JP5279238B2 - 血圧降下作用を有する花粉の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、血圧降下作用を有する花粉の製造方法、ならびに、該方法によって得られる花粉を含有する花粉組成物および血圧降下剤に関する。

花粉には糖類、タンパク質、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｃ、Ｅ、パントテン酸、ナイアシン、葉酸、ビオチン、コリン、γ−アミノ酪酸、リン脂質、核酸、さらにミネラルとしてカリウム、カルシウム、リン、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、珪素などが含まれており、花粉は栄養価に富んだものである。

さらに、食物繊維、アミノ酸としてアラニン、グリシン、プロリン、ビタミンとしてイノシトール、葉酸、ミネラルとしてカルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、その他としてカテキン、ルチン、核酸などの栄養成分がローヤルゼリーよりお茶由来またはそば由来の花粉に多く含まれていることが発明者らの研究で明らかになってきた。
このように花粉には様々な栄養成分を含んでおり、例えば、整腸作用、貧血、滋養と体力回復、精神安定など数多くの効果が知られている。

一方、生活習慣病の中でも高血圧患者数は我が国では３０歳以上で２０００万人と推定され、高血圧は現在の国民病ともいわれる側面をもっている。高血圧は各種慢性疾患に対するリスクファクターとなり、脳血管障害、心筋梗塞などの血管障害を誘発することが知られている。今後ますます高齢化が進むにつれ、高血圧症者も増大することが予想され、高血圧の改善あるいは発症の予防が課題となっている（非特許文献１）。

アンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと略することがある）はアンジオテンシンＩを血圧上昇物質であるアンジオテンシンＩＩに変換し、血圧降下作用をもつブラジキニンを分解するため血圧を上昇させる働きがある。したがってＡＣＥを阻害する物質（ＡＣＥ阻害物質）があれば血圧を下げることができ、高血圧症予防又は治療に効果があることが期待される。
ＡＣＥ活性を抑制させることにより血圧を降下させるＡＣＥ阻害物質として、例えば、カプトプリルが開発され医薬品として利用されている。

一方、食品分野においては、乳カゼイン（非特許文献２）、わかめタンパク質（非特許文献３）、かつお節（非特許文献４、非特許文献５）、イワシ（非特許文献６）などの酵素分解物、発酵乳（非特許文献７）、ブナハリタケエキス（非特許文献８）蜜蜂の子（特許文献１）などＡＣＥ阻害阻害物質を含む食品が数多く市販されている。

近年では動物の消化酵素であるトリプシンや枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物由来のタンパク質分解酵素を用いてローヤルゼリーを加水分解することによりＡＣＥ阻害物質を得る試みがなされている（特許文献２、非特許文献９）。さらに、枯草菌由来のタンパク質分解酵素を用いてローヤルゼリーを加水分解した際の血圧降下の関与成分としてはイソロイシン−チロシン、バリン−チロシンおよびイソロイシン−バリン−チロシンなどのペプチドが知られている（非特許文献１０）。しかし、ローヤルゼリーは栄養価に富むものの非常に高価であり、より安価で栄養価に富む血圧降下作用を有する食品が望まれていた。

藤田裕之他、薬理と治療 Ｖｏｌ．２５ Ｎｏ．８ １４７（２１５５）−１５１（２１５９） Ｓ．ｍａｒｕｙａｍａ，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１５８１（１９８７）． Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０，８２−９０，２００４ Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｋ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，１５４１（１９９２） Ｈ． Ｆｕｊｉｔａ．ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．， ６５：５６４（２０００） 関英治 他、日本農芸化学会誌 第６９巻（８号）、１０１３−１０２０（１９９５） Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ， ７７， ９１７−９２２ （１９９４） 坂元雄二 他、応用薬理 第６１巻（４／５）、２２１−２２９（２００１） 丸山広恵 他、日本食品科学工学会誌 第５０巻（７号）、３１０−３１５（２００３年） Ｔｏｋｕｎａｇａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２７（２），１８９−１９２（２００４） 特開２００６−２１１９４６号公報 特開平４−２７９５９７号公報

本発明は、血圧降下作用などの有用な特性を発揮する花粉を得ることのできる新しい技術を提供することを目的とする。

本発明者らは鋭意検討を行った結果、花粉のタンパク質を分解することにより、前記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、
１．花粉のタンパク質を分解する工程を含むことを特徴とする、血圧降下作用を有する花粉の製造方法、
２．タンパク質を分解する工程がタンパク質分解酵素を花粉に作用させる工程である、前記１に記載の花粉の製造方法、
３．タンパク質分解酵素がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属由来のタンパク質分解酵素である前記２に記載の花粉の製造方法、
４．血圧降下作用を有する花粉がアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することを特徴とする、前記１〜３のいずれか一に記載の花粉の製造方法、
５．前記１〜４のいずれかの方法によって得られる血圧降下作用を有する花粉を含有することを特徴とする、花粉組成物、
６．前記１〜４のいずれかの方法によって得られる血圧降下作用を有する花粉を有効成分として含有することを特徴とする、血圧降下剤
からなる。

本発明によれば、安価で高栄養価な血圧降下作用を有する花粉を製造することができ、この血圧降下作用を有する花粉を利用して、花粉組成物質や血圧降下剤を提供することができる。

本発明の血圧降下作用を有する花粉は、花粉のタンパク質を分解する工程により製造される。
花粉には、ミツバチが採取した団子状の花粉のほか、人間が直接採取した花粉であってもよい。ミツバチ花粉の起源植物の種類は好適にお茶、そば、ひまわり、アカシア、菜の花、ユーカリ、バラなどを挙げることができ、いずれの種類の花粉を用いてもよい。また、本発明に用いる花粉は、水またはアルコール等の有機溶媒により花粉から抽出した物であってもよい。さらにこれら抽出物をろ過、フリーズドライまたは熱風乾燥などの加工を行ったものであっても良い。

さらに、花粉は水または適当な緩衝液または有機溶媒またはこれらのものを適宜組み合わせたものに懸濁または溶解させたものであってもよい。このときの花粉の懸濁液または溶解液の濃度は、０．１〜８０ Ｗ／Ｗ％を挙げることがで、好ましくは１〜６０ Ｗ／Ｗ％、より好ましくは５〜５０ Ｗ／Ｗ％を挙げることができる。

花粉のタンパク質を分解する工程はタンパク質分解酵素または微生物を用いた発酵などにより行われる。
タンパク質分解酵素はタンパク質のペプチド結合を加水分解する酵素である。タンパク質分解酵素は微生物由来、動物由来または植物由来のものが例示される。微生物由来のタンパク質分解酵素は微生物培養することにより得られ、植物または動物由来のタンパク質分解酵素は植物または動物の臓器をホモジネートすることに得られる。これらタンパク質分解酵素はさらに精製を行ったものを用いてもよく、またポリエチレングリコールなどで修飾されたものであってもよい。さらに、２種類以上のタンパク質分解酵素を組み合わせて用いても良い。

これら微生物、植物または動物由来のタンパク質分解酵素の内、微生物由来のタンパク質分解酵素を好適に挙げることができる。また、微生物の中でもバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物を挙げることができ、さらに好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物を挙げることができる。これら微生物の具体的な例として枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、パエニバチルス ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、アスペルギルス オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス ホエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、アスペルギルス ソウヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、リゾプス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、ストレプトマイセス グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）を好適に挙げることができる。さらに好適には、枯草菌、バチルス ステアロサーモフィルス、パエニバチルス ポリミキサを挙げることができる。例えば、後述の実施例で用いられているプロテアーゼＮおよびアロアーゼＡＰ−１０は、いずれも、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のタンパク質分解酵素である。

これらタンパク質分解酵素を花粉に作用させる際のｐＨは、花粉の成分の安定性及びタンパク質分解酵素の反応至適ｐＨ及び安定性を考慮して適宜決定することができる。
さらに、タンパク質分解酵素を花粉に作用させる際の温度は、花粉の成分の安定性及びタンパク質分解酵素の反応至適温度及び安定性を考慮して適宜決定することができる。
また、金属塩、キレート剤、無機塩類など適宜加えても良い。

発酵によるタンパク質を分解する工程に用いられる微生物としては例えば細菌、酵母、カビなどが挙げられる。
微生物は単独で使用してもよく、２種以上の微生物を使用してもよい。また、微生物と花粉を混合する場合、必要な菌体量を一度に花粉と混合してもよいし、必要な菌体量を２回以上に分けて混合してもよい。また、２種以上の微生物を使用する場合、ぞれぞれの微生物を同時に花粉と混合してもよく、別々に分けて花粉と混合してもよい。

また、花粉の懸濁液または溶解液に培地成分を添加してもよい。培地成分として例えば、炭素源としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、スクロース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、エチレングリコール、澱粉、糖蜜、コーン・ステープ・リカー、麦芽エキス、澱粉水解物などを単独または二種以上混合したものを例示できる。窒素源としては、アンモニユウム塩、硝酸塩などの無機性窒素源や、ペプトン、大豆粉、肉エキス、カゼイン、カザミノ酸、尿素などの有機性窒素源を単独または二種以上混合したものを例示できる。また、培地には必要に応じて、アミノ酸、各種ビタミン、酵母エキス、粉末酵母、脂肪酸などの有機微量栄養素、リン酸塩、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩、その他の金属塩などの無機塩類をそれぞれ単独または二種以上併用して用いることができる。

本発明に従う花粉の製造においては、花粉のタンパク質を分解する工程の他に多糖類を分解する工程を含んでもよい。
多糖類を分解する工程は多糖分解酵素または微生物を用いた発酵などにより行われる。
多糖分解酵素は糖と糖の結合を加水分解する酵素であり、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、ブルラナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼを例示することができる。多糖分解酵素は微生物由来、動物由来または植物由来のものが例示される。微生物由来の多糖分解酵素は微生物培養することにより得られ、植物または動物由来の多糖分解酵素は植物または動物の臓器をホモジネートすることに得られる。これら多糖分解酵素はさらに精製を行ったものを用いてもよく、またポリエチレングリコールなどで修飾されたものであってもよい。さらに、２種類以上の多糖分解酵素を組み合わせて用いても良い。

これら多糖分解酵素中でもセルラーゼを好適に挙げることができる。さらに、微生物、植物または動物由来のセルラーゼの中でも微生物由来のセルラーゼを好適に挙げることができる。また、微生物の中でも、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、トリコデルマ レェセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ ビリィデェ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）由来のセルラーゼを好適に挙げることができる。

これら多糖分解酵素を花粉に作用させる際のｐＨは、花粉の成分の安定性及び多糖分解酵素の反応至適ｐＨ及び安定性を考慮して適宜決定することができる。
さらに、多糖分解酵素を花粉に作用させる際の温度は、花粉の成分の安定性及び多糖分解酵素の反応至適温度及び安定性を考慮して適宜決定することができる。
また、金属塩、キレート剤、無機塩類など適宜加えても良い。

発酵による多糖類を分解する工程に用いられる微生物としては例えば細菌、酵母、カビなどが挙げられる。
微生物は単独で使用してもよく、２種以上の微生物を使用してもよい。また、微生物と花粉を混合する場合、必要な菌体量を一度に花粉と混合してもよいし、必要な菌体量を２回以上に分けて混合してもよい。また、２種以上の微生物を使用する場合、ぞれぞれの微生物を同時に花粉と混合してもよく、別々に分けて花粉と混合してもよい。

また、花粉の懸濁液または溶解液に培地成分を添加してもよい。培地成分として例えば、炭素源としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、スクロース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、エチレングリコール、澱粉、糖蜜、コーン・ステープ・リカー、麦芽エキス、澱粉水解物などを単独または二種以上混合したものを例示できる。窒素源としては、アンモニユウム塩、硝酸塩などの無機性窒素源や、ペプトン、大豆粉、肉エキス、カゼイン、カザミノ酸、尿素などの有機性窒素源を単独または二種以上混合したものを例示できる。また、培地には必要に応じて、アミノ酸、各種ビタミン、酵母エキス、粉末酵母、脂肪酸などの有機微量栄養素、リン酸塩、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩、その他の金属塩などの無機塩類をそれぞれ単独または二種以上併用して用いることができる。

多糖類を分解する工程は、タンパク質を分解する工程の前に行ってもよいし、タンパク質を分解する工程の後に行ってもよいし、タンパク質を分解する工程と同時に行ってもよい。タンパク質を分解する工程の前に多糖類を分解する工程を行うのが好ましい。

また、酵素を用いて花粉のタンパク質の分解や、多糖類の分解を行った後に、酵素を失活させる工程を含んでもよい。酵素を失活させる方法は、酵素が食品として問題がない程度に失活されればよい。酵素を失活させる方法として加熱により失活させる方法、酵素の阻害剤を用いて失活させる方法、限外ろ過またはゲルろ過などにより酵素を取除く方法が例示でき、これら方法を単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせてもよい。好ましくは、加熱により酵素を失活させる。加熱温度は６０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上で加熱することが好ましい。

微生物を用いて花粉のタンパク質の分解や、多糖類の分解を行った後に、微生物を殺菌する工程を含んでもよい。殺菌方法は、微生物が食品として問題がない程度に殺菌されればよい。殺菌方法としては、加熱により殺菌する方法、薬剤を用いて殺菌する方法、ろ過により微生物を除菌する方法、遠心分離を用いて微生物を除菌する方法が例示でき、これら方法を単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせてもよい。好ましくは、加熱により微生物を殺菌する。加熱温度は６０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上で加熱することが好ましい。

さらに、本発明に従う花粉の製造においては、花粉を殺菌する工程を含んでもよい。殺菌方法としては、加熱により殺菌する方法、薬剤を用いて殺菌する方法、ろ過により微生物を除菌する方法、遠心分離を用いて微生物を除菌する方法が例示でき、これら方法を単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせてもよい。好ましくは、加熱により微生物を殺菌する。加熱温度は６０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上で加熱することが好ましい。花粉を殺菌する工程は、花粉のタンパク質を分解する工程の前または後に行ってもよく、さらに、タンパク質を分解する工程で用いた酵素または微生物を失活または殺菌する工程と兼ねてもよい。さらに、多糖類を分解する工程を行う場合、花粉を殺菌する工程は多糖類を分解する工程の前または後に行ってもよく、さらに、多糖類を分解する工程で用いた酵素または微生物を失活または殺菌する工程と兼ねてもよい。

本発明の血圧降下作用を有する花粉から血圧降下作用に関与する物質について分離または精製を行っても良い。分離または精製の方法としてゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動などを挙げることができ、これら単独若しくは組み合わせることにより精製を行うことも可能である。

ゲルろ過クロマトグラフィーは、種々な分子量のタンパク質を分離できるゲルろ過クロマトグラフィー用の担体があり、分子量が約１万以下のタンパク質を分離できるゲルろ過クロマトグラフィー用の担体が好ましい。イオン交換クロマトグラフィーに用いられているイオン交換基としては、陰イオン交換体、陽イオン交換体などがあり、陰イオン交換体としては、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ基）、四級アミノエチル基（ＱＡＥ）などを例示することができる。また、陽イオン交換体としては、カルボキシメチル（ＣＭ）基、スルホプロピル（ＳＰ）基を例示することができる。疎水クロマトグラフィーに用いられる担体としてはブチル基（Ｂｕｔｙｌ基）、エチル基（Ｅｔｈｙｌ基）、フェニル基（Ｐｈｅｎｙｌ基）が結合した担体を例示することができる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としとはオクタデシル基（Ｃ１８）、オクタデシル基とはアルキル基の長さが異なるＣ３０、Ｃ８、Ｃ４などが結合した担体が例示される。順相クロマトグラフィーに用いられる担体としてはシリカゲルのほか、シアノプロピル基、ジオール構造を有する官能基、アミノプロピル基、ポリアミンなどが結合した担体が例示される。

本発明の血圧降下作用を有する花粉は、上記のように分離または精製を行うことにより血圧降下剤として利用することができる。また、本発明の血圧降下作用を有する花粉、分離または精製品に各種成分を添加することにより花粉組成物として供することができる。各種成分としては、例えば糖、脂質、タンパク質、乳化剤、増粘剤、調味料、香料、酸味調整剤、保存料、果汁、香料、各種栄養成分などが挙げられ、本発明の効果を損なわない範囲で使用することができる。また、各種成分は単独で用いても良いし二種以上を混合して用いてもよい。例えば糖としては、蔗糖、異性化糖、グルコース、フラクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース等を例示することができる。タンパク質としては大豆由来、乳由来のタンパク質を例示することができる。乳化剤としては、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチン等を例示することができる。増粘剤としてはカラギーナン、アラビアガム、キサンタンガム、グァーガム、ペクチン、ローカストビーンガム増粘剤澱粉、ジェランガム等を例示することができる。酸味調整剤としては、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、フマル酸、グルコン酸、酒石酸等を例示することができる。保存料としては、安息香酸及びその塩、ソルビン酸及びその塩、パラベン、亜硫酸ナトリウム、ペクチン分解物、グリシン等を例示することができる。果汁としては、トマト果汁、梅果汁、リンゴ果汁、レモン果汁、オレンジ果汁、ベリー系果汁等を例示することができる。香料としては、ハーブ、スパイスなどの香辛料、フルーツ系香料、バニラなどの香料等を例示することができる。この他、好ましい他の栄養成分として、ビタミンＤ等のビタミン類やカルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類等が挙げられる。

本発明によって得られる血圧降下作用を有する花粉、花粉組成物または血圧降下剤はそれらを添加・配合して調製した食品として供することもできる。そのような食品の具体的形態としては、例えば、飲料類、菓子、キャンディ、ガム、パン、畜肉製品、乳製品、レトルト食品、即席食品、冷凍食品、ゼリー状食品、養蜂産品、漬物、調味料等を挙げることができる。これらの食品は、いわゆる健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品、サプリメントなどとしても有用である。また、それらの食品としての形状としては、顆粒、粉末、タブレット、カプセル、チュアブル、ドリンク、ゼリー、ペースト、粒などを挙げることができる。

さらに、花粉にアレルゲンが含まれている場合、花粉のタンパク質を分解する工程により、アレルゲンが分解されアレルギー性が抑えられた花粉を提供することも可能である。
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。

ＡＣＥ阻害活性測定方法
＜ホウ酸緩衝液の調製＞
５０ｍＭ Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７４５０ｍＬと２２０ｍＭ
Ｈ_３ＢＯ_４５５０ｍＬを混合し、ｐＨ８．３のホウ酸緩衝液を調製した。
＜基質溶液の調製＞
約３０ｍＬのホウ酸緩衝液にＢｚ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ・Ｈ_２Ｏ（分子量４４７．４９ ペプチド研究所社製）１７０ｍｇ、ＮａＣｌ１．７８ｇを溶解後、１ＮＮａＯＨでｐＨ８．３に調整し、ホウ酸緩衝液で５０ｍＬにメスアップして、基質溶液とした。
＜ＡＣＥ溶液の調製＞
アンジオテンシン変換酵素（ウサギ肺由来 シグマ社製）をホウ酸緩衝液で溶解して６０ｍＵ／ｍＬの溶液をＡＣＥ溶液とした。
＜ＡＣＥ阻害活性の測定方法＞

（１）阻害活性の測定
サンプル３０μＬと基質溶液２５０μＬを混合し、３７℃で５分間放置した。５分間放置した後、ＡＣＥ溶液を１００μＬ添加し、３７℃で３０分間反応後、１ＮＨＣｌを２５０μＬ添加し、反応を停止させた。反応停止後１．５ｍＬの酢酸エチルを添加し、激しく１分間攪拌した。次に３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い上層の酢酸エチル層を０．５ｍＬ分取し、遠心エバポレーター（４０℃、１．５時間）で蒸発乾固させた。蒸発乾固させたものに２ｍＬの精製水を加え、溶解後、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＡとする。

（２）ブランクの測定
サンプル３０μＬ及び基質溶液２５０μＬを混合し、３７℃で３５分間放置した。３５分間放置した後、１ＮＨＣｌ２５０μＬを添加しその後ＡＣＥ溶液を１００μＬ添加した。さらに、１．５ｍＬの酢酸エチルを添加し、激しく１分間攪拌した。次に３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い上層の酢酸エチル層を０．５ｍＬ分取し、遠心エバポレーター（４０℃、１．５時間）で蒸発乾固させた。蒸発乾固させたものに２ｍＬの精製水を加え、溶解後、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＢとする。

（３）コントロールの測定
前記（１）活性の測定でサンプルの代わりにホウ酸緩衝液を用いて同様に操作を行い、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＣとする。さらに、前記（２）ブランクの測定の測定でサンプルの代わりにホウ酸緩衝液を用いて同様に操作を行い、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＤとする。

（４）計算
下式によりＡＣＥ阻害活性を求めた。
ＡＣＥ阻害活性（％）＝（Ａ−Ｂ）×１００／（Ｃ−Ｄ）

（１）セルラーゼ処理花粉
ミキサーで粒子を細かくしたお茶由来の花粉１２．５ｇに精製水１５ｍＬを添加し、お茶花粉を懸濁させ、トリコデルマ ビリィデェ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）由来のセルラーゼ（ナガセ産業株式会社）１００ｍｇ添加し、５０℃で３０分間反応させた後、凍結乾燥を行いセルラーゼ処理お茶花粉を得た。

（２）プロテアーゼ処理花粉の調製
ミキサーで細かく粉砕した（１）のセルラーゼ処理お茶花粉を３．７５ｇ秤量し精製水５０ｍＬにメスアップしたものにプロテアーゼＮ（アマノエンザイム社製）を５０ｍｇ添加し、５０℃で１５時間反応させた。反応後９５℃で３０分間処理して酵素を失活させるとともに花粉の殺菌を行い、プロテアーゼＮ処理お茶花粉を得た。
プロテアーゼＮ処理お茶花粉を遠心分離（３０００ｒｐｍ×１０分間）に供し、その上清をホウ酸緩衝液で２５倍希釈して、実施例１に示す方法でＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を表１に示す。

〔表１〕
ＡＣＥ阻害活性（％）
プロテアーゼＮ酵素処理前 ４．５
プロテアーゼＮ酵素処理後 ４４．５

表１に示すようにプロテアーゼＮで処理することにより、ＡＣＥ阻害活性が高くなり、プロテアーゼＮで花粉を処理することによりＡＣＥ阻害物質が生産されていることが確認された。
また、（１）のセルラーゼ処理を行わず、ミキサーで細かく粉砕したお茶由来の花粉に（２）と同様にプロテアーゼＮを作用させ、ホウ酸緩衝液で２５倍希釈して、実施例１に示す方法でＡＣＥ阻害活性を測定したときのＡＣＥ阻害活性は２２．３％となり、ＡＣＥ阻害活性は検出されたもののセルラーゼ処理を行った花粉よりもＡＣＥ阻害活性は低いものとなった。
さらに、プロテアーゼＮ処理によりお茶由来の大部分のタンパク質が分解されていることを電気泳動により確認した。

実施例２で得られたプロテアーゼＮ処理お茶花粉を凍結乾燥処理を行い、単回投与血圧降下薬効試験に供した。自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）を２週間予備飼育後、１１週齢のＳＨＲに（一群６匹、雄）に凍結乾燥処理を行ったプロテアーゼＮ処理お茶花粉を２．５ｍｇ／ｍＬになるように精製水で懸濁し、体重１ｋｇ当り１０ｍＬ投与した（２５ｍｇ／Ｋｇ）。その結果、投与後３時間後の凍結乾燥処理を行ったプロテアーゼＮ処理お茶花粉投与群の血圧の平均は１７１ｍｍＨｇであり、対象群の血圧の平均は１８６ｍｍＨｇであり、プロテアーゼＮ処理お茶花粉を投与することにより有意（ｐ＜０．０５）に血圧降下作用を示した。なお、対象群は精製水を１０ｍＬ投与した。

（１）セルラーゼ処理花粉
ミキサーで粒子を細かくしたソバ由来の花粉１２．５ｇに精製水１５ｍＬを添加し、ソバ花粉を懸濁させ、トリコデルマ ビリィデェ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）由来のセルラーゼ（ナガセ産業株式会社）１００ｍｇ添加し、５０℃で３０分間反応させた後、凍結乾燥を行いセルラーゼ処理ソバ花粉を得た。

（２）プロテアーゼ処理花粉の調製
ミキサーで細かく粉砕した（１）のセルラーゼ処理ソバ花粉を３．７５ｇ秤量し精製水５０ｍＬにメスアップしたものにプロテアーゼＮ（アマノエンザイム社製）を５０ｍｇ添加し、５０℃で１５時間反応させた。反応後９５℃で３０分間処理して酵素を失活させるとともに花粉の殺菌を行い、プロテアーゼＮ処理ソバ花粉を得た。
プロテアーゼＮ処理ソバ花粉を遠心分離（３０００ｒｐｍ×１０分間）に供し、その上清をホウ酸緩衝液で１２倍希釈して、実施例１に示す方法でＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を表２に示す。

〔表２〕
ＡＣＥ阻害活性（％）
プロテアーゼＮ酵素処理前 １．７
プロテアーゼＮ酵素処理後 １６．４

表２に示すようにプロテアーゼＮで処理することにより、ＡＣＥ阻害活性が高くなり、プロテアーゼＮで花粉を処理することによりＡＣＥ阻害物質が生産されていることが確認された。

実施例４で得られたプロテアーゼＮ処理ソバ花粉を凍結乾燥処理を行い、単回投与血圧降下薬効試験に供した。自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）を２週間予備飼育後、１１週齢のＳＨＲに（一群５匹、雄）に凍結乾燥処理を行ったプロテアーゼＮ処理ソバ花粉を１０ｍｇ／ｍＬになるように精製水で懸濁し、体重１ｋｇ当り１０ｍＬ投与した（１００ｍｇ／Ｋｇ）。その結果、投与後６時間後の凍結乾燥処理を行ったプロテアーゼＮ処理ソバ花粉投与群の血圧の平均は１６１ｍｍＨｇであり、対象群の血圧の平均は１８８ｍｍＨｇであり、プロテアーゼＮ処理ソバ花粉を投与することにより有意（ｐ＜０．０５）に血圧降下作用を示した。なお、対象群は精製水を１０ｍＬ投与した。

ミキサーで粒子を細かくしたバラ由来の花粉を３．７５ｇ秤量し精製水５０ｍＬにメスアップしたものに９５℃で３０分間加熱を行い花粉の殺菌を行った。次にアロアーゼＡＰ−１０（ヤクルト薬品工業株式会社社製）を３００ｍｇ添加し、４０℃で１５時間反応させた。反応後９５℃で３０分間処理して酵素を失活させ、アロアーゼ処理バラ花粉を得た。
アロアーゼ処理バラ花粉を遠心分離（３０００ｒｐｍ×１０分間）に供し、その上清をホウ酸緩衝液で１５倍希釈して、実施例１に示す方法でＡＣＥ阻害活性を測定した。ただし、ウサギ肺由来のアンジオテンシン変換酵素のかわりにブタ腎臓由来アンジオテンシン変換酵素（シグマ社）を使用した。その結果を表３に示す。

〔表３〕
ＡＣＥ阻害活性（％）
アロアーゼＡＰ−１０酵素処理前 ４．０
アロアーゼＡＰ−１０酵素処理後 ５３．９

表３に示すようにアロアーゼＡＰ−１０で処理することにより、ＡＣＥ阻害活性が高くなり、アロアーゼＡＰ−１０で花粉を処理することによりＡＣＥ阻害物質が生産されていることが確認された。
バラ花粉は実施例２または４に示すセルラーゼ処理はＡＣＥ阻害活性に影響を及ぼさなかった。

実施例６で得られたアロアーゼＡＰ−１０処理バラ花粉を凍結乾燥処理を行い、単回投与毒性試験に供した。
ＳＤラットを１週間予備飼育後、６週目のＳＤラット（一群雄、雌各６匹）に体重１ｋｇあたり２ｇの割合で経口投与し、１４日間観察した。その結果、全例とも死亡動物はなく、また副作用も認められず、１４日目の剖検においても、組織、臓器の異常はなんら観察されなかった。

Claims (4)

1. お茶由来花粉、ソバ由来花粉またはバラ由来花粉のタンパク質をＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のタンパク質分解酵素で分解する工程を含むことを特徴とする、血圧降下作用を有する花粉のタンパク質分解酵素処理物の製造方法。
2. 血圧降下作用を有する花粉のタンパク質分解酵素処理物がアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
3. 請求項１または２に記載の方法によって得られる血圧降下作用を有する花粉のタンパク質分解酵素処理物を含有することを特徴とする、花粉組成物。
4. 請求項１または２に記載の方法によって得られる血圧降下作用を有する花粉のタンパク質分解酵素処理物を含有することを特徴とする、血圧降下剤。