KR20020019965A - 목초 화분 알러젠의 분리 및 정제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 목초 화분으로부터 5가지 알러젠, 즉 그룹 1, 2, 3, 10 및 13 알러젠을 신속하고 효과적으로 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 상기 목초 화분의 정제는 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 및 양이온 교환 크로마토그래피의 발명적 조합에 기초한다. 본 발명의 방법에 의해 얻은 단백질은 향상된 화분 알러지 진단을 촉진하고, 화분원성 질병의 치료를 위한 약제학적 제제에 사용된다.
Description
타입 1 알러지는 전세계적으로 중요하다. 산업 국가에서, 식물, 진드기, 고양이 또는 개와 같은 다양한 원인에 의해 방출되어, 공기 중에 존재하는 알러젠(에어로알러젠)에 의한 알러지성 비염, 결막염 또는 기관지 천식과 같은 병으로 고통받는 인구가 20%에 이른다. 이러한 타입 1 알러지로 고통받는 사람 중 40%는 또한 목초 화분 알러젠인 경우 특이적 IgE 반응성을 나타낸다(Freidhoff et al., 1986, J Allergy Clin Immunol 78, 1190-201).
타입 1 알러지를 유발하는 물질은 단백질, 당단백질 또는 폴리펩티드이다.점막을 통해 흡수된 후, 이들 알러젠은 감작된 사람의 마스트세포의 표면에 결합된 IgE 분자와 반응한다. 둘 이상의 IgE 분자가 알러젠을 통해 서로 연결되면, 효과기 세포에 의해 매개자(예를 들어, 히스타민, 프로스타글란딘) 및 사이토카인이 분비되어, 대응하는 임상적 증상이 나타난다.
특정 알러젠에 대한 IgE 항체를 가진 알러지 환자의 상대적 빈도에 따라, 주알러젠과 부알러젠 사이에 차이가 생긴다. 지금까지 큰조아재비(푸레움 푸라텐스)의 경우, Phl p 1(Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92, 789-796), Phl p 5(Matthiesen and Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21, 297-307; Petersen et al., 1992), Phl p 6(Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54) 및 Phl p 2/3(Dolecek et al., 1993)는 주알러젠으로 간주되고, Phl p 4(Lowenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62) 및 롤리움 페렌느(Lolium perenne, Ansari et al., 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 80, 229-235)의 그룹 10 및 11은 부알러젠으로 간주되었다. 또한, 최근에는 Phl p 13이라는 다른 고분자량 주알러젠이 기술되고 있다. 그룹 1 및 13 알러젠은 글리코실화된다.
본 발명과 관련하여, 알러지 그룹 1, 2, 3, 10 및 13은 특히 중요하다. 확립된 천연 알러젠 정제방법은 각 경우에 개별 단백질의 분리에 기초한다. 지금까지는 특이적 항체를 사용하여 친화성 크로마토그래피로, 예를 들어, 로리움 페렌느(Lolium perenne, Boutin et al., 1996, Int.Arch.Allergy Immunol. 112, 218-225) 및 푸레움 푸라텐스(Grobe et al., 1999, Eur.J.Biochem. 263, 33-40)로부터 그룹 1 알러젠을 정제해왔다. 이 방법은 용량이 한정적이고, 극단적인 pH를 사용하여 수행되면서도, 그 결과로 본래 구조를 얻을 수 있다는 것이 보장되지 않는다. 다른 방법들은 다양한 다단계 순서의 크로마토그래피 단계에 기초한다. 여기서, 각 경우에 예를 들어, 그룹 10(Ansari et al., 1987, J Allergy Clin Immunol 80, 229-235) 또는 그룹 3(Ansari et al., 1989, Biochemistry 28, 8665-8670)과 같은 개별 알러젠들이 얻어진다. 이 방법들에서는 다른 알러젠들이 손실되거나 순수한 형태로 제조될 수 없다.
DNA 서열 데이터는 특히 Phl p 1(Laffer et al., 1994, J.Allergy Clin. Immunol. 94, 1190-98; Petersen et al., 1995, J. Allergy Clin. Immunol. 95(5), 987-994), Phl p 5(Vrtala et al., 1993, J. Immunol. 151(9), 4773-4781), Phl p 6(Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108(1), 55-59) 및 Phl p 2(Dolecek et al., 1993, FEBS 335(3), 299-304)에 대해 이용가능하다. cDNA 서열의 도움으로, 진단 및 치료에 사용될 수 있는 재조합 알러젠을 생성할 수 있다(Scheiner and Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391).
알러지의 효과적인 치료에 대한 고전적 접근방법은 특이적 면역치료 또는 저감작화이다(Fiebig, 1995, Allergo J. 4(6), 336-339; Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin Immunol. 102(4), 558-562). 이 방법들에서, 천연 알러젠 추출물을 증가된 투여량으로 환자에게 피하주사한다. 그러나, 이 방법은 알러지 반응 또는 과민성 쇼크의 위험을 수반한다. 이러한 위험을 최소화하기 위해, 알러고이드(allergoid) 형태의 새로운 제제를 사용한다. 이들은 미처리 추출물과비교할 때 T-세포 반응성은 동일하지만 IgE 반응성은 상당히 감소된 화학적으로 변형된 알러젠 추출물이다(Fiebig, 1995, Allergo J. 4(7), 377-382).
고도로 정제된 알러젠을 사용하면 더 큰 치료적 최적화가 가능하다. 천연 알러젠으로부터 한정된 칵테일은 이전의 추출물을 대신할 수 있는데, 그 이유는 다양한 알러젠 이외에 이전의 추출물은 특이적 면역치료에 필요하지 않은, 상당히 많은 수의 면역원성이지만 비알러지성인 동반 단백질을 포함하기 때문이다. 알러젠 칵테일을 사용하면, 감작화 스펙트럼에 대응하는 환자-특이적 알러젠 혼합물을 제조할 수도 있다. 실제로, 치료에 필수적인 T-세포 에피토프를 손상시키지 않으면서 2차 및 3차 구조의 비가역적 변형에 의해 IgE 에피토프가 파괴된 변형 알러젠을 사용하면 고순도 천연 알러젠으로 안전하게 저감작시킬 수 있을 것으로 예상된다.
이와 유사하게 본 발명은 유리하게도 알러지 질환, 특히 화분증의 생체외 및 생체내 진단에 사용될 수 있다. 또한, 정제된 알러젠 그룹은 IgE 항체를 검출하는 확립된 방법에 사용된다.
본 발명은 목초 화분으로부터 그룹 1, 2, 3, 10 및 13의 5가지 알러젠(allergen)을 신속하고 효과적으로 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 알러젠 정제에 사용되는 천연 원료는 예를 들면, 푸레움 푸라텐스(Phleum pratense)와 같은 향기풀(sweet grass)이다. 정제는 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 및 양이온 교환 크로마토그래피의 신규 조합을 기초로 한다. 이런 방법으로 얻어진 단백질은 향상된 화분알러지 진단 및 화분-알러지 질병의 치료를 위한 약제학적 제제에 사용될 수 있다.
도 1은 목초 화분 추출물로부터의 상기 5개의 알러젠의 정제 도식을 나타낸다. 알러젠명 Phl p 1 내지 Phl p 13은 본 명세서에 사용된 알러젠 1 내지 13에 해당한다.
본 발명은 효과적인 3단계 정제에 의해 단시간 수성 화분 추출물로부터 4개의 주알러젠 및 1개의 부알러젠을 분리하는 생화학적 정제방법에 관한 것이다. 사용된 천연 원료는 특히, 예를 들어, 푸레움 푸라텐스, 로리움 페렌느(Lolium perenne), 닥틸리스 글로머라타(Dactylis glomerata), 포아 푸라텐시스(Poa pratensis), 사이노돈 닥틸론(Cynodon dactylon), 홀쿠스 라나투스(Holcus lanatus)와 같은 벼과(Graminae)의 화분이다.
따라서, 본 발명은 벼과 화분의 수성 추출물을 제조하고, 가용성 성분을 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 단계 및 바람직하다면, 양이온 교환 크로마토그래피하여, 본질적으로 순수한 그룹 1, 2, 3, 10 및 13 목초 알러젠을 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 한 종류의 크로마토그래피를 다단계 수행할 수 있지만, 일반적으로 이 방법은 매우 효과적이기 때문에, 각 경우에 별도의 한 단계로도 충분하다.
이 방법은 특히 푸레움 푸라텐스, 로리움 페렌느, 닥틸리스 글로머라타, 페스투카 푸라텐시스, 홀쿠스 라나투스, 포아 푸라텐시스, 세칼레 시리얼(Secale cereale) 종의 화분으로부터 상기 알러젠을 분리하는 데 적합하다.
바람직한 실시형태에서, 추출은 트리스/HCl-완충 수용액에 의해 수행된다. 그러나, 본 발명에 따르면 다른 공지된 수성 완충액을 사용할 수도 있다.
상기 알러젠을 정제하기 위하여, 추출물의 가용성 성분을 사용할 수 있다. 그 후, 이 추출물을 18,000 내지 30,000 x g에서 3 내지 8분, 바람직하게는 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 더 정제한다. 이와 달리, 불용성 성분은 다른 방법, 예를 들면, 여과에 의해 분리할 수 있다.
제1크로마토그래피 정제 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피, 예를 들면, 세파로즈(Sepharose)로 수행된다. 여기서, 다수의 불순물들은 지지체 상에 고정되고, 바람직한 알러젠들은 컬럼을 통과한 분획에 위치한다. 이와 유사하게 대응하는 다른 지지 물질이 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 그룹 1, 2, 3, 10 및 13 목초 알러젠이 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 다른 성분으로부터 분리되는 대응 방법에 관한 것이다.
다음 정제단계에서, 목초 알러젠은 세 분획으로 나뉘는데, 그룹 1 및 13이 각각 한 분획씩 나타내고, 그룹 2, 3 및 10이 세번째 분획을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 특히, 그룹 1 및 13 알러젠은 이어지는 겔 여과 단계에 의해 별도의 분획으로 얻어지고, 그룹 2, 3 및 10 알러젠으로부터 분리되는 방법에 관한 것이다.
그리고 나서, 그룹 2, 3 및 10 알러젠은 이어지는 양이온 교환을 통한 크로마토그래피 단계에 의해 본 발명에 따라 서로 분리될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 겔 여과 단계 후에 얻어진 그룹 2, 3 및 10 알러젠이 다음의 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 서로 분리되는 방법에 관한 것이다.
그 자체로 공지된 상기 알러젠은 그들의 공지된, 다른 물리적, 화학적, 생물학적 또는 면역학적 특성에 의해, 특히 등전집중, UV 흡수 측정, SDS-PAGE 및 특이적 항체에 의해 확인된다. 이들 방법 및 기술은 공지되어 있고, 일반적인 용어로 기재되어 있다.
본 발명에 따라 얻어진 알러젠의 수율은 처음 사용된 목초 화분의 총 단백질을 기준으로 0.5 내지 1.5%이다.
본 발명은 또한 알러젠 성분을 분석하는 환자-특이적 감작 스펙트럼 확인의 일부로서 생체내 및 생체외 진단을 향상시키는 데도 기여한다. 따라서, 본 발명은 청구항 1 내지 6에 따라 얻어진 알러젠을 사용하는 화분 알러지의 생체내 및 생체외 진단 방법에 관한 것이다.
이와 유사하게 본 발명은 면역원성이지만 치료와는 관련없는 추출물 성분을 분리하여 얻어진 목초 화분 알러지의 특이적 면역치료를 위한 향상된 제제를 제조하는데 이용할 수 있다. 또한, 정제된 알러젠의 화학반응으로 알러고이드 제제를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 하나 이상의 알러젠 및 바람직하다면 대응하는 보조제 및 부형제를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다.
상기 방법은 하기에 상세하게 기술한다:
큰조아재비 화분으로부터 천연 알러젠의 정제는 3단계 공정으로 수행한다(도 1 참조). 30분 동안 화분을 트리스/HCl-완충액(20mM 트리스/HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)을 사용하여 수성 추출한 후, 추출물을 바람직하게는 20,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 분리한다. 트리스/HCl-완충(20mM 트리스/HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 상등액을 1M 황산암모늄으로 처리하고, 이어서 소수성 상호작용 크로마토그래피(Phenyl-Sepharose High Performance, Pharmacia)한다. 일반 컬럼에 50 내지 100ml의 지지물질을 충전하고, 약 5ml/min의 유속으로 조작한다. 컬럼을 통과하는 분획은 다섯 알러젠 그룹의 단백질만을 포함한다: 그룹 1(30-35 kDa),그룹 2(11kDa), 그룹 3(12kDa), 그룹 10(13kDa) 및 그룹 13(55-60kDa).
이어서, 부피 감소, 바람직하게는 한외여과 또는 동결건조시킨다.
그리고 나서, 제2단계에서는, 수퍼덱스75 프렙 등급 (Superdex75 prep grade, Pharmacia) 또는 이 목적에 적합한 유사한 공지된 지지 물질을 사용하여, 겔 여과하여 이의 상이한 분자량에 따라 저분자량 알러젠으로부터 그룹 13 및 1 알러젠을 분리한다. 용리 매질은 50mM 탄산수소암모늄인 것이 바람직하다. 이 컬럼은 약 5ml/min의 유속으로 조작된다. 알러젠 1 및 13(각각 별도로) 및 2, 3 및 10(한 분획으로)을 포함하는 세 분획을 얻었다.
겔 여과의 세번째 분획에 함께 용리된 저분자량 그룹 2, 3 및 10 알러젠은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 서로 분리된다. 그 후, 동결건조된 시료를 수성 완충액, 바람직하게는 pH 7.2의 20mM 인산염 완충액에 녹이고, 이 완충액(예를 들어, 소스 S)으로 평형시킨 양이온 교환 컬럼에 적용한다. 이 컬럼을 통과하는 분획은 산성 알러젠2를 포함한다. 결합 알러젠들인 3과 10은 0 내지 500mM NaCl의 염 구배로 약 20 컬럼 부피에 걸쳐 차례로 용리된다. 따라서, 저분자량 알러젠 그룹은 이의 개별 알러젠으로 분리된다. 본 발명에 따르면 다른 양이온 교환 물질도사용될 수 있다.
크로마토그래피 단계의 특별한 순서 및 크로마토그래피 매질의 선택으로 구별되어 제공되는 본 발명에 따른 방법에 의해, 본 발명은 노동집약적이거나 시간 소모적이지 않고, 기술적으로 수행될 수 있는, 다수의 고순도, 천연 목초 알러젠을분리하기 위한 고도의 제조방법을 촉진한다. 사용된 정제방법은 단백질에 대해 매우 순하기 때문에, 이의 형태 및 항원성이 유지된다. 이는 성공적인 알러지 질환 진단에 필수적이다.
Claims (8)
- 벼과(Graminae) 화분의 수성 추출물을 제조하고, 가용성 성분을 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 단계 및 필요시, 양이온 교환 크로마토그래피하는 것을 특징으로 하는, 본질적으로 순수한 그룹 1, 2, 3, 10 및 13 목초 알러젠의 분리방법.
- 제 1항에 있어서,푸레움 푸라텐스(Phleum pratense), 로리움 페렌느(Lolium perenne), 닥틸리스 글로머라타(Dactylis glomerata), 페스투카 푸라텐시스(Festuca pratensis), 홀쿠스 라나투스(Holcus lanatus), 포아 푸라텐시스(Poa pratensis), 세칼레 시리얼(Secale cereale) 종의 화분이 추출하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서,상기 추출이 트리스/HCl-완충 수용액을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서,제1단계에서, 그룹 1, 2, 3, 10 및 13 목초 알러젠이 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 다른 성분으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서,상기 그룹 1 및 13 알러젠이 이어지는 겔 여과 단계에 의해 분리된 분획으로 얻어지고, 그룹 2, 3 및 10 알러젠으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서,상기 겔 여과 단계 후 얻어진 그룹 2, 3 및 10 알러젠이 이어지는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 서로 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 따라 얻어진 알러젠을 사용하여 화분 알러지를 생체내 및 생체외 진단하는 방법.
- 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 따라 얻어진 하나 이상의 알러젠 및 대응하는 보조제 및 부형제를 포함하는 약제학적 제제.
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