ES2333951T5 - Método para producir alergenos principales rBet v 1 hipoalergénicos de abedul - Google Patents
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Description
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DESCRIPCION
Metodo para producir alergenos principales rBet v 1 hipoalergenicos de abedul Ambito tecnico de la invencion
La invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de alergenos de polen de abedul que se caracterizan por la ausencia, o como mlnimo una reduccion, de la union a inmunoglobulina E, es decir, se caracterizan por su hipoalergenicidad. Estos alergenos conservan totalmente la estimulacion de celulas T terapeuticamente relevante. Por tanto, se pueden emplear como agentes terapeuticos con pocos efectos secundarios para inmunoterapia especlfica.
Antecedentes de la invencion
Las alergias del tipo 1 han aumentado dramaticamente en todo el mundo durante las ultimas decadas. Hasta el 20% de la poblacion de los palses industrializados sufre de dolencias, como rinitis alergica, conjuntivitis o asma bronquial, provocadas por alergenos que se encuentran en el aire (aeroalergenos), que son liberados por diferentes fuentes, como polen vegetal, acaros, mamlferos (gatos, perros, caballos) y mohos. Las alergias graves tambien pueden desencadenarse por picaduras de insectos, como por ejemplo, abejas y avispas.
Las sustancias desencadenantes de las alergias de tipo 1 son protelnas, glicoprotelnas o polipeptidos. Estos alergenos reaccionan, tras la absorcion a traves de las mucosas o tras la picadura, con los anticuerpos IgE unidos en la superficie de los mastocitos de personas sensibilizadas. Si dos o mas anticuerpos IgE se unen entre si a traves de un alergeno, esto conduce a la produccion de mediadores (p. ej., histamina, prostaglandinas) y citoquinas a traves de celulas efectoras y por tanto conduce a la activacion de los slntomas alergicos. Entre los polenes de arboles, el polen de abedul es el que desencadena mas frecuentemente reacciones alergicas (Jarolim E. y col., 1989, Allergy 44:385-95). Mas del 90% de las personas que sufren de alergia al polen de abedul poseen anticuerpos IgE contra el alergeno principal Bet v 1 (Elfman, L. y col., 1997, Int. Arch. Allergy Immunol., 113: 24951).
Con ayuda de las secuencias de ADNc es posible preparar alergenos recombinantes que se pueden emplear en el diagnostico y la terapia de las alergias. (Scheiner y Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391). La preparacion de alergenos recombinantes Bet v 1 (rBet v 1) y su purificacion con fines farmaceuticos ha sido descrita p. ej. por Hoffmann- Sommergruber y col. (Protein Exp. Purif. 9 (1), 1997: 33-39).
Ademas, son posibles modificaciones mediante ingenierla genetica dirigidas de los alergenos recombinantes, con lo que se puede alcanzar un potencial alergenico reducido (Schramm y col., 1999, J. Immunol. 162 (4): 2406-2414; Valenta y col., 1999, Biol. Chem. 380: 815-24; Singh y col., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 119: 75-85). Dichas variantes de alergenos son futuros candidatos prometedores para la inmunoterapia especlfica de la alergia de tipo 1.
Sin embargo, un inconveniente potencial en las variantes de alergenos recombinantes es que mediante la modificacion de la estructura primaria se pierden los epltopos de celulas T necesarios para el exito terapeutico o se reduce su actividad. Esta posibilidad solo se puede eludir si la estructura primaria correspondiente al alergeno natural sirve como base para la preparacion de la protelna recombinante.
En el caso del alergeno principal del polen de abedul Bet v 1, para optimizarlo con fines terapeuticos mediante metodos recombinantes, es decir, para reducir la capacidad de union a IgE, se preparo en dos mitades (Vrtala, S., y col., 1997, J. Clin. Invest. 99: 1673-81) o como trlmero (Vrtala, S., y col., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 118:2189). En estos enfoques tambien resulta un inconveniente la perdida potencial de los epltopos de celulas T, as! como la insolubilidad de las protelnas. Otro inconveniente a considerar aqul es la costosa tecnica de preparacion de estas variantes rBet v 1.
Por consiguiente, un enfoque apropiado para la preparacion de un alergeno principal recombinante rBet v 1 que se pueda emplear con fines terapeuticos serla por tanto una molecula que equivaliera al tipo salvaje en la estructura primaria, no estuviera limitada en su estimulacion de celulas T, pero presentara una actividad IgE reducida, es decir, fuera hipoalergenica.
Este objetivo se ha alcanzado en el marco de la presente invencion mediante la realizacion de una serie de etapas de purificacion bioqulmica conocidas con el uso de alergenos principales recombinantes rBet v 1 solubles como producto de partida. Sorprendentemente, en las protelnas purificadas de este modo se ha comprobado una actividad IgE reducida y al mismo tiempo una estimulacion de celulas T conservada.
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Por consiguiente, el procedimiento segun la invencion proporciona una eficacia terapeutica mejorada y al mismo tiempo una clara reduccion o ausencia de efectos secundarios.
Asl, es de especial importancia el diseno del procedimiento de preparacion de los alergenos recombinantes, ya que como consecuencia de este procedimiento las protelnas adquieren una conformacion que no presenta ninguna afinidad con IgE o la presenta muy reducida, manteniendose la estimulacion de celulas T.
Figuras
Figura 1A: SDS-PAGE para la caracterizacion de rBet v 1 hipoalergenica
Rastro 1: Patron de protelna para la estimacion del peso molecular
Rastro 2: nBet v 1 natural
Rastro 3: rBet v 1 purificada segun la invencion
Rastro 4: rBet v 1 purificada de forma convencional
Figura 1B: Transferencia a nitrocelulosa del SDS-PAGE de la Fig. 1A
Figura 2A: Transferencia a nitrocelulosa para la determinacion de la actividad IgE con 20 sueros de pacientes individuales
Posicion 3: nBet v 1 natural
Posicion 4: rBet v 1 purificada segun la invencion
Posicion 5: rBet v 1 purificada de forma convencional
Figura 2B: Transferencia a nitrocelulosa para la determinacion de la identidad de las muestras Bet v 1
Manchas 21-26: Diferentes anticuerpos policlonales anti-Bet v 1 de conejo Mancha 27: Anticuerpo 6B6 monoclonal anti-Bet v 1 de raton
Figura 3: Enzym-Allergo-Sorbent-Test (EAST) para la cuantificacion de la union a IgE
En el eje vertical se indica la concentracion de un inhibidor de la union IgE-Bet v 1 en ng/ml, en indica el grado de la inhibicion en [%].
Figura 4: Determinacion de la estimulacion de celulas T por parte de variantes Bet v 1. concentraciones de nBet v 1 natural, de rBet v 1 recombinante purificada de forma convencional,
1 recombinante purificada segun la invencion y los correspondientes Indices de estimulacion diferentes llneas de celulas T (TCL) y clones de celulas T (TCC).
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion trata de un procedimiento de purificacion bioqulmica que a traves de una purificacion eficaz de, por ejemplo, alergenos producidos con metodos recombinantes, mediante el uso de eluyentes especiales, conduce a la obtencion de protelnas con las propiedades modificadas segun la invencion.
Estas propiedades consisten en una ausencia de actividad IgE, como mlnimo una actividad IgE fuertemente reducida, manteniendo al mismo tiempo la estimulacion de celulas T.
Por tanto, es objeto de la presente invencion un procedimiento para la reduccion de la actividad IgE del alergeno principal del polen de abedul rBet v 1, que consiste en el uso de alergenos principales del polen de abedul recombinantes rBet v 1 solubles, asl como en la realizacion de las siguientes etapas de cromatografla descritas para su purificacion y de la posterior etapa de neutralizacion.
Ademas, es objeto de la invencion un procedimiento para la preparacion de alergenos principales del polen de abedul rBet v 1 hipoalergenicos mediante varias etapas de purificacion cromatografica con el uso como eluyente de bases acuosas esencialmente no tamponadas y una neutralizacion posterior, empleandose como producto de partida una protelna cruda rBet v 1 soluble preparada mediante metodos recombinantes.
el eje horizontal se
Se comparan las asl como de rBet v (SI) obtenidos con
Las etapas de purificacion cromatografica comprenden preferiblemente cromatografla de intercambio anionico, cromatografla de interaccion hidrofobica, as! como filtracion en gel y se pueden realizar una vez, varias veces sucesivamente o varias veces alternativamente. Sin embargo, las etapas de purificacion cromatografica se realizan 5 preferiblemente en el orden siguiente: primera filtracion en gel, cromatografla de intercambio anionico, cromatografla de interaccion hidrofobica, segunda filtracion en gel.
Normalmente la purificacion cromatografica se realiza con una concentracion de base de 5 a 100 mM, aunque preferiblemente con 5 a 40 mM y de forma especialmente preferible con 10 a 30 mM, empleandose preferiblemente NaOH como sustancia basica. En lugar de un sistema acuoso puro se puede emplear tambien un sistema mixto, 10 que contiene por ejemplo agua y metanol. Tambien se puede pensar en un sistema no acuoso, p. ej. metanol. Sin embargo, se trabaja preferiblemente con un sistema acuoso.
Dependiendo de la etapa de cromatografla correspondiente se pueden adicionar al eluyente diferentes concentraciones de una sal neutra - preferiblemente NaCl - hasta aproximadamente 5 M.
Para una eventual reduccion necesaria del valor de pH que sea tolerada por protelnas sensibles, se puede 15 adicionar hidrogenocarbonato sodico.
Tambien el proposito de establecer unas condiciones fisiologicas al final de la purificacion puede ser un motivo para la presencia de hidrogenocarbonato sodico durante las etapas de cromatografla. Asl, fundamentalmente son posibles concentraciones de hasta 100 mM. Sin embargo, en el entorno fisiologico se trabaja preferiblemente por debajo de 20 mM, con especial preferencia por debajo de 11 mM.
20 En el caso de rBet v 1 no es necesaria una reduccion del valor de pH. Sin embargo, para la aplicacion del procedimiento segun la invencion en rBet v 1 se anade por regla general hidrogenocarbonato sodico, para poder establecer de forma sencilla concentraciones fisiologicas al final de la purificacion.
Asl, la invencion trata de un procedimiento para la preparacion de alergenos principales del polen de abedul rBet v 1 hipoalergenicos, en que un eluyente basico esencialmente no tamponado mantiene las protelnas a purificar en 25 solucion en condiciones suaves y por tanto en un estado cromatografiable.
En una forma de realizacion preferible del procedimiento, la protelna cruda rBet v 1 se pre-purifica antes de la purificacion real mediante una cromatografla, por ejemplo una cromatografla de interaccion hidrofobica o una cromatografla de intercambio ionico, y/o mediante precipitacion de la sal, en la que se trabaja con un eluyente tamponado o una solucion tamponada, en contraposicion a la posterior purificacion principal.
30 Los productos de partida para el procedimiento son alergenos recombinantes solubles expresados en bacterias u otras celulas huesped apropiadas (como levaduras). Puesto que el procedimiento representa una aplicacion general para estos productos de expresion, segun el procedimiento de la invencion tambien se pueden formular, renaturalizar y purificar alergenos solubles de otra procedencia. En particular, para la correspondiente similitud de estos alergenos de otra procedencia con los alergenos principales del polen de abedul Bet v 1, se cuenta con 35 obtener las propiedades segun la invencion.
Se tienen en consideracion las protelnas o sus fragmentos con otras protelnas o peptidos. Sin embargo, las modificaciones pueden ser de naturaleza qulmica y se pueden realizar a nivel de protelna.
A continuacion se describe de forma general el procedimiento de preparacion segun la invencion. Asl, todos los materiales de cromatografla mencionados a modo de ejemplo proceden de la empresa Amersham Biosciences 40 (Freiburg, Alemania).
Una primera etapa de pre-purificacion para la eliminacion de acidos nucleicos puede consistir en una cromatografla de interaccion hidrofobica realizada bajo condiciones fisiologicas (a un pH de 6-8, no desnaturalizante), concentrandose al mismo tiempo la protelna objetivo. Alternativamente a esto tambien se puede realizar una precipitacion de sal o una cromatografla de intercambio ionico. Sin embargo, la realizacion de esta primera etapa de 45 pre-purificacion no es obligatoriamente necesaria para la obtencion del efecto segun la invencion.
La siguiente etapa de purificacion sirve para la transferencia de la protelna en un eluyente debilmente salino en un intervalo de concentracion de 10-100 mM, p. ej. NaCI 20 mM, por ejemplo mediante filtracion en gel en una columna Sephadex G-25. Asl se consiguen condiciones que permiten la realizacion de una cromatografla de intercambio ionico con eluyentes alcalinos. La solucion de protelna asl preparada se emplea a continuacion para la 50 cromatografla de intercambio anionico, por ejemplo con una columna Source Q. Asl la mayorla de alergenos se
unen al soporte. El eluyente alcalino provoca que permanezcan en solucion las protelnas anteriormente poco
5
10
15
20
25
30
35
40
45
solubles o insolubles. Mediante la elucion en gradiente de NaCI se realiza una separacion parcial de impurezas bacterianas y fragmentos de principios activos.
En dos etapas de purificacion posteriores, una cromatografla de interaccion hidrofobica y una filtracion en gel, se separan esencialmente los alergenos pre-purificados y equilibrados de las impurezas bacterianas restantes. Para ello se emplean fundamentalmente las mismas sustancias eluyentes, compuestas de una base de baja molaridad y una proporcion variable de una sal neutra inorganica. Asl, los alergenos se pueden unir a la columna en cromatografla de interaccion hidrofobica con p. ej. hasta NaCI 5 M, NaOH 20 mM y NaHCO3 11 mM y a continuacion se pueden eluir con una solucion pobre en sales o exenta de ellas, p. ej. NaOH 20 mM.
En la ultima etapa cromatografica se realiza un cambio de eluyente de manera que las protelnas recombinantes purificadas se obtienen en forma soluble listas para el uso mediante una sencilla neutralizacion de la base presente en el eluyente con un acido correspondiente. Para la seleccion adecuada de las concentraciones de los aditivos del eluyente se emplea una solucion fisiologica adecuada para parenterales.
La identificacion de los alergenos purificados se realiza a traves de sus propiedades flsicas, qulmicas o biologicas conocidas, en particular mediante SDS-PAGE y anticuerpos monoclonales especlficos. Para la caracterizacion posterior se puede realizar por ejemplo un ensayo de inhibicion EAST (EAST significa Enzym-Allergo-Sorbent-Test), con el que se puede determinar la union IgE especlfica de una protelna en comparacion con una referencia, y/o se puede realizar un ensayo de proliferacion de celulas T. El analisis del disolvente se realiza por medicion del valor de pH y cuantificacion de la concentracion de Na+ y CI-, asl como dado el caso de CO32". Estos procedimientos son conocidos y descritos de forma general.
El rendimiento de los alergenos preparados segun la invencion asciende en general al 75-95 % referido a la protelna de partida.
Asl, el procedimiento incluye tratamientos de muestra mlnimos, tiempos de residencia cortos de las muestras, preferiblemente el uso exclusivo de sustancias farmacologicamente compatibles, la compatibilidad de un unico eluyente con diversos principios de separacion y evitar procedimientos largos y no validables en ciertas condiciones, como la dialisis. Ademas, el hidroxido sodico empleado preferiblemente como base, conocido como bacteriostatico eficaz, impide que las protelnas presentes en este producto se degraden o impurifiquen por microorganismos. Incluso se eliminan o degradan de forma eficaz las endotoxinas, que pueden ser problematicas en las expresiones bacterianas, otras protelnas extranas y ADN.
El orden y la cantidad de las etapas de cromatografla descritas arriba puede ser modificada. Para ello se pueden tener en cuenta, entre otras cosas, las propiedades fisicoqulmicas especlficas de la protelna objetivo.
Por eso, incluso sin otras explicaciones, se asume que un especialista puede utilizar la descripcion anterior en el alcance mas amplio. Por eso, las formas de realizacion preferibles descritas a continuacion se deben interpretar solamente como una revelacion descriptiva, en ningun caso limitante de cualquiera de las maneras.
Una forma de realizacion especialmente preferible del procedimiento se presenta en el esquema (Tab. 1):
Tab. 1 Resumen del procedimiento de preparacion segun la invencion
1. Pre-purificacion (opcional) Cromatografla Eluyente 1: Tris/HCI 20 mM,
Eluyente 2: Agua destilada
- de
- interaccion hidrofobica
- Sulfato
- amonico 1 M,
(fenil-Sefarosa) pH 8,0
2. Cambio de eluyente para la purificacion principal Eluyente: NaCI 20 mM
filtracion
en gel (Sephadex 25)
3.
Cromatografla de intercambio anionico
Eluyente 1: NaOH 20 mM, NaHCO3 11 mM
Eluyente 2: Gradientes NaCl (de NaOH 20mM; NaHCO3 11 mM;
NaCI 20 mM a NaOH 20mM; NaHCO3 11 mM; NaCI 0,5 M)
y
(Source 15Q)
NaCI 20 mM
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Cromatografla de
Eluyente 1: NaCI 3
Eluyente 2: NaOH 20 mM
interaccion M, NaOH
hidrofobica 20 mM,
(Source PHE)
NaHCO3 11 mM
5.
Filtracion en gel (Superdex
Eluyente: NaOH 10 mM, NaHCO3 11 mM y NaCI 148,4 mM l
75)
6. Neutralizacion con 1/10 (v/v) HCl 100 mM
La invencion se presenta a continuacion con el ejemplo de la purificacion de Bet v 1 recombinante (rBet v1) terapeuticamente eficaz. Todos los materiales de cromatografla son distribuidos comercialmente por la empresa Amersham Biosciences (Freiburg, Alemania).
Ejemplo 1: Obtencion de rBet v 1 hipoalergenico
En primer lugar se prepara un lisado de E. coli que contiene un alergeno rBet v 1 soluble segun el procedimiento estandar (Breiteneder H., y col., EMBO J. 1989, 8: 1935-8; Hoffmann-Sommergruber y col., Protein Exp. Purif. 9 (1), 1997: 3339).
Despues, para la eliminacion de acidos nucleicos se lleva a cabo una cromatografla de interaccion hidrofobica con fenil-sefarosa en un tampon tris-amoniosulfato (Tris/HCI 20 mM, sulfato amonico 1 M, pH 8,0). La elucion se realiza con agua destilada. Para la preparacion de la siguiente etapa de purificacion que se realiza con eluyentes debilmente alcalinos, se intercambia el sulfato amonico restante por NaCl 20 mM mediante filtracion en gel a traves de Sephadex G-25.
La solucion de protelnas pre-purificada de este modo se emplea para la cromatografla de intercambio anionico con Source 15Q, equilibrandose el material de soporte con una solucion alcalina (NaOH 20 mM, NaHCO3 11 mM y NaCI 20 mM). El valor de pH relativamente elevado de la solucion inicial provoca que casi todas las protelnas objetivo se unan al intercambiador de aniones. La elucion siguiente se realiza con un gradiente creciente de NaCl (de NaOH 20mM; NaHCO3 11 mM; NaCI 20 mM a NaOH 20mM; NaHCO3 11 mM; NaCI 0,5 M) y provoca una separacion de impurezas (protelnas de celulas huesped) y fragmentos de principios activos.
La siguiente etapa de cromatografla representa una cromatografla de interaccion hidrofobica mediante Source PHE. Para ello el eluato de la cromatografla de intercambio ionico se ajusta a NaCI 3 M, NaOH 20 mM, NaHCO3 11 mM mediante adicion de las cantidades correspondientes de una solucion madre de NaCl 5 M, una solucion madre de NaOH 2 M e hidrogenocarbonato sodico. Bajo estas condiciones rBet v 1 se une al material de las columnas. La elucion de la protelna objetivo unida se realiza con NaOH 20 mM.
Como etapa final se realiza una filtracion en gel mediante Superdex 75, bajo condiciones alcalinas. La solucion de cromatografla se selecciona de manera que se realiza una neutralizacion de la base anadida al eluyente hasta la formulacion final deseada: NaOH 10 mM, NaHCO3 11 mM y NaCI 148,4 mM, lo que corresponde a las concentraciones de una solucion fisiologica salina.
Para acabar, el eluato de la filtracion en gel se neutraliza con el acido HCl correspondiente a la base NaOH utilizada, de modo que se ajusta un valor de pH neutro y al mismo tiempo se obtiene el contenido de sal deseado de una solucion fisiologica salina. Esto se consigue mediante la adicion de 1/10 (v/v) HCl 100 mM.
Ejemplo 2: Caracterizacion por SDS-PAGE
Para la caracterizacion de rBet v 1 hipoalergenico del ejemplo 1 se realiza un SDS-PAGE (15 %). Como resulta evidente en la Fig. 1A, el nBet v 1 natural (rastro 2), el rBet v 1 recombinante, purificado de forma convencional segun Hoffmann-Sommergruber y col. (Protein Exp. Purif. 9 (1), 1997: 33-39) (rastro 4) y el rBet v 1 purificado segun la invencion (rastro 3) presentan el mismo peso molecular en SDS-PAGE.
Ejemplo 3: Determinacion de la actividad IgE con una mezcla de suero
Para la determinacion de la actividad IgE se transfiere el SDS-PAGE del ejemplo 2 a nitrocelulosa. Tras la transferencia de las manchas con una mezcla de suero de alergicos al polen de abedul se incuba con un conjugado compuesto de un anticuerpo anti-IgE y fosfatasa alcalina. La reaccion de coloracion provocada por la fosfatasa
5
10
15
20
25
alcalina (Fig. 1B) muestra una actividad IgE del nBet v 1 natural, as! como del rBet v 1 recombinante purificado de forma convencional, pero no del rBet v 1-MF purificado segun la invencion.
Ejemplo 4: Determinacion de la actividad IgE con sueros individuales
Para la determinacion de la actividad IgE con sueros sangulneos de alergicos al polen de abedul individuales se transfieren a una membrana de nitrocelulosa segun la figura 2A nBet v 1 (posicion 3), rBet v 1 recombinante purificado de forma convencional (posicion 5), as! como rBet v 1 purificado segun la invencion (posicion 4) y se ensaya de forma analoga al ejemplo 3. La Fig. 2A muestra que con la excepcion del suero 5, donde rBet v 1 purificado segun la invencion presenta una debil actividad IgE, solo tienen actividad IgE el nBet v 1 natural y rBet v 1 recombinante, purificado de forma convencional, pero no rBet v 1 purificado segun la invencion.
Para demostrar la identidad de los alergenos estudiados, la membrana de nitrocelulosa se incubo con diferentes anticuerpos policlonales anti-Bet v 1 de conejo (muestras 21 a 26), as! como con anticuerpos 6B6 monoclonales anti-Bet v 1 de raton (muestra 27) y finalmente se trato de forma analoga al ejemplo 3 (Fig. 2B).
Ejemplo 5: Cuantificacion de la union a IgE
En un ensayo de inhibicion EAST realizado segun Suck y col. (Int. Arch. Allergy Immunol. 2000; 121: 284-291) con una mezcla de suero de alergicos se comparan entre si nBet v 1 natural, rBet v 1 recombinante purificado de forma convencional y rBet v 1 purificado segun la invencion en relacion a la intensidad de su union a IgE (Fig. 3). Se muestra que rBet v 1 purificado segun la invencion tiene una actividad IgE 100 veces inferior a las otras protelnas Bet v 1.
Ejemplo 6: Determinacion de la estimulacion de celulas T
Para la determinacion de la influencia del alergeno rBet v 1 segun la invencion en el crecimiento de las celulas T se realiza un ensayo de proliferacion con llneas de celulas T (TCL) y clones de celulas T (TCC) segun Schramm y col. (1999, J. Immunol. 162 (4): 2406-2414) (Fig. 4). A partir de la comparacion del Indice de estimulacion (SI) se deduce que las celulas T de los donantes estudiados con rBet v 1 reaccionan al menos tan intensamente como con nBet v 1 natural o rBet v 1 recombinante purificado de forma convencional. Dependiendo de las condiciones seleccionadas, la reaccion con rBet v 1 supera incluso en un tercio la reaccion con nBet v 1 o rBet v 1.
Claims (11)
- 510152025REIVINDICACIONES1. Procedimiento para la preparacion de alergenos principales del polen de abedul rBet v 1 hipoalergenicos mediante una o varias etapas de purificacion cromatografica con el uso como eluyentes de bases acuosas esen- cialmente no tamponadas y a continuacion neutralizacion, caracterizado por que se emplea como producto de partida una protelna cruda rBet v 1 soluble preparada con metodos recombinantes.
- 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la protelna cruda rBet v 1 soluble preparada con metodos recombinantes se expresa en E. coli.
- 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que las etapas de purificacion cromatografica comprenden cromatografla de intercambio anionico, cromatografla de interaccion hidrofobica y filtracion en gel.
- 4. Procedimiento segun una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que las etapas de purificacion cromatografica se realizan en el orden siguiente: primera filtracion en gel, cromatografla de intercambio anionico, cromatografla de interaccion hidrofobica, segunda filtracion en gel.
- 5. Procedimiento segun una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la base utilizada como eluyente se emplea en un intervalo de concentracion de 5 mM a 100 mM, preferiblemente 5 mM a 40 mM.
- 6. Procedimiento segun una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la base utilizada como eluyente es NaOH.
- 7. Procedimiento segun una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que al eluyente se le anade una sal neutra inorganica y dado el caso NaHCO3.
- 8. Procedimiento segun una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la sal neutra inorganica anadida al eluyente es NaCl.
- 9. Procedimiento segun una o varias de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado por que las concentraciones de las sustancias NaOH, NaCI y NaHCO3 contenidas en el eluyente se selecciona de manera que en la etapa de neutralizacion incluida en la purificacion se pueden ajustar las concentraciones tlpicas de una solucion fisiologica salina.
- 10. Procedimiento segun una o varias de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que la protelna cruda rBet v 1 se pre-purifica cromatograficamente en una solucion tamponada y/o mediante precipitacion de sal.
- 11. Procedimiento para la reduccion de la actividad IgE del alergeno principal del polen de abedul rBet v 1, caracterizado por que un alergeno principal del polen de abedul rBet v 1 soluble preparado con metodos recom- binantes se somete a uno de los procedimientos descritos en las reivindicaciones 1 a 10.
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