RU2311424C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПОАЛЛЕРГЕННОГО ОСНОВНОГО АЛЛЕРГЕНА ПЫЛЬЦЫ БЕРЕЗЫ r Bet v 1 - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПОАЛЛЕРГЕННОГО ОСНОВНОГО АЛЛЕРГЕНА ПЫЛЬЦЫ БЕРЕЗЫ r Bet v 1Info
- Publication number
- RU2311424C2 RU2311424C2 RU2004129282/13A RU2004129282A RU2311424C2 RU 2311424 C2 RU2311424 C2 RU 2311424C2 RU 2004129282/13 A RU2004129282/13 A RU 2004129282/13A RU 2004129282 A RU2004129282 A RU 2004129282A RU 2311424 C2 RU2311424 C2 RU 2311424C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rbet
- eluent
- birch pollen
- chromatography
- purified
- Prior art date
Links
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 39
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims abstract description 8
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical group [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 66
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 41
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 21
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 19
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 18
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 15
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 9
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims description 8
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 17
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 18
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 7
- 239000002585 base Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 206010048908 Seasonal allergy Diseases 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 alkali metal salt Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000013575 birch pollen allergen Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 102000006392 myotrophin Human genes 0.000 description 2
- 108010058605 myotrophin Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- PORMUFZNYQJOEI-UHFFFAOYSA-N sumatriptan succinate Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O.CNS(=O)(=O)CC1=CC=C2NC=C(CCN(C)C)C2=C1 PORMUFZNYQJOEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 206010010744 Conjunctivitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000013567 aeroallergen Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002205 allergic conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000024998 atopic conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000002655 kraft paper Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229940046536 tree pollen allergenic extract Drugs 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/14—Decongestants or antiallergics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Botany (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии. Препарат гипоаллергенного основного аллергена пыльцы березы r Bet v 1 получают с помощью одного или более этапов хроматографической очистки при использовании существенно небуферизованных водных оснований в качестве элюента и последующей нейтрализации. Гипоаллергенные основные аллергены пыльцы березы отличаются отсутствием или снижением связывания иммуноглобулина Е с одновременным сохранением терапевтически релевантной стимуляции Т-клеток. Поэтому полученный препарат может быть использован в качестве терапевтического агента с уменьшенными побочными эффектами для специфической иммунотерапии. 5 н. и 22 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.
Description
Область техники изобретения
Изобретение относится к способу получения аллергенов пыльцы березы, которые отличаются отсутствием или, по крайней мере, снижением связывания иммуноглобулина Е, то есть гипоаллергенностью. Эти аллергены полностью сохраняют терапевтически релевантную стимуляцию Т-клеток. Таким образом, они могут быть использованы в качестве терапевтических агентов с низкими побочными эффектами для специфической иммунотерапии.
Предпосылки создания изобретения
Количество аллергий типа 1 значительно увеличилось во всем мире в последние десятилетия. До 20% популяции населения в индустриально развитых странах страдают от заболеваний, таких, как аллергический ринит, конъюнктивит или бронхиальная астма, которые вызываются аллергенами, присутствующими в воздухе (аэроаллергены), и которые выделяются различными источниками, такими, как растительная пыльца, клещи, млекопитающие (коты, собаки, лошади) и плесневые грибки. Тяжелые аллергии могут также инициироваться укусами или ужалением насекомых, таких как, например, пчелы и осы.
Вещества, вызывающие аллергию типа 1, представляют собой гликопротеины или полипептиды. Эти аллергены после попадания воздействуют через мембраны или взаимодействуют с IgE антителами, связанными с поверхностью тучных клеток у сенсибилизированных людей после ужаления или укуса. Если два или более IgE антител поперечно являются поперечно-связанными друг с другом с помощью аллергена, то это приводит к высвобождению медиаторов (например, гистамина, простагландинов) и цитокинов эффекторной клеткой, и таким образом, к инициации аллергических симптомов.
Пыльца березы представляет собой наиболее частый инициатор аллергических реакций среди пыльцы деревьев (Jarolim E. и др., 1989, Allergy 44: 385-95). Более чем 90% страдающих от аллергий, вызываемых пыльцой березы, имеют IgE антитела против основного аллергена Bet v 1 (Elfman, L. и др., 1997, Int. Arch. Allergy Immunol., 113: 249-51).
С помощью последовательностей кДНК возможно получить рекомбинантные аллергены, которые могут быть использованы для диагностики и терапии аллергий (Scheiner и Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391). Получение рекомбинантных аллергенов Bet v 1 (rBet v 1) и их очистка для фармацевтических целей были описаны, например, Hoffmann-Sommergruber и др. (Protein Exp. Purif. 9(1), 1997: 33-39).
Кроме того, возможны специфические генетические модификации рекомбинантных аллергенов, что дает возможность снизить достигнутый аллергенный потенциал (Schramm и др., 1999, J. Immunol. 162 (4): 2406-2414; Valenta и др., 1999, Biol. Chem. 380: 815-24; Singh и др., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 119: 75-85).). Варианты аллергенов этого типа представляют собой будущих кандидатов для специфической иммунотерапии аллергии типа 1.
Однако потенциальный недостаток вариантов рекомбинантного аллергена заключается в том, что модификация первичной структуры вызывает потерю или снижение реактивности эпитопов Т-клеток, которые необходимы для достижения терапевтического эффекта. Такая возможность может исключаться только тогда, когда первичная структура, соответствующая природному аллергену, служит как основа для получения препарата рекомбинантного белка.
В случае основного аллергена пыльцы березы rBet v 1 осуществляли получение такового, состоящего из двух частей (Vrtala, S., и др., 1997, J. Clin. Invest. 99: 1673-81) или такого, который представляет собой тример (Vrtala, S., и др., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 118: 218-9), для того, чтобы оптимизировать его для терапевтических целей, то есть снизить способность связывания с IgE при использовании рекомбинантных способов. Потенциальная потеря эпитопов Т-клеток и нерастворимость белков также оказывают негативный эффект в таких подходах. Другой недостаток в этом случае может заключаться в комплексном способе получения этих вариантов rBet v 1.
Приемлемая начальная точка получения рекомбинантного основного аллергена rBet v 1, который может использоваться для терапевтических целей, будет соответственно представлять собой молекулу, которая соответствует дикому типу в отношении первичной структуры и является неограниченной в ее стимуляции Т-клеток, но имеет сниженную IgE активность, то есть является гипоаллергенной.
Задача данного изобретения решается в соответствии с настоящим изобретением путем проведения серии этапов биохимической очистки, которые известны сами по себе, при использовании растворимого рекомбинантного основного аллергена rBet v 1 в качестве исходного материала. Неожиданно было обнаружено, что в белках, очищенных таким образом, наблюдается сниженная IgE активность и в то же время поддержание стимуляции Т-клеток. Соответственно способ в соответствии с изобретением обеспечивает улучшенную терапевтическую эффективность и в то же время значительное снижение или отсутствие побочных эффектов.
Форма способа получения рекомбинантных аллергенов представляется проблемой исключительной важности в данной заявке, поскольку белки превращаются при проведении этого процесса в конформацию, которая не имеет аффинности или имеет значительно сниженную способность к связыванию с IgE при сохранении постоянной стимуляции Т-клеток.
Фигуры
Фигура 1А: Электрофорез в полиакриламидном геле при использовании (SDS-PAGE) для характеристики гипоаллергенного rBet v 1
Полоса 1: Белковый стандарт для оценки молекулярного веса
Полоса 2: Природный nBet v 1
Полоса 3: rBet v 1, очищенный в соответствии с изобретением
Полоса 4: Традиционно очищенный rBet v 1
Фигура 1В: Блоттинг на нитроцеллюлозный фильтр SDS-PAGE, представленного на фигуре 1А
Фигура 2А: Блоттинг на нитроцеллюлозный фильтр для определения активности IgE при использовании сывороток 20 индивидуальных пациентов
Положение 3: Природный nBet v 1
Положение 4: rBet v 1, очищенный в соответствии с изобретением
Положение 5: Традиционно очищенный rBet v 1
Фигура 2В: Блоттинг на нитроцеллюлозный фильтр для определения идентичности образцов Bet v 1
Блоты 21-26: Различные поликлональные кроличьи анти-Bet v 1 антитела
Блот 27: Моноклональное мышиное анти-Bet v 1 антитело 6В6
Фигура 3: Ферментный аллерго-сорбентный тест (EAST) для количественной оценки связывания IgE
Концентрация ингибитора связывания IgE-Bet v 1 приведена на вертикальной оси, степень ингибирования в % показана по горизонтальной оси.
Фигура 4: Определение стимуляции Т-клеток с помощью вариантов Bet v 1. Сравнивали концентрации природного nBet v 1, традиционно очищенного рекомбинантного rBet v 1 и рекомбинантного rBet v 1, очищенного в соответствии с изобретением, и соответствующие индексы стимуляции (SI), полученные с различными линиями Т-клеток (TCL) и клонами Т-клеток (ТСС).
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к способу биохимической очистки, который приводит к получению белков, которые имеют свойства, модифицированные в соответствии с изобретением с помощью эффективной очистки, при этом для очистки белков, например, аллергенов, полученных с помощью рекомбинантных способов, используют специфические элюенты. Эти свойства заключаются в отсутствии или, по крайней мере, в значительном снижении активности IgE с одновременным поддержанием стимуляции Т-клеток.
Таким образом, изобретение относится к способу снижения активности в отношении IgE основного аллергена пыльцы березы rBet v 1, который заключается в использовании растворимого рекомбинантного основного аллергена пыльцы березы rBet v 1 и осуществлении хроматографических этапов, описанных ниже, для его очистки и при осуществлении последующего этапа нейтрализации.
Изобретение также касается способа получения гипоаллергенного основного аллергена пыльцы березы rBet v 1 с помощью ряда этапов хроматографической очистки при использовании существенно небуферизованных водных оснований в качестве элюента, а также последующей нейтрализации, при этом используемый исходный материал представляет собой неочищенный растворимый белок rBet v 1, полученный с помощью рекомбинантных способов.
Этапы хроматографической очистки предпочтительно включают анионообменную хроматографию, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия и гель-фильтрацию, при этом они могут применяться один раз, несколько раз друг после друга или несколько раз альтернативно. Однако этапы хроматографической очистки предпочтительно осуществляют в следующей последовательности: проводят первую гель-фильтрацию, анионообменную хроматографию, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, вторую гель-фильтрацию.
Хроматографическую очистку обычно осуществляют при использовании основания в концентрации от 5 до 100 мМ, но предпочтительно от 5 до 40 мМ и особенно предпочтительно от 10 до 30 мМ, при этом используемым веществом с основными свойствами является предпочтительно NaOH. Вместо использования исключительно водной системы также возможно применять смешанную систему, которая включает, например, воду и метанол. Неводная, например, метаноловая система также является возможной. Однако предпочтение отдается использованию водной системы.
В зависимости от соответствующего хроматографического этапа к элюенту могут прибавляться различные концентрации нейтральной соли - предпочтительно NaOH - приблизительно до 5 М.
Любое снижение значения рН, которое может быть необходимым для достижения значений, которые являются приемлемыми для соответствующих чувствительных белков, может быть достигнуто путем добавления гидрокарбоната натрия.
Намерение установить физиологические условия в конце очистки может быть причиной наличия гидрокарбоната натрия во время проведения хроматографических этапов. Концентрации до 100 мМ являются, в основном, возможными для данной заявки. Однако процесс предпочтительно проводят в физиологическом интервале концентрации, которая ниже 20 мМ, в частности, при концентрации 11 мМ.
В случае rBet v 1 снижение значения рН не является необходимым. Тем не менее, к rBet v 1 обычно прибавляют гидрокарбонат натрия при осуществлении способа в соответствии с изобретением для того, чтобы установить физиологические концентрации простым способом в конце очистки.
Изобретение, таким образом, относится к способу получения гипоаллергенного основного аллергена пыльцы березы rBet v 1, в котором существенно небуферизованные элюенты создают в растворе мягкие условия для белков, которые подвергаются очистке, и таким образом, поддерживают их в состоянии, позволяющем проводить хроматографию.
В предпочтительном воплощении способа неочищенный белок rBet v 1 предварительно подвергают очистке перед основной очисткой с помощью хроматографии, например, при использовании хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий или ионообменной хроматографии и/или высаливания, где в отличие от последующей основной очистки, используется забуференный элюент или забуференный раствор.
Исходные материалы для осуществления способа являются растворимыми, рекомбинантные аллергены экспрессируются бактериальными клетками или другими приемлемыми хозяйскими клетками (такими, как, например, дрожжи). Поскольку способ представляет общее применение этих экспрессионных продуктов, растворимые аллергены различного происхождения в соответствии с изобретением могут также быть очищены с помощью данного способа, подвергнуты ренатурации и использованы для введения в состав препаратов. В частности, в случае соответствующей подобности этих аллергенов различного происхождения основному аллергену пыльцы березы rBet v 1 можно ожидать, что будут достигнуты свойства в соответствии с изобретением. Однако процесс является, в частности, приемлемым для получения основного аллергена пыльцы березы rBet v 1, полученного с помощью рекомбинантных способов. Однако природный основной аллерген пыльцы березы nBet v 1 также является по существу пригодным в качестве исходного материала.
Заключительная нейтрализация рекомбинантных активных ингредиентов путем модификации значения рН позволяет сделать соответствующий выбор концентрации ингредиентов элюента, получить готовый к использованию физиологический раствор, который может быть получен непосредственно.
Фармацевтически активные ингредиенты могут также использоваться непосредственно после нейтрализации в качестве продуктов для парентерального введения. Кроме того, воспроизводимый и стандартизованный способ может быть осуществлен в условиях в соответствии с установленным порядком производства товаров (GMP), соблюдение которого необходимо для получения фармацевтических препаратов.
Таким образом, изобретение предназначено для получения улучшенных препаратов для специфической иммунотерапии аллергий, чего достигают при использовании способа в соответствии с изобретением. Значительно сниженная или отсутствующая активность обеспечивает преимущественные свойства для специфической иммунотерапии. Рекомбинантные гипоаллергенные аллергены, полученные таким образом, могут сделать свой вклад в усовершенствование терапии аллергических заболеваний.
Изобретение, таким образом, относится к гипоаллергенному основному аллергену пыльцы березы rBet v 1, который получают с помощью процесса в соответствии с данным изобретением, в частности, при его применении в качестве лекарственного средства.
Также является возможным для дополнительного влияния на свойства основного аллергена пыльцы березы rBet v 1, например, для того, чтобы достичь дальнейшего снижения активности IgE или дальнейшего повышения стимуляции Т-клеток, осуществить фармацевтически приемлемые модификации белка и, таким образом, получить производные белка. Такие модификации могут, с одной стороны, быть генетическими модификациями на уровне ДНК, в которых, например, вставки, делеции и замены аминокислот, разрезание белка на фрагменты или слияние белка или его фрагментов с другими белками или пептидами также являются приемлемыми. Однако модификации также должны иметь химическую природу и происходить на белковом уровне.
Изобретение, таким образом, относится к применению гипоаллергенного основного аллергена пыльцы березы rBet v 1 в соответствии с изобретением и/или его фармацевтически приемлемых производных, включая их смеси во всех соотношениях, для получения лекарственного средства для специфической иммунотерапии аллергий, в инициацию которых вовлечен основной аллерген пыльцы березы rBet v 1.
В заключение изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей гипоаллергенный основной аллерген пыльцы березы rBet v 1 в соответствии с изобретением и/или его фармацевтически используемые производные, включая их смеси во всех соотношениях. Активные ингредиенты в соответствии с изобретением могут быть превращены в приемлемые дозированные формы в сочетании с, по крайней мере, одним твердым, жидким и/или полужидким наполнителем или адъювантом и необязательно в комбинации с одним или более дополнительными активными ингредиентами.
Эти композиции могут использоваться в качестве терапевтических агентов для человека или в ветеринарной медицине. Приемлемые наполнители представляют собой органические или неорганические вещества, которые являются приемлемыми для парентерального введения и которые не взаимодействуют с гипоаллергенным основным аллергеном пыльцы березы rBet v 1. Приемлемыми для парентерального введения являются, в частности, растворы, предпочтительно растворы на основе масла или водные растворы, кроме того, суспензии, эмульсии или имплантаты. Гипоаллергенный основной аллерген пыльцы березы rBet v 1 в соответствии с изобретением может также быть лиофилизирован, а полученный лиофилизат используют, например, для получения препаратов для инъекции. Указанные композиции могут подвергаться стерилизации и/или включать вспомогательные вещества, такие, как лубриканты, консервирующие агенты, стабилизаторы и/или смачивающие агенты, эмульгаторы, соли для модификации осмотического давления, буферные вещества и/или ряд других активных ингредиентов.
Кроме того, соответствующие препараты гипоаллергенного основного аллергена пыльцы березы rBet v 1 в соответствии с изобретением дают возможность получить препараты длительного высвобождения, например, с помощью адсорбции на гидроокиси алюминия.
Способ получения в соответствии с изобретением в общей форме приведен ниже. В этом описании все хроматографические материалы, упомянутые в виде примеров, получены от Amersham Biosciences (Freiburg, Germany). Первый предварительный этап для удаления нуклеиновых кислот может заключаться в хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия, которую осуществляют при физиологических условиях (при значении рН 6-8, неденатурирующем), при этом белок, который представляет интерес, одновременно подвергается фокусированию. Альтернативно можно также осуществлять высаливание или ионообменную хроматографию. Однако не является абсолютно необходимым проводить этот этап предварительной очистки для достижения эффекта в соответствии с изобретением.
Последующий этап очистки служит для перевода белков в слабо соленый элюент, который имеет концентрацию в пределах от 10 до 1000 мМ, например, 20 мМ NaCl, например, путем гель-фильтрации на колонке Сефадекс G-25. Создают, таким образом, условия, которые улучшают проведение ионообменной хроматографии при использовании щелочных элюентов. Раствор белка, приготовленный таким образом, в последующем используют для анионообменной хроматографии, например, при использовании колонки Source Q. Большинство аллергенов связываются с носителем. Щелочной элюент вызывает тот факт, что изначально слабо растворимые или нерастворимые белки остаются в растворе. Элюирование при использовании градиента NaCl приводит к частичному удалению бактериальных загрязнений и фрагментов активного ингредиента.
В ходе дальнейших этапов очистки, на этапе хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия и гель-фильтрации, предварительно очищенные и уравновешенные аллергены существенно отделяют от бактериальных загрязнений, которые еще остались. С этой целью применение, в основном, осуществляют на основе тех же веществ элюента, которые состоят из основания низкого молекулярного веса и варьирующего соотношения неорганической нейтральной соли. Таким образом, аллергены могут быть связаны с колонкой при проведении хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия при использовании, например, до 5 М NaCl, 20 мМ NaOH и 11 мМ NaHCO3 и в дальнейшем элюируют при использовании раствора с низким содержанием соли щелочного металла или не содержащего соли щелочного металла, например, содержащего 20 мМ NaOH.
На этапе заключительной хроматографической очистки осуществляют замену элюента таким образом, что очищенные рекомбинантные белки получают в растворимой, готовой к применению форме путем простой нейтрализации основания, присутствующего в элюенте при использовании соответствующей кислоты. При осуществлении приемлемого выбора концентраций добавок, входящих в состав элюента, получают физиологический раствор, который является приемлемым для парентерального введения.
Очищенные аллергены идентифицируют при использовании известных физических, химических или биологических свойств, в частности, путем SDS-PAGE и специфических моноклональных антител. Для дальнейшей характеристики можно осуществлять, например, анализ на основе EAST ингибирования (EAST означает ферментный аллерго-сорбентный тест), с помощью которого специфическое связывание белка с IgE сравнивают со стандартом, который может быть определен, и/или на основе анализа пролиферации Т-клеток. Растворитель подвергают исследованию с помощью измерения рН и количественной оценки ионов Na+ и Cl-, и в случае необходимости, концентрации СО3 -. Эти способы являются общеизвестными и описанными в литературе.
Выход аллергенов, полученных в соответствии с изобретением, в общем случае составляет 75-95% от исходного белка.
Способ, таким образом, предусматривает минимальную обработку образца, короткий период отстаивания, предпочтительное использование исключительно фармакологически совместимых веществ, совместимость одного элюента с различными принципами разделения, а также дает возможность избежать длительных и, при некоторых обстоятельствах, неподтвержденных способов, таких, как диализ. Кроме того, раствор гидроокиси натрия, который предпочтительно используют в качестве основания, является известным в качестве эффективного бактериостатика, который предотвращает процесс деградации белков, присутствующих в растворе, или его контаминацию микроорганизмами. Эндотоксины, которые вызывают проблемы в бактериальной экспрессии, другие чужеродные белки и ДНК также эффективно удаляются или разлагаются.
Последовательность и количество хроматографических этапов, описанных выше, может изменяться. Таким образом, среди прочих, могут быть взяты во внимание специфические физико-химические свойства белка, представляющего интерес.
Даже без дальнейших комментариев предполагается, что специалист в данной области будет в состоянии использовать приведенное выше описание в его более широком объеме. Предпочтительные воплощения, описанные ниже, таким образом, должны восприниматься только как описательное раскрытие, которое абсолютно не ограничивает изобретение любым путем.
В частности, предпочтительное воплощение способа показано на следующей схеме (Таблица 1)
Таблица 1 Обзор способа получения в соответствии с изобретением |
|
1. | Предварительная очистка (необязательно) при использовании хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия (фенил-Сефароза) |
Элюент 1: 20 мМ Трис/HCl, 1 М сульфат аммония, рН 8,0 | |
Элюент 2: дистиллированная вода | |
2. | Замена элюента для основной очистки при использовании гель-фильтрации (Сефадекс 25) |
Элюент: 20 мМ NaCl | |
3. | Анионообменная хроматография (Source 15 Q) |
Элюент 1: 20 мМ NaOH, 11 мМ NaHCO3 и 20 мМ NaCl | |
Элюент 2: градиент NaCl (от 20 мМ NaOH; 11 мМ NAHCO3; 20 мМ | |
NaCl до 20 мМ NaOH; 11 мМ NaHCO3; 0,5 М NaCl) | |
4. | Хроматография на основе гидрофобного взаимодействия (Source PHE) |
Элюент 1: 3 М NaCl, 20 мМ NaOH, 11 мМ NaHCO3 | |
Элюент 2: 20 мМ NaOH | |
5. | Гель-фильтрация (Супердекс 75) |
Элюент: 10 мМ NaOH, 11 мМ NaHCO3 и 148,4 мМ NaCl | |
6. | Нейтрализация при использовании 1/10 (об./об.) 100 мМ HCl |
Изобретение описано ниже посредством приведения примера очистки терапевтически эффективного рекомбинантного Bet v 1 (rBet v 1). Все хроматографические материалы являются коммерчески доступными от Amersham Biosciences (Freiburg, Germany).
Пример 1: Получение гипоаллергенного rBet v 1
Сначала с помощью стандартных способов получают лизат Е. coli, содержащий растворимый алерген rBet v 1 (Breiteneder H., и др., EMBO J. 1989, 8: 1935-8; Hoffmann-Sommergruber и др., Protein Exp. Purif. 9 (1), 1997: 33-39).
Для того чтобы удалить нуклеиновые кислоты, осуществляют хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия при использовании фенил-Сефарозы в Трис/аммонийном буфере (20 мМ Трис/HCl, 1 М сульфата аммония, рН 8,0). Элюирование осуществляют при использовании дистиллированной воды. При осуществлении этапов дальнейшей очистки при использовании слабо щелочных элюентов остаточный сульфат аммония заменяют на 20 мМ NaCl путем гель-фильтрации через Сефадекс G-25.
Белковый раствор, предварительно очищенный таким образом, используют для анионообменной хроматографии, применяя Source 15Q, при этом материал носителя уравновешивают с помощью щелочного раствора (20 мМ NaOH; 11 мМ NaHCO3; 20 мМ NaCl до 20 мМ NaOH; 11 мМ NaHCO3; 0,5 М NaCl) и проводят удаление загрязнений (белков хозяйской клетки) и фрагментов активного ингредиента.
Последующий хроматографический этап представляет собой хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия при использовании Source PHE. С этой целью элюат, полученный при использовании ионообменной хроматографии, доводят до 3 М NaCl; 20 мМ NaOH; 11 мМ NaHCO3 путем прибавления соответствующих количеств 5 М маточного раствора NaCl, 2 М маточного раствора NaOH и гидрокарбоната натрия. В этих условиях rBet v 1 связывается с материалом колонки. Элюирование связанного белка, представляющего интерес, осуществляют при использовании 20 мМ NaOH.
В качестве заключительного этапа осуществляют гель-фильтрацию через Супрадекс 75 в щелочных условиях. Хроматографический раствор выбирают таким образом, чтобы нейтрализация основания, прибавленного к элюенту, приводила к получению желаемой заключительной композиции: 10 мМ NaOH, 11 мМ NaHCO3 и 148,4 мМ NaCl, что соответствует концентрациям физиологического раствора. Элюат, полученный путем гель-фильтрации, на конечном этапе нейтрализуют при использовании кислоты HCl, что соответствует используемому основанию NaOH и приводит к получению нейтрального значения рН и в то же время к достижению желательного содержания соли физиологического раствора. Этого достигают путем прибавления 1/10 (об./об.) 100 мМ HCl.
Пример 2: Характеристика с помощью SDS-PAGE
Для характеристики гипоаллергенного rBet v 1 из Примера 1 осуществляли SDS-PAGE (15%). Как видно из Фигуры 1А, природный nBet v 1 (полоса 2), рекомбинантный rBet v 1, очищенный традиционным способом по методике Hoffmann-Sommergruber и др. (Protein Exp. Purif. 9(1), 1997: 33-39) (полоса 4), и rBet v 1, очищенный в соответствии с изобретением (полоса 3), имели одинаковый молекулярный вес в SDS-PAGE.
Пример 3: Определение активности в отношении IgE при использовании пула сывороток
Для определения активности в отношении IgE SDS-PAGE из Примера 2 подвергали блоттингу на нитроцеллюлозный фильтр. После того, как прибавляли пул сывороток крови пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу березы, к блоту, блот подвергали инкубации с конъюгатом, содержащим анти-IgE антитело и щелочную фосфатазу. Цветная реакция, усиленная при использовании щелочной фосфатазы (Фиг.1В), показала активность в отношении IgE природного nBet v 1 и рекомбинантного, традиционным образом очищенного rBet v 1, но не rBet v 1-MF, очищенного в соответствии с изобретением.
Пример 4: Определение активности в отношении IgE при использовании индивидуальных сывороток
Для определения активности в отношении IgE при использовании сывороток крови, полученных от индивидуальных пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу березы, использовали nBet v 1 (положение 3), рекомбинантный, традиционным образом очищенный rBet v 1 (положение 5) и rBet v 1, очищенный в соответствии с изобретением (положение 4), как представлено на Фигуре 2А, нитроцеллюлозную мембрану анализировали аналогично Примеру 3. Фиг.2А показывает, что за исключением сыворотки 5, в которой rBet v 1, очищенный в соответствии с изобретением, имел слабую активность в отношении IgE, только природный nBet v 1 и рекомбинантный, очищенный традиционным способом rBet v 1, но не rBet v 1, очищенный в соответствии с изобретением, имели активность в отношении IgE.
Для определения идентичности изучаемых аллергенов нитроцеллюлозный фильтр подвергали инкубации с различными кроличьими анти-rBet v 1 антителами (образцы от 21 до 26) и с моноклональным мышиным анти-rBet v 1 антителом 6В6 (образец 27) и последовательно обработанным так, как описано в Примере 3 (Фигура 2В).
Пример 5: Количественная оценка связывания IgE
В анализе ингибирования EAST, который осуществляли в соответствии со способом Suck и др. (Int. Arch. Allergy Immunol. 2000; 121: 284-291) при использовании пула сывороток крови пациентов, страдающих от аллергии, сравнивали друг с другом природный nBet v 1, рекомбинантный, традиционным образом очищенный rBet v 1 и rBet v 1, очищенный в соответствии с изобретением, в отношении силы их связывания с IgE (Фиг.3). Было обнаружено, что rBet v 1, очищенный в соответствии с изобретением, имеет сниженную более чем в 100 активность связывания с IgE по сравнению с другими белками rBet v 1.
Пример 6: Определение стимуляции Т-клеток
Для определения влияния аллергена rBet v 1 в соответствии с изобретением на рост Т-клеток осуществляли анализ пролиферации при использовании линий Т-клеток (TCL) и клонов Т-клеток (ТСС) при использовании способа Schramm и др. (1999, J. Immunol. 162 (4): 2406-2414) (Фиг.4). Из сравнения индексов стимуляции (SI) можно увидеть, что Т-клетки исследуемых доноров реагируют, по крайней мере, также сильно с rBet v 1, как и с природным nBet v 1 или рекомбинантным rBet v 1, очищенным традиционным способом. В зависимости от выбранных условий реакция с rBet v 1 даже превышает реакцию с nBet v 1 или rBet v 1 на одну треть.
Claims (27)
1. Способ получения основного аллергена пыльцы березы rBet v 1, предусматривающий выделение растворимого рекомбинантного rBet v 1 из клеток и его очистку путем осуществления одного или более этапов хроматографии, отличающийся тем, что при использовании хроматографии в качестве элюента используют существенно небуферизованные водные основания с последующей их нейтрализацией.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что растворимый неочищенный белок rBet v 1, полученный с помощью рекомбинантных способов, экспрессируется в Е.coli.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что этапы хроматографической очистки включают анионообменную хроматографию, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия и гель-фильтрацию.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что этапы хроматографической очистки осуществляют в следующей последовательности: первая гель-фильтрация, анионообменная хроматография, хроматография на основе гидрофобного взаимодействия, вторая гель-фильтрация.
5. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, отличающийся тем, что используемое в качестве элюента основание применяют в интервале концентраций от 5 до 100 мМ, предпочтительно от 5 до 40 мМ.
6. Способ по п.3, отличающийся тем, что используемое в качестве элюента основание применяют в интервале концентраций от 5 до 100 мМ, предпочтительно от 5 до 40 мМ.
7. Способ по любому из пп.1, 4 или 6, отличающийся тем, что основанием, используемым в качестве элюента, является NaOH.
8. Способ по п.5, отличающийся тем, что основанием, используемым в качестве элюента, является NaOH.
9. Способ по п.1 или 6, отличающийся тем, что к элюенту прибавляют неорганическую нейтральную соль и необязательно NaHCO3.
10. Способ по п.5, отличающийся тем, что к элюенту прибавляют неорганическую нейтральную соль и необязательно NaHCO3.
11. Способ по п.7, отличающийся тем, что к элюенту прибавляют неорганическую нейтральную соль и необязательно NaHCO3.
12. Способ по п.8, отличающийся тем, что к элюенту прибавляют неорганическую нейтральную соль и необязательно NaHCO3.
13. Способ по любому из пп.10, 11 или 12, отличающийся тем, что неорганической нейтральной солью, прибавляемой к элюенту, является NaCl.
14. Способ по п.9, отличающийся тем, что неорганической нейтральной солью, прибавляемой к элюенту, является NaCl.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что концентрации веществ NaOH, NaCl и NaHCO3, присутствующих в элюенте, выбирают таким образом, что типичные концентрации для физиологического раствора могут быть установлены на этапе нейтрализации, который следует за этапом очистки.
16. Способ по п.14, отличающийся тем, что концентрации веществ NaOH, NaCl и NaHCO3, присутствующих в элюенте, выбирают таким образом, что типичные концентрации для физиологического раствора могут быть установлены на этапе нейтрализации, который следует за этапом очистки.
17. Способ по любому из пп.1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 14, 15 или 16, отличающийся тем, что неочищенный белок rBet v 1 предварительно очищают в забуференном растворе при использовании хроматографии и/или высаливания.
18. Способ по п.3, отличающийся тем, что неочищенный белок rBet v 1 предварительно очищают в забуференном растворе при использовании хроматографии и/или высаливания.
19. Способ по п.5, отличающийся тем, что неочищенный белок rBet v 1 предварительно очищают в забуференном растворе при использовании хроматографии и/или высаливания.
20. Способ по п.7, отличающийся тем, что неочищенный белок rBet v 1 предварительно очищают в забуференном растворе при использовании хроматографии и/или высаливания.
21. Способ по п.9, отличающийся тем, что неочищенный белок rBet v 1 предварительно очищают в забуференном растворе при использований хроматографии и/или высаливания.
22. Способ по п.13, отличающийся тем, что неочищенный белок rBet v 1 предварительно очищают в забуференном растворе при использований хроматографии и/или высаливания.
23. Способ снижения активности IgE основного аллергена пыльцы березы rBet v 1, отличающийся тем, что рекомбинантный растворимый основной аллерген пыльцы березы rBet v 1 используют в способе по одному из пп.1-22.
24. Гипоаллергенный основной аллерген пыльцы березы rBet v 1 полученный с помощью одного из процессов, описанных в пп.1-22.
25. Гипоаллергенный основной аллерген пыльцы березы rBet v 1 по п.24 в качестве лекарственного средства.
26. Применение гипоаллергенного основного аллергена пыльцы березы rBef v 1 по п.24 и/или его фармацевтически приемлемых производных, включая их смеси во всех соотношениях, для получения лекарственного средства для специфической иммунотерапии аллергий, в инициацию которых вовлечен основной аллерген пыльцы березы rBet v 1.
27. Фармацевтическая композиция для специфической иммунотерапии аллергий, в инициацию которых вовлечен основной аллерген пыльцы березы rBet v 1, включающая гипоаллергенный основной аллерген пыльцы березы rBet v 1 по п.24 и/или его фармацевтически приемлемые производные, включая их смеси во всех соотношениях, и необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP02004567 | 2002-02-27 | ||
EP02004567.0 | 2002-02-27 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2004129282A RU2004129282A (ru) | 2005-06-10 |
RU2311424C2 true RU2311424C2 (ru) | 2007-11-27 |
Family
ID=27763342
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2004129282/13A RU2311424C2 (ru) | 2002-02-27 | 2003-02-07 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПОАЛЛЕРГЕННОГО ОСНОВНОГО АЛЛЕРГЕНА ПЫЛЬЦЫ БЕРЕЗЫ r Bet v 1 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20050123568A1 (ru) |
EP (1) | EP1478662B2 (ru) |
JP (1) | JP4343702B2 (ru) |
AT (1) | ATE443716T1 (ru) |
AU (1) | AU2003208817A1 (ru) |
CA (1) | CA2477409C (ru) |
DE (1) | DE50311945D1 (ru) |
ES (1) | ES2333951T5 (ru) |
PL (1) | PL206709B1 (ru) |
PT (1) | PT1478662E (ru) |
RU (1) | RU2311424C2 (ru) |
WO (1) | WO2003072601A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2658767C1 (ru) * | 2010-01-14 | 2018-06-22 | Мерк Патент Гмбх | Варианты группы 5 аллергенов злаковых со сниженной аллергенностью вследствие мутагенеза остатков пролина |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AT503690A1 (de) | 2006-06-09 | 2007-12-15 | Biomay Ag | Hypoallergene moleküle |
JP5279238B2 (ja) * | 2006-11-16 | 2013-09-04 | 森川健康堂株式会社 | 血圧降下作用を有する花粉の製造方法 |
EP2974741A1 (en) * | 2014-07-16 | 2016-01-20 | Stallergenes | Composition of allergen extracts having reduced toxicity and method of production thereof |
BR102017026619A2 (pt) | 2017-02-15 | 2018-10-30 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag | ensaio melhorado para a diagnose de alergia a amendoim |
RU2761431C9 (ru) | 2020-10-26 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока в качестве вакцины от аллергии |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10044360A1 (de) * | 2000-09-08 | 2002-03-21 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur Aufreinigung von rekombinanten als unlösliche Aggregate exprimierte Proteinen |
-
2003
- 2003-02-07 WO PCT/EP2003/001246 patent/WO2003072601A1/de active Application Filing
- 2003-02-07 PT PT03706458T patent/PT1478662E/pt unknown
- 2003-02-07 AU AU2003208817A patent/AU2003208817A1/en not_active Abandoned
- 2003-02-07 CA CA2477409A patent/CA2477409C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-02-07 DE DE50311945T patent/DE50311945D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-02-07 RU RU2004129282/13A patent/RU2311424C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-02-07 JP JP2003571307A patent/JP4343702B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-02-07 US US10/505,897 patent/US20050123568A1/en not_active Abandoned
- 2003-02-07 PL PL373526A patent/PL206709B1/pl unknown
- 2003-02-07 ES ES03706458.1T patent/ES2333951T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-02-07 AT AT03706458T patent/ATE443716T1/de active
- 2003-02-07 EP EP03706458.1A patent/EP1478662B2/de not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-07-03 US US12/167,712 patent/US9441021B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 9, no. 1, 1997, p.33-39. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2658767C1 (ru) * | 2010-01-14 | 2018-06-22 | Мерк Патент Гмбх | Варианты группы 5 аллергенов злаковых со сниженной аллергенностью вследствие мутагенеза остатков пролина |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2477409C (en) | 2015-01-27 |
PL373526A1 (en) | 2005-09-05 |
WO2003072601A8 (de) | 2005-08-18 |
DE50311945D1 (de) | 2009-11-05 |
WO2003072601A1 (de) | 2003-09-04 |
EP1478662B2 (de) | 2017-07-05 |
PL206709B1 (pl) | 2010-09-30 |
EP1478662B1 (de) | 2009-09-23 |
JP2005536454A (ja) | 2005-12-02 |
CA2477409A1 (en) | 2003-09-04 |
AU2003208817A1 (en) | 2003-09-09 |
ATE443716T1 (de) | 2009-10-15 |
US20090069236A1 (en) | 2009-03-12 |
PT1478662E (pt) | 2009-12-29 |
JP4343702B2 (ja) | 2009-10-14 |
US9441021B2 (en) | 2016-09-13 |
RU2004129282A (ru) | 2005-06-10 |
EP1478662A1 (de) | 2004-11-24 |
ES2333951T3 (es) | 2010-03-03 |
US20050123568A1 (en) | 2005-06-09 |
ES2333951T5 (es) | 2017-11-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2553205C2 (ru) | ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ГИАЛУРОНИДАЗА ИЗ Streptomyces koganeiensis | |
US9441021B2 (en) | Process for the preparation of hypoallergenic major birch pollen allergen rBet v 1 | |
DK175251B1 (da) | Renfremstilling af erythropoietin | |
EP0537280B1 (en) | Preparation and use of transfer factor | |
JPH07188291A (ja) | 蛋白質とその製造方法並びに用途 | |
RU2299214C2 (ru) | СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВАРИАНТОВ Bet v 1 | |
RU2323942C2 (ru) | ВАРИАНТЫ ОСНОВНОГО АЛЛЕРГЕНА Phl p 1 ИЗ ТИМОФЕЕВКИ ЛУГОВОЙ | |
US5747047A (en) | Purified mite allergen | |
JP4573772B2 (ja) | 改変ダニ主要アレルゲンの精製方法 | |
AT405940B (de) | Verfahren zur gewinnung und reinigung von rekombinantem, nicht-lipidiertem osp-protein | |
Nakamura et al. | A new membrane-associated Ca2+-binding protein of rat spermatogenic cells: Its purification and characterization | |
KR20000048181A (ko) | 글리코실화된 단백질과 비글리코실화된 단백질을 분리하는방법 | |
JP2002516340A (ja) | ワクチン | |
JP4798831B2 (ja) | ヒト血清アルブミンのミスホールディングを抑制する方法 | |
JPH06192299A (ja) | 精製ダニアレルゲン | |
JPH0597898A (ja) | 精製ダニアレルゲン | |
JPH07267998A (ja) | 血清アミロイドa蛋白質の分離精製方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180208 |