JP4763259B2 - 魚パルブアルブミンに基づく低アレルギー誘発性ポリペプチド - Google Patents
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(a)配列番号:1に示すアミノ酸配列に関して、アミノ酸残基1〜15個が欠失、置換、および/または付加されているアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)断片が少なくともアミノ酸15個の長さであって、断片のアミノ酸残基の少なくとも90%が、配列番号:1に示されるアミノ酸配列の対応する残基と同一である、(a)の断片を含むポリペプチド;
(c)断片が少なくともアミノ酸15個の長さである、配列番号:1に示されるアミノ酸配列の断片を含むポリペプチド;
(d)断片が少なくともアミノ酸10個の長さであって、断片のアミノ酸残基の少なくとも80%が配列番号:1に示されるアミノ酸配列の対応する残基と同一である、(a)の断片からなるポリペプチド;および
(e)断片が少なくともアミノ酸10個の長さである、配列番号:1に示されるアミノ酸配列の断片からなるポリペプチド。
(a)配列番号:1に示すアミノ酸配列に関して、アミノ酸残基1〜15個が欠失、置換、および/または付加されているアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)断片が少なくともアミノ酸15個の長さであって、断片のアミノ酸残基の少なくとも90%が、配列番号:1に示されるアミノ酸配列の対応する残基と同一である、(a)の断片を含むポリペプチド;
(c)断片が少なくともアミノ酸15個の長さである、配列番号:1に示されるアミノ酸配列の断片を含むポリペプチド;
(d)断片が少なくともアミノ酸10個の長さであって、断片のアミノ酸残基の少なくとも80%が配列番号:1に示されるアミノ酸配列の対応する残基と同一である、(a)の断片からなるポリペプチド;ならびに
(e)断片が少なくともアミノ酸10個の長さである、配列番号:1に示されるアミノ酸配列の断片からなるポリペプチド。
行列:BLOSUM 62;ギャップオープン:11;ギャップ伸長:1;Xドロップオフ:50;期待値:10;ワードサイズ:3;フィルター:なし
である。
組換え型コイパルブアルブミンの交叉反応能を試験して定量するために、魚アレルギー患者16人からの血清を、組換え型野生型パルブアルブミンと共に予めインキュベートして、既に記述されているように(Swoboda, I.、A. Bugajska-Schretter、P. Verdino、W. Keller、W. R. Sperr、P. Valent、R. Valenta、およびS. Spitzauer、2002、Recombinant carp parvalbumin, the major cross-reactive fish allergen: A tool for diagnosis and therapy of fish allergy、J. Immunol. 168:4576Swoboda, I.、A. Bugajska-Schretter、P. Verdino、W. Keller、W. R. Sperr、P. Valent、R. Valenta、およびS. Spitzauer、2002、Recombinant carp parvalbumin, the major cross-reactive fish allergen: A tool for diagnosis and therapy of fish allergy、J. Immunol. 168:4576)発現および精製させてから、タラ、マグロ、およびサケからのアレルゲン抽出物に曝露した。CAP-FEIA測定による残留IgE反応性の定量から、タラ抽出物に対するIgE結合の62%〜96%の減少、マグロ抽出物に対する33%〜98%の減少、およびサケ抽出物に対する41%〜95%の減少が明らかになった(表2)。これらの知見は、組換え型コイパルブアルブミンが、様々な魚種のアレルゲン抽出物に存在するIgEエピトープの大部分を含む、高度に交叉反応性のアレルゲンを表すことを示した。
魚アレルギー患者16人からの血清を、組換え型コイパルブアルブミン5 μg、または対照目的でBSA 5 μg と共に予めインキュベートした。タラ、マグロ、およびサケの魚抽出物に対する残留IgE反応性を、CAP-FEIAシステム(Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン)を用いて定量した。組換え型アレルゲンに予め吸収させた後の魚抽出物に対するIgE結合の阻害率は、((cpmBSA−cpmparv)/cpmBSA)×100として計算され、ここで、cpmBSAおよびcpmparvは、BSAおよび組換え型コイパルブアルブミンと共にそれぞれ予め吸収させた後のIgE結合を示す。
コイパルブアルブミンcDNA Cyp c 1.01(EMBLアクセッション番号AJ292211)を1つまたは双方の機能的カルシウム結合部位(CDドメインまたはEFドメイン)で改変するために、シャメロン二本鎖部位特異的変異誘発キット(Chameleon Double-Stranded, Site-Directed Mutagenesis Kit)(ストラタジーン(Stratagene)、ラホヤ、カリフォルニア州)を用いて部位特異的変異誘発を行った。Ca2+結合ドメインは、カルシウム結合ループの第1および第3のアミノ酸(Asp)を非極性Ala残基に置き換えることによって変異させた。変異誘発実験は、2つの合成オリゴヌクレオチド(mutCDおよびmutEF)によって、発現ベクターpET-17bにクローニングしたCyp c 1.01 DNAを鋳型として用いて(Swoboda, I.、A. Bugajska-Schretter、P. Verdino、W. Keller、W. R. Sperr、P. Valent、R. Valenta、およびS. Spitzauer、2002、Recombinant carp parvalbumin, the major cross-reactive fish allergen: A tool for diagnosis and therapy of fish allergy、J. Immunol. 168:4576)製造元の説明書に従って実施した。双方のオリゴヌクレオチドは、パルブアルブミンcDNAの45 bpを含んだ。プライマーmutCD(5'-AAG GCC TTT GCT GTC ATT GCC CAA GCC AAG AGC GGC TTC ATT GAG-3'; 配列番号:16)は、コドン52(GAC→GCC)および54(GAC→GCC)に変化を導入し、mutEF (5'-GCC TTC CTG AAA GCT GGA GCC TCT GCT GGT GAT GGC AAG ATT GGA-3'; 配列番号:17)は、コドン90(GAC→GCC)および92(GAT→GCT)にそれぞれ変化を導入した。改変されたコドンは、オリゴヌクレオチド配列における下線で示す。改変は、T7シークエンシングキット(Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン)を用いてジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーションシークエンシング(Sanger, F.、S. Nicklen、およびA. R. Coulson、1977、DNA sequencing with chain terminating、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 74:5463)によって確認し、得られたタンパク質をMut-CD(CDドメインにおける変異)、Mut-EF(EFドメインにおける変異)、およびMut-CD/EF(双方のドメインにおける変異)と命名した。
組換え型野生型パルブアルブミンおよび3つのパルブアルブミン変異体を大腸菌株BL21(DE3)において発現させた。Mut-CDおよびMut-EFタンパク質のイソプロピルチオガラクトピラノシド(IPTG)誘導発現により、野生型タンパク質について認められたものと類似のタンパク質産生が得られ(Swoboda, I.、A. Bugajska-Schretter、P. Verdino、W. Keller、W. R. Sperr、P. Valent、R. Valenta、およびS. Spitzauer、2002、Recombinant carp parvalbumin, the major cross-reactive fish allergen: A tool for diagnosis and therapy of fish allergy、J. Immunol. 168:4576)、総大腸菌タンパク質あたり組換え型タンパク質は25〜30%であった。しかし、Mut-CD/EFを発現する細菌は増殖がより遅く、Mut-CD/EFタンパク質は総細菌タンパク質の約2〜3%に過ぎなかった。組換え型タンパク質は、細菌抽出物の可溶性細胞質分画から陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、15%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE;図2A)のクーマシーブリリアントブルー染色(Laemmli, U.K、1970、Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4、Nature 227:680)による判定で約95%均一になるようにした。
組換え型タンパク質の発現は、100 mg/Lアンピシリンを含むLB培地においてOD600が0.4となるまで増殖させておいた大腸菌BL21(DE3)細胞において誘導した。37℃で2時間誘導した後、タンパク質の大部分は、細菌抽出物の可溶性分画において認められた。細胞を回収して、10 mMトリス(pH 7.5)、1 mM PMSFにおいて再懸濁させ、液体窒素中で凍結して10〜15℃で融解する凍結融解サイクルを数回行うことによって溶解した。Mut-CD/EFの場合、融解した細胞は最終的にウルトラチュラックス(ultraturrax)(Polytron、Kinematica AG、スイス)によって機械的に破壊した。4℃、20,000×gで30分間遠心した後、透明にした上清をDEAEセルロース-セファロースカラム(DEAE Sepharose Fast Flow、Pharmacia Biotech、ウプサラ、スウェーデン)に載せた。精製タンパク質を含む分画を直線的な塩勾配(0〜0.5 M NaClの10 mMトリス、pH 7.5)によって溶出して、PBS(pH 7.4)に対して透析した。
組換え型野生型パルブアルブミンの遠紫外CDスペクトル(図1)は、208 nmおよび223 nmでの2つの広い最小値ならびに200 nm未満での強い最大値とを特徴とした。そのような形状は、αヘリックスがかなりの量存在する構造のしっかりしたタンパク質に典型的である。全体的に、カルシウム結合ドメインの1つが改変されている変異体(Mut-CDおよびMut-EF)のスペクトルは、野生型タンパク質の折りたたまれたタンパク質と同じ特徴を示した。しかし、双方のカルシウム結合ドメインに導入した変異(Mut-CD/EFの場合のような)によって、遠紫外スペクトルの形状に顕著な差が示された。約202 nmで認められた単一の広い最小値は、αヘリックス含有量および分子の二次構造の有意な減少、ならびにランダムコイルの折りたたまれていない構造に移行したことを示している。このように、少数の標的化点突然変異の導入によって、本発明者らは、この非常に安定なアレルゲンの構造を有意に改変することに成功した。
円二色性(CD)測定は、20℃で平衡にした光路1 mmの石英キュベット(Hellma、ムルハイム、バーデン、ドイツ)を用いて12.3〜24.0 μMのタンパク質濃度によって、Jasco(東京、日本)J-715分光偏光計によって行った。スペクトルは、解像度0.2 nm、スキャン速度50 nm/分で記録し、スキャン3回の平均値から得た。最終的なスペクトルは、同一の条件で得られた対応するベースラインスペクトルを差し引くことによって補正した。結果は、所定の波長での平均残基楕円率(Θ)として表記する。
組換え型野生型および変異型のパルブアルブミンに対するIgE反応性を、イムノブロットおよびドットブロット実験において分析した。図2Bに示すイムノブロットは、魚アレルギー患者の血清によって探索して、変性した固定タンパク質のIgE結合能の例となる。血清は常に、野生型アレルゲンに対して強いIgE反応性を示し、Mut-CDまたはMut-EFに対してIgE結合の減少を示し、Mut-CD/EFに対しては結合を示さなかった。
IgE反応性はγ計数によって定量した。結果は1分間あたりの計数(cpm)で示す。
イムノブロットおよびドットブロット分析:
魚アレルギー患者からの血清IgEに対する組換え型コイパルブアルブミン変種の反応性を、イムノブロットまたはドットブロット実験において決定した。イムノブロットの場合、精製タンパク質1.5 μgをSDS-PAGE(Laemmli, U.K、1970、Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4、Nature 227:680)によって分離して、ニトロセルロースメンブレン(Schleicher & Schuell、ダッセル、ドイツ;Towbin, H.、T. Staehelin、およびJ. Gordon、1979、Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350)にブロッティングした。ドットブロット分析の場合、パルブアルブミンタンパク質のアリコート約0.5 μgをニトロセルロースメンブレンにドットした(Schleicher & Schuell)。いずれの場合も、フィルターを、PBST(0.5%v/vツイーン20を含むPBS、pH 7.5)によって1:10に希釈した患者血清によって探索して、結合したIgE抗体を、1:15に倍希釈した125I標識抗ヒトIgE抗体(RAST、Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン)によって検出した。
イムノブロット阻害実験の場合、魚アレルギー患者からの血清を精製組換え型タンパク質と共に、かつ対照目的のために免疫学的に無関係なタンパク質(BSA)(1:10に希釈した血清の10 μg/ml溶液)と共に予めインキュベートした。その後、ニトロセルロースにブロットした精製天然パルブアルブミンを、予め吸収させた血清試料と共にインキュベートして、125Iウサギ抗ヒトIgE抗体(Pharmacia)によって結合したIgEを検出した。
パルブアルブミン変異体の生物活性を分析するために、魚アレルギー患者の末梢血好塩基球を、異なる濃度の組換え型野生型および変異型のタンパク質と共にインキュベートした(図5)。組換え型野生型タンパク質によって、好塩基性顆粒球からの強い用量依存的なヒスタミン放出が誘導された。放出されたヒスタミンの量は、顆粒球をMut-CDまたはMut-EFに曝露した場合にはより少なかったが、細胞をMu-CD/EFに暴露後は大きく減少した。Mut-CD/EFのこの有意に低下したアレルギー誘発活性は、変異したパルブアルブミン誘導体が、治療応用にとって適した候補分子であることを示唆している。
好塩基球ヒスタミン放出アッセイ法
顆粒球をデキストラン沈降によって魚アレルギー患者のヘパリン加血液試料から単離した。細胞を、既に記述されているように(Valent, P.、J. Besemer、M. Muhm、O. Majdic、K. Lechner、およびP. Bettelheim、1989、Interleukin 3 activates human blood basophils via high-affinity binding sites、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5542)、増加した濃度の組換え型コイパルブアルブミン変種、抗ヒトIgE抗体、または緩衝液と共にインキュベートした。遊離したヒスタミンは、ラジオイムノアッセイ法(Immunotech、マルセイユ、フランス)によって無細胞上清において測定した。
Claims (17)
- 以下からなる群より選択される、魚パルブアルブミンに由来する変異ポリペプチド:
(a)配列番号:1の52位、54位、91位および93位のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
(b)配列番号:4の2〜109位のアミノ酸を含むポリペプチド。 - 魚アレルギー患者において、配列番号:1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して低下したアレルギー反応誘導能を有する、請求項1記載のポリペプチド。
- 哺乳類においてIgG反応を誘導することができる、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- 配列番号:1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して有意に減少したヒスタミン放出を誘導する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 配列番号:1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して低下したIgE結合活性を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 配列番号:4に示すアミノ酸配列を含む、変異ポリペプチド。
- 配列番号:1の52位、54位、91位および93位のアミノ酸に対応するアミノ酸位置で置換されている、魚パルブアルブミンに由来する変異ポリペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項8記載のポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミド。
- 請求項9記載のベクターまたはプラスミドによって形質転換またはトランスフェクトした単離宿主細胞。
- ポリペプチドが発現される条件で、請求項10記載の単離宿主細胞を培養する段階、および任意で宿主細胞からポリペプチドを回収する段階を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製する方法。
- ポリペプチドを化学合成する段階を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製する方法。
- 魚アレルギーを治療および/または予防する薬剤を製造するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項8記載のポリヌクレオチド、または請求項10記載の単離宿主細胞の使用。
- 魚アレルギーが配列番号:1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対するアレルギーである、請求項13記載の使用。
- 薬剤が予防的ワクチン接種に用いられる、請求項13または14記載の使用。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項8記載のポリヌクレオチド、または請求項10記載の単離宿主細胞と、薬学的に許容される担体もしくは希釈剤とを含む、薬学的組成物。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項8記載のポリヌクレオチド、請求項10記載の単離宿主細胞、または請求項16記載の薬学的組成物を含む薬学的キット。
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