar un polipéptido de ácaro que, que cuando
se administra en cantidades suficientes a un individuo sensible a
APD, modificará la respuesta alérgica del individuo a un alergeno
de ácaro. Esto puede hacerse, por ejemplo, examinando las
estructuras de las proteínas de ácaro, produciendo péptidos que se
examinarán para ver su capacidad de influir sobre las respuestas de
los linfocitos B y/o linfocitos T en individuos sensibles a APD y
seleccionando epítopos adecuados, reconocidos por las células.
Pueden usarse así mismo secuencias de aminoácidos sintéticas que
simulan los epítopos alergénicos y que son capaces de regular una
respuesta alérgica a alergenos de ácaro.
Los polipéptidos o anticuerpos de la presente
invención se pueden usar también para detectar y diagnosticar la
alergia o la sensibilización a APD. Por ejemplo, combinando sangre o
productos sanguíneos obtenidos de un individuo en el que hay que
evaluar su sensibilidad frente a un alergeno de APD con un péptido
alergénico aislado de alergeno de ácaro, en condiciones apropiadas
para unir los componentes (tales como anticuerpos, células T,
células B) de la sangre con el polipéptido y determinar el grado en
que se produce tal unión.
También es posible diseñar un agente o un
fármaco capaces de bloquear o inhibir la capacidad de los alergenos
de ácaro para inducir una reacción alérgica en individuos sensibles
a los ácaros. Los agentes de este tipo podrían diseñarse, por
ejemplo, de tal manera que se unieran a IgE antiácaros relevantes,
impidiendo de este modo la unión IgE-alergeno y la
subsiguiente desgranulación de las células cebadas. De manera
alternativa, los agentes de este tipo podrían unirse a componentes
celulares del sistema inmunológico dando como resultado la
supresión o la desensibilización de la respuesta alérgica a los
alergenos de ácaro. Un ejemplo no restrictivo de estas
realizaciones de la presente invención es el uso de péptidos
epítopos apropiados de linfocitos B y T, o modificaciones de los
mismos, basados en las estructuras de ADNc/polipéptido de la
presente invención para suprimir la respuesta alérgica a los
alergenos APD. Esto se puede llevar a cabo definiendo las
estructuras de los péptidos epítopos de los linfocitos B y T que
afectan al funcionamiento de los linfocitos B y T en los estudios
in vitro con células sanguíneas procedentes de individuos
sensibles a los ácaros.
Por último, la invención se refiere a kits que
son útiles para el diagnóstico, el tratamiento y/o la prevención de
un trastorno alérgico, que comprenden un polipéptido y/o un
polinucleótido y/o un anticuerpo y/o un vector o plásmido y/o una
célula huésped de acuerdo con la presente invención. Los materiales
proporcionados por la presente invención, así como las
composiciones y los kits que contienen estos materiales, pueden
usarse en procedimientos de diagnóstico, tratamiento y prevención
de la alergia o sensibilización frente a APD o especies
relacionadas, tales como ácaros de almacén.
La presente invención se basa en una molécula de
ADN recombinante o fragmentos de la misma que codifican un alergeno
de 14,7 kDa procedente del ácaro del polvo doméstico
Dermatophagoides pteronyssinus (Der p). El nuevo alergeno de
ácaro se puede usar para el diagnóstico de pacientes alérgicos a APD
así como para el tratamiento. De acuerdo con la presente invención,
se pudo demostrar que el nuevo alergeno de ácaro induce una
respuesta IgG intensa y específica en conejos, indicando que la
inmunoterapia específica con este nuevo alergeno de ácaro inducirá
el bloqueo de los anticuerpos IgG en seres humanos. El uso de
derivados hipoalergénicos generados basándose en la secuencia de
este nuevo alergeno para inmunoterapia, podría reducir de manera
adicional el riesgo de efectos secundarios anafilácticos (3).
Las figuras muestran:
Figura 1A muestra el ADNc (SEC ID Nº 2) y la
secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº 1) del alergeno
preferido de acuerdo con la invención. El codón de inicio, el codón
de parada y la señal de poliadenilación están subrayados. La
secuencia que codifica para la secuencia señal (aminoácidos 1 a 19)
comprende los nucleótidos 24 a 80. El sitio de escisión está entre
los residuos de aminoácido 19 (G) y 20 (F) (en negrita). Los números
a la izquierda de la secuencia indican las posiciones de los
nucleótidos y los situados a la derecha de la secuencia las
posiciones de los aminoácidos.
Figura 1B muestra un gel
SDS-PAGE con tinción de azul de Coomassie y el
resultado del análisis de espectrometría de masas del alergeno
identificado. Izquierda: gel SDS-PAGE con tinción de
azul de Coomassie. En el carril 1 se muestra un marcador de masa y
en el carril 23 \mug de alergeno purificado. Derecha: análisis MS
del alergeno purificado de acuerdo con la invención. La proporción
masa/carga se muestra en el eje X y la intensidad de la señal en el
eje Y en forma del porcentaje de la señal más intensa obtenida en el
intervalo de masas investigado. El pico en 14.724,9 corresponde a
la masa calculada de la secuencia de aminoácidos deducida de
14.726,1.
Figura 2A muestra la reactividad IgE del nuevo
alergeno de ácaro. El alergeno identificado se transfirió sobre
tiras de nitrocelulosa y se incubó con sueros procedentes de
pacientes alérgicos a Der p. La IgE fijada se detectó con
anticuerpos IgE humanos marcados con ^{125}I.
Figura 2B muestra la inducción de la liberación
de histamina desde los basófilos de un paciente alérgico a Der p.
Los granulocitos de un paciente alérgico a Der p se incubaron con
diversas concentraciones de nDer p, alergeno de acuerdo con la
invención y rDer p 5 (eje X). En el eje Y se muestra el porcentaje
de histamina liberado en el sobrenadante del cultivo libre de
células.
Figura 3A muestra un alineamiento de la
secuencia de aminoácidos del alergeno de acuerdo con la presente
invención (SEC ID Nº 1) con alergenos de ácaros del polvo doméstico
homólogos. La secuencia de aminoácidos del alergeno de acuerdo con
la invención se comparó con alergenos del grupo 5 de
Lepidoglyphus destructor (Lep d 5) (SEC ID Nº 3), Blomia
tropicalis (Blo t 5) (SEC ID Nº 4) y Dermatophagoides
pteronyssinus (Der p 5) (SEC ID Nº 5). Los aminoácidos
idénticos al alergeno de la invención se indican con guiones y los
puntos representan huecos introducidos para conseguir un máximo
ajuste.
Figura 3B muestra la falta de reactividad
cruzada entre el nuevo alergeno de ácaro y Der p 5. Los sueros
procedentes de pacientes alérgicos a Der p (1-9) y
un paciente no alérgico (10) se adsorbieron previamente de manera
respectiva con BSA, rDer p 5 y el alergeno de acuerdo con la
invención. Se transfirieron sobre tiras de nitrocelulosa Der p 5
recombinante, el nuevo alergeno de ácaro y BSA, se incubaron con los
sueros adsorbidos previamente y las IgE fijadas se detectaron con
anticuerpos IgE anti-humanos marcados con
^{125}I.
Figura 4 muestra la reactividad IgG de un
antisuero de conejo comparada con el nuevo alergeno identificado
con diferente alergenos Der p. Se sometieron a ensayo el suero
preinmune y el antisuero en busca de reactividad IgG a PBS (como
control), rDer p 2, eDer p 5 y el alergeno de la invención.
La presente invención se explica más a fondo
mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
El clon 25 del ADNc (Fig. 1A) que codifica para
el nuevo alergeno maduro se clonó en el vector de expresión
pET-17b (Novagene, Madison, WI) y se expresó en
Escherichia coli BL21 (DE3) (Strategene, La Jolla, CA). Se
cultivaron las células bacterianas con un OD_{600} de 0,6 a 0,8 en
medio LB que contenía 100 mg/ml de ampicilina. Se indujo la
expresión de la proteína recombinante añadiendo
isopropil-\beta-tiogalactopiranosido
(IPTG) hasta una concentración final de 0,5 mM y se cultivó durante
3 horas adicionales a 37ºC. Las células de E. coli
procedentes de un cultivo de 1 litro se recolectaron mediante
centrifugación, se suspendieron de nuevo en 10 ml 25 mM de imidazol
a pH 7,4, 0,1% de Triton X 100 y se trataron con 100 \mug de
lisozima durante 20 minutos a temperatura ambiente. El lisado de
células bacterianas se congeló en nitrógeno líquido y se descongeló
en un baño de agua a 50ºC. Se degradó el ADN mediante la adición de
1 \mug de ADNasa durante 10 minutos a temperatura ambiente y se
interrumpió la reacción con 200 \mul 5M de NaCl. Después de la
centrifugación de las células bacterianas lisadas a 10.000 rpm
(Sorval RC5C, SS34) durante 20 minutos a 4ºC, se obtuvo una
fracción que contenía las proteínas solubles. La fracción soluble,
que contenía el alergeno derivado del clon 25, se dializó frente a
tampón A (10 mM Tris-Cl pH 7,0, 4% de isopropanol, 1
ml/l de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, PMSF) y se aplicó a una
columna DEAE Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences, Upsala,
Suecia). Se diluyó el alergeno derivado del clon 25 con un
gradiente de 0-500 mM NaCl. Se agruparon las
fracciones que contenían el alergeno recombinante, se dializaron
frente a tampón B (10 mM Na_{2}HPO_{4} pH 4,0, 5 mM de
\beta-mercaptoetanol, 1 ml/l de PMSF) y se
aplicaron a una columna SP Sepharose Fast Flow (Amersham
Biosciences). Se eluyó el alergeno derivado del clon 25 mediante un
gradiente combinado de pH 4,0-7,0 y
0-500 mM NaCl y se agruparon las fracciones que
contenían más del 90% de alergeno puro codificado por el clon 25, se
dializaron frente a 10 mM de Na_{2}HPO_{4} pH 7,0 y se
guardaron a -20ºC. Se analizó la pureza de muestras de proteína
mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecilsulfato sódico
(SDS-PAGE) y tinción de la proteína con azul
Coomassie (Fig. 1B).
Se analizó la capacidad de unión de la IgE del
nuevo alergeno Der p codificado por el clon 25 del ADNc mediante
experimentos de transferencia por puntas (dot blot) usando sueros
procedentes de 117 pacientes alérgicos a los ácaros. Se transfirió
el nuevo alergeno a tiras de nitrocelulosa (1 \mug/punta) y se
incubaron las tiras con sueros de pacientes alérgicos a Der p. Los
anticuerpos IgE ligados se detectaron con anticuerpos IgE
anti-humanos etiquetados con ^{125}I.
Treinta de los 117 sueros (26%) mostraron unión
de la IgE al nuevo alergeno Der p (Figura 2A).
Se compararon el alergeno mayor nDer p 1 (4) y
el alergeno menor rDer p 5 (5) del ácaro del polvo doméstico Der p
con el nuevo alergeno codificado por el clon 25 del ADNc para
averiguar su capacidad de inducir la liberación de histamina desde
los basófilos de un individuo alérgico a Der p.
Mediante sedimentación con dextrano se aislaron
granulocitos de las muestras de sangre heparinizada de un individuo
alérgico a Der p. Se incubaron las células con concentraciones
crecientes (10^{-6} a 1 \mug/ml) de nDer p 1, rDer p 5 y
alergeno derivado del clon 25 respectivamente. Se midió mediante
radioinmunoensayo (Immunotech, Marsella, Francia) la histamina
liberada en el sobrenadante libre de células y se indicó en forma
del porcentaje de liberación total de histamina. Los resultados se
representaron como valores medios de determinaciones por
triplicado. Tal como se muestra en la Figura 2, tanto el nuevo
alergeno codificado por el clon 25 de ADNc como el rDer p 5
indujeron ya una liberación máxima de histamina a 10 pg/ml, mientras
que el alergeno mayor nDer p 1 indujo una liberación máxima de
histamina sólo a una concentración de 1 ng/ml.
El nuevo alergeno codificado por el clon 5
muestra homología con otros alergenos de los ácaros del polvo (Fig.
3A), a saber con los alergenos del grupo 5 de Lepidoglyphus
destructor (Lep d 5), Blomia tropicalis (Blo t 5) y
Dermatophagoides pteronyssinus (Der p 5). Debido a la
identidad de aminoácidos del 30% entre el nuevo alergeno y Der p 5,
el alergeno derivado del clon 25 pertenece a un nuevo grupo
desconocido hasta la fecha de alergenos de ácaros del polvo. Los
experimentos de inhibición con transferencia por puntas (dot blot)
demostraron que Der p 5 y el nuevo alergeno no comparten epítopos de
IgE. Se transfirió a tiras de celulosa un \mug de Der p 5, del
alergeno derivado del clon 25 y de BSA. Se incubaron las tiras con
sueros de nueve pacientes con reactividad frente a Der p 5 y al
nuevo alergeno y con un suero de un paciente no alérgico, que
previamente habían sido adsorbidos con 10 \mug/ml cada uno de rDer
p 5, el alergeno derivado del clon 5 y BSA. Los anticuerpos IgE
fijados se detectaron con anticuerpos IgE
anti-humanos marcados con ^{125}I (Fig. 3B).
La adsorción previa de los sueros procedentes de
pacientes alérgicos a ácaros con el nuevo alergeno inhibe la unión
de la IgE al nuevo alergeno transferido y también la adsorción
previa de los sueros con rDer p 5 inhibe la unión de la IgE al rDer
p 5 transferido. Sin embargo, la adsorción previa de rDer p 5 no
inhibió la unión de la IgE al nuevo alergeno y viceversa,
demostrando así la ausencia de reactividad cruzada entre rDer p 5 y
el nuevo alergeno.
Con el fin de verificar si el nuevo alergeno de
ácaro es inmunogénico, se inmunizó a un conejo con el nuevo
alergeno usando adyuvante de Freund. Se inmunizó al conejo con 200
\mug/inyección usando una vez adyuvante completo de Freund y dos
veces el incompleto (Charles River, Ki\betalegg, Alemania).
La inducción de anticuerpos IgG se estudió por
medio de ELISA. Se recubrió con Der p 2, rDer p 5 y el alergeno
derivado del clon 25, cada uno de ellos a una concentración de 5
\mug/ml, una placa ELISA (Nunc, Roskilde, Dinamarca) durante toda
la noche a 4ºC y después se incubó con el antisuero de alergeno
derivado del clon 25 diluido a 1:10.000 y un suero preinmune de
conejo como control. Los anticuerpos de conejo fijados se detectaron
con anticuerpos Ig anti-conejo de asno con HRP
conjugado (Amersham).
Con el nuevo alergeno de ácaros se indujeron
títulos altos de anticuerpos IgG específicos. El anticuerpo inducido
con el alergeno derivado del clon 25 reacciona específicamente con
el alergeno derivado del clon 25 y no pudo detectarse ninguna
reactividad cruzada con rDer p 2 y rDer p 5 (Figura 5).
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<110> Biomay Produktions- und
Handels-Aktiengesellschaft
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Alergeno de ácaros del polvo
doméstico
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Alergeno Der p
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Dermatophagoides
pteronyssinus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 473
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Dermatophagoides
pteronyssinus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 110
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<212> PRT
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<213> Lepidoglyphus destructor
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<400> 3
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<211> 134
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<212> PRT
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<213> Blomia tropicalis
\newpage
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<110> Biomay Produktions- und
Handels-Aktiengesellschaft
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<120> Alergeno de ácaros del polvo
doméstico
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<130> Alergeno Der p
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<160> 5
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<170> PatentIn version 3.2
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<212> PRT
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
Claims (16)
1. Un polipéptido seleccionado del grupo
constituido por:
- a)
- polipéptidos que comprenden un fragmento de al menos 18 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1;
- b)
- polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1; y
- c)
- polipéptidos constituidos por un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1.
2. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se
muestra en la SEC ID Nº 1.
3. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1 que comprende los aminoácidos 20 a 140 que se
muestran en la SEC ID Nº 1.
4. Un polinucleótido seleccionado del grupo
constituido por:
- a)
- polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1;
- b)
- polinucleótidos que codifican un polipéptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y
- c)
- polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 75% con la secuencia de nucleótidos que se muestra en la Fig. 1A;
o la hebra complementaria de tal nucleótido.
5. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 4 que comprende la secuencia de nucleótidos que se
muestra en la Fig. 1A.
6. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 4 que comprende los nucleótidos 81 a 434 de la
secuencia que se muestra en la Fig. 1A.
7. Un plásmido o vector que comprende el
polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
4 a 6.
8. Una célula que contiene el plásmido o vector
de acuerdo con la reivindicación 7 y/o el polinucleótido de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, no siendo dicha
célula una célula dentro de un ser humano.
9. La célula de acuerdo con la reivindicación 8,
que se selecciona del grupo constituido por células vegetales,
células bacterianas y células de levaduras.
10. Un procedimiento para la preparación del
polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 3, que comprende la etapa de cultivar células tal como se define
en la reivindicación 8 o 9 en un medio en condiciones apropiadas
para la expresión del polipéptido y opcionalmente la posterior
recuperación del polipéptido desde las células y/o el medio.
11. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10 en el que se rompen las células y se recupera el
polipéptido usando cromatografía de intercambio iónico y/o
cromatografía de afinidad.
12. Un anticuerpo dirigido contra el polipéptido
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
13. Una composición farmacéutica que comprende
el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3 y/o el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6 y/o el plásmido o vector de acuerdo con la
reivindicación 7 y/o la célula de acuerdo con la reivindicación 8 o
9 y/o el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12,
opcionalmente en combinación con uno o más excipientes y/o
diluyentes y/o vehículos y/o adyuvantes farmacéuticamente
aceptables.
14. Un kit de diagnóstico que comprende el
polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 3 y/o el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6 y/o el plásmido o vector de acuerdo con la
reivindicación 7 y/o la célula de acuerdo con la reivindicación 8 o
9 y/o el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12.
15. Uso del polipéptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o el polinucleótido de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 y/o el
plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 7 y/o la célula
de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 y/o el anticuerpo de acuerdo
con la reivindicación 12 para la preparación de un medicamento para
el tratamiento y/o la prevención o el diagnóstico de un trastorno
alérgico, siendo el trastorno alérgico sensibilización o alergia a
los ácaros del polvo doméstico o los ácaros de almacén.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15
en el que el medicamento debe administrarse a un individuo al que
hay que desensibilizar.
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