ES2333951T3 - Metodo para producir alergenos principales rbet v 1 hipoalergenicos de abedul. - Google Patents
Metodo para producir alergenos principales rbet v 1 hipoalergenicos de abedul. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la preparación de alergenos principales del polen de abedul rBet v 1 hipoalergénicos mediante una o varias etapas de purificación cromatográfica con el uso como eluyentes de bases acuosas esencialmente no tamponadas y a continuación neutralización, caracterizado por que se emplea como producto de partida una proteína cruda rBet v 1 soluble preparada con métodos recombinantes.
Description
Método para producir alergenos principales rBet
v 1 hipoalergénicos de abedul.
La invención se refiere a un procedimiento para
la preparación de alergenos de polen de abedul que se caracterizan
por la ausencia, o como mínimo una reducción, de la unión a
inmunoglobulina E, es decir, se caracterizan por su
hipoalergenicidad. Estos alergenos conservan totalmente la
estimulación de células T terapéuticamente relevante. Por tanto, se
pueden emplear como agentes terapéuticos con pocos efectos
secundarios para inmunoterapia específica.
Las alergias del tipo 1 han aumentado
dramáticamente en todo el mundo durante las últimas décadas. Hasta
el 20% de la población de los países industrializados sufre de
dolencias, como rinitis alérgica, conjuntivitis o asma bronquial,
provocadas por alergenos que se encuentran en el aire
(aeroalergenos), que son liberados por diferentes fuentes, como
polen vegetal, ácaros, mamíferos (gatos, perros, caballos) y mohos.
Las alergias graves también pueden desencadenarse por picaduras de
insectos, como por ejemplo, abejas y avispas.
Las sustancias desencadenantes de las alergias
de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. Estos
alergenos reaccionan, tras la absorción a través de las mucosas o
tras la picadura, con los anticuerpos IgE unidos en la superficie
de los mastocitos de personas sensibilizadas. Si dos o más
anticuerpos IgE se unen entre sí a través de un alérgeno, esto
conduce a la producción de mediadores (p. ej., histamina,
prostaglandinas) y citoquinas a través de células efectoras y por
tanto conduce a la activación de los síntomas alérgicos. Entre los
pólenes de árboles, el polen de abedul es el que desencadena más
frecuentemente reacciones alérgicas (Jarolim E. y col., 1989,
Allergy 44:385-95). Más del 90% de las personas que
sufren de alergia al polen de abedul poseen anticuerpos IgE contra
el alérgeno principal Bet v 1 (Elfman, L. y col., 1997, Int. Arch.
Allergy Immunol., 113: 249-51).
Con ayuda de las secuencias de ADNc es posible
preparar alergenos recombinantes que se pueden emplear en el
diagnóstico y la terapia de las alergias. (Scheiner y Kraft, 1995,
Allergy 50, 384-391). La preparación de alergenos
recombinantes Bet v 1 (rBet v 1) y su purificación con fines
farmacéuticos ha sido descrita p. ej. por
Hoffmann-Sommergruber y col. (Protein Exp. Purif. 9
(1), 1997: 33-39).
Además, son posibles modificaciones mediante
ingeniería genética dirigidas de los alergenos recombinantes, con
lo que se puede alcanzar un potencial alergénico reducido (Schramm y
col., 1999, J. Immunol. 162 (4): 2406-2414; Valenta
y col., 1999, Biol. Chem. 380: 815-24; Singh y col.,
1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 119: 75-85).
Dichas variantes de alergenos son futuros candidatos prometedores
para la inmunoterapia específica de la alergia de tipo 1.
Sin embargo, un inconveniente potencial en las
variantes de alergenos recombinantes es que mediante la modificación
de la estructura primaria se pierden los epítopos de células T
necesarios para el éxito terapéutico o se reduce su actividad. Esta
posibilidad sólo se puede eludir si la estructura primaria
correspondiente al alérgeno natural sirve como base para la
preparación de la proteína recombinante.
En el caso del alérgeno principal del polen de
abedul Bet v 1, para optimizarlo con fines terapéuticos mediante
métodos recombinantes, es decir, para reducir la capacidad de unión
a IgE, se preparó en dos mitades (Vrtala, S., y col., 1997, J.
Clin. Invest. 99: 1673-81) o como trímero (Vrtala,
S., y col., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol.
118:218-9). En estos enfoques también resulta un
inconveniente la pérdida potencial de los epítopos de células T,
así como la insolubilidad de las proteínas. Otro inconveniente a
considerar aquí es la costosa técnica de preparación de estas
variantes rBet v 1.
Por consiguiente, un enfoque apropiado para la
preparación de un alérgeno principal recombinante rBet v 1 que se
pueda emplear con fines terapéuticos sería por tanto una molécula
que equivaliera al tipo salvaje en la estructura primaria, no
estuviera limitada en su estimulación de células T, pero presentara
una actividad IgE reducida, es decir, fuera hipoalergénica.
Este objetivo se ha alcanzado en el marco de la
presente invención mediante la realización de una serie de etapas
de purificación bioquímica conocidas con el uso de alergenos
principales recombinantes rBet v 1 solubles como producto de
partida. Sorprendentemente, en las proteínas purificadas de este
modo se ha comprobado una actividad IgE reducida y al mismo tiempo
una estimulación de células T conservada.
Por consiguiente, el procedimiento según la
invención proporciona una eficacia terapéutica mejorada y al mismo
tiempo una clara reducción o ausencia de efectos secundarios.
Así, es de especial importancia el diseño del
procedimiento de preparación de los alergenos recombinantes, ya que
como consecuencia de este procedimiento las proteínas adquieren una
conformación que no presenta ninguna afinidad con IgE o la presenta
muy reducida, manteniéndose la estimulación de células T.
Figura 1A: SDS-PAGE para la
caracterización de rBet v 1 hipoalergénica
Rastro 1: Patrón de proteína para la estimación
del peso molecular
Rastro 2: nBet v 1 natural
Rastro 3: rBet v 1 purificada según la
invención
Rastro 4: rBet v 1 purificada de forma
convencional
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1B: Transferencia a nitrocelulosa del
SDS-PAGE de la Fig. 1A
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2A: Transferencia a nitrocelulosa para la
determinación de la actividad IgE con 20 sueros de pacientes
individuales
Posición 3: nBet v 1 natural
Posición 4: rBet v 1 purificada según la
invención
Posición 5: rBet v 1 purificada de forma
convencional
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2B: Transferencia a nitrocelulosa para la
determinación de la identidad de las muestras Bet v 1
Manchas 21-26: Diferentes
anticuerpos policlonales anti-Bet v 1 de conejo
Mancha 27: Anticuerpo 6B6 monoclonal
anti-Bet v 1 de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3:
Enzym-Allergo-Sorbent-Test
(EAST) para la cuantificación de la unión a IgE
En el eje vertical se indica la concentración de
un inhibidor de la unión IgE-Bet v 1 en ng/ml, en el
eje horizontal se indica el grado de la inhibición en [%].
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4: Determinación de la estimulación de
células T por parte de variantes Bet v 1. Se comparan las
concentraciones de nBet v 1 natural, de rBet v 1 recombinante
purificada de forma convencional, así como de rBet v 1 recombinante
purificada según la invención y los correspondientes índices de
estimulación (SI) obtenidos con diferentes líneas de células T
(TCL) y clones de células T (TCC).
La presente invención trata de un procedimiento
de purificación bioquímica que a través de una purificación eficaz
de, por ejemplo, alergenos producidos con métodos recombinantes,
mediante el uso de eluyentes especiales, conduce a la obtención de
proteínas con las propiedades modificadas según la invención.
Estas propiedades consisten en una ausencia de
actividad IgE, como mínimo una actividad IgE fuertemente reducida,
manteniendo al mismo tiempo la estimulación de células T.
Por tanto, es objeto de la presente invención un
procedimiento para la reducción de la actividad IgE del alérgeno
principal del polen de abedul rBet v 1, que consiste en el uso de
alergenos principales del polen de abedul recombinantes rBet v 1
solubles, así como en la realización de las siguientes etapas de
cromatografía descritas para su purificación y de la posterior
etapa de neutralización.
Además, es objeto de la invención un
procedimiento para la preparación de alergenos principales del polen
de abedul rBet v 1 hipoalergénicos mediante varias etapas de
purificación cromatográfica con el uso como eluyente de bases
acuosas esencialmente no tamponadas y una neutralización posterior,
empleándose como producto de partida una proteína cruda rBet v 1
soluble preparada mediante métodos recombinantes.
Las etapas de purificación cromatográfica
comprenden preferiblemente cromatografía de intercambio aniónico,
cromatografía de interacción hidrofóbica, así como filtración en gel
y se pueden realizar una vez, varias veces sucesivamente o varias
veces alternativamente. Sin embargo, las etapas de purificación
cromatográfica se realizan preferiblemente en el orden siguiente:
primera filtración en gel, cromatografía de intercambio aniónico,
cromatografía de interacción hidrofóbica, segunda filtración en
gel.
Normalmente la purificación cromatográfica se
realiza con una concentración de base de 5 a 100 mM, aunque
preferiblemente con 5 a 40 mM y de forma especialmente preferible
con 10 a 30 mM, empleándose preferiblemente NaOH como sustancia
básica. En lugar de un sistema acuoso puro se puede emplear también
un sistema mixto, que contiene por ejemplo agua y metanol. También
se puede pensar en un sistema no acuoso, p. ej. metanol. Sin
embargo, se trabaja preferiblemente con un sistema acuoso.
Dependiendo de la etapa de cromatografía
correspondiente se pueden adicionar al eluyente diferentes
concentraciones de una sal neutra -preferiblemente NaCl- hasta
aproximadamente 5 M.
Para una eventual reducción necesaria del valor
de pH que sea tolerada por proteínas sensibles, se puede adicionar
hidrogenocarbonato sódico.
También el propósito de establecer unas
condiciones fisiológicas al final de la purificación puede ser un
motivo para la presencia de hidrogenocarbonato sódico durante las
etapas de cromatografía. Así, fundamentalmente son posibles
concentraciones de hasta 100 mM. Sin embargo, en el entorno
fisiológico se trabaja preferiblemente por debajo de 20 mM, con
especial preferencia por debajo de 11 mM.
En el caso de rBet v 1 no es necesaria una
reducción del valor de pH. Sin embargo, para la aplicación del
procedimiento según la invención en rBet v 1 se añade por regla
general hidrogenocarbonato sódico, para poder establecer de forma
sencilla concentraciones fisiológicas al final de la
purificación.
Así, la invención trata de un procedimiento para
la preparación de alergenos principales del polen de abedul rBet v
1 hipoalergénicos, en que un eluyente básico esencialmente no
tamponado mantiene las proteínas a purificar en solución en
condiciones suaves y por tanto en un estado cromatografiable.
En una forma de realización preferible del
procedimiento, la proteína cruda rBet v 1 se
pre-purifica antes de la purificación real mediante
una cromatografía, por ejemplo una cromatografía de interacción
hidrofóbica o una cromatografía de intercambio iónico, y/o mediante
precipitación de la sal, en la que se trabaja con un eluyente
tamponado o una solución tamponada, en contraposición a la posterior
purificación principal.
Los productos de partida para el procedimiento
son alergenos recombinantes solubles expresados en bacterias u
otras células huésped apropiadas (como levaduras). Puesto que el
procedimiento representa una aplicación general para estos productos
de expresión, según el procedimiento de la invención también se
pueden formular, renaturalizar y purificar alergenos solubles de
otra procedencia. En particular, para la correspondiente similitud
de estos alergenos de otra procedencia con los alergenos principales
del polen de abedul Bet v 1, se cuenta con obtener las propiedades
según la invención.
Se tienen en consideración las proteínas o sus
fragmentos con otras proteínas o péptidos. Sin embargo, las
modificaciones pueden ser de naturaleza química y se pueden realizar
a nivel de proteína.
Por tanto, es objeto de la invención el uso del
alérgeno principal del polen de abedul rBet v 1 hipoalergénico
según la invención para la preparación de un medicamento para la
inmunoterapia específica de alergias, en cuya activación participa
el alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1.
Finalmente, es objeto de la invención una
preparación farmacéutica que contiene el alérgeno principal del
polen de abedul rBet v 1 hipoalergénico según la invención. De este
modo los principios activos según la invención se pueden aplicar
junto con al menos un excipiente o coadyuvante sólido, líquido y/o
semilíquido y dado el caso en combinación con uno o varios
principios activos diferentes en una forma de dosificación
apropiada.
Estas preparaciones pueden utilizarse como
agentes terapéuticos en medicina humana o veterinaria. Se tienen en
consideración como excipientes sustancias orgánicas o inorgánicas
que son apropiadas para la aplicación parenteral y que no
reaccionan con el alérgeno principal del polen de abedul rBet v 1
hipoalergénico. Para la aplicación parenteral se emplean en
particular soluciones, preferiblemente soluciones oleosas o acuosas,
otras suspensiones, emulsiones o implantes. El alérgeno principal
del polen de abedul rBet v 1 hipoalergénico según la invención
también pueden someterse a liofilización y el producto liofilizado
obtenido puede emplearse p. ej. para la elaboración de
preparaciones inyectables. Las preparaciones indicadas se pueden
esterilizar y/o contener coadyuvantes, como lubricantes,
conservantes para conseguir una reducción de la actividad IgE o un
aumento adicional de la estimulación de células T se preparan
modificaciones farmacéuticamente aceptables y con ello se pueden
producir derivados de la proteína. Por un lado estas modificaciones
se pueden realizar por ingeniería genética a nivel de ADN, entrando
en consideración p. ej. inserciones, deleciones e intercambios de
aminoácidos, roturas de la proteína en fragmentos, así como fusiones
de la proteína o sus fragmentos con otras proteínas o péptidos. Sin
embargo, las modificaciones pueden ser de naturaleza química y se
pueden realizar a nivel de proteína.
Por tanto, es objeto de la invención el uso del
alérgeno principal del polen de abedul rBet v 1 hipoalergénico y/o
sus derivados farmacéuticamente aplicables, incluidas sus mezclas en
todas las proporciones para la preparación de un medicamento para la
inmunoterapia específica de alergias, en cuya activación participa
el alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Finalmente es objeto de la invención una
preparación farmacéutica que contiene el alérgeno principal del
polen de abedul rBet v 1 hipoalergénico según la invención y/o sus
derivados farmacéuticamente aplicables, incluidas sus mezclas en
todas las proporciones. Para ello los principios activos según la
invención pueden mezclarse con al menos un excipiente o
co-adyuvante sólido, líquido y/o semilíquido y, en
su caso, combinarse con uno o varios principios activos diferentes
en una forma de dosificación adecuada.
Estas preparaciones pueden utilizarse como
agentes terapéuticos en medicina humana o veterinaria. Se tienen en
consideración como excipientes sustancias orgánicas o inorgánicas
que son apropiadas para la aplicación parenteral y que no
reaccionan con el alérgeno principal del polen de abedul rBet v 1
hipoalergénico. Para la aplicación parenteral se emplean en
particular soluciones, preferiblemente soluciones oleosas o acuosas,
otras suspensiones, emulsiones o implantes. El alérgeno principal
del polen de abedul rBet v 1 hipoalergénico según la invención
también pueden someterse a liofilización y el producto liofilizado
obtenido puede emplearse p. ej. para la elaboración de
preparaciones inyectables. Las preparaciones mencionadas pueden
esterilizarse y/o contener coadyuvantes, como lubricantes,
conservantes, estabilizadores y/o humectantes, emulsionantes, sales
para influir sobre la presión osmótica, tampones y/o varios
principios activos diferentes.
Además, mediante la formulación correspondiente
del alérgeno principal del polen de abedul rBet v 1 hipoalergénico
según la invención se pueden obtener preparados depot, por ejemplo
mediante adsorción en hidróxido de aluminio.
A continuación se describe de forma general el
procedimiento de preparación según la invención. Así, todos los
materiales de cromatografía mencionados a modo de ejemplo proceden
de la empresa Amersham Biosciences (Freiburg, Alemania).
Una primera etapa de
pre-purificación para la eliminación de ácidos
nucleicos puede consistir en una cromatografía de interacción
hidrofóbica realizada bajo condiciones fisiológicas (a un pH de
6-8, no desnaturalizante), concentrándose al mismo
tiempo la proteína objetivo. Alternativamente a esto también se
puede realizar una precipitación de sal o una cromatografía de
intercambio iónico. Sin embargo, la realización de esta primera
etapa de pre-purificación no es obligatoriamente
necesaria para la obtención del efecto según la invención.
La siguiente etapa de purificación sirve para la
transferencia de la proteína en un eluyente débilmente salino en un
intervalo de concentración de 10-100 mM, p. ej. NaCl
20 mM, por ejemplo mediante filtración en gel en una columna
Sephadex G-25. Así se consiguen condiciones que
permiten la realización de una cromatografía de intercambio iónico
con eluyentes alcalinos. La solución de proteína así preparada se
emplea a continuación para la cromatografía de intercambio
aniónico, por ejemplo con una columna Source Q. Así la mayoría de
alergenos se unen al soporte. El eluyente alcalino provoca que
permanezcan en solución las proteínas anteriormente poco solubles o
insolubles. Mediante la elución en gradiente de NaCl se realiza una
separación parcial de impurezas bacterianas y fragmentos de
principios activos.
En dos etapas de purificación posteriores, una
cromatografía de interacción hidrofóbica y una filtración en gel,
se separan esencialmente los alergenos
pre-purificados y equilibrados de las impurezas
bacterianas restantes. Para ello se emplean fundamentalmente las
mismas sustancias eluyentes, compuestas de una base de baja
molaridad y una proporción variable de una sal neutra inorgánica.
Así, los alergenos se pueden unir a la columna en cromatografía de
interacción hidrofóbica con p. ej. hasta NaCl 5 M, NaOH 20 mM y
NaHCO_{3} 11 mM y a continuación se pueden eluir con una solución
pobre en sales o exenta de ellas, p. ej. NaOH 20 mM.
En la última etapa cromatográfica se realiza un
cambio de eluyente de manera que las proteínas recombinantes
purificadas se obtienen en forma soluble listas para el uso mediante
una sencilla neutralización de la base presente en el eluyente con
un ácido correspondiente. Para la selección adecuada de las
concentraciones de los aditivos del eluyente se emplea una solución
fisiológica adecuada para parenterales.
La identificación de los alergenos purificados
se realiza a través de sus propiedades físicas, químicas o
biológicas conocidas, en particular mediante
SDS-PAGE y anticuerpos monoclonales específicos.
Para la caracterización posterior se puede realizar por ejemplo un
ensayo de inhibición EAST (EAST significa
Enzym-Allergo-Sorbent-Test),
con el que se puede determinar la unión IgE específica de una
proteína en comparación con una referencia, y/o se puede realizar
un ensayo de proliferación de células T. El análisis del disolvente
se realiza por medición del valor de pH y cuantificación de la
concentración de Na^{+} y Cl^{-}, así como dado el caso de
CO_{3}^{2-}. Estos procedimientos son conocidos y descritos de
forma general.
El rendimiento de los alergenos preparados según
la invención asciende en general al 75-95% referido
a la proteína de partida.
Así, el procedimiento incluye tratamientos de
muestra mínimos, tiempos de residencia cortos de las muestras,
preferiblemente el uso exclusivo de sustancias farmacológicamente
compatibles, la compatibilidad de un único eluyente con diversos
principios de separación y evitar procedimientos largos y no
validables en ciertas condiciones, como la diálisis. Además, el
hidróxido sódico empleado preferiblemente como base, conocido como
bacteriostático eficaz, impide que las proteínas presentes en este
producto se degraden o impurifiquen por microorganismos. Incluso se
eliminan o degradan de forma eficaz las endotoxinas, que pueden ser
problemáticas en las expresiones bacterianas, otras proteínas
extrañas y ADN.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El orden y la cantidad de las etapas de
cromatografía descritas arriba puede ser modificada. Para ello se
pueden tener en cuenta, entre otras cosas, las propiedades
fisicoquímicas específicas de la proteína objetivo. Por eso, incluso
sin otras explicaciones, se asume que un especialista puede
utilizar la descripción anterior en el alcance más amplio. Por eso,
las formas de realización preferibles descritas a continuación se
deben interpretar solamente como una revelación descriptiva, en
ningún caso limitante de cualquiera de las maneras.
Una forma de realización especialmente
preferible del procedimiento se presenta en el esquema (Tab. 1):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se presenta a continuación con el
ejemplo de la purificación de Bet v 1 recombinante (rBet v1)
terapéuticamente eficaz. Todos los materiales de cromatografía son
distribuidos comercialmente por la empresa Amersham Biosciences
(Freiburg, Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar se prepara un lisado de E.
coli que contiene un alérgeno rBet v 1 soluble según el
procedimiento estándar (Breiteneder H., y col., EMBO J. 1989, 8:
1935-8; Hoffmann-Sommergruber y
col., Protein Exp. Purif. 9 (1), 1997: 33-39).
Después, para la eliminación de ácidos nucleicos
se lleva a cabo una cromatografía de interacción hidrofóbica con
fenil-sefarosa en un tampón
tris-amoniosulfato (Tris/HCl 20 mM, sulfato amónico
1 M, pH 8,0). La elución se realiza con agua destilada. Para la
preparación de la siguiente etapa de purificación que se realiza con
eluyentes débilmente alcalinos, se intercambia el sulfato amónico
restante por NaCl 20 mM mediante filtración en gel a través de
Sephadex G-25.
La solución de proteínas
pre-purificada de este modo se emplea para la
cromatografía de intercambio aniónico con Source 15Q,
equilibrándose el material de soporte con una solución alcalina
(NaOH 20 mM, NaHCO_{3} 11 mM y NaCl 20 mM). El valor de pH
relativamente elevado de la solución inicial provoca que casi todas
las proteínas objetivo se unan al intercambiador de aniones. La
elución siguiente se realiza con un gradiente creciente de NaCl (de
NaOH 20 mM; NaHCO_{3} 11 mM; NaCl 20 mM a NaOH 20 mM; NaHCO_{3}
11 mM; NaCl 0,5 M) y provoca una separación de impurezas (proteínas
de células huésped) y fragmentos de principios activos.
La siguiente etapa de cromatografía representa
una cromatografía de interacción hidrofóbica mediante Source PHE.
Para ello el eluato de la cromatografía de intercambio iónico se
ajusta a NaCl 3 M, NaOH 20 mM, NaHCO_{3} 11 mM mediante adición
de las cantidades correspondientes de una solución madre de NaCl 5
M, una solución madre de NaOH 2 M e hidrogenocarbonato sódico. Bajo
estas condiciones rBet v 1 se une al material de las columnas. La
elución de la proteína objetivo unida se realiza con NaOH 20
mM.
Como etapa final se realiza una filtración en
gel mediante Superdex 75, bajo condiciones alcalinas. La solución
de cromatografía se selecciona de manera que se realiza una
neutralización de la base añadida al eluyente hasta la formulación
final deseada: NaOH 10 mM, NaHCO_{3} 11 mM y NaCl 148,4 mM, lo que
corresponde a las concentraciones de una solución fisiológica
salina.
Para acabar, el eluato de la filtración en gel
se neutraliza con el ácido HCl correspondiente a la base NaOH
utilizada, de modo que se ajusta un valor de pH neutro y al mismo
tiempo se obtiene el contenido de sal deseado de una solución
fisiológica salina. Esto se consigue mediante la adición de 1/10
(v/v) HCl 100 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la caracterización de rBet v 1
hipoalergénico del ejemplo 1 se realiza un SDS-PAGE
(15%). Como resulta evidente en la Fig. 1A, el nBet v 1 natural
(rastro 2), el rBet v 1 recombinante, purificado de forma
convencional según Hoffmann-Sommergruber y col.
(Protein Exp. Purif. 9 (1), 1997: 33-39) (rastro 4)
y el rBet v 1 purificado según la invención (rastro 3) presentan el
mismo peso molecular en SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación de la actividad IgE se
transfiere el SDS-PAGE del ejemplo 2 a
nitrocelulosa. Tras la transferencia de las manchas con una mezcla
de suero de alérgicos al polen de abedul se incuba con un conjugado
compuesto de un anticuerpo anti-IgE y fosfatasa
alcalina. La reacción de coloración provocada por la fosfatasa
alcalina (Fig. 1B) muestra una actividad IgE del nBet v 1 natural,
así como del rBet v 1 recombinante purificado de forma
convencional, pero no del rBet v 1-MF purificado
según la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación de la actividad IgE con
sueros sanguíneos de alérgicos al polen de abedul individuales se
transfieren a una membrana de nitrocelulosa según la figura 2A nBet
v 1 (posición 3), rBet v 1 recombinante purificado de forma
convencional (posición 5), así como rBet v 1 purificado según la
invención (posición 4) y se ensaya de forma análoga al ejemplo 3.
La Fig. 2A muestra que con la excepción del suero 5, donde rBet v 1
purificado según la invención presenta una débil actividad IgE, sólo
tienen actividad IgE el nBet v 1 natural y rBet v 1 recombinante,
purificado de forma convencional, pero no rBet v 1 purificado según
la invención.
Para demostrar la identidad de los alergenos
estudiados, la membrana de nitrocelulosa se incubó con diferentes
anticuerpos policlonales anti-Bet v 1 de conejo
(muestras 21 a 26), así como con anticuerpos 6B6 monoclonales
anti-Bet v 1 de ratón (muestra 27) y finalmente se
trató de forma análoga al ejemplo 3 (Fig. 2B).
\vskip1.000000\baselineskip
En un ensayo de inhibición EAST realizado según
Suck y col. (Int. Arch. Allergy Immunol. 2000; 121:
284-291) con una mezcla de suero de alérgicos se
comparan entre sí nBet v 1 natural, rBet v 1 recombinante purificado
de forma convencional y rBet v 1 purificado según la invención en
relación a la intensidad de su unión a IgE (Fig. 3). Se muestra que
rBet v 1 purificado según la invención tiene una actividad IgE 100
veces inferior a las otras proteínas Bet v 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación de la influencia del
alérgeno rBet v 1 según la invención en el crecimiento de las
células T se realiza un ensayo de proliferación con líneas de
células T (TCL) y clones de células T (TCC) según Schramm y col.
(1999, J. Immunol. 162 (4): 2406-2414) (Fig. 4). A
partir de la comparación del índice de estimulación (SI) se deduce
que las células T de los donantes estudiados con rBet v 1 reaccionan
al menos tan intensamente como con nBet v 1 natural o rBet v 1
recombinante purificado de forma convencional. Dependiendo de las
condiciones seleccionadas, la reacción con rBet v 1 supera incluso
en un tercio la reacción con nBet v 1 o rBet v 1.
Claims (15)
1. Procedimiento para la preparación de
alergenos principales del polen de abedul rBet v 1 hipoalergénicos
mediante una o varias etapas de purificación cromatográfica con el
uso como eluyentes de bases acuosas esencialmente no tamponadas y a
continuación neutralización, caracterizado por que se emplea
como producto de partida una proteína cruda rBet v 1 soluble
preparada con métodos recombinantes.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por que la proteína cruda rBet v 1 soluble
preparada con métodos recombinantes se expresa en E.
coli.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2,
caracterizado por que las etapas de purificación
cromatográfica comprenden cromatografía de intercambio aniónico,
cromatografía de interacción hidrofóbica y filtración en gel.
4. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que las etapas de
purificación cromatográfica se realizan en el orden siguiente:
primera filtración en gel, cromatografía de intercambio aniónico,
cromatografía de interacción hidrofóbica, segunda filtración en
gel.
5. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la base
utilizada como eluyente se emplea en un intervalo de concentración
de 5 mM a 100 mM, preferiblemente 5 mM a 40 mM.
6. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la base
utilizada como eluyente es NaOH.
7. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que al eluyente se
le añade una sal neutra inorgánica y dado el caso NaHCO_{3}.
8. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la sal neutra
inorgánica añadida al eluyente es NaCl.
9. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 6 a 8, caracterizado por que las
concentraciones de las sustancias NaOH, NaCl y NaHCO_{3}
contenidas en el eluyente se selecciona de manera que en la etapa
de neutralización incluida en la purificación se pueden ajustar las
concentraciones típicas de una solución fisiológica salina.
10. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que la proteína
cruda rBet v 1 se pre-purifica cromatográficamente
en una solución tamponada y/o mediante precipitación de sal.
11. Procedimiento para la reducción de la
actividad IgE del alérgeno principal del polen de abedul rBet v 1,
caracterizado por que un alérgeno principal del polen de
abedul rBet v 1 soluble preparado con métodos recombinantes se
somete a uno de los procedimientos descritos en las reivindicaciones
1 a 10.
12. Alérgeno principal del polen de abedul rBet
v 1 hipoalergénico, que se puede obtener según uno de los
procedimientos descritos en las reivindicaciones 1 a 10.
13. Alérgeno principal del polen de abedul rBet
v 1 hipoalergénico, según la reivindicación 12, como
medicamento.
14. Uso del alérgeno principal del polen de
abedul rBet v 1 hipoalergénico según la reivindicación 12 para la
preparación de un medicamento para la inmunoterapia específica de
alergias en cuya activación está implicado el alérgeno principal
del polen de abedul Bet v 1.
15. Preparación farmacéutica que contiene un
alérgeno principal del polen de abedul rBet v 1 hipoalergénico
según la reivindicación 12, así como dado el caso excipientes y/o
coadyuvantes.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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