JPH08500492A - 組換えアワガエリ草花粉アレルゲンＰｈ１ ｐ ▲ＩＩ▼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 組換えＤＮＡ分子は、オオアワガエリ草花粉のアレルゲンであるPhl p IIの抗原性を有するぺプチドをコードする。アミノ酸配列（５）およひこの分子の最も重要なＢ細胞およびＴ細胞エピトープは、これらに由来する。この組換えPhl pII抗原は大腸菌で発現され、すべての草の花粉にアレルギー体質の人の血清ＩｇＥに６０％以上結合し、それゆえ、抗原抗体反応、メディエーターの遊離、およびＴ細胞の反応性に基づく過程にとって自然に発生するPhl p IIと同様に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】組換えアワガエリ草花粉アレルゲンPhl p II 草花粉アレルギーは夏季の最も重要な植物アレルギーの一つである。花粉アレ ルギー患者の20％以上が草花粉によってアレルギー症状を示す。最も重要な草花 粉アレルゲンに属すのは群Ｉ（１）、群Ｖ（２）、群II/III（３）及び群IV(4、5 )アレルゲンである。そうこうするうちにプロフィリンも草花粉アレルゲンとし て発見された(7、8)。上記のアレルゲンは免疫学的並びに構造的に近い類縁分子 として種々の草に見いだされ、１つの群の類縁アレルゲンは患者のＩｇＥと交差 反応性を示す。これまでこれらのアレルゲン系列が組換え技術によって分離され 、E.coliにおいて発現された(9)。E.coliで発現されたアレルゲンの多くは天然 蛋白質と類似の性質を示し、したがってアレルギー性疾患の診断及び治療に用い ることができる(10、11、12)。今始めて、Phl p IIをコード（暗号解読）する(c oding)完全なｃＤＮＡの分子特性、並びにこの蛋白質のE.coliにおける発現につ いて説明する。群II/IIIの完全組替え草花粉アレルゲンはこれまでは自由に使え なかったのであるが、そして実施例からわかるように、細胞操作に用いられるよ うな抗原−抗体相互作用に基づく方法に、天然蛋白質と同様に用いることができ る；というのは全部のＴ−細胞エピトープが天然分子にあるのと同様に組換え分 子上にもあるからである。さらに組換えPhl p IIは測定可能の仲介物質遊離を生 じさせる操作に適している。免疫調節プロセス、抗原抗体相互作用、Ｔ−細胞反 応性及び仲介物質遊離に対する作用に基づく治療に組換えPhl p IIを使用できる のは、天然−及び組換え蛋白質が構造的並びに生物学的に類似しているからであ る。本発明では組換えPhl p IIアレルゲンをコードする完全ｃＤＮＡを利用 する。ｃＤＮＡから誘導されるアミノ酸配列に基づいてPhl p IIアレルゲンのＢ −細胞及びＴ−細胞エピトープを決定する。組換えPhl p IIアレルゲンはE.coli を使って作られ、群II/IIIの天然−草花粉アレルゲンと同様な性質をもつ。そこ で組換えPhl p IIアレルゲンも群II/IIIの天然アレルゲンも抗原−抗体−相互作 用、抗原依存性Ｔ−細胞作用又は抗原依存性仲介物質遊離に基づく操作に使用す ることができ、その際実に組換えアレルゲンの方がより高い純度とより高い特異 性という長所を示す。 材料及び方法：１．ｃＤＮＡジーンバンク（ライブラリー）の構築 光−及び電子顕微鏡によって純度を調べたアワガエリ草花粉（Allergon ＡＢ Engelholm, スウェーデン）を用いてポリアデニル化ＲＮＡを単離した(13)。ｃ ＤＮＡ合成はオリゴ−ｄＴ及びランダムプライマーで行われ、ｃＤＮＡ末端はＴ ４−ポリメラーゼで平滑に消化し(glattverdauen) 、EcoRI−リンカーを取り付 けた。リンカーをもったｃＤＮＡを脱燐酸化 Lambda gtl 1アーム(Arme)に結合 し、パック(verpackt)する。800.000の独立クローンから成るｃＤＮＡジーンバ ンクが得られる(13)。２．ｃＤＮＡジーンバンクのスクリーニング、サブクローニング及びＤＮＡ塩基 配列解析 アワガエリ草花粉ｃＤＮＡジーンバンクのＩｇＥスクリーニングをBriteneder らの方法によって行った(14)。ＩｇＥ結合クローンを富化し、これらのクローン からファージ−ＤＮＡをつくった(15)。Kpn I及びSac I切断によって２つのＤＮ Ａ断片を得た；それらは完全Phl p II ｃＤＮＡの両部分と側面の(flankierend) lambda gtll配列とを含んでいた。生じたKpnI/SacI及び SacI ＤＮＡ断片をプ ラスミド pＵＣ 18 サブクローニングし、それで E.coli XL-1ブルーを形質変換 した。制限酵素分折によって適したクローンを決定し、lambda gtl 1前進シーケ ンシングプライマー(22-mer)及びlambda gtl 1逆シーケンシングプライマー(22- mer)(Clontech Laboratories、Palo Alto、 ＵＳＡ)により、並びにＭ13 pＵＣ1 8前進−及び逆プライマー（ドイツ）によってSanger(16)の方法で両鎖(beidstr ngig)の塩基配列を決定した。３．ＲＮＡ(Northern)ブロット アワガエリ草(Phleum pratense)及びドクムギ草(Lojium perenne)の花粉から 得た総ＲＮＡ 10 μｇを変性ゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース上 にブロットした(17)。Phl pII をコードするｃＤＮＡを単離するために、組換え ファージから始めて、相当するＤＮＡインサートをＰＣＲによって増やした。そ の時々に５ピコモルのプライマー ［lambda gtl 1 前進シーケンシングプライマ ー(22-mer)及びlambda gtl 1逆シーケンシング プライマー(22-mer)、Clontech Laboratories、ＵＳＡ］を使用した。ＰＣＲ−生産物をアガロースゲル上で分 離し、バンドをＤＥＡＥ−イオン交換濾紙を用いて溶出した(18)。得られたＤＮ Ａをランダムプライミングによって32Ｐで標識化した(19)。プレハイブ リダイゼーション及びハイブリダイゼーションを標準法によって行った(15)。ブ ロットを3.0 ｘＳＳＣ(20 ｘＳＳＣ＝３Ｍ ＮａＣｌ、0.3 Ｍクエン酸ナトリウ ム、ｐＨ 7.0) 、0.1％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；1.5ＳＳＣ、0.1％ ＳＤＳ及び最後に0.75％ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳで50℃で洗い、オートラジオグラ フィー (Hyperfilm MP ， Amersham,ロンドン、英国)した。４．溶原性E.coli Y1089 におけるPhl p II ｃＤＮＡのβ−ガラクトシダーゼ融 合蛋白質としての発現 ＩｇＥスクリーニングを利用して、Phl p IIアレルゲンをコードする完全ｃＤ ＮＡコローンを得た。組換えLambda gtl 1ファージを溶原性E.coli種Y 1089に感 染させ、付着物（沈殿物）(Ansatz)からβ−ガラクトシダーゼ−融合蛋白質を得 た(20)。付着物を7.5％ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動により分離し( 21)、ニトロセルロースにブロットした(22)。その融合蛋白質は草花粉アレルギ ー患者の血清−ＩｇＥ及びヨード標識家兎抗ヒトＩｇＥ抗体(Pharmacia 、アプ サラ、スウェーデン）によって検出された。 添付の図はこの組換えPhl p IIアレルゲンを、抗原−抗体−相互作用、抗原依 存性仲介物質遊離、並びに抗原依存性細胞反応性に基づく操作に利用できること を説明するものである。図１は組換えPhl p IIアレルゲンのｃＤＮＡ及びそれか ら誘導されるアミノ酸配列を示す。Phl p IIアレルゲンの完全ｃＤＮＡ塩基配列 が示される。塩基長さ24のnon-coding （ノンコーディング）（非翻訳）配列が ｃＤＮＡの５’末端に見いだされ、それに続いて78塩基長さの先導配列がある； それは図中で下線を引いたシグナルペプチドを規定する。成熟蛋白のアミノ酸配 列は塩基 78 以下から導かれ、バリンで始まる。コードする塩基配列を３’末端 で打ち切る停止コドンには星印をつける。３つのnon-coding塩基配列はポリＡ末 端で終わりである。 図２は組換えPhl p IIアレルゲンのアミノ酸配列とその他の群II/III草花粉ア レルゲンのアミノ酸配列との類似性を示す。 図３は組換えPhl p IIアレルゲンのＢ−細胞エピトープの説明である。 図４はＴ−細胞エピトープを示す。 図５は組換えPhl p IIアレルゲンと草花粉アレルギー患者の血清ＩｇＥとの反 応性を示す。組換えPhl p IIはファージ感染及びＩＰＴＧ誘導によって、β−ガ ラクトシダーゼ融合蛋白として溶原性E.coli Y 1089に発現される。組換えPhl p IIを含むE.coli蛋白質を電気泳動によって分離し、ニトロセルロースに移す。 ライン１では群II/IIIのアレルゲンに反応するアレルギー性患者の血清ＩｇＥが 用いられ、ライン２及び３では群II/IIIアレルゲンで反応を示さなかったアレル ギー患者のＩｇＥによって検出され、ライン４は非アレルギー性のコントロール 患者の血清による検査を示す。 図６は或る草花粉アレルゲンに対してＩｇＥ反応性を示す草花粉アレルギー患 者のパーセンテージを列挙した表である。種々の草花粉アレルゲンをもった草花 粉アレルギー患者の反応性の頻度が示される。数値は、代表的数の患者において 天然−及び組換え草花粉アレルゲンによる試験によって明らかにされた概算値で ある。 図７は組換えPhl p IIが天然−群II/IIIアレルゲン−ＩｇＥ−阻害と同様のＩ ｇＥ−エピトープを担うことを証明している。群II/IIIアレルゲン(10- 12 kD)及び群Ｉアレルゲン(約 30kD)とのＩｇＥ反応性を示す草花粉アレルギー 患者の血清を、組換えPhl p II （ライン２）、組換えPhl p I （ライン３）、 組換え BetνＩ（ライン４）、又はE.coli−蛋白質（ライン１）と共にプレイン キュベーションした。組換えPhl p IIとのプレインキュベーションは、12 kD 領 域における天然Phl p IIへのＩｇＥ結合をほとんど完全に消失せしめたが、30 k DにおけるPhl p IIとの反応性には影響を与えない。組換えPhl p Ｉは天然Phl p Ｉへの結合のみを減少させ、Phl p IIへのＩｇＥ結合には影響を及ぼさない。 コントロール蛋白質、組換えBetνＩ及びE.coli蛋白質とのプレインキュベーシ ョンは天然Phl p Ｉ及びPhl p IIへのＩｇＥ結合に害を及ぼさない。このことか ら、組換えPhl p IIは天然Phl p IIと類似の又は同じＩｇＥ−エピトープをもつ が、群Ｉの天然−又は組換えアレルゲンとの間に抗原類縁関係がないことがわか る。 図８は、Phl p IIを規定するｃＤＮＡの、アワガエリ草及びドクムギ草のｍＲ ＮＡとのハイブリダイゼーションを明らかにする。ドクムギ草（ライン１）及び アワガエリ草（ライン２）花粉から総ＲＮＡを単離し、10μｇを変性アガロース ゲル上で分離し、ニトロセルロースにブロットした。Phl p IIをコードする、32 Ｐで標識化したｃＤＮＡは大体18SＲＮＡの高さでドクムギ草−並びにアワガエ リ草ＲＮＡとハイブリダイゼーションし、明らかにそれ以下でも約600塩基の転 写大きさでハイブリダイゼーションする。交差ハイブリダイゼーションは、種々 の草類の群II/IIIアレルゲンをコードする転写物（トランスクリプト）が構造的 に類似していることを示す。 図９Ａ及びＢは組換えPhl p IIアレルゲンと群II/III草花粉アレルゲン特異的 抗体との反応性を示す Ａ：アワガエリ草花粉アレルゲン及びシラカバの主要アレルゲン、Bet ν Ｉ （Ｃｏ）を発現する Lanbda gtl 1ファージ、並びに組換えてないファージ（λ ）をDot Blot法で草花粉アレルゲン特異抗体で試験した。４Ｂ１は群Ｖアレルゲ ンに結合し、Ｒ４は群Ｉアレルゲンを検出し、Ｒ５は群Ｖ及び群II/IIIアレルゲ ンを確認する。Ｂ：グラフはクローン記号をあらわす。組換えPhl p IIはクロー ンＡによって発現される。 実施例：組換えPhl p IIアレルゲンの塩基配列解析−他の群II/IIIアレルゲンとの類似性 Phl p IIアレルゲンのＤＮＡ塩基配列をSanger(16)の方法によりｃＤＮＡのシ ーケンシングによって決定した。図１は決定されたＤＮＡ−塩基配列及びそれか ら誘導されるアミノ酸配列を示す。成熟蛋白質に先行するシグナルペプチドが他 の真核生物シグナルペプチドと顕著な相同性を示すことから、群II/IIIアレルゲ ンは明白な遺伝子断片によってコードされるもので、群Ｉアレルゲンから蛋白分 解性互解によって生じるものではないことが明らかに証明される。図２に示され た組換えPhl p IIとドクムギ草からの相同蛋白質(Lot p II及びLot p III)との 高い塩基配列相同性(約 70 ％の塩基配列が一致）は、これらの蛋白質の構造的 に狭い類縁関係を示し、したがって種々の種の群II/IIIアレルゲンの免疫学的類 縁関係の分子的基礎を与える。組換えPhl p IIアレルゲンのＢ−細胞及びＴ−細胞エピトープの決定 Phl p IIアレルゲンの誘導されたアミノ酸配列に基づいて、Ｂ−細胞及びＴ− 細胞エピトープを適切なコンピュータープログラム（24、25）を利用して決定す ることができた。重要なＢ−細胞及びＴ−細胞エピトープを図３及び図４にまと める。Ｂ−細胞エピトープに相当する合成ぺプチドは草花粉アレルギー患者のＩ ｇＥに結合し、一方Ｔ−細胞エピトープに相当する合成ぺプチドは草花粉アレル ギー患者のＴ−細胞の増殖を促進し、その結果Ｈ3−チミジンの取り込みが高ま る。Phl p IIをコードするｃＤＮＡの、E.coliにおける組換えPhl p IIアレルゲンと しての発現 Phl p IIをコードするｃＤＮＡを含む組換えファージを溶原性E.coli Y 1089 に感染させた。液体培養におけるＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトシ ド）誘導によって組換えβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質が得られた(20)。 コントロール蛋白質、β−ガラクトシダーゼはウェスターン−ブロット法ではＩ ｇＥ結合を示さなかったが、組換えPhl p II融合蛋白質は、種々の草種の群II/I IIアレルゲンに反応する患者の血清ＩｇＥで、特異的に顕著なＩｇＥ結合を示し た。組換えPhl p IIアレルゲンのＩｇＥ結合能力 群II/IIIの天然アレルゲンと反応する草花粉アレルギー患者の血清を組換 えPhl p IIとプレインキュベートし、その後群II/III特異的ＩｇＥを分離した。 図６は、群II/III天然アレルゲンとの結合がプレインキュベーションによってほ とんど完全に消失し、一方群Ｉ及び群Ｖアレルゲンとの結合は影響を受けなかっ たことを示す。これは天然群II/IIIアレルゲンのＩｇＥエピトープが組換えPhl p IIによって覆われたこと、及び群Ｉ、群Ｖ及び群II/IIIアレルゲンの間の交差 反応性は多分些細であることを示すものである。Phl p II ｃＤＮＡと Lol p II/III ｍＲＮＡとの交差ハイブリダイゼーション ドクムギ草−及びアワガエリ草花粉の総ＲＮＡを単離し、変性アガロースゲル で分離し、ニトロセルロース膜に移した。その膜を、Phl p IIを規定する完全ｃ ＤＮＡとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション−バンドは18Sリボソー ムＲＮＡの高さ及び明らかにその下にあらわれる。臭化エチジウムでゲルを着色 した後ほぼ同量の総ＲＮＡを用いたとはいえ、ハイブリダイゼーションはドクム ギ草ＲＮＡとよりもアワガエリ草ＲＮＡとの方がより強い。それにもかかわらず 厳密な条件のもとで交差ハイブリダイゼーションに達することができた。より大 きい転写物（トランスクリプト）は、場合によっては、より大きい、だが未熟な ＲＮＡを生じる、なせならばそのハイブリダイゼーションは厳しい洗浄にも耐え るからである。この実施例は種々の種の群II/III草花粉アレルゲンの相同性を証 明するものである。 参考文献 １．フライドホフ，L.R., エルリッヒ−カウツキィ，E., グラント，J.H. ,メ イヤーズ，D.A., およびマーシュ，D.G.(1986) ジャーナル オブアレルギー クリニカル イミノロジー 78巻、1190-1201頁［ Freidhoff ,L.R., Ehrlich- Kautzky, E.,Grant, J.H., Meyers, D.A., and Marsh, D.G.(1986) J Allergy C lin Immunol 78,1190-1201 ］ ２．マチエッセン，F., ローエンステイン，H. クリニカル エキスペリメ ンタル アレルギー 21巻、 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (72)発明者 ラフェル シルビア オーストリア国 Ａ―1190 ウィーン ギ ムナジウムストラーセ 85／318 (72)発明者 スタインベルガー ペーテル オーストリア国 Ａ―1150 ウィーン ユ ーレクガッセ 28／７ (72)発明者 クラフト ディートリッヒ オーストリア国 Ａ―1170 ウィーン レ ベンベーク １／18／１ (72)発明者 シャイナー オットー オーストリア国 Ａ―2380 ペルヒトドル ヅドルフ ペーテルバッハガッセ 128 (72)発明者 バレンタ ルドルフ オーストリア国 Ａ―2604 テレズイエン フェルド ベートーヴェンストラ．18

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アレルゲンPhl p II（アワガエリ草花粉アレルゲン）、特にモノコチレド ナー(monocotyledoner)植物、の抗原性をもつポリペプチド、又はこのアレルゲ ンの少なくとも一つのエピトープを示すぺプチド、をコードする核酸塩基配列、 並びに上記核酸塩基配列と厳密な条件のもとでハイブリダイズする核酸塩基配列 を有することを特徴とする組換えＤＮＡ分子。 ２．図１に示される総塩基配列、又はその部分的領域と相同的に一致する核酸 塩基配列を有することを特徴とする請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。 ３．図１に示される塩基配列から変性によって誘導され得る核酸塩基配列を有 することを特徴とする請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。 ４．抗原として特に、モノコチレドナー(monocotyledoner)植物のPhl p IIア レルゲンと交差反応性を示し、且つこれとの高い相同性を示す核酸塩基配列を有 することを特徴とする請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。 ５．発現コントロール塩基配列と結合して機能的に発現構造となることを特徴 とする請求項１ないし４のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ分子。 ６．請求項５記載の組換え発現構造で形質変換されることを特徴とする宿主系 。 ７．Phl p II又はその少なくとも一つのエピトープの抗原性を示すことを特徴 とし、請求項１ないし４のいずれか１項記載のＤＮＡ分子から誘導される ８．図１に示される配列と完全に又は部分的に一致するアミノ酸配列を示すこ とを特徴とする請求項７記載の組換え又は合成蛋白質又はポリペプチド。 ９．アワガエリ草のPhl p IIアレルゲン又はその少なくとも一つのエピトープ の抗原性を示し、且つ付加的ポリペプチド部分を示し、その際総融合生成物が請 求項５記載の発現構造のＤＮＡによってコードされることを特徴とする請求項７ 又は８記載の組換え又は合成蛋白質又はポリペプチド。 10．上記付加的ポリペプチドがβ−ガラクトシダーゼ又は融合に適したその他 のポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載の組換え又は合成蛋白質又 はポリペプチド。 11．請求項７ないし10のいずれか１項記載の合成蛋白質又はポリペプチドを含 むことを特徴とする診断用又は治療用試薬。 12．患者の血清中のＩｇＥ抗体反応を請求項７ないし10のいずれか１項記載の 組換え又は合成蛋白質又はポリペプチドで測定することを特徴とする、患者のPh l p IIアレルゲンに対するアレルギーをインビトロ(in-vitro)で証明する方法。 13．請求項７ないし10のいずれか１項記載の組換え又は合成蛋白質又はポリペ プチドを使用して細胞性反応を剌激又は阻止することを特徴とする、Phl p IIア レルゲンに対する細胞性反応をインビトロ(in-vitro)で証明する方法。 14．花粉アレルギーを示す哺乳類の治療法であって、該哺乳類に請求項７ない し10のいずれか１項記載の組換え又は合成蛋白質又はポリペプチドを投与する20 ことを特徴とする治療法。