JP4756864B2

JP4756864B2 - 低アレルギー性モザイク抗原の製造方法

Info

Publication number: JP4756864B2
Application number: JP2004566792A
Authority: JP
Inventors: モゼス・ナディーン; スタンボル・サバイン; フォッケ・マルギット; リンハルト・ビルギット; クラウト・マリアテレジア; バレント・ピーター; クラフト・ディートリッヒ; バレンタ・ルドルフ
Original assignee: バイオメイアクツェンゲゼルシャフト
Priority date: 2003-01-21
Filing date: 2003-12-18
Publication date: 2011-08-24
Anticipated expiration: 2023-12-18
Also published as: WO2004065414A1; CA2513711A1; DE60301944D1; ATE307141T1; CN1742019A; AU2003293931A1; US20060263391A1; DK1440979T3; EP1440979B1; US7491396B2; EP1440979A1; US20090148466A1; AU2003293931B2; DE60301944T2; JP2006523436A; CA2513711C; ES2247433T3

Description

本発明は、天然に存在するアレルゲン、特にオオアワガエリ草の花粉アレルゲンＰｈｌｐ２に由来するモザイク抗原に関する。このモザイク抗原は、弱められたアレルゲン活性を示し、感作アレルギー患者の治療用あるいは予防接種用のアレルギーワクチンとして有用である。

多くの人々がＩｇＥを媒介としたアレルギーに苦しんでいる。こうした患者はいくつかの抗原に対するアレルギー反応に悩まされている。アレルギー反応は、高い割合で植物花粉により引き起こされる。アレルギー性鼻結膜炎、喘息、皮膚炎およびアナフィラキシーショックなどのようなアレルギー諸症状は、ＩｇＥのアレルゲン認識に基づく。ＩｇＥ分子は、花粉症、喘息および蕁麻疹のようなアレルギー反応の諸症状の主たる原因である。

ＩｇＥ分子は、例えば植物花粉のようなアレルゲンと結合する。ＩｇＥ分子の末端領域、すなわちＦｃ領域は、組織中のマスト細胞あるいは血液中の好塩基球の表面に存在しているＦｃ受容体に結合する。抗原が結合すると、マスト細胞あるいは好塩基球を誘発して、様々なサイトカイン類および生物活性化合物、特にヒスタミンを分泌させる。これらの分子は血管を拡張し、漏出して、今度は白血球、抗体および補体成分が反応部位に参加するのを促進する。これらの分子は、一方では、アレルギー反応の症状の主な原因となる。眼の軽い痒みおよび軽い風邪の症状から、激しい痛みや例えばハチに刺された後に起こるアナフィラキシーショックのような死亡する恐れがある症状まで、様々な程度のアレルギー反応がある。

こうしたアレルギー反応を回避するために、少量の低アレルゲン化合物の適用に基づくアレルギー用ワクチンが開発されてきている。低アレルゲンワクチンの適用により、個体がアレルゲンと接触した直後には、アレルゲンと反応するＩｇＧ抗体が産生すると言われている。こうしたいわゆる遮断抗体によって、アレルゲンと患者の身体の中にあるＩｇＥ分子の間の接触が大部分、回避される。したがって、アレルゲンとＩｇＥ分子が介在するマスト細胞との大部分の反応が避けられる。

アレルギー反応の治療分野では、種々のワクチンが使用されてきている。以前は少量のアレルゲンが患者に適用されてきた。遺伝子工学の発展と共に、組み換えアレルゲンがワクチン予防接種のために使用することができる。そのようなアレルゲン含有ワクチンの主な欠点は、そのワクチンを適用すると、患者に望ましくない副作用をもたらすことである。例えば、患者がそれに対してアレルギーであるアレルゲンを皮下的に投与した場合、痒みからアナフィラキシーショックまでの望ましくない副作用が起きる。それというのも、患者の身体の中にあるＩｇＥ抗体が、アレルゲンと反応してアレルギー反応を引き起こすからである。

望ましくない副作用を解決するために、アレルゲンに由来する低アレルゲン性モザイク抗原の製造方法、すなわち
（ａ）アレルゲンを少なくとも２つの部分に分解し、各部分のＩｇＥ活性を測定する第１工程および
（ｂ）検出可能なＩｇＥ反応を示さないアレルゲンの上記部分を結合して、アレルゲンのアミノ酸から成り、且つそのアミノ酸順序は天然に存在するアレルゲンのそれとは異なるモザイク抗原とする第２工程
とから成る方法が開示される。

本発明方法で使われている用語「低アレルゲン性モザイク抗原」は、該抗原が天然に存在するアレルゲンの実質的に全てのアミノ酸を含むことを意味する。しかしながら、天然に存在する抗原と比較しての違いは、該アレルゲンが第１工程で異なる部分に分解されるということである。
アレルゲンのアミノ酸配列が知られている場合、抗原から長さを変えたペプチドを製造することは、当業者には一般に常識である。ペプチドは、当該分野でよく知られた化学合成によっても製造することができる。別法として、配列が分かっている場合、適切なプライマーは簡単に合成することができるので、そのようなペプチドはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって容易に製造することができる。

ペプチドあるいはポリペプチドとして存在するアレルゲンの各部分の反応性を測定する必要がある。この測定は、ペプチドを天然に存在するアレルゲンに対するアレルギー患者からの血清と反応させることにより実施することができる。そのような血清中のＩｇＥ抗体は、ＩｇＥエピトープがそのペプチド上に存在する場合にはペプチドと反応する。しかしながら、直線状のＩｇＥエピトープが存在しないか、あるいは全長の天然に存在するアレルゲンを分離することにより、その立体的なＩｇＥエピトープ構造が破壊されると、ＩｇＥとペプチドとの結合は起こらないであろう。ＩｇＥ抗体はＩｇＥ抗体と結合する特異的抗抗体との反応によって、その後、容易に検出することができる。これらの抗抗体は、通常、検出のために標識される。

本発明の重要な一側面は、アレルゲンをＩｇＥ抗体と反応しない部分に分割することにある。アレルゲンの一部がまだ実質的な量のＩｇＥ抗体と反応する場合、アレルゲンのそのような各部分はモザイク抗原の製造のために使用するべきではない。各血清における特異性とＩｇＥ濃度は変わるかもしれないので、モザイク抗原で使用される天然抗原の各部分は異なるアレルギー患者からの血清により試験することが勧められる。

アレルゲンを検出可能ないかなるＩｇＥ反応性も持たない幾つかの部分へ分解する場合、それらの各部分はモザイク抗原を提供するために新たに配列される。アレルゲンの分解部分が実質的なＩｇＥ反応性を持たないということは、天然に存在する全長アレルゲン、およびその各部分についてのＩｇＥ反応性が、アレルギー患者からの好ましくは少なくとも５つの血清で試験されることを意味する。アレルゲンおよびその各部分へのＩｇＥ分子の結合は定量的に測定され、その部分のＩｇＥ反応性は天然アレルゲンに対して得られる値の１０％未満、好ましくは５％未満に減らさなければならない。

最も単純な場合、モザイク抗原に対する天然アレルゲンの各部分の再配列は、アレルゲンを２つの部分、すなわちＮ−末端を含み、開裂部位で終わる部分Ａ、および開裂部位から始まり、ポリペプチドのＣ−末端で終わるペプチドＢを意味する。開裂部位は、１つの部分が終わり、他の部分が始まる、ポリペプチド中の位置を意味する。天然抗原の両方の部分が実質的なＩｇＥ反応性を持たない場合、部分ＢがそのＮ−末端を表し、部分ＡがＣ−末端を表すように、２つの部分は再配列される。

天然アレルゲンを天然に存在するＡ、Ｂ、Ｃの順序で３つの部分に分解させる場合、幾つかのモザイク抗原が可能であり、例えば、Ｃ、Ｂ、Ａ；あるいはＡ、Ｃ、Ｂがそうである。より多くの分解部分が形成されればされる程、モザイク抗原を提供するためのより多くの選択肢が生じる。
本発明の好ましい態様では、天然アレルゲン中の隣接した位置に存在する部分の結合、例えばＣ、Ａ、Ｂの順序の結合は回避される。その理由は、エピトープへのＩｇＥの結合がモザイク抗原上で再び形成されるかもしれないからである。しかしながら、それにはモザイク抗原が実質的に天然抗原のすべてのアミノ酸を含んでいることが必須である。確かに、明らかに何らの機能も持たない幾つかのアミノ酸は欠失させることができるし、あるいは幾つかのアミノ酸は製造上の理由から欠失させることができるが、できるだけ多くのアミノ酸は維持されるべきである。さらに、モザイク抗原は、製造目的で利用される幾つかのアミノ酸を含んでいてもよい。モザイク抗原で再編成される天然アレルゲンの部分は、できるだけ大きいのが好ましい。開裂部位は、できるだけ長く続くＩｇＥエピトープを破壊するように選択されるのが好ましい。

本発明方法の好ましい態様では、グループ２アレルゲンが使用される。好ましいグループ２アレルゲンは、次の出版物に記載されている：ＦｒｅｉｄｈｏｆｆＬＲ，Ｅｈｒｌｉｃｈ−ＫａｕｔｚｋｙＥ，ＧｒａｎｔＪＨ，ＭｅｙｅｒｓＤＡ，ＭａｒｓｈＤＧ．ＡｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＬｏｌｉｕｍｐｅｒｅｎｎｅ（ｒｙｅ）ｐｏｌｌｅｎａｎｄｉｔｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＬｏｌｐＩａｎｄＬｏｌｐＩＩ（ｒｙｅＩａｎｄｒｙｅＩＩ）．Ｉ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｔｏｔｈｅａｌｌｅｒｇｅｎｓａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓａｍｏｎｇｓｋｉｎｔｅｓｔ，ＩｇＥａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｄＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙｄａｔａ．Ｌｏｌｉｕｍｐｅｒｅｎｎｅ[ホソムギ（ライ麦）花粉およびその成分ＬｏｌｐＩおよびＬｏｌｐＩＩ（ライ麦Ｉおよびライ麦ＩＩ）に対するヒト免疫応答に関する研究。Ｉ．アレルゲンの反応性の優劣および皮膚試験、ＩｇＥ抗体およびＩｇＧ抗体データ間の相関性。ホソムギ]、ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ１９８６，７８，１１９０−１２０１。
ＦｒｅｉｄｈｏｆｆＬＲ，Ｅｈｒｌｉｃｈ−ＫａｕｔｚｋｙＥ，ＭｅｙｅｒｓＤＡ，ＭａｒｓｈＤＧ．ＡｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＬｏｌｉｕｍｐｅｒｅｎｎｅ（ｒｙｅ）ｐｏｌｌｅｎａｎｄｉｔｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＬｏｌｐＩａｎｄＬｏｌｐＩＩ（ＲｙｅＩａｎｄＲｙｅＩＩ）．ＩＩ．Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌｓｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｓｙｍｐｔｏｍａｔｏｌｏｇｙａｎｄｐｏｌｌｅｎｅｘｐｏｓｕｒｅａｎｄｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅａｓｏｎａｌｌｙｅｌｅｖａｔｅｄａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌｓｔｏｂａｓａｌｖａｌｕｅｓ．[（ライ麦）花粉およびその成分、ＬｏｌｐＩおよびＬｏｌｐＩＩ（ライ麦Ｉおよびライ麦ＩＩ）へのヒト免疫反応に関する研究。ＩＩ。症候学と花粉接触とに関する抗体レベルの縦方向への変化および基礎値に対する季節的な高濃度抗体の補正]、ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ１９８７，８０，６４６−６５５。
ＡｎｓａｒｉＡＡ，ＳｈｅｎｂａｇａｍｕｒｔｈｉＰ，ＭａｒｓｈＤＧ．ＣｏｍｐｌｅｔｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａＬｏｌｉｕｍｐｅｒｅｎｎｅ（ｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓ）ｐｏｌｌｅｎａｌｌｅｒｇｅｎ，ＬｏｌｐＩＩ。[ペレニアルライグラス（ホソムギ）花粉アレルゲンＬｏｌｐＩＩの完全アミノ酸配列]、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ１９８９，２６４，１１１８１−１１１８５。
ＤｏｌｅｃｅｋＣ，ＶｒｔａｌａＳ，ＬａｆｆｅｒＳ，ＳｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒＰ，ＫｒａｆｔＤ，ＳｃｈｅｉｎｅｒＯ，ＶａｌｅｎｔａＲ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＰｈｌｐＩＩ，ａｍａｊｏｒｔｉｍｏｔｈｙｇｒａｓｓ（Ｐｈｌｅｕｍｐｒａｔｅｎｓｅ）ｐｏｌｌｅｎａｌｌｅｒｇｅｎ。[主要オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍｐｒａｔｅｎｓｅ）花粉アレルゲン、ＰｈｌｐＩＩの分子特性」ＦＥＢＳＬｅｔｔ１９９３，３３５，２９９−３０４。

特に好ましい態様として、モザイク抗原に使用されるアレルゲンは、オオアワガエリ花粉アレルゲンＰｈｌｐ２である。この草木花粉アレルゲンＰｈｌｐ２の配列はＷＯ９４／２３０３５に開示されている。オオアワガエリ花粉からのＰｈｌｐ２のより詳細な記述は、文献（ＤｅＭａｒｉｎｏｅｔａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９９）Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．８，ｐ．９４３−９５２）に報告されている。このＰｈｌｐ２抗原は、草木花粉アレルギー患者の血清ＩｇＥの約７０％と反応し、感作患者の好塩基球からのヒスタミン遊離を誘発するので、好ましい抗原である。

本発明の研究の間に、Ｐｈｌｐ２アレルゲンは、３つのペプチド、すなわちアミノ酸１−３３のペプチド１、アミノ酸３４−６４のペプチド２、およびアミノ酸６５−９６のペプチド３へと好ましく分解されることが分かった。配列順序をペプチド１、ペプチド３およびペプチド２に再配列することにより、低アレルゲン性ワクチン予防接種に使用できるモザイク抗原が提供される。このモザイク抗原は、十分な量のＩｇＥ阻害抗体を産生するが、ワクチン接種による望ましくない副作用は殆ど完全に回避されている、といった利点を有している。

好ましいモザイクアレルゲンのアミノ酸配列は、配列番号１に示される。この好ましいモザイクアレルゲンをコードするＤＮＡは、配列番号２に示される。

本発明の開示によって提供されるモザイクアレルゲンは、アレルギー反応の治療用医薬の製造のために好ましく使用することができる。好ましいＰｈｌｐ２モザイク抗原は、草木花粉アレルギーの治療用医薬の製造のために使用することができる。このＰｈｌｐ２は、アレルギー患者の大多数がＩｇＥ抗体を形成する抗原であるので、そのモザイク抗原は花粉症に苦しむ患者の治療に非常に有用である。

上記の方法により製造されるモザイク抗原は、アレルギー反応の治療用医薬として製剤化することができる。その主要成分は、アジュバントと共に好ましく投与されるモザイク抗原である。ヒトへの適用に適切な幾つかのアジュバントがあり、例えば水酸化アルミニウムゲルがそうである。本発明の別の態様では、モザイク抗原を身体免疫反応を一般に増強する別の成分に、共有結合で直接、結合させることも可能である。

さらに、モザイク抗原をコードするＤＮＡあるいはその相補的なＤＮＡ配列をＤＮＡワクチンとして使用することもできる。核酸ワクチンとしては、適切なポリヌクレオチド配列が標的細胞に挿入される。モザイク抗原をコードする配列の他に、そのようなＤＮＡワクチンは、プロモーター、リボゾーム結合サイトあるいは終結配列のような調節要素を含んでいてもよい。これらのＤＮＡ配列は、適当な運び屋に組み込まれ、それによりＤＮＡが細胞のタンパク質合成工場に到達できる。

ここに詳細に記載されているモザイク抗原は、好ましくはヒトへの適用を目的としている。しかしながら、モザイク抗原はペット（例えば、犬または猫）あるいは馬のような有益な動物に対しても使用することができる。

図面および表は、本発明の好ましい態様を記載している。

表１はＰｈｌｐ２由来合成ペプチドの特性を示す。Ｐｈｌｐ２アレルゲンの配列、アミノ酸の数、位置、ペプチドの分子量および等電点が示されている。ペプチド１は配列番号：３に、ペプチド３は配列番号：４に、そしてペプチド２は配列番号：５に対応する。

表２は、完全鎖ｒＰｈｌｐ２およびＰｈｌｐ２モザイク（Ｐ２Ｍ）に対する即時型皮膚反応を示す。２人のオオアワガエリ花粉アレルギー患者（患者１、２）が、Ｐ２とＰ２Ｍに対する皮膚反応性について試験された。平均腫れ直径（ｍｍ）が、ｒＰｈｌｐ２およびＰｈｌｐ２モザイクに対する５種類の濃度に対してのみならず、オオアワガエリ花粉エキスおよびヒスタミンに対しても表示されている。

表３は、ウサギαＰ２Ｍ抗体およびウサギαＰ２抗体による、草木花粉アレルギー患者のｒＰｈｌｐ２へのＩｇＥ結合阻害を示している。ＩｇＥ結合の阻害％は、５人の患者に対するものである。

本発明をさらに、以下の実施例で説明する。

（実施例１）
アレルゲン活性を有しない合成Ｐｈｌｐ２由来ペプチド
アレルゲン活性を有しないＰｈｌｐ２断片を同定するために、Ｐｈｌｐ２タンパク質の約１／３から成る複数のペプチドを化学的に合成した（表１参照）。各ペプチドは、約３．７ｋＤａの分子量を有する３２から３４のアミノ酸鎖長を持ち、共同して完全鎖Ｐｈｌｐ２アミノ酸配列をカバーする。

３種類のペプチドが、ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートの活性化法）（０．１ｍｍｏｌの小規模サイクル）を用いたＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）法によりＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（ホスター、カリフォルニア州）のペプチド合成機モデル４３３Ａ上で合成された。予め充填したＰＥＧ−ＰＳ（ポリエチレングリコール／ポリスチレン）樹脂（０．１５−０．２ｍｍｏｌ／ｇ充填量）（ＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、英国）が、ペプチドを構築するための固相として用いられた。試薬はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。アミノ酸のカップリンは、フィードバック制御系での伝導度モニタリングによって確認した。担体へのペプチドのカップリングを容易にするために、１個のシステイン残基をＮ−末端あるいはＣ−末端に付加した。ペプチドは、２５０μｌの蒸留水、２５０のμｌトリイソプロピルシラン（Ｆｌｕｋａｎ社、Ｂｕｃｈｓ、スイス）および９．５ｍｌのトリフルオロ酢酸の混合物で２時間処理して樹脂から解裂させ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（Ｆｌｕｋａｎ社、Ｂｕｃｈｓ、スイス）中に沈殿させた。ペプチドの同定は、質量分析によってチェックし、定量的ＨＰＬＣ（ＰｉＣｈｅｍ社、Ｇｒａｚ、オーストリア）［参照：ＦｏｃｋｅＭ，ＭａｈｌｅｒＶ，ＢａｌｌＴ，ＳｐｅｒｒＷＲ，ＭａｊｌｅｓｉＹ，ＶａｌｅｎｔＰ，ＫｒａｆｔＤ，ＶａｌｅｎｔａＲ．，ＮｏｎａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＢｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓｏｆｔｈｅｍａｊｏｒｇｒａｓｓｐｏｌｌｅｎａｌｌｅｒｇｅｎ，Ｐｈｌｐ１，ｆｏｒａｌｌｅｒｇｙｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ（主要な草木花粉アレルゲンＰｈｌｐ１のＢ細胞エピトープ由来アレルギー予防接種用の非アナフィラキシー性合成ペプチド）、ＦＡＳＥＢＪ．２００１１５：２０４２−２０４４］によって、＞９０％の純度に精製された。

Ｐｈｌｐ２由来ペプチドのアレルゲン活性は、完全長ｒＰｈｌｐ２のＩｇＥ反応性をドットブロット分析法（図１参照）によりペプチドと比較することにより評価された。
ニトロセルロース上にドットされたＰｈｌｐ２由来ペプチド（Ｐ１−Ｐ３）、免疫学的に無関係な主要な草木花粉アレルゲンであるｒＰｈｌｐ５［参照：ＶｒｔａｌａＳ，ＳｐｅｒｒＷＲ，ＲｅｉｍｉｔｚｅｒＩ，ｖａｎＲｅｅＲ，ＬａｆｆｅｒＳ，ＭｕｌｌｅｒＷＤ，ＶａｌｅｎｔＰ，ＬｅｃｈｎｅｒＫ，ＲｕｍｐｏｌｄＨ，ＫｒａｆｔＤ，ＳｃｈｅｉｎｅｒＯ，ＶａｌｅｎｔａＲ．ｃＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｍａｊｏｒａｌｌｅｒｇｅｎｆｒｏｍｔｉｍｏｔｈｙｇｒａｓｓ（Ｐｈｌｅｕｍｐｒａｔｅｎｓｅ）ｐｏｌｌｅｎ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎｉａｎｔＰｈｌｐＶａｌｌｅｒｇｅｎ（オオアワガエリ草（Ｐｈｌｅｕｍｐｒａｔｅｎｓｅ）花粉からの主要アレルゲンのｃＤＮＡクローニング；組み換えＰｈｌｐＶアレルゲンの特徴）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３，１５１：４７７３−４７８１］およびコントロールとしてヒト血清アルブミン、同様にコントロールペプチドを、草木花粉アレルギー患者からの血清および非アレルギー性の個人の血清にそれぞれ暴露した。

結合ＩｇＥ抗体は、先に文献（ＶａｌｅｎｔａＲ，ＤｕｃｈｅｎｅＭ，ＥｂｎｅｒＣ，ＶａｌｅｎｔＰ，ＳｉｌｌａｂｅｒＣ，ＤｅｖｉｌｌｅｒＰ，ＦｅｒｒｅｉｒａＦ，ＴｅｊｋｌＭ，ＥｄｅｌｍａｎｎＨ，ＫｒａｆｔＤ，ＳｃｈｅｉｎｅｒＯ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎｓｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅａｎｏｖｅｌｆａｍｉｌｙｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｌａｎｔｐａｎ−ａｌｌｅｒｇｅｎｓ［プロフィリンは、機能性植物パンアレルゲンの新しいファミリーを構成する］、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９２，１７５：３７７−３８５）に記載されている方法で検出した。３５人全ての草木花粉アレルギー患者の血清は、ニトロセルロース上にドットされたｒＰｈｌｐ２に対してはＩｇＥ反応性を示したが、３種類のＰｈｌｐ２由来ペプチドのどれに対しても反応しなかった（図１参照）。非アレルギーの個人からの血清は、ペプチドまたはタンパク質のいずれに対してもＩｇＥ反応性を示さなかった。

（実施例２）
組み換えＰｈｌｐ２モザイクタンパク質の特定
組み換えＰｈｌｐ２モザイクタンパク質は、３種類のＰｈｌｐ２由来ペプチドの配列を変える組み換えによって得られた。このモザイクタンパク質は、３種類の非アレルゲン性Ｐｈｌｐ２断片の配列順序を変えて組み換えることにより、破壊された３次元構造を有するモザイクタンパク質をもたらし、その結果アレルゲン活性を減じる、との仮定の下に創製されたものである。さらに、モザイクタンパク質は、個々のより小さいペプチドユニットと比較して、よりよい免疫原性を示し、Ｐｈｌｐ２の関連Ｔ細胞エピトープを含むＰｈｌｐ２の完全鎖の主要アミノ酸配列を保存するであろうことが期待された。

図２は、Ｐｈｌｐ２モザイクタンパク質と比較した、天然Ｐｈｌｐ２アレルゲンにおける３種類のペプチドのアセンブリを示す。２つのタンパク質を比較するために、Ｃ−末端ヘキサヒスチジンテイルと組み換えモザイクタンパク質とを含む組み換えＰｈｌｐ２が生産された。これはまたＣ−末端ヘキサヒスチジンテイル（図２参照）を含んでおり、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー（Ｑｕｉａｇｅｎ社、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）による両タンパク質の精製を可能とした。

図３に示されたプライマーおよびＰｈｌｐ２をコードするｃＤＮＡ［ＤｏｌｅｃｅｋＣ，ＶｒｔａｌａＳ，ＬａｆｆｅｒＳ，ＳｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒＰ，ＫｒａｆｔＤ，ＳｃｈｅｉｎｅｒＯ，ＶａｌｅｎｔａＲ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＰｈｌｐＩＩ，ａｍａｊｏｒｔｉｍｏｔｈｙｇｒａｓｓ（Ｐｈｌｅｕｍｐｒａｔｅｎｓｅ）ｐｏｌｌｅｎａｌｌｅｒｇｅｎ（ＰＨｌｐＩＩ、主要オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍｐｒａｔｅｎｓｅ）草木花粉アレルゲンの分子特性）、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．１９９３，３３５：２９９−３０４］を鋳型として用いる方法［ＬｉｎｈａｒｔＢ，Ｊａｈｎ−ＳｃｈｍｉｄＢ，ＶｅｒｄｉｎｏＰ，ＫｅｌｌｅｒＷ，ＥｂｎｅｒＣ，ＫｒａｆｔＤ，ＶａｌｅｎｔａＲ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｖａｃｃｉｎｅｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｇｒａｓｓｐｏｌｌｅｎａｌｌｅｒｇｙｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｈｙｂｒｉｄｍｏｌｅｃｕｌｅｓｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ（遺伝子工学による、増大した免疫原性を有するハイブリッド分子から成る草木花粉アレルギー治療用混合ワクチン）、ＦＡＳＥＢＪ．２００２，１６：１３０１−１３０３］で、組み換えＰｈｌｐ２モザイクを、図２に示された順序で３種類のペプチドをコードするｃＤＮＡのＰＣＲ遺伝子増幅法により構築した。

図４は、組み換えＰｈｌｐ２モザイクタンパク質のＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を示す。ヒスチジンタグモザイクタンパク質は、計算上１１７６９Ｄａの分子量のタンパク質、これはヒスチジンタグ組み換えＰｈｌｐ２アレルゲン（１１７８４Ｄａ）と殆ど同じであるが、をコードする３０９塩基対のＤＮＡによってコードされる。

ヒスチジンタグｒＰｈｌｐ２アレルゲンをコードするｃＤＮＡは、５’−プライマーＰ２／１（配列番号：６）と３’−プライマーＰ２／７：ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＴＴＣＴＧＧＣＧＣＧＴＡＧＧＴＧＧＣ（配列番号：１２）を組み合わせ、Ｐｈｌｐ２をコードする鋳型ｃＤＮＡを用いたＰＣＲによって得た：

ヒスチジンタグＰｈｌｐ２モザイクをコードするｃＤＮＡおよびヒスチジンタグＰｈｌｐ２アレルゲンを、別々にＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ切断プラスミドｐＥＴ１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に結合させた。２つのプラスミド構築物のＤＮＡ配列が、配列解析により確認され、組み換えタンパク質を、６００ｎｍにおける光学密度０．４の液体培地（ＬＢ、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含む培地）中、０．５ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドで３７℃、４時間、誘導させることにより大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に発現させた。５００ｍＬ培養液から大腸菌細胞を遠心分離により回収し、生産者（Ｑｕｉａｇｅｎ社，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）の指示に従い、天然条件下（ｒＰｈｌｐ２）あるいは変性条件下（ｒＰｈｌｐ２モザイク）での精製の準備をした。タンパク質サンプルは、ドデシル硫酸ナトリウム―ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、およびタンパク質染色（ＦｌｉｎｇＳＰ，ＧｒｅｇｅｒｓｏｎＤＳ．Ｐｅｐｔｉｄｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｂｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｕｓｉｎｇａｈｉｇｈ−ｍｏｌａｒｉｔｙＴｒｉｓｂｕｆｆｅｒｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｏｕｔｕｒｅａ（尿素非存在下、高濃度モルのトリス緩衝液系を用いる電気泳動によるペプチドおよびタンパク質分子量の測定）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８６，１５５：８３−８８）により純度が測定された（図４参照）。

図５は、ヒスチジンタグ組み換えタンパク質（ｒＰｈｌｐ２：Ｐ２；ｒＰｈｌｐ２モザイク：Ｐ２Ｍ）の純度を示す。２つのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、完全に同じ挙動を示さなかったが、文献［ＮｉｅｄｅｒｂｅｒｇｅｒＶ，ＨａｙｅｋＢ，ＶｒｔａｌａＳ，ＬａｆｆｅｒＳ，ＴｗａｒｄｏｓｚＡ，ＶａｎｇｅｌｉｓｔａＬ，ＳｐｅｒｒＷＲ，ＶａｌｅｎｔＰ，ＲｕｍｐｏｌｄＨ，ＫｒａｆｔＤ，ＥｈｒｅｎｂｅｒｇｅｒＫ，ＶａｌｅｎｔａＲ，ＳｐｉｔｚａｕｅｒＳ．Ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＥｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｏ− ａｎｄｃａｌｃｉｕｍ−ｂｏｕｎｄｆｏｒｍｏｆａｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ，ｔｗｏＥＦ−ｈａｎｄｔｉｍｏｔｈｙｇｒａｓｓｐｏｌｌｅｎａｌｌｅｒｇｅｎＰｈｌｐ７（カルシウム依存性免疫グロブリンＥの、交差反応性を示す２つのＥＦ−ハンドのオオアワガエリ花粉アレルゲンＰｈｌｐ７のアポ体およびカルシウム結合体の認識）、ＦＡＳＥＢＪ．１９９９，１３：８４３−８５６］に記載された質量分析では、２つのタンパク質（ｒＰｈｌｐ２：１１７７５Ｄａ；ｒＰｈｌｐ２モザイク：１１７７０Ｄａ）は、Ｎ−末端にメチオニンを含む推定分子量とよく一致した（図６参照）。

（実施例３）
ｒＰｈｌｐ２モザイクのＩｇＥ反応性とアレルゲン性の欠如
精製Ｐｈｌｐ２モザイク（Ｐ２Ｍ）のＩｇＥ結合能が、ペプチド類に対して報告されているドットブロット実験に従って、１２人のオオアワガエリ草木花粉アレルギー患者からの血清を用い、Ｐｈｌｐ２野生型のそれと比較された（図７参照）。１２人の草木花粉アレルギー患者からの血清は全てｒＰｈｌｐ２に対するＩｇＥ抗体を含んでいたが、ｒＰｈｌｐ２モザイクあるいは陰性コントロールすなわちヒト血清アルブミンに対してはＩｇＥ反応性を示さなかった（図７参照）。ｒＰｈｌｐ２モザイクの非常に低減されたアレルゲン活性は、好塩基球のヒスタミン遊離および皮膚試験の実験によってさらに実証された。草木花粉アレルギー患者からの好塩基球は、デキストラン沈降法によって濃縮され、文献［ＶａｌｅｎｔＰ，ＢｅｓｅｍｅｒＪ，ＭｕｈｍＭ，ＭａｊｄｉｃＯ；ＬｅｃｈｎｅｒＫ，ＢｅｔｔｅｌｈｅｉＰ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３ａｃｔｉｖａｔｅｓｈｕｍａｎｂｌｏｏｄｂａｓｏｐｈｉｌｓｖｉａｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓ（インターロイキン３は、高アフィニティー結合サイトを介してヒト血液好塩基球を活性化する），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８９，８６：５５４２−５５４６］に記載されている方法に従って、順に増大する濃度の精製ｒＰｈｌｐ２あるいはｒＰｈｌｐ２モザイクに暴露した。

無細胞上澄み液中に遊離されたヒスタミンは、放射免疫測定法により３通り測定され、Ｖａｌｅｎｔらによって報告されているように、細胞内のヒスタミン全含量の平均百分率として表示されている。

図８は、ｒＰｈｌｐ２モザイク（最大遊離値：１〜１０ μｇ／ｍｌ）が、ｒＰｈｌｐ２アレルゲン（最大遊離値：１０^-3 μｇ／ｍｌ）に比べて、１０００倍以上に低減されたアレルゲン活性を示すことを証明している。

ｒＰｈｌｐ２モザイクの強く低減されたアレルゲン活性は、草木花粉アレルギー患者の皮膚試験により確認された（表２参照）。ＳＰＴ（皮膚プリックテスト）は、患者の前腕上で実施された。５種類濃度のｒＰｈｌｐ２およびＰｈｌｐ２−由来モザイクＰ２Ｍ（１ μｇ／ｍｌ、２ μｇ／ｍｌ、４ μｇ／ｍｌ、８ μｇ／ｍｌ、１６ μｇ／ｍｌ）の２０μｌの一定分量が適用された。さらに、標準化された皮膚プリック溶液（オオアワガエリ草木花粉エキスおよびヒスタミン）（Ａｌｌｅｒｇｏｐｈａｒｍａ社、Ｒｅｉｎｂｅｃｋ、ドイツ）が試験された。反応は、ＳＰＴ試験の２０分後、写真に記録され、ボールペンで囲まれた腫れ面積をスコッチテープで紙に転送した。平均の腫れ直径（Ｄｍ）は、縦の最大の長さと横断直径とを測定し、Ｆｏｃｋｅ、２００１年らの方法により、その合計値を２で割って計算した。

ｒＰｈｌｐ２は、最も低い試験濃度、つまり１μｇ／ｍｌで、強い腫れの反応を引き起こしたのに対して、ｒＰｈｌｐ２モザイクでは最大試験濃度（すなわち８〜１６μｇ／ｍｌ）でも緩和な腫れ反応のみを引き起こした。従って、このことはモザイクタンパク質のアレルゲン活性が低減化されたことを確証するものである。

（実施例４）
ｒＰｈｌｐ２野生型を認識し、アレルギー患者のＩｇＥがＰｈｌｐ２と結合するのを阻害するＩｇＧ抗体のｒＰｈｌｐ２モザイク免疫による誘発
Ｐｈｌｐ２モザイクによる免疫およびＰｈｌｐ２モザイクが、天然Ｐｈｌｐ２と反応するＩｇＧ抗体を産生するかどうかを試験するために、ウサギｒＰｈｌｐ２モザイク、ＫＬＨ結合ｒＰｈｌｐ２モザイクあるいはｒＰｈｌｐ２で、Ｆｏｃｋｅらによって報告されているようにフロイントアジュバントを使用してウサギを免疫した。

ウサギＩｇＧ抗体のｒＰｈｌｐ２に対する反応性は、ドットブロット試験（図９参照）により検討された。Ｐｈｌｐ２野生型（Ｐ２）のみならず、対応する免疫原Ｐｈｌｐ２モザイク（Ｐ２Ｍ）が、ニトロセルロースのストリップ上にドットされた（１μｇ／ドット）。ニトロセルロースをウサギの免疫前血清または免疫血清（１：５００）に暴露し、結合ウサギ抗体を１０００倍希釈した¹²⁵Ｉで標識したロバ抗ウサギ抗血清（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社）を使用し、Ｖａｌｅｎｔａらの報告（１９９２年）に従って検出した。

ウサギ抗ｒＰｈｌｐ２モザイク抗血清は、免疫原（ｒＰｈｌｐ２モザイク）のみならず、ｒＰｈｌｐ２アレルゲンと強く反応した（図９参照）。この抗体の反応性は、ＫＬＨ結合モザイクで免疫して産生される抗血清で得られる反応性と比較しうる強度であり、ｒＰｈｌｐ２アレルゲン（図９）による免疫でもたらされる反応性よりも強かった。

（実施例６）
阻害抗体の測定
ｒＰｈｌｐ２モザイクによる免疫で誘発されたＩｇＧ抗体は、アレルギー性患者血清ＩｇＥの完全長ｒＰｈｌｐ２との結合を、５人の草木花粉アレルギー患者血清を用いるＥＬＩＳＡ競合法により、阻害するかどうかを検討した（表３参照）。ＥＬＩＳＡプレート（ＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｐ社、Ｒｏｋｓｌｉｄｅ、デンマーク）は、ｒＰｈｌｐ２（１μｇ／ｍｌ）でコーティングし、１００倍希釈の抗Ｐｈｌｐ２モザイク抗血清あるいは抗Ｐｈｌｐ２抗血清、およびコントロール用として対応する免疫前血清と共にプレインキュベーションした。洗浄後、プレートは５人のＰｈｌｐ２感作草木花粉アレルギー患者からの３倍希釈血清と共にインキュベーションし、結合したＩｇＥ抗体は、１０００倍希釈したリン酸アルカリコンジュゲートのモノクローナルラット抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社，ＳａｎＤｉｅｇｏ，カリフォルニア州）で検出された。抗Ｐｈｌｐ２モザイクおよびＰｈｌｐ２とのプレインキュベーションで達成されたＩｇＥ結合の阻害％は、以下の式で計算した。
ＩｇＥ結合の阻害％＝１００−ＯＤ₁／ＯＤ_p×１００
ＯＤ_１およびＯＤ_ｐは、Ｆｏｃｋｅ（２００１年）らが報告した方法により、ウサギ免疫血清および免疫前血清でプレインキュベーションした後の吸光度をそれぞれ表す。

この抗Ｐｈｌｐ２モザイク抗体は、ｒＰｈｌｐ２アレルゲンでの免疫により産生される抗体と共にプレインキュベーションして達成される場合（５４．７３％の平均阻害）と同じく低い程度ではあるが、Ｐｈｌｐ２に対する草木花粉アレルギー患者のＩｇＥ結合の結合阻害（２０．９３％の平均阻害）を示した。

免疫研究の結果によれば、ｒＰｈｌｐ２モザイクに対する抗体は、Ｐｈｌｐ２野生型アレルゲンを認識し、アレルギー患者のＩｇＥがＰｈｌｐ２を認識するのを阻害することを証明している。

図１は、合成Ｐｈｌｐ２由来ペプチドと完全鎖ｒＰｈｌｐ２（組み換えで製造された野生型アレルゲン）とのＩｇＥ反応性の比較を示す。ドットされた（Ａ）Ｐｈｌｐ２ペプチド（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、コントロールペプチド（Ｐ）および交差反応しないオオアワガエリ花粉アレルゲン（ｒＰｈｌｐ５）、および（Ｂ）ｒＰｈｌｐ５およびＰｈｌｐ２（ｒＰｈｌｐ２）を含んでいるニトロセルロースを、３５人の草木花粉アレルギー患者（１−３５）の血清および非アレルギーの個人（Ｎ）の血清に暴露した。図２は、組み換えヒスチジンタグＰｈｌｐ２野生型および組み換えヒスチジンタグＰｈｌｐ２モザイクの概略図を示す。３種類のペプチドの位置が示されている。図３は、Ｐｈｌｐ２モザイクの構築のために使用されるＤＮＡ配列およびｒＰｈｌｐ２モザイクをコードするｃＤＮＡのアセンブリーに使用されるＰＣＲアプローチの概略図を示す。ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩの制限酵素部位が、プライマーＰ２／１およびＰ２／６にそれぞれ強調されている。プライマーは、配列番号：６〜１１に対応する。図４は、ヒスチジンタグＰｈｌｐ２モザイクのｃＤＮＡ（配列番号：２）および推定アミノ酸配列（配列番号：１）を示す。アミノ酸は、単一の文字コードで示され、塩基対およびアミノ酸数は、右側の余白に表示されている図５は、ｒＰｈｌｐ２モザイクおよびｒＰｈｌｐ２の純度を示す。Ｐｈｌｐ２（レーン：Ｐ２）、Ｐｈｌｐ２モザイク（レーン：Ｐ２Ｍ）および分子量マーカー（レーン：Ｍ）を含むクーマシー染色ゲルによる。図６は、精製ｒＰｈｌｐ２モザイク（Ａ）およびｒＰｈｌｐ２（Ｂ）の質量分光分析を示す。質量電荷比はｘ軸に示され、シグナル強度は、調べた質量範囲の中で得られた最も強いシグナルに対する％として表示されている。図７は、ｒＰｈｌｐ２（Ｐ２）およびｒＰｈｌｐ２モザイク（Ｐ２Ｍ）のＩｇＥ結合能の比較を示す。ｒＰｈｌｐ２（Ｐ２）およびｒＰｈｌｐ２モザイク（Ｐ２Ｍ）、さらにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）がそれぞれドットされたニトロセルロースを、１２人のＰｈｌｐ２反応性草木花粉アレルギー患者（１−１２）の血清で調べた。結合ＩｇＥ抗体を、¹²⁵Ｉで標識した抗ヒトＩｇＥ抗体で検出し、オートラジオグラフィーで視覚化した。図８は、好塩基球のヒスタミン遊離により測定されたｒＰｈｌｐ２モザイクの低アレルゲン活性を示す。草木花粉アレルギー患者からの好塩基球を、順に増大する濃度のｒＰｈｌｐ２およびｒＰｈｌｐ２モザイク（ｘ−軸）に暴露した。ヒスタミン遊離は、ｙ−軸上で全ヒスタミン遊離に対する％として表記されている。図９は、ウサギ抗ｒＰｈｌｐ２モザイク抗体による、ｒＰｈｌｐ２野生型アレルゲンの認識を示している。ｒＰｈｌｐ２モザイク（αＰ２Ｍ）、ＫＬＨ結合モザイク（αＰ２Ｍ−ＫＬＨ）およびｒＰｈｌｐ２（αＰｈｌｐ２）のみならず、緩衝液（Ｃ）に対して採取されたウサギ抗血清を、ドットブロットされたＫＬＨ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ｒＰｈｌｐ２（Ｐ２）およびｒＰｈｌｐ２モザイク（Ｐ２Ｍ）に暴露した。結合ウサギ抗体は、¹²⁵Ｉで標識したロバ抗ウサギＩｇＧで検出し、オートラジオグラフィーで視覚化した。

Claims

（ａ）オオアワガエリ花粉アレルゲンＰｈｌｐ２を３つのペプチド、すなわち、天然に存在するＰｈｌｐ２のアミノ酸配列のアミノ酸１〜３３を有するペプチド１、アミノ酸３４〜６４を有するペプチド２およびアミノ酸６５〜９６を有するペプチド３に分解し、各部分のＩｇＥ活性を測定する第１工程および
（ｂ）検出可能なＩｇＥ反応を示さないオオアワガエリ花粉アレルゲンＰｈｌｐ２の上記各部分をペプチド１、ペプチド３及びペプチド２の順序で結合してモザイク抗原とする第２工程
とからなることを特徴とする、オオアワガエリ花粉アレルゲンＰｈｌｐ２由来の低アレルゲン性モザイク抗原の製造方法。
さらに、
（ｃ）第２工程で得られるモザイク抗原が、オオアワガエリ花粉アレルゲンＰｈｌｐ２を認識するＩｇＧ抗体を誘導し、該ＩｇＧ抗体がオオアワガエリ花粉アレルギー患者の血清中に含まれるＩｇＥ抗体のオオアワガエリ花粉アレルゲンＰｈｌｐ２への結合を阻害することを確認する第３工程
を有することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
配列番号：１のアミノ酸配列を有するモザイクアレルゲン。
請求項３に記載のモザイクアレルゲンをコードする配列番号：２のＤＮＡ配列またはその相補的配列からなるＤＮＡ。
オオアワガエリ花粉アレルギー反応の治療用医薬の製造のための、請求項１または２に記載の方法により製造され得るモザイクアレルゲンの使用。
請求項１または２に記載の方法により製造され得るモザイクアレルゲンあるいは請求項３に記載のモザイクアレルゲンを含むことを特徴とする、オオアワガエリ花粉アレルギー患者の治療用ワクチン。
請求項１または２に記載の方法により製造され得るモザイクアレルゲンをコードするＤＮＡ、または請求項４に記載のＤＮＡから成ることを特徴とする、オオアワガエリ花粉アレルギー患者の治療用ワクチン。