ES2241646T5 - Procedimiento para el aislamiento y la purificación de alérgenos del polen de las gramíneas - Google Patents
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Procedimiento para el aislamiento y la purificacion de alergenos del polen de las gramfneas.
La invencion se refiere a un procedimiento para el aislamiento y la purificacion de manera rapida y eficaz de cinco alergenos de los grupos 1, 2, 3, 10 y 13 de los polenes de las gramfneas. Para la purificacion de los alergenos sirven los polenes de poaceas como materia prima natural, tal como por ejemplo de Phleum pratense. La purificacion esta basada en una combinacion, segun la invencion, de cromatograffa de interaccion, hidrofoba, filtracion a traves de gel y cromatograffa con intercambio de cationes. Las protefnas, obtenidas de este modo, pueden ser empleadas para un diagnostico mejorado de alergias al polen asf como para preparaciones farmaceuticas para la terapia de enfermedades alergicas por polen.
Las alergias del tipo 1 tienen un significado mundial. Hasta el 20 % de la poblacion en los pafses industrializados sufre molestias tales como rinitis alergica, conjuntivitis o asma bronquial, que son provocadas por los alergenos (aeroalergenos), que se encuentran en el aire, que son liberados por diversas fuentes tales como plantas, acaros, gatos o perros. Hasta el 40 % de estos alergicos de tipo 1 presentan, a su vez, reactividad especffica a IgE con alergenos procedentes del polen de las gramfneas (Freidhoff et al., 1986, J Allergy Clin Immunol 78, 1190-201).
Las substancias, que provocan la alergia del tipo 1, estan constituidas por protefnas, glicoprotefnas o polipeptidos. Estos alergenos reaccionan, tras la absorcion a traves de las mucosas, con moleculas IgE enlazadas en la superficie de los mastocitos en personas sensibilizadas. Cuando se reticulan entre sf dos o varias moleculas IgE por medio de un alergeno, esto conduce a un vertido de mediadores (por ejemplo histamina, prostaglandina) y citoquinas a traves de las celulas efectoras y, de este modo, a los sfntomas clfnicos correspondientes.
En funcion de la frecuencia relativa de los alergicos, que presentan anticuerpos IgE frente a determinados alergenos se distingue entre alergenos mayores y alergenos menores. En el caso del fleo de los prados (Phleum pratense) se han caracterizado, hasta el presente Phl p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92, 789-796), Phl p 5 (Matthiesen y Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21, 297-307; Petersen et al., 1992), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54) y Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993) como alergenos mayores y Phl p 4 (Lowenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62) asf como grupos 10 y 11 de Lolium perenne (Ansari et. al., 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 80, 229-235) como alergenos menores. Ademas se ha descrito recientemente otro alergeno mayor de elevado peso molecular, que se ha designado Phl p 13. Los alergenos de los grupos 1 y 13 estan glicosilados.
En relacion con la presente invencion tienen un significado especial los grupos de alergenos 1, 2, 3, 10 y 13. Los metodos de purificacion establecidos de los alergenos naturales estan basados en el aislamiento de las protefnas individuales correspondientes. Mediante cromatograffa de afinidad con empleo de anticuerpos especfficos se han purificado por ejemplo hasta el presente alergenos del grupo 1 a partir de Lolium perenne (Boutin et al., 1996, Int. Arch. Allergy Immunol. 112, 218-225) y Phleum pratense (Grobe et al., 1999, Eur. J. Biochem. 263, 33-40). Este metodo esta limitado en lo que respecta a su capacidad y se lleva a cabo con empleo de un valor del pH extremo de manera que el contenido de la conformacion nativa no puede ser asegurado. Otros procedimientos estan basados en diversas series, multietapas, de etapas cromatograficas. En este caso se obtienen respectivamente alergenos individuales, tales como por ejemplo grupo 10 (Ansari et al., 1987, J. Allergy Clin Immunol 80, 229-235) o grupo 3 (Ansari et al., 1989, Biochemistry 28, 8665-8670). Otros alergenos se pierden o no pueden ser obtenidos en estado puro con estos metodos.
Se describe un metodo para la purificacion de los alergenos principales de los grupos 1 y 5 a partir de polen de gramfneas por Fahlbusch et al., (J. Immunol. Meth. 194 (1996) 27-34). Sin embargo este metodo esta limitado tambien lo que se refiere a su capacidad.
Los datos de la secuencia DNA estan disponibles, entre otros, para Phl p1 (Laffer et al., 1994, J. Allergy Clin. Immunol. 94, 1190-98; Petersen et al., 1995, J. Allergy Clin. Immunol. 95(5) 987-994), Phl p 5 (Vrtala et al., 1993, J. Immunol 151 (9), 4773-4781), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108 (1), 55-59) y Phl p 2 (Dolecek et. al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304). Con ayuda de las secuencias cDNA es posible la preparacion de alergenos recombinantes, que pueden encontrar aplicacion en el diagnostico y la terapia (Scheiner and Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391).
Una publicacion clasica relativa al tratamiento terapeutico eficaz de alergias esta representada por el artfculo Spezifische Immuntherapie oder Hyposensibilisierung (Inmunoterapia especffica o hiposensibilizacion) (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6), 336-339; Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin Immunol. 102 (4), 558-562). En este caso se inyectan de manera subcutanea al paciente extractos naturales de alergenos a dosis crecientes. Desde luego en el caso de este metodo existe el peligro de reacciones alergicas o incluso de un choque anafilactico. Con el fin de minimizar estos riesgos se emplean preparados innovativos en forma de alergoides. Estos estan constituidos por extractos de
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alergenos qufmicamente modificados, que presentan una reactividad IgE claramente menor, sin embargo identica a la reactividad de la celula T en comparacion con el extracto no tratado (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382).
Serfa posible una optimacion mayor de la terapia con alergenos altamente purificados. Las combinaciones definidas constituidas por alergenos naturales pueden sustituir a los extractos actuales puesto que estos contienen, ademas de los diversos alergenos, un numero mayor de protefnas acompanantes inmunogenas, pero no alergenicas, que no son necesarias para la inmunoterapia especffica. El empleo de combinaciones de alergenos permite tambien la preparacion de mezclas de alergenos especfficas para cada paciente de acuerdo con el espectro de sensibilizacion. Las perspectivas realfsticas, que podrfan conducir a una hiposensibilizacion segura con alergenos naturales altamente purificados, son ofrecidas por alergenos modificados, en los cuales han sido destruidos los epitopos IgE mediante modificacion irreversible de la estructura secundaria y terciaria, sin que se influya negativamente sobre los epitopos de las celulas T, esenciales para la terapia.
La invencion puede emplearse ventajosamente, tambien, en el diagnostico in vitro e in vivo de enfermedades alergicas, especialmente de polinosis. Para ello se emplearan los grupos de alergenos, purificados, para la deteccion de anticuerpos IgE en procedimientos establecidos.
La invencion esta constituida por un procedimiento bioqufmico de purificacion, que conduce al aislamiento de 4 alergenos mayores y de 1 alergeno menor a partir de extractos acuosos de polen, momentaneos, por medio de una purificacion eficaz en tres etapas. Como materias primas naturales sirven polenes de gramfneas, tales como por ejemplo de Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus. La figura 1 representa entre otras cosas, el esquema de purificacion de los 5 alergenos citados a partir de extractos de polen de gramfneas. En este caso corresponden las denominaciones de los alergenos Phl p 1 hasta Phl p 13 a las denominaciones empleadas por lo demas en el texto de los alergenos 1 hasta 13.
El objeto de la invencion es, por lo tanto, un procedimiento para la obtencion de alergenos de gramfneas, esencialmente puros, de los grupos 1, 2, 3, 10, 13, excepto Phleum pratense, en el que se prepara un extracto acuoso del polen de las gramfneas, y los componentes solubles se someten a una cromatograffa de interaccion, hidrofoba, a una etapa de filtracion a traves de gel y, opcionalmente, a una cromatograffa con intercambio de cationes. Conforme a la invencion, tambien se proporciona un procedimiento para la obtencion de alergenos de gramfneas esencialmente puros, de los grupos 1, 2, 3, 10, 13, caracterizado porque se prepara un extracto acuoso del polen de las gramfneas, y los componentes solubles se someten a una cromatograffa de interaccion hidrofoba, a un paso de filtracion a traves de gel y a una cromatograffa con intercambio de cationes.
Segun la invencion pueden llevarse a cabo, tambien, varias etapas de un tipo de cromatograffa, por regla general el procedimiento es tan eficaz, que es suficiente una sola etapa de separacion, respectivamente.
El procedimiento es adecuado, de forma preferente, para la obtencion de los alergenos citados a partir del polen de las especies Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Festuca pratensis, Holcus lanatus, Poa pratensis, Secale cereale.
En una variante preferente de realizacion se lleva a cabo la extraccion por medio de solucion acuosa tamponada de Tris/HCl. Sin embargo pueden emplearse, segun la invencion, tambien otras soluciones acuosas tamponadas conocidas.
Para la purificacion de los alergenos citados se emplean los componentes solubles del extracto. Para ello se centrifuga el extracto durante 3 hasta 8 minutos, preferentemente durante 5 minutos a 18.000 hasta 30.000 x g y el sobrenadante se toma para una purificacion adicional. Alternativamente puede llevarse a cabo tambien una separacion de los componentes insolubles mediante otros metodos, por ejemplo mediante filtracion.
La primera etapa cromatografica de purificacion se lleva a cabo por medio de cromatograffa de interaccion hidrofoba, por ejemplo sobre Sepharose®. En este caso se retiene un gran numero de impurezas sobre el soporte, mientras que los alergenos deseados se encuentran en el soluto. Igualmente pueden emplearse otros materiales de soporte correspondientes.
El objeto de la invencion es, por lo tanto, un procedimiento correspondiente, en el cual se separan, de otros componentes, los alergenos de las gramfneas de los grupos 1, 2, 3, 10, 13 por medio de cromatograffa de interaccion hidrofoba.
En la etapa de purificacion subsiguiente se separan los alergenos de las gramfneas en tres fracciones, representando los grupos 1, 13 respectivamente una fraccion y los grupos 2, 3 y 10 la tercera fraccion. El objeto de la invencion es, por lo tanto, en especial, un procedimiento en el que se obtienen los alergenos de los grupos 1 y 13 en fracciones separadas por medio de una etapa de filtracion a traves de gel conectada aguas abajo y se separan de los alergenos de los grupos 2, 3 y 10.
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Estos ultimos pueden separarse entre si, segun la invencion, por medio de una etapa de cromatograffa conectada aguas abajo, por medio de un intercambiador de cationes. El objeto de la invencion es, por lo tanto, un procedimiento, en el que los alergenos de los grupos 2, 3 y 10, obtenidos tras la etapa de filtracion a traves de gel, se separan entre si por medio de una cromatograffa de intercambio de cationes conectada aguas abajo.
La identificacion de los alergenos citados, en si conocidos, se lleva a cabo bien por medio de sus propiedades ffsicas, qufmicas, biologicas o inmunologicas que, segun se sabe, son diferentes, especialmente mediante focalizado isoelectrico, medicion mediante absorcion de UV, SDS-PAGE y anticuerpos especfficos. Estos procedimientos y tecnicas son conocidos y se han descrito de manera general.
Los rendimientos de los alergenos obtenidos segun la invencion son de 0,5 hasta 1,5 % referido al conjunto de la protefna originalmente empleada del polen de las gramfneas.
La invencion sirve tambien para mejorar el diagnostico in vitro e in vivo en el ambito de una identificacion del espectro de sensibilizacion especffico del paciente, resolvedora de los componentes alergenos.
La invencion sirve, igualmente, para la obtencion de preparados mejorados para la inmunoterapia especffica de alergias del polen de las gramfneas, que se consigue mediante la separacion de los componentes del extracto inmunogenos, pero irrelevantes para la terapia. Ademas, puede obtenerse un preparado alergoide mediante la reaccion qufmica de los alergenos purificados.
A continuacion se describe en detalle el procedimiento.
La purificacion de los alergenos naturales a partir del polen del fleo de los prados se lleva a cabo en un procedimiento con tres etapas (vease la figura 1). Despues de la extraccion acuosa con solucion tamponada de Tris/HCl (20 mM de Tris/HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0) de polen durante 30 minutos se separa el extracto mediante centrifugacion, preferentemente a 20.000 x g durante cinco minutos. El sobrenadante tamponado con Tris/HCl (20 mM de Tris/HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0) se combina con sulfato de amonio 1 M y, a continuacion, se somete a una cromatograffa de interaccion hidrofoba (Phenyl-Sepharose High Performance, Pharmacia). Una columna tfpica esta empaquetada con 50 hasta 100 ml de material de soporte y se hace trabajar con una velocidad de flujo de 5 ml/min aproximadamente. La fraccion del soluto contiene exclusivamente la protefna de cinco grupos de alergenos: grupo 1 (30-35 kDa), grupo 2 (11 kDa), grupo 3 (12 kDa), grupo 10 (13 kDa) y grupo 13 (55-60 kDa). A continuacion se lleva a cabo una reduccion del volumen preferentemente mediante ultrafiltracion o por liofilizacion.
En una segunda etapa se separan los alergenos de los grupos 13 y 1 a continuacion mediante filtracion a traves de gel, de manera correspondiente a sus pesos moleculares diferentes con Superdex® 75 prep grade (Pharmacia) o con materiales de soporte similares, conocidos, adecuados para esta finalidad, de los alergenos de bajo peso molecular. El medio de elucion esta constituido preferentemente por bicarbonato de amonio 50 mM. La columna se hace trabajar con una velocidad de flujo de 5 ml/min aproximadamente. Se obtienen tres fracciones, que contienen los alergenos 1, 13 (separados respectivamente) y 2, 3, 10 (en una sola fraccion).
Los alergenos de bajo peso molecular de los grupos 2, 3 y 10, que se han eluido junto con la tercera fraccion de la filtracion a traves de gel, se separan entre sf por medio de cromatograffa de intercambio cationico. Para ello se recoge la muestra liofilizada en un tampon acuoso, preferentemente tampon de fosfato 20 mM, pH 7,2 y se aplica sobre una columna intercambiadora de cationes, equilibrada con este tampon (por ejemplo Source S ®). En el soluto se encuentra el alergeno acido 2. Mediante un gradiente salino de NaCl desde 0 hasta 500 mM durante aproximadamente 20 volumenes de la columna, se eluyen, sucesivamente, los alergenos enlazados 3 y 10. De este modo se ha separado el grupo de alergenos de bajo peso molecular en sus alergenos individuales. Segun la invencion pueden emplearse tambien otros materiales intercambiadores de cationes.
La presente invencion posibilita, por lo tanto, mediante el procedimiento segun la invencion, puesto a disposicion, que se caracteriza por la serie especial de etapas de cromatograffa asf como por la eleccion de los medios para la cromatograffa, un metodo de produccion altamente calibrado, empleable industrialmente para la obtencion de varios alergenos naturales, de gramfneas, altamente purificados con un coste menor de trabajo y de tiempo. Puesto que los procedimientos de purificacion empleados son muy cuidadosos para las protefnas, se mantienen sus conformaciones y su antigenidad. Esto es una condicion previa para llevar a cabo un diagnostico con exito de las enfermedades alergicas.
Claims (8)
- 510152025REIVINDICACIONES1. Procedimiento de obtencion de alergenos de gramfnea esencialmente puros de los grupos 1, 2, 3, 10, 13, caracterizado porque se elabora un extracto acuoso de polen de gramfneas, excepto Phleum pratense, y los componentes solubles se someten a una cromatograffa de interaccion, hidrofoba y a un paso de filtracion a traves de gel y, si fuera necesario, a una cromatograffa con intercambio de cationes.
- 2. Procedimiento conforme a la reivindicacion 1, caracterizado porque para la extraccion se emplea polen de las especies Lolium perenne, Dactylis glomerata, Festuca pratensis, Holcus lanatus, Poa pratensis, Secale cereale.
- 3. Procedimiento conforme a la reivindicacion 1 o 2, caracterizado porque la extraccion se realiza por medio de disolucion acuosa tamponada con Tris/HCl.
- 4. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque en un primer paso se separan los alergenos de gramfnea de los grupos 1, 2, 3, 10, 13 de otros componentes por cromatograffa de interaccion, hidrofoba.
- 5. Procedimiento conforme a la reivindicacion 4, caracterizado porque los alergenos de los grupos 1 y 13 se obtienen en fracciones separadas mediante un paso posterior de filtracion a traves de gel y se separan de los alergenos de los grupos 2, 3, y 10.
- 6. Procedimiento conforme a la reivindicacion 5, caracterizado porque los alergenos de los grupos 2, 3, y 10 obtenidos tras el paso posterior de filtracion a traves de gel se separan por una posterior cromatograffa con intercambio de cationes.
- 7. Procedimiento de obtencion de alergenos de gramfnea esencialmente puros del grupo 13, excepto Phleum pratense, caracterizado porque se elabora un extracto acuoso de polen de gramfneas y los componentes solubles se someten a una cromatograffa de interaccion, hidrofoba y a un paso de filtracion a traves de gel, obteniendose en el ultimo paso tres fracciones de las cuales los alergenos de los grupos 1 y 13 representan, en cada caso, una fraccion, y los alergenos de los grupos 2, 3 y 10, representan la tercera fraccion.
- 8. Procedimiento de obtencion de alergenos de gramfnea esencialmente puros de los grupos 1, 2, 3, 10, 13, caracterizado porque se elabora un extracto acuoso de polen de gramfneas y los componentes solubles se someten a una cromatograffa de interaccion hidrofoba, a un paso de filtracion a traves de gel y a una cromatograffa con intercambio de cationes.
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