JP2015154773A - 脳機能改善用ペプチドの酵素的製造方法 - Google Patents
脳機能改善用ペプチドの酵素的製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明はまた、上記加水分解産物を含む飲食品又は医薬組成物に関する。
(2) プロテアーゼが中性プロテアーゼ又はアルカリプロテアーゼである、上記(1)に記載の方法。
(3) プロテアーゼが微生物由来である、上記(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 微生物が、バチルス(Bacillus)属又はアスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物、或いは乳酸菌である、上記(3)に記載の方法。
(5) 微生物が、Bacillus licheniformis、Aspergillus sp.、Aspergillus oryzae、Aspergillus melleus、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus bulgaricus及びStreptococcus thermophilusからなる群から選択される、上記(4)に記載の方法。
(6) 乳カゼインが牛乳カゼインである、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) 配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はそのアミノ酸配列において1若しくは2個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなるペプチドの生成収率が5〜10%、又はそれ以上である、上記(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8) 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はそのアミノ酸配列において1若しくは2個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなるペプチドの生成収率が10〜50%、又はそれ以上である、上記(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9) 配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はそのアミノ酸配列において1若しくは2個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はそのアミノ酸配列において1若しくは2個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなるペプチドとの合計生成収率が15〜60%、又はそれ以上である、上記(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10) 加水分解産物が配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はそのアミノ酸配列において1若しくは2個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなるペプチドをさらに含む、上記(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(11) 酵素触媒がペプチダーゼ活性を有する酵素をさらに含む、上記(1)〜(10)のいずれかに記載の方法。
(12) 酵素触媒が担体に固定化されている、上記(1)〜(11)のいずれかに記載の方法。
(13) 乳カゼインの加水分解が乳汁を用いて行われる、上記(1)〜(12)のいずれかに記載の方法。
(14) 酵素/乳カゼインの重量比が1/100〜1/1,000である、上記(1)〜(13)のいずれかに記載の方法。
(15) 45〜55℃での加水分解反応の反応時間が2〜10時間である、上記(1)〜(14)のいずれかに記載の方法。
(16) 酵素触媒を失活させることをさらに含む、上記(1)〜(15)のいずれかに記載の方法。
(17) 配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はそのアミノ酸配列において1若しくは2個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はそのアミノ酸配列において1若しくは2個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はそのアミノ酸配列において1若しくは2個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなるペプチド、又はそれらのペプチドの少なくとも2種以上を含む混合物を単離及び/又は濃縮することをさらに含む、上記(1)〜(16)のいずれかに記載の方法。
(19) 乾燥されている、上記(18)に記載の加水分解産物。
(20) 上記(18)又は(19)に記載の加水分解産物を含有する飲食品。
(21) 上記(18)又は(19)に記載の加水分解産物を含有するサプリメント。
(22) 乳酸菌発酵飲食品である、上記(20)に記載の飲食品又は上記(21)に記載のサプリメント。
(23) 機能性食品である、上記(20)〜(21)のいずれかに記載の飲食品又はサプリメント。
(24) 上記(18)又は(19)に記載の加水分解産物及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
(25) 脳機能改善用である、上記(24)に記載の医薬組成物。
(26) 脳機能改善が健忘の改善又は予防である、上記(25)に記載の医薬組成物。
1. 脳機能改善作用を有するペプチド
本発明の方法によって乳カゼイン又は乳カゼイン含有原料から酵素的に製造されるペプチド類は以下のアミノ酸配列を有する。
・AsnIleProProLeuThrGlnThrProValValValProProPheLeuGlnProGlu(又は、NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)のアミノ酸配列(配列番号1;以下「N-Eペプチド」と称することもある。)又はそのアミノ酸配列において1若しくは2個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列
・AsnIleProProLeuThrGlnThrProValValValProProPheLeuGlnProGluValMet(又は、NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM)のアミノ酸配列(配列番号2;以下「N-EVMペプチド」と称することもある。)又はそのアミノ酸配列において1若しくは2個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列
・SerTrpMetHisGlnProHisGlnProLeuProProThrValMetPheProProGlnSerValLeu(又は、SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL)のアミノ酸配列(配列番号3;以下「S-SVLペプチド」と称することもある。)又はそのアミノ酸配列において1若しくは2個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列
2.1 酵素的製法の一般的手順
本発明の脳機能改善用ペプチドは、乳カゼインをプロテアーゼを含む酵素触媒で加水分解することによって製造される。
本発明の方法で乳カゼインを加水分解するために使用される酵素触媒は、プロテアーゼを含む酵素触媒である。ここで「含む」という表現は、プロテアーゼの他に、必要に応じてペプチダーゼ活性を有する酵素などの加水分解酵素を含んでもよいことを意味する。
酵素的な加水分解反応は、連続式又はバッチ式のいずれで行ってもよい。連続式では、一般に、固定化酵素触媒が使用され、一方、バッチ式では、非固定化酵素触媒が使用される。
反応をモニターし、目的ペプチドの生成含量が所定の値に達するまで反応を行う。
本発明はさらに、上記の方法によって製造された加水分解産物であって、かつ、配列番号1〜3に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はそのアミノ酸配列において1若しくは2個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなるペプチドのいずれか1種以上を、加水分解産物の乾燥固体1gあたり約0.5mg以上の量で含有することを特徴とする加水分解産物を提供する。
本発明の加水分解産物又は上記ペプチド類は、脳機能を改善する作用を有し、例えば健忘を改善又は予防し、記憶力を増強させる働きがある。健忘は、上記のとおり、記憶力減退を指し、記憶障害のひとつである。このような効果は、後述の実施例で証明されている。したがって、本発明の加水分解産物又は上記ペプチド類は、脳機能の低下に起因する症状及び疾患、例えばうつ病、統合失調症、せん妄、認知症(脳血管性認知症、アルツハイマー病など)などの疾患又は症状の治療または予防のために使用することができるし、このような疾患に至らないが健忘症状が認められる場合にも使用することができる。
本発明はさらに、上記加水分解産物及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
認知症治療薬、例えばアセチルコリンエステラーゼ阻害剤(ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン、タクリンなど)、NMDA受容体拮抗薬(メマンチンなど)等。
抗不安薬、例えばベンゾジアゼピン系抗不安薬等。
抗うつ薬、例えば選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)、セロトニン・ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)、再取り込み阻害薬(SNRI)、三環系抗うつ薬(TCA)、四環系抗うつ薬、トリアゾロピリジン系抗うつ薬(SARI)、モノアミン酸化酵素阻害薬(MAO阻害薬)、ノルアドレナリン作動性・特異的セロトニン作動性抗うつ薬(NaSSA)、ノルエピネフリン-ドパミン再取り込み阻害薬(NDRI)等。
抗精神病薬。
睡眠薬。
本発明はさらに、上記の加水分解産物を含有する飲食品又はサプリメントを提供する。
食品成分、例えばイチョウ葉エキス、アラキドン酸(ARA)、ギャバ(GABA)、テアニン、セラミド、カフェイン、カルニチン、α‐グリセリルホスホリルコリン(α-GPC)、バコパモニエラ、DHA結合リン脂質、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルコリン、セントジョーンズワート、アスタキサンチン、ナイアシン、ピロロキノリンキノン(PQQ)、コエンザイムQ10(CoQ10)等。
不飽和脂肪酸、例えばドコサヘキサエン酸(DHA)、エイコサペンタエン酸(EPA)等。 ポリフェノール類、例えばレスベラトロール等。
クロロゲン酸等。
カテキン類等。
微生物由来酵素を用いたカゼインの加水分解によるAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE;配列番号1)およびAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM;配列番号2)およびSer-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL;配列番号3)のペプチドの酵素的製法
牛乳由来カゼインナトリウム10mgを1mlのpH7.0〜7.3のリン酸緩衝液に分散溶解させ、温度を50℃に調整して基質溶液を調製した。得られた基質溶液に表1に示す市販の各種酵素を、酵素/カゼインの重量比が1/100〜1/400となるように添加して、50℃で4時間反応させ、次いで10%トリクロロ酢酸水溶液を終濃度1%となるよう反応液に添加し、反応を停止させた。続いて、得られた溶液中に含有する各ペプチドの定量は、高速液体クロマトグラフトリプル四重極型質量分析計(LC/MS/MS、Waters TQD)を使用し、分離カラムに逆相のODSカラム、溶離液に0.1%ギ酸水溶液および0.1%ギ酸含有アセトニトリルを用いたグラジエント分析により各成分を分離後、質量分析計で各ペプチドを検出し、合成ペプチドを標準物質として作成した検量線を用いて、含有量を算出した。
酸性プロテアーゼを用いたカゼインの加水分解によるAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE;配列番号1)およびAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM;配列番号2)およびSer-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL;配列番号3)のペプチドの酵素的製法
牛乳由来カゼインナトリウム10mgを1mlのpH4.0の酢酸緩衝液に分散溶解させ、温度を40℃に調整して基質溶液を調製した。得られた基質溶液に表2に示す市販の各種酵素を、酵素/カゼインの重量比が1/200となるように添加して、40℃で3時間反応させ、次いで10%トリクロロ酢酸水溶液を終濃度1%となるよう反応液に添加し、反応を停止させた。続いて、得られた溶液中に含有する各ペプチドの定量は、高速液体クロマトグラフトリプル四重極型質量分析計(LC/MS/MS、Waters TQD)を使用し、分離カラムに逆相のODSカラム、溶離液に0.1%ギ酸水溶液および0.1%ギ酸含有アセトニトリルを用いたグラジエント分析により各成分を分離後、質量分析計で各ペプチドを検出し、合成ペプチドを標準物質として作成した検量線を用いて、含有量を算出した。また、各ペプチドの収率は、実施例1と同様にして概算値を求めた。
哺乳類由来パンクレアチンおよびトリプシンを用いたカゼインの加水分解によるAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE;配列番号1)およびAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM;配列番号2)およびSer-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL;配列番号3)のペプチドの酵素的製法
牛乳由来カゼインナトリウム10mgを1mlのpH7.3のリン酸緩衝液に分散溶解させ、温度を50℃に調整して基質溶液を調製した。得られた基質溶液に表3に示した市販酵素トリプシンおよびトリプシンを、酵素/カゼインの重量比が1/200となるように添加して、50℃で4時間反応させ、次いで10%トリクロロ酢酸水溶液を終濃度1%となるよう反応液に添加し、反応を停止させた。続いて、得られた溶液中に含有する各ペプチドの定量は、高速液体クロマトグラフトリプル四重極型質量分析計(LC/MS/MS、Waters TQD)を使用し、分離カラムに逆相のODSカラム、溶離液に0.1%ギ酸水溶液および0.1%ギ酸含有アセトニトリルを用いたグラジエント分析により各成分を分離後、質量分析計で各ペプチドを検出し、合成ペプチドを標準物質として作成した検量線を用いて、含有量を算出した。また、各ペプチドの収率は、実施例1と同様にして概算値を求めた。
Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE;配列番号1)およびAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM;配列番号2)およびSer-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL;配列番号3)を生成する最適な反応時間の検討
牛乳由来カゼインナトリウム10mgを1mlのpH7.3のリン酸緩衝液に分散溶解させ、温度を50℃に調整して基質溶液を調製した。得られた基質溶液にBacillus licheniformis由来の酵素プロチンSD-AY10(天野エンザイム社製)を、酵素/カゼインの重量比が1/200および1/1000となるように添加して50℃で7時間反応させ、1時間ごとに経時的に反応液を回収した。回収時は、10%トリクロロ酢酸水溶液を終濃度1%となるよう反応液に添加し、反応を停止させた。続いて、得られた溶液中に含有する各ペプチドの定量は、高速液体クロマトグラフトリプル四重極型質量分析計(LC/MS/MS、Waters TQD)を使用し、分離カラムに逆相のODSカラム、溶離液に0.1%ギ酸水溶液および0.1%ギ酸含有アセトニトリルを用いたグラジエント分析により各成分を分離後、質量分析計で各ペプチドを検出し、合成ペプチドを標準物質として作成した検量線を用いて、含有量を算出した。また、各ペプチドの収率は、実施例1と同様にして概算値を求めた。
Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(配列番号1)およびAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(配列番号2)およびSer-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(配列番号3)を生成する最適な反応時間の検討
牛乳由来カゼインナトリウム10mgを1mlのpH7.0または8.0のリン酸緩衝液に分散溶解させ、温度を50℃に調整して基質溶液を調製した。得られた基質溶液にAspergillus sp.由来の酵素スミチームMP(新日本化学工業社製)を、酵素/カゼインの重量比が1/200となるように添加して50℃で7時間反応させ、1時間ごとに経時的に反応液を回収した。回収時は、10%トリクロロ酢酸水溶液を終濃度1%となるよう反応液に添加し、反応を停止させた。続いて、得られた溶液中に含有する各ペプチドの定量は、高速液体クロマトグラフトリプル四重極型質量分析計(LC/MS/MS、Waters TQD)を使用し、分離カラムに逆相のODSカラム、溶離液に0.1%ギ酸水溶液および0.1%ギ酸含有アセトニトリルを用いたグラジエント分析により各成分を分離後、質量分析計で各ペプチドを検出し、合成ペプチドを標準物質として作成した検量線を用いて、含有量を算出した。また、各ペプチドの収率は、実施例1と同様にして概算値を求めた。
Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)の健忘予防作用
ddY系雄性マウス(約7週齢)を用い(n=15-75)、餌及び水は自由摂取させた。被験物質として、Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu 0.05nmol/kg体重(0.1μg/kg体重)、0.5nmol/kg体重(1μg/kg体重)、1.5nmol/kg体重(3μg/kg体重)、5nmol/kg体重(10μg/kg体重)、50nmol/kg体重(100μg/kg体重)、500nmol/kg体重(1000μg/kg体重)を用いた。被験物質は自発的交替行動を評価するY字迷路試験の実施60分前にマウスに単回経口投与した。また、Y字迷路試験の実施30分前には、マウスに脳機能障害(記憶障害および/または認知障害)を誘発するため、スコポラミンを1mg/kg体重となるよう背部に皮下投与した。Y字迷路試験では、一本のアームの長さが40cm、壁の高さが12cm、床の幅が3cm、上部の幅が10cmで3本のアームがそれぞれ120度の角度で接続されたY字迷路を実験装置として用いた。マウスをY字迷路のいずれかのアームの先端に置き、8分間にわたって迷路内を自由に探索させ、マウスが移動したアームを順に記録した。マウスが測定時間内に各アームに移動した回数をカウントし、これを総進入数とし、この中で連続して異なる三つのアームを選択した組み合わせ(例えば、3本のアームをそれぞれA、B、Cとした際に、進入したアームの順番がABCBACACBの場合は重複も含めて4とカウントする)を調べ、この数を自発的交替行動数とした。自発的交替行動数を総進入数から2を引いた数で割り、それに100を掛けて求めた値を自発的交替行動変化率とし、これを自発的交替行動の指標とした。本指標が高値である程、短期記憶が保持されていたことを示す。測定値は群毎に平均値±標準誤差で表した。対照群とスコポラミン対照群との有意差検定はスチューデント(Student)のt検定で行った。また、スコポラミン対照群とNIPPLTQTPVVVPPFLQPE投与群との有意差検定は、一元配置分散分析後にダネット(Dunnett)型多重比較検定で行った。結果を図5に示す。NIPPLTQTPVVVPPFLQPEは0.05nmol/kg体重〜500nmol/kg体重(0.1μg/kg体重〜1000μg/kg体重)の範囲で健忘予防作用を有することが示された。
Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)関連ペプチドの健忘予防作用
ddY系雄性マウス(約7週齢)を用い(n=15-45)、餌及び水は自由摂取させた。被験物質として、Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu 50nmol/kg体重(100μg/kg体重)、またはAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM)50nmol/kg体重(120μg/kg体重)を用いた。被験物質は自発的交替行動を評価するY字迷路試験の実施60分前にマウスに単回経口投与した。また、Y字迷路試験の実施30分前には、マウスに脳機能障害(記憶障害および/または認知障害)を誘発するため、スコポラミンを1mg/kg体重となるよう背部に皮下投与した。Y字迷路試験では、一本のアームの長さが40cm、壁の高さが12cm、床の幅が3cm、上部の幅が10cmで3本のアームがそれぞれ120度の角度で接続されたY字迷路を実験装置として用いた。マウスをY字迷路のいずれかのアームの先端に置き、8分間にわたって迷路内を自由に探索させ、マウスが移動したアームを順に記録した。マウスが測定時間内に各アームに移動した回数をカウントし、これを総進入数とし、この中で連続して異なる三つのアームを選択した組み合わせ(例えば、3本のアームをそれぞれA、B、Cとした際に、進入したアームの順番がABCBACACBの場合は重複も含めて4とカウントする)を調べ、この数を自発的交替行動数とした。自発的交替行動数を総進入数から2を引いた数で割り、それに100を掛けて求めた値を自発的交替行動変化率とし、これを自発的交替行動の指標とした。本指標が高値である程、短期記憶が保持されていたことを示す。測定値は群毎に平均値±標準誤差で表した。対照群とスコポラミン対照群との有意差検定はスチューデント(Student)のt検定で行った。また、スコポラミン対照群と各ペプチド投与群との有意差検定は、一元配置分散分析後にダネット(Dunnett)型多重比較検定で行った。結果を図6に示す。NIPPLTQTPVVVPPFLQPEは50nmol/kg体重(100μg/kg体重)、NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMは50nmol/kg体重(120μg/kg体重)で健忘予防作用を有することが示された。
Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)の記憶力増強作用
ddY系雄性マウス(約7週齢)を用い(n=14-15)、餌及び水は自由摂取させた。被験物質として、Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu 500nmol/kg体重(1000μg/kg体重)を用いた。被験物質は記憶保持を評価する新奇物体認識試験の実施60分前にマウスに単回経口投与した。新奇物体認識試験では、30×30×30 cmの箱を実験装置として用いた。馴化操作として、床敷きを敷いた実験装置内にマウスを5分間入れて自由に装置内を探索させた。馴化操作の翌日に訓練試行を実施した。訓練試行では実験装置内に3種類の物体のうち2個を選んで設置した(物体は床の中心線に沿って両サイドの壁からそれぞれ8 cmの位置に置き、その位置をX1及びX2とした。)。なお、設置する物体の選択については、動物及び群間で偏りがないようにあらかじめランダムに選択した。被験物質または水を経口投与した60分後にマウスを実験装置に5分間入れ、マウスが各物体に対して1 cm以内に接近して探索した時間(秒)を測定した。訓練試行の48時間後に保持試行を実施した。保持試行では訓練試行と同様に実験装置内に物体を2個設置するが、そのうち1個は訓練試行で使用したものとは異なる物体(新奇物体)に替え、その位置をYとした(例として、訓練試行で物体AをX1に物体BをX2に設置した場合、保持試行では物体Aに替えて物体Cを新奇物体として設置し、その位置をYとした。)。訓練試行及び保持試行について、マウスが各物体に対して1 cm以内に接近して探索した時間(秒)を測定した(ただし、物体の上に乗っている状態を除く。)。訓練試行及び保持試行について、それぞれ2個の物体に対して探索を行った時間の比率を求めた。各物体に対する探索時間の比率 (%) は各群とも平均値±標準誤差で表した。有意差検定は、保持試行での新奇物体(Yに設置された物体)に対する探索時間の比率と、訓練試行で新奇物体が置かれていた場所に設置されていた物体(X1またはX2に設置された物体)に対する探索時間の比率について、対照群とペプチド群の間でスチューデント(Student)のt検定で行った。結果を図7に示す。NIPPLTQTPVVVPPFLQPEは500nmol/kg体重(1000μg/kg体重)で記憶力増強作用を有することが示された。
Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL)の健忘予防作用
ddY系雄性マウス(約7週齢)を用い(n=15-30)、餌及び水は自由摂取させた。被験物質として、Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu 150nmol/kg体重(380μg/kg体重)、500nmol/kg体重(1280μg/kg体重)を用いた。被験物質は自発的交替行動を評価するY字迷路試験の実施60分前にマウスに単回経口投与した。また、Y字迷路試験の実施30分前には、マウスに脳機能障害(記憶障害および/または認知障害)を誘発するため、スコポラミンを1mg/kg体重となるよう背部に皮下投与した。Y字迷路試験では、一本のアームの長さが40cm、壁の高さが12cm、床の幅が3cm、上部の幅が10cmで3本のアームがそれぞれ120度の角度で接続されたY字迷路を実験装置として用いた。マウスをY字迷路のいずれかのアームの先端に置き、8分間にわたって迷路内を自由に探索させ、マウスが移動したアームを順に記録した。マウスが測定時間内に各アームに移動した回数をカウントし、これを総進入数とし、この中で連続して異なる三つのアームを選択した組み合わせ(例えば、3本のアームをそれぞれA、B、Cとした際に、進入したアームの順番がABCBACACBの場合は重複も含めて4とカウントする)を調べ、この数を自発的交替行動数とした。自発的交替行動数を総進入数から2を引いた数で割り、それに100を掛けて求めた値を自発的交替行動変化率とし、これを自発的交替行動の指標とした。本指標が高値である程、短期記憶が保持されていたことを示す。測定値は群毎に平均値±標準誤差で表した。対照群とスコポラミン対照群間の有意差検定はスチューデント(Student)のt検定で行った。また、スコポラミン対照群とSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL投与群との有意差検定は、スチューデントのt検定で行った。結果を図8に示す。SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVLは150nmol/kg体重〜500nmol/kg体重(380μg/kg体重〜1280μg/kg)の範囲で健忘予防作用を有することが示された。
Claims (19)
- 乳カゼインを、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)由来のアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・エスピー(Aspergillus sp.)由来のアルカリプロテアーゼ、又はアスペルギルス・メレウス(Aspergillus melleus)由来の中性プロテアーゼを含む酵素触媒で、30〜60℃、pH6.5〜8.5において加水分解して、(i)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、(ii)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、或いは(iii)前記(i)及び(ii)のペプチドの混合物を含む加水分解産物を生成することを含む、但し、該ペプチドの各々の生成収率が2%以上である、又は該混合物の合計生成収率が10%以上であることを特徴とする、脳機能改善用ペプチドの製造方法。
- プロテアーゼがアルカリプロテアーゼである、請求項1に記載の方法。
- 乳カゼインが牛乳カゼインである、請求項1又は2に記載の方法。
- 乳カゼインが乳カゼインナトリウムである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 加水分解産物が、配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 酵素触媒がペプチダーゼ活性を有する酵素をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 酵素触媒が担体に固定化されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 乳カゼインの加水分解が乳汁を用いて行われる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 酵素/乳カゼインの重量比が1/100〜1/1,000である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 酵素/乳カゼインの重量比が1/100〜1/400である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、又はそれらのペプチドの少なくとも2種以上を含む混合物を単離及び/又は濃縮することをさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法によって生成された加水分解産物であって、配列番号1〜3に示されるアミノ酸配列からなるペプチドのいずれか1種以上を、加水分解産物の乾燥固体1gあたり0.5mg以上の量で含有することを特徴とする加水分解産物。
- 乾燥されている、請求項12に記載の加水分解産物。
- 請求項12又は13に記載の加水分解産物を含有する飲食品又はサプリメント。
- 乳酸菌発酵飲食品である、請求項14に記載の飲食品又はサプリメント。
- 機能性食品である、請求項14又は15に記載の飲食品又はサプリメント。
- 請求項12又は13に記載の加水分解産物及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
- 脳機能改善用である、請求項17に記載の医薬組成物。
- 脳機能改善が健忘の改善又は予防である、請求項18に記載の医薬組成物。
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