ES2285703T3

ES2285703T3 - Formulaciones farmaceuticas de peptidos para el tratamiento de alergia a los acaros del polvo.

Info

Publication number: ES2285703T3
Application number: ES95916952T
Authority: ES
Inventors: Xian Chen; Sean Evans; Ze'ev Shaked; Henry M. Franzen; Mei-Chang Kuo
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1994-04-14
Filing date: 1995-04-12
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2015-04-12
Also published as: ATE359296T1; DK0755407T3; EP0755407A1; CA2187329A1; DE69535460T2; KR970702295A; DE69535460D1; PT755407E; KR100379161B1; EP0755407B1; NZ284637A; AU2286295A; AU717187B2; WO1995028424A1; JPH09512014A; CA2187329C

Abstract

Composición terapéutica que comprende al menos un péptido aislado seleccionado del grupo que consiste en: DPI-21.2(SEQ ID NO:27) y DFI-22.2 (SEQ ID NO:28), y al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-20.9 (SEQ ID NO:31), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33).

Description

Formulaciones farmacéuticas de péptidos para el tratamiento de alergia a los ácaros del polvo.

Antecedentes de la invención

Aproximadamente 500 millones de personas en todo el mundo son alérgicas a los ácaros del polvo y se cree que la alergia a los ácaros del polvo puede ser un factor en del 50% al 80% de los pacientes con asma así como numerosos casos de eccema, rinitis polínica y otros síntomas alérgicos. Los ácaros del polvo están omnipresentes en los hogares, y se desarrollan en camas, cortinas y alfombras. Es extremadamente difícil eliminarlos del ámbito de vida y un individuo alérgico está constantemente expuesto al alérgeno y tal exposición constante puede producir el empeoramiento del estado alérgico con el tiempo. Por tanto, la alergia a los ácaros del polvo puede ser crónica y difícil de tratar.

La alergia a los ácaros del género Dermatophagoides se ha asociado a varios estados alérgicos tales como asma, rinitis y dermatitis ectópica. Predominan dos especies, D. pteronyssinus y D. farinae y como resultado, se ha dedicado un esfuerzo considerable para tratar de identificar los alérgenos producidos por estas dos especies. Los investigadores han documentado la importancia de las respuestas frente a los alérgenos proteicos del grupo I (por ejemplo Der p I, y Der f I) y grupo II (por ejemplo Der p II y Der f II). Por ejemplo, se ha documentado que más del 60% de los pacientes tiene al menos el 50% de sus anticuerpos anti-ácaros dirigidos frente a estas proteínas (por ejemplo, Lind, P. et al., Allergy, 39:259-274 (1984); van der Zee, J.S. et al., Journal Allergy and Clinical Immunology, 81:884-896 (1988)). Es posible que los niños muestren un mayor grado de reactividad frente a los alérgenos del grupo I y grupo II (Thompson, P.J., et al., Immunology, 64:301-314 (1988)).

Se ha realizado un esfuerzo concertado para caracterizar mediante clonación génica los principales alérgenos tanto de D. pteronyssinus como de D. farinae. Por consiguiente, varias publicaciones han notificado las secuencias de nucleótidos completas de varios alérgenos incluyendo Der p I (Thomas, W.R., et al., International Archives of Allergy and Applied Immunology. 85:127-129 (1988); y Chua, K.Y., et al., Journal of Experimental Medicine, 167:175-182 (1988)), Der p II (Chua, K.Y., et al., International Archives of Allergy and Applied Immunology, 91:118-123 (1990)), Der f I (Dilworth, R.J., et al., Clinical and Experimental Allergy, 21:25-32 (1891)), Der f II (Yuuki, T., et al., Japan Journal Allergol., 39:557-461 (1990); y Trudinger, M., et al., Clinical and Experimental Allergy, 21:33-37 (1991)) y un alérgeno de bajo peso molecular (Ovey, E.R., et al., Journal of Experimental Medicine, 170:1457-1462
(1989)).

Las secuencias de nucleótidos publicadas de ADNc que codifican para Der p I y Der f I demuestran que estas dos proteínas son sumamente homólogas al nivel de aminoácido (identidad del 81%) y que los productos de proteína maduros están compuestos de 222 y 223 residuos, respectivamente (Chua, K.Y., et al., Journal of Experimental Medicine, 167:175-182 (1988); y Dilworth, R.J., et al., citado anteriormente)). Los alérgenos proteicos de Der p II y Der f II están ambos compuestos de 129 residuos, y también son sumamente homólogos (identidad del 88%) en la secuencia de aminoácidos (Trudinger, M., et al. citado anteriormente; Yuuki, T., et al. citado anteriormente); Chua, K.Y., et al, International Archives of Allergy and Applied Immunology, 91:118-123 (1990)).

El aislamiento de clones de ADNc que codifican para Der p I y Der p II ha permitido estudios de unión a anticuerpo en los antígenos recombinantes (Green, W.K., et al., International Archives of Allergy and Applied Immunology. 92:30-38 (1990); Chua, K.Y., et al., International Archives of Allergy and Applied Immunology, 91:124-129 (1990)). Se han expresado fragmentos de ADN complementario de Der p I en E. coli y estudios de unión a IgE con sueros de IgE de alergia a los ácaros humanos agrupados han demostrado regiones de unión y de no unión en toda la molécula (Thomas, W.R., et al., en: Epitopes of Atopic Allergens. Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berlín, septiembre de 1989. páginas 77-82). Se han notificado epítopos de células T de Der p I (O'Hehir, R.E., et al., Annual Review Immunology, 9:67-95 (1991); Stewart, G.A., et al., en: Epitopes of Atopic Allergens. Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology. Berlín, septiembre de 1989. Páginas 41-47; Yessel, H., et al., en: T cell Activation in Health and Disease: Discrimination Between Immunity and Tolerance, conferencia del 22-26 septiembre, 1990, Trinity College, Oxford, R.U. y Hessel, H., et al., Journal of Immunology, 148(3): 738-745 (1 de febrero de
1992).

Actualmente, se usan tratamientos de desensibilización para el tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo doméstico. Tal tratamiento incluye la administración de un extracto derivado de cultivos de ácaros del polvo doméstico completos a un individuo alérgico. El tratamiento de desensibilización usando tal extracto tiene inconvenientes ya que puede provocar anafilaxia si se usan dosis altas, mientras que cuando se usan dosis bajas para evitar la anafilaxia, el tratamiento no es muy eficaz y debe continuarse durante varios años para crear tolerancia frente al
extracto.

Los documentos WO93/08279 y WO94/24281 describen métodos y composiciones mejorados para el tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo doméstico que minimiza enormemente los posibles efectos adversos asociados al tratamiento de desensibilización convencional usando extracto de ácaro del polvo doméstico completo. Los documentos WO93/08279 y WO94/24281 describen fragmentos antigénicos aislados o derivados de péptidos de Der p I, Der p II, Der f I y Der f II que cuando se administran a un individuo sensible a los ácaros del polvo, pueden regular por disminución la respuesta alérgica del individuo frente a los ácaros del polvo doméstico. Tal regulación por disminución de la respuesta alérgica del individuo da como resultado la disminución o el alivio de los síntomas clásicos de alergia incluyendo síntomas asmáticos inducidos por ácaros del polvo doméstico. Tales fragmentos antigénicos se describen en los documentos WO93/08279 y WO94/24281 como que pueden provocar una respuesta de las células T tal como la estimulación (es decir proliferación de células T o secreción de linfocina) y/o pueden inducir la ausencia de respuesta de las células T o la respuesta reducida de las células T cuando se enfrentan a un alérgeno de ácaro del polvo doméstico. Además, los documentos WO93/08279 y WO94/24281 describen que los péptidos más preferidos derivados de alérgenos proteicos de Der p y Der f del grupo I y grupo II adecuados para su uso terapéutico no se unen a IgE específica para tales proteínas de Der p y Der f, o se unen aIgE en un grado sustancialmente menor que el alérgeno proteico de ácaro del polvo nativo, reduciendo o eliminando así la posibilidad de anafilaxia en un régimen de tratamiento que incluye tales péptidos. Además, los documentos WO93/08279 y WO94/24281 describen que la reactividad cruzada entre los alérgenos de distintas especies del grupo I (es decir, Der p I y Der f I) y los alérgenos de distintas especies del grupo II (es decir, Der p II y Der f II), péptidos del grupo I, por ejemplo, derivados de una especie (por ejemplo, Der p I) pueden provocar una respuesta de las células T a partir de células T específicas para otra especie (por ejemplo, Der f I) y viceversa. Por último, los documentos WO93/08279 y WO94/24281 describen péptidos que presentan las características descritas anteriormente.

Como resultado de amplios esfuerzos de formulación previa, la presente invención proporciona composiciones novedosas y formulaciones de múltiples péptidos de péptidos derivados de los alérgenos proteicos de Der p y Der f del grupo I y grupo II que son óptimos para la preparación de un producto farmacéutico adecuado para su uso en el tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo doméstico en humanos y otros mamíferos. No se han descrito o contemplado anteriormente formulaciones de múltiples péptidos y composiciones novedosas de este tipo de péptidos de alérgenos proteicos de Der p y Der f para su uso como un producto farmacéutico humano
optimizado

Sumario de la invención

La presente invención proporciona composiciones terapéuticas y formulaciones de múltiples péptidos novedosas de péptidos y péptidos modificados de alérgenos proteicos derivados de Der p y Der f del grupo I y grupo II. Tales formulaciones de múltiples péptidos y composiciones terapéuticas novedosas son el resultado de un esquema de formulación previa para desarrollar un producto farmacéutico optimizado para el tratamiento terapéutico de seres humanos que padecen alergia a alérgenos de los ácaros del polvo doméstico. Los péptidos y péptidos modificados de Der p y Der f según la invención presentan determinadas características únicas que los vuelven particularmente adecuados para formulación de productos farmacéuticos. Las composiciones terapéuticas y formulaciones de múltiples péptidos de la invención se han optimizado para acomodar y mantener las características únicas de los péptidos y péptidos modificados derivados de los alérgenos proteicos de los ácaros del polvo doméstico y al mismo tiempo para proporcionar un efecto terapéutico máximo cuando se usan en regímenes terapéuticos para el tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo doméstico en seres humanos. La invención proporciona adicionalmente péptidos modificados novedosos derivados de alérgenos proteicos de Der p I y Der p II.

Por consiguiente, la invención proporciona una composición terapéutica que comprende al menos un péptido aislado seleccionado del grupo que consiste en: DPI-21.2 (SEQ ID NO:27) y DFI-22.2 (SEQ ID NO:28), y al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-20.9 (SEQ ID NO:31), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33) todos tal como se muestran en la figura 1. La composición es preferiblemente para su uso en tratamientos.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición terapéutica que comprende: a) péptidos DFI-22.2 (SEQ ID NO:28); DPI 23.1 (SEQ ID NO:29) y DPII-22.14 (SEQ ID NO:32); b) péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO:27), DPI-26.6(SEQ ID NO:30) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33); c) péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO:27), DFI-22.22 (SEQ ID NO:28), DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33); o d) péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO:27), DFI-22.22 (SEQ ID NO:28), DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-20.9 (SEQ ID NO:31), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.1 5 (SEQ ID NO:33). La composición es preferiblemente para su uso en tratamientos.

En otro aspecto, la invención proporciona una formulación de múltiples péptidos para administración farmacéutica que comprende: a) al menos un péptido aislado seleccionado del grupo que consiste en DPI-21.2 (SEQ ID NO:27) y DFI-22.2(SEQ ID NO:28), y al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6(SEQ ID NO:30), DPII-20.9 (SEQ ID NO:31), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33), siendo cada péptido soluble y estable a un pH en el intervalo de pH 6,0 a pH 8,0 y en la que dicha formulación comprende un porcentaje suficiente de actividad de células T de alérgenos de los ácaros del polvo de Der f y Der p del grupo I y grupo II; b) un vehículo farmacéuticamente aceptable; y opcionalmente c) uno o más de EDTA y un contraión farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente la formulación comprende al menos un 37% de actividad de células T de alérgenos de ácaros del polvo doméstico de Der f y Der p del grupo I y grupo
II.

En otro aspecto, la invención proporciona una formulación de múltiples péptidos optimizada adecuada para el tratamiento terapéutico de seres humanos que padecen alergia a los ácaros del polvo doméstico que comprende:

a) péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO:27); DFI-22.22 (SEQ ID NO:28), DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33); y opcionalmente DPII-20.9; estando cada péptido en una concentración de 0,75 mg por péptido; fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.; manitol al 5% p/v U.S.P.; EDTA de disodio dihidratado 0,1 mg/ml U.S.P.; y agua estéril para inyección U.S.P.; en la que dicha formulación tiene un pH final de 7,2-7,4; o b) péptidos DFI-22.2 (SEQ ID NO:28); DPI-23.1 (SEQ ID NO:29) y DPII-22.14 (SEQ ID NO:32); estando cada péptido en una concentración de 0,75 mg por péptido; fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.; manitol al 5% p/v U.S.P.; EDTA de disodio dihidratado 0,1 mg/ml U.S.P.; y agua estéril para inyección U.S.P.; en la que dicha formulación tiene un pH final de 7,0; o c) péptidos DP1-21.2 (SEQ ID NO:27), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33); estando cada péptido en una concentración de 0,75 mg por péptido; fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.; manitol al 5% p/v U.S.P.; EDTA de disodio dihidratado 0,1 mg/ml U.S.P.; y agua estéril para inyección U.S.P.; en la que dicha formulación tiene un pH final de 6,2. Preferiblemente, la formulación es para su uso en
tratamientos.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones de múltiples péptidos optimizadas primera y segunda para uso simultáneo o secuencial en tratamientos, en la que dicha primera formulación comprende los péptidos DFI-22.2 (SEQ ID NO:28); DPI-23.1 (SEQ ID NO:29) y DPII-22.14 (SEQ ID NO:32); estando cada péptido en una concentración de 0,75 mg por péptido; fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.; manitol al 5% p/v U.S.P.; EDTA de disodio dihidratado 0,1 mg/ml U.S.P.; y agua inyectable para inyección U.S.P.; teniendo un pH final de 7,0; y en la que dicha segunda formulación de múltiples péptidos optimizada comprende los péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33); estando cada péptido en una concentración de 0,75 mg por péptido; fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.; manitol al 5% p/v U.S.P.; EDTA de disodio dihidratado 0,1 mg/ml U.S.P.; y agua estéril para inyección U.S.P.; teniendo un pH final de 6,2. Preferiblemente la formulación es para su uso en el tratamiento de sensibilidad a los alérgenos de los ácaros del polvo doméstico.

Descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de los péptidos "únicos" según la invención incluyendo los péptidos "únicos" novedosos de la invención.

La figura 2 muestra péptidos solapantes derivados de alérgenos proteicos de Der p I y Der p II usados en estudios de células T descritos en el presente documento.

La figura 3 es una representación gráfica que muestra las respuestas de células T frente a los péptidos de Der p I solapantes - péptidos mostrados en la figura 2 y los péptidos "únicos" del grupo I, DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), mostrados en la figura 1. El I.E. medio mostrado encima de cada barra (entre paréntesis) así como el porcentaje de respuestas, el índice de positividad (I.E. medio multiplicado por el porcentaje de respuestas), es el eje Y.

La figura 4 es una representación gráfica que muestra las respuestas de células T frente a los péptidos de Der p II solapantes, DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO: 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33), mostrados en la figura 2 y los péptidos "únicos" de Der p II mostrados en la figura 2. El I.E. medio mostrado encima de cada barra (entre paréntesis) así como el porcentaje de respuestas, el índice de positividad (I.E. medio multiplicado por el porcentaje de respuestas), es el eje Y.

La figura 5 es un perfil de pH-solubilidad de péptidos candidatos "únicos" DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO.28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33), en tampones de fosfato de sodio 50 mM con manitol al 5%. La solubilidad se mide en mg/ml (eje y) en un intervalo de pH 5,5 a pH 8,5 a aproximadamente 22ºC\pm2.

La figura 6 es un perfil de pH-estabilidad de péptidos candidatos DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) en una combinación de concentración idéntica. La degradación del péptido se calcula como % de degradación (determinado por área de pico usando análisis de HPLC) del péptido observada tras 24 horas a aproximadamente 22ºC\pm2 y aproximadamente 5ºC, a diversas concentraciones teóricas de 3,0, 2,0 y 1,0 mg/ml de péptido en un intervalo de pH de 6,0 a 8,5.

Descripción detallada de la invención

La bibliografía científica y de patentes mencionada en el presente documento establece el conocimiento que está disponible para los expertos en la técnica.

La presente invención se refiere a péptidos de Der p I y Der p II modificados novedosos que están en combinación con otros péptidos de Der p I y Der f I que son una parte de un esquema de formulación previa para desarrollar un producto farmacéutico optimizado para el tratamiento terapéutico de seres humanos que padecen alergia a alérgenos de los ácaros del polvo doméstico. Tales péptidos y péptidos modificados presentan determinadas características únicas que los vuelven particularmente adecuados para la formulación de productos farmacéuticos, y pueden denominarse en el presente documento como péptidos "únicos".

Según la química farmacéutica, la formulación previa es el proceso de optimizar un fármaco a través de la determinación y/o definición de las propiedades físicas y químicas consideradas importantes en la formulación de una forma farmacéutica estable, eficaz y segura. También se consideran las posibles interacciones con los diversos componentes que pretenden usarse en el producto farmacéutico final. La formulación previa es un esfuerzo intenso que incluye el estudio de parámetros tales como solubilidad, perfil de estabilidad de pH e interacciones fármaco - excipiente, que pueden tener un efecto profundo sobre la disponibilidad fisiológica y estabilidad física y química de un fármaco. Los datos obtenidos de tales estudios se integran con los obtenidos de estudios farmacológicos y bioquímicos preliminares del principio activo del fármaco proporcionando de esta manera información que permite la selección de la mejor forma farmacéutica y los excipientes más deseables para usarse en su
desarrollo.

El desarrollo de una formulación óptima de excipientes y principio activo del fármaco es complejo y muchos factores influyen en las propiedades de la formulación. El elevado grado de uniformidad, la disponibilidad fisiológica y la calidad terapéutica esperada de los productos farmacéuticos sólo puede lograse mediante un esfuerzo y experiencia considerables. La flexibilidad también es un factor importante en la formulación previa. Numerosos excipientes, contraiones estabilizadores y similares pueden tener que someterse a prueba con el fin de encontrar los que son compatibles con el principio activo del fármaco de la formulación. Pueden llegar a ser necesarias múltiples modificaciones del principio activo para formular satisfactoriamente un producto farmacéutico. Tales modificaciones no deben afectar la eficacia terapéutica global del fármaco, pero al mismo tiempo deben convertir al fármaco más adecuado para la formulación.

Como una parte de un esquema de formulación previa para proporcionar un producto farmacéutico optimizado adecuado para su uso en seres humanos y otros mamíferos para tratar la sensibilidad a los ácaros del polvo doméstico, se determinó que el principio activo (denominado en el presente documento como un "péptido" o "péptido candidato" o "péptido único") en tal formulación debe tener las siguientes características que convertirían tales péptidos en "únicos" entre todos los posibles péptidos derivados de las secuencias de alérgenos proteicos de Der p I, Der p II y Der f I. En primer lugar, un péptido único debe comprender solo o en combinación con otros péptidos únicos un porcentaje suficiente de reactividad de células T de los alérgenos proteicos de Der p y Der f para inducir la ausencia de respuesta de las células T o la respuesta reducida de las células T en un porcentaje sustancial de los individuos sensibles a los alérgenos de los ácaros del polvo doméstico. En segundo lugar, el péptido candidato debe tener la característica de "solubilidad superior" que se define en el presente documento como una solubilidad superior a 3 mg/ml a un pH en un intervalo de pH de pH 6 a pH 8 en un tampón acuoso. En tercer lugar, el péptido es estable en un tampón acuoso a un pH en un intervalo de pH desde pH 6 hasta pH 8. Los péptidos candidatos derivados de alérgenos proteicos de Der p y Der f que se han determinado que son péptidos "únicos" de uso en la invención son DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) todos tal como se muestran en la
figura 1.

Según la primera característica, se entiende que los péptidos que se ha encontrado que provocan una respuesta de células T tal como proliferación de células T o secreción de linfocina (es decir comprenden al menos un epítopo de células T), o inducen la ausencia de respuesta de las células T o la respuesta reducida de las células T tienen reactividad frente a células T. Se cree que los epítopos de células T están implicados en la iniciación y perpetuación de la respuesta inmunitaria frente a un alérgeno proteico que es responsable de los síntomas clínicos de la alergia. Se piensa que estos epítopos de células T provocan acontecimientos tempranos a nivel de célula T cooperadora uniéndose a una molécula de HLA apropiada sobre la superficie de una célula que presenta antígenos y estimulando la subpoblación de células T relevante. Estos acontecimientos dan lugar a la proliferación de células T, secreción de linfocina, reacciones inflamatorias locales, reclutamiento de células inmunitarias adicionales en el sitio y activación de cascada de células B que conduce a la producción de anticuerpos. Un isotipo de estos anticuerpos, IgE, es importante fundamentalmente para el desarrollo de síntomas alérgicos y su producción está influenciada de manera temprana en la cascada de acontecimientos a nivel de la célula T cooperadora, por la naturaleza de las linfocinas segregadas. Un epítopo de células T es el elemento básico o la unidad más pequeña de reconocimiento por un receptor de células T, cuando el epítopo comprende aminoácidos esenciales para el reconocimiento del receptor. Se cree que la exposición de pacientes alérgicos a los ácaros del polvo doméstico a péptidos de alérgenos proteicos del grupo I y grupo II de ácaros del polvo doméstico aislados que comprenden al menos un epítopo de células T puede producir la ausencia de respuesta de las células T de subpoblaciones de células T apropiadas de manera que se vuelvan insensibles o tengan una respuesta reducida al alérgeno proteico y no participen en la estimulación de una respuesta inmunitaria tras tal exposición por ejemplo, a través de anergia, tolerancia o apoptosis, la capacidad para modificar el perfil de secreción de linfocina comparado con la exposición al antígeno que se produce de manera natural; y/o la capacidad de producir la inducción de células T supresoras.

Para determinar los péptidos que tienen reactividad de células T y que comprenden al menos un epítopo de células T, se someten a prueba péptidos aislados mediante, por ejemplo, técnicas biológicas de células T, para determinar si los péptidos provocan o no una respuesta de las células T o inducen la ausencia de respuesta de las células T. Tal como se discute en los ejemplos, la actividad estimulante de células T humanas puede someterse a prueba cultivando células T obtenidas de un individuo sensible a los alérgenos de los ácaros del polvo, (es decir, un individuo que tiene una respuesta inmunitaria mediada por IgE frente a los alérgenos de los ácaros del polvo doméstico) con un péptido o péptido modificado derivado de un alérgeno proteico de Der p o Der f del grupo I o grupo II y determinando si la proliferación de células T se produce en respuesta al péptido tal como se mide, por ejemplo, mediante la captación celular de timidina valorada. Los índices de estimulación para respuestas mediante células T de péptidos pueden calcularse como las máximas cuentas por minuto (CPM) en respuesta al péptido dividido por las CPM control. Un índice de estimulación (I.E.) igual a o superior a dos veces el nivel de fondo se considera "positivo". Los resultados positivos se usan para calcular el índice de estimulación media para cada péptido para el grupo de pacientes sometidos a prueba. Los péptidos adecuados como candidatos para la formulación en un producto farmacéutico final tienen un índice de estimulación de células T medio superior a o igual a 2,0 y preferiblemente mayor, (por ejemplo al menos 2,5, más preferiblemente al menos 3,5, más preferiblemente al menos 4,0, más preferiblemente al menos 5, incluso más preferiblemente al menos 7 y lo más preferiblemente al menos aproximadamente
9).

Con fines terapéuticos, los péptidos candidatos se reconocen por al menos el 10%, más preferiblemente al menos el 20%, más preferiblemente al menos el 30% e incluso más preferiblemente al menos el 40% o más de individuos en una población de individuos sensibles a los alérgenos de los ácaros del polvo doméstico. Además, los péptidos candidatos preferidos tienen un índice de positividad (I.P.) de al menos aproximadamente 100, más preferiblemente al menos aproximadamente 250 y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 350. El índice de positividad para un péptido se determina multiplicando el índice de estimulación de células T medio por el porcentaje de individuos, en una población de individuos sensibles a los alérgeno de los ácaros del polvo doméstico (por ejemplo, preferiblemente al menos 15 individuos, más preferiblemente al menos 30 individuos o más), que tienen un índice de estimulación de células T de tal péptido de al menos 2,0. Por tanto, el índice de positividad representa tanto la fuerza de una respuesta de las células T frente a péptido (I.E.) como la frecuencia de una respuesta de las células T frente a un péptido en una población de individuos sensibles a los alérgenos de los ácaros del polvo
doméstico.

Para determinar si es probable que un péptido (péptido candidato) o una combinación de péptidos candidatos comprendan un porcentaje suficiente de reactividad de células T de alérgenos proteicos de ácaros del polvo doméstico, para inducir la ausencia de respuesta de las células T en un porcentaje sustancial de una población de individuos sensibles a los alérgeno de los ácaros del polvo doméstico, puede usarse un algoritmo. Según un algoritmo de este tipo, se produce un conjunto de péptidos solapantes dividiendo sistemáticamente el/los alérgeno(s) proteico(s) de interés en al menos dos regiones peptídicas solapantes de longitudes deseadas (por ejemplo, de aproximadamente 12-30 residuos de aminoácidos de longitud, preferiblemente no más largas de aproximadamente 25 residuos de aminoácidos de longitud con aproximadamente 5-15 residuos de aminoácidos de solapamiento). Esta división en regiones peptídicas puede ser arbitraria, puede realizarse según un algoritmo, o puede basarse total o parcialmente en regiones de alérgenos proteicos del grupo I y/o grupo II de ácaros del polvo doméstico de los que se sabe que comprenden al menos un epítopo de células T. Preferiblemente, al menos el 50% de la secuencia completa de alérgeno proteico de ácaros del polvo doméstico y más preferiblemente, la secuencia completa de alérgeno proteico de ácaros del polvo doméstico se divide en dos o más péptidos. Se determina un índice de estimulación de células T humanas para cada uno de los péptidos en un ensayo de proliferación de células T in vitro tal como se describe en el presente documento para cada individuo sometido a prueba en una población de individuos sensibles a antígenos proteicos. Por ejemplo ambos documentos WO93/08279 y WO94/24281 describen estudios de células T con péptidos solapantes derivados de Der p I, Der p II, Der f I y Der f II. Se selecciona un péptido candidato o una combinación de péptidos candidatos basándose, al menos en parte, en el índice medio de estimulación de células T humanas del péptido candidato en el conjunto de péptidos sometidos a prueba y el índice de positividad del péptido candidato en el conjunto de péptidos sometidos a prueba (véanse las figuras 3 y 4). Se suma el índice de estimulación de células T humanas para el/los péptido(s) candidato(s). Para cada individuo, el índice de estimulación de células T humanas del/de los péptido(s) candidato(s)
se divide por la suma de índices de estimulación de células T humanas de los péptidos restantes en el conjunto de péptidos sometidos a prueba para determinar un porcentaje de reactividad de células T tal como se muestra a
continuación:

(1)\text{% reactividad de células T de un(os) péptido(s) candidato(s)}: \frac{I.E.\ del\ candidato}{suma\ de\ I.E.\ del\ conjunto}\ x\ 100

Alternativamente, la presencia de epítopos de células T en el péptido candidato dependiente de residuos de aminoácidos en un péptido solapante ubicado en cualquiera de los extremos N-terminal o C-terminal del péptido candidato en la secuencia de aminoácidos del antígeno proteico, pero cuyos epítopos no están presentes en el péptido candidato pueden considerarse para calcular el porcentaje de reactividad de células T en el péptido candidato usando la siguiente fórmula:

% reactividad de las células T de un(os) péptido(s) candidato(s):

(2)\frac{\text{I.E. del péptido flanqueante}\ N_{T} + \text{I.E. del péptido candidato + I.E. del péptido flanqueante}\ C_{T}}{\text{suma de I.E. del conjunto de péptidos que solapan}}

En esta fórmula, "péptido flanqueante N_{T}" se refiere a un péptido que comprende residuos de aminoácidos solapantes con residuos de aminoácidos ubicados en el extremo N-terminal del péptido candidato en la secuencia de aminoácidos del antígeno proteico a partir de la que se deriva el péptido; "péptido flanqueante C_{T}" se refiere a un péptido que comprende residuos de aminoácidos solapantes con los residuos de aminoácidos ubicados en el extremo C-terminal del péptido candidato en la secuencia de aminoácidos el antígeno proteico a partir de la que se deriva el péptido. En este cálculo, los índices de estimulación para el péptido candidato, el péptido flanqueante de extremo N-terminal y el péptido flanqueante de extremo C-terminal se suman y se dividen por la suma total de los índices de estimulación para el conjunto completo de péptidos solapantes obteniendo un porcentaje de reactividad de células T para el péptido candidato. Si se selecciona una combinación de dos o más péptidos candidatos cada uno de los cuales contiene residuos de aminoácidos solapantes, este cálculo no puede usarse para determinar un porcentaje de reactividad de células T para cada péptido candidato por separado. Sin embargo, puede obtenerse un porcentaje total de reactividad de células T para la combinación de péptidos candidatos. En esta situación, los índices de estimulación para todos los péptidos candidatos solapantes están incluidos en el
cálculo.

Los valores obtenidos para el porcentaje de reactividad de células T para el péptido o combinación de péptidos en cada individuo sometido a prueba puede expresarse como un intervalo de los valores inferior y superior de los resultados de los cálculos descritos anteriormente. Mediante cualquiera de los cálculos anteriores, el porcentaje se obtiene para al menos aproximadamente veinte (20) y preferiblemente al menos aproximadamente treinta (30) individuos sensibles al antígeno proteico y se determina un porcentaje medio. Para usarse en las composiciones de la invención, el péptido candidato o combinación de péptidos candidatos tiene los siguientes criterios: (1) el péptido candidato o combinación de péptidos candidatos tiene un porcentaje medio de al menos aproximadamente el 10%, preferiblemente al menos aproximadamente el 20%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 30%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 40% y más preferiblemente al menos aproximadamente el 50-60% o superior; y (2) en la población de individuos sometidos a prueba al menos aproximadamente el 60%, preferiblemente al menos aproximadamente el 75% y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90-100% tienen respuestas frente a células T positivas (I.E. igual a superior a 2,0) en respuesta frente al péptido candidato o combinación de péptidos candidatos. Un péptido candidato o combinación de péptidos candidatos que reúnen los criterios anteriores es probable que comprenda un porcentaje suficiente de la reactividad de células T frente a alérgenos proteicos de ácaros del polvo doméstico para la ausencia de respuesta de las células T o la respuesta reducida de las células T en un porcentaje sustancial de población de individuos sensibles a los ácaros del polvo
doméstico.

Como una realización ilustrativa del algoritmo descrito anteriormente, se produjo un conjunto de péptidos y péptidos candidatos solapantes derivados de Der p I y Der p II respectivamente y se sometió a prueba. En segundo lugar, los cultivos de células T que se había determinado que eran reactivos con alérgenos proteicos de Der p I se derivaron a partir de 39 sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico y se analizaron para determinar la reactividad frente a un conjunto solapante de péptidos, así como péptidos candidatos derivados de alérgenos proteicos de Der p I y Der f I, DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29) y DPI-26.6 (SEQ. ID. NO.30), en un ensayo de proliferación de células T in vitro tal como se describe en el presente documento. Los resultados se muestran en la figura 3. Se registró el mayor índice de estimulación mayor que o igual a 2,0 en respuesta frente a cada péptido para cada sujeto sometido a prueba. Luego se analizaron los datos mediante las ecuaciones anteriores. Los resultados y cálculos del porcentaje de reactividad de células T para un único sujeto alérgico a los ácaros del polvo doméstico se muestran a continuación usando las fórmulas (1) y
(2).

\vskip1.000000\baselineskip

Reactividad de células T para el paciente 1733 índice de estimulación peptídica

DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27)	3,6
DPI-3 (SEQ. ID. NO. 3)	3,9
DPI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28)	3,1
DPI-12.1 (SEQ. ID. NO. 6)	2,2
DPI-5.1 (SEQ. ID. NO. 7)	3,5
DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29)	5,7
DPI-14 (SEQ. ID. NO. 9)	2,3
DPI-15 (SEQ. ID. NO. 10)	2,8
DPI-6.1 (SEQ. ID. NO. 11)	2,1
DPI-7.1 (SEQ. ID. NO. 12)	2,2
DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30)	5,0
DPI-9 (SEQ. ID. NO. 14)	2,4
DPI-16 (SEQ. ID. NO. 15)	2,0
DPI-10 (SEQ. ID. NO. 16)	0,0
DPI-17 (SEQ. ID. NO. 17)	0,0
Suma de índices de estimulación	40,8	(Denominador)

\newpage

El % de reactividad del péptido DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30) par el paciente 1733 es

(1)\frac{DPI - 26.6(I.E.)}{40.8} = \frac{5.0}{40.8} \times 100 = 12.3%

(2)\frac{DPI - 7.1 + DPI - 26.6 + DPI - 9}{40.8} = \frac{2.2 + 5.0 + 2.4}{40.8} \times 100 = 24%

Por tanto, el intervalo estimado de reactividad de células T para el péptido DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30) para este paciente es del 12,3%-24% de la reactividad total de la proteína de Der p I. El cálculo anterior se repite para cualquier posible péptido candidato para cada paciente sometido a prueba. En la población de 39 sujetos alérgicos a Cry j I sometidos a prueba se obtuvieron los siguientes resultados:

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Péptidos candidatos	Intervalo de porcentaje medio	Frecuencia de respuesta de al
	de reactividad de células T	menos un péptido
DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27)
DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28)
DPI-23.31 (SEQ: ID. NO. 29)
DPI-26.6 (SEQ. ID NO. 30)	38-67%	82%

\vskip1.000000\baselineskip

Por tanto, la combinación de los cuatro péptidos candidatos está bastante dentro del intervalo deseado por tener, en combinación, suficiente reactividad de células T del alérgeno proteico del grupo I de Der f y Der p, y satisfacer la primera característica de un péptido "único" de la invención.

Se determinó el mismo cálculo para el alérgeno proteico de Der p del grupo II. En segundo lugar los cultivos de células T que se había determinado que eran reactivos con el alérgeno proteico de Der p I se derivaron de 30 sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico y se analizaron para detectar la reactividad frente a un conjunto solapante de péptidos, así como péptidos candidatos derivados de Der p II, DPII-20.9 (SEQ. ID. NO: 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33), en un ensayo de proliferación de células T in vitro tal como se describe en el presente documento. Los resultados se muestran en la figura 4. Se registró el mayor índice de estimulación superior a o igual a 2,0 en respuesta frente a cada péptido para cada sujeto sometido a prueba. Luego se analizaron los datos mediante las ecuaciones anteriores. En la población de 30 sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico sometidos a prueba se obtuvieron los siguientes resultados:

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Péptidos candidatos	Intervalo de porcentaje medio	Frecuencia de respuesta de al
	de reactividad de células T	menos un péptido
DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31),
DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32)
DPII-25.15 (SEQ: ID. NO. 33)	37-51%	63%

\vskip1.000000\baselineskip

Por tanto, la combinación de los tres péptidos candidatos de Der p II de la invención se encuentran bastante dentro del intervalo deseado por tener, en combinación, suficiente reactividad de células T de alérgeno proteico de los ácaros del polvo doméstico del grupo II de Der p, y satisfacer la primera característica de un péptido "único" de la
invención.

Para el tratamiento de la alergia según los métodos de la invención, se prefiere que el péptido usado junto con ello no se una a la inmunoglobulina E (IgE) o se una a la IgE en un grado sustancialmente inferior (es decir unión al menos 100 veces inferior y más preferiblemente, unión al menos 1.000 veces inferior) que el alérgeno proteico de ácaro de polvo doméstico respectivo a partir del que se deriva el péptido que se une a IgE. Las principales complicaciones de la inmunoterapia convencional son las respuestas mediadas por IgE tales como anafilaxia. La inmunoglobulina E es un mediador de las reacciones anafilácticas que son el resultado de la unión y reticulación del antígeno con IgE en mastocitos o basófilos y la liberación de mediadores (por ejemplo, histamina, serotonina, factores quimitácticos de eosinófilo) en pacientes alérgicos ("atópicos"). Por tanto, la anafilaxia en un porcentaje sustancial de la población de individuos sensibles al alérgeno que se está tratando podría evitarse mediante el uso en inmunoterapia un péptido o péptidos que no se unen a IgE en un porcentaje sustancial (por ejemplo, al menos aproximadamente el 75%) de una población de individuos sensibles a alérgenos de ácaros del polvo doméstico, o si el péptido se une a IgE, tal unión no da como resultado la liberación de mediadores desde mastocitos o basófilos. El riesgo de anafilaxia podría reducirse mediante el uso en inmunoterapia de un péptido o péptidos que han reducido su unión a IgE. Puede someterse a prueba la unión a IgE, por ejemplo mediante ELISA directo o ELISA de captura. Además, los péptidos que tienen una actividad estimulante de IgE mínima son deseables para la eficacia terapéutica. La actividad estimulante de IgE mínima se refiere a la producción de IgE que es inferior a la cantidad de producción de IgE y/o producción de IL-4 estimulada por el alérgeno proteico de los ácaros del polvo doméstico respectivo nativo. Si un péptido se une a IgE, es preferible que tal unión no de cómo resultado la liberación de mediadores (por ejemplo histaminas) a partir de mastocitos o basófilos. Para determinar si un péptido que se une a IgE produce la libración de mediadores, puede realizarse un ensayo de liberación de histamina usando protocolos y reactivos convencionales obtenidos por ejemplo, de Amac, Inc. (Westbrook, ME). En resumen, una solución tamponada de un péptido que va a someterse a prueba se combina con un volumen igual de sangre heparinizada completa de un sujeto alérgico. Tras el mezclado y la incubación, las células se sedimentan y se procesan los sobrenadantes y se analizan usando un radioinmunoanálisis para determinar la cantidad de histamina liberada. Los experimentos hasta la fecha indican que los péptidos candidatos DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28); DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) muestran liberación de histamina o reactividad negativa de IgE (datos no
mostrados).

La segunda característica para un péptido único es la de "solubilidad superior" que se definió previamente como solubilidad superior a 3 mg/ml a un pH en un intervalo de pH 6 a pH 8. La solubilidad en un intervalo de pH fisiológicamente aceptable (por ejemplo pH 6 a pH 8) es particularmente importante cuando se formula un agente terapéutico de múltiples péptidos para inyección. La administración de un producto farmacéutico soluble en un intervalo de pH fisiológicamente aceptable mediante inyección intravenosa o subcutánea proporciona aproximadamente el 100% de biodisponibilidad del principio activo con respecto al sistema fisiológico en el que se introduce el fármaco. Por tanto, es necesario que un producto farmacéutico destinado para la inyección sea líquido hasta el punto de que exista fácil inyectabilidad, y el principio activo sea soluble también si ha de lograrse un efecto terapéutico máximo. La solubilidad también es útil cuando se formulan composiciones que van a administrarse por otros modos de administración tales como mediante administración por oral (comprimido, aerosol, sublingual), o formulaciones y preparaciones de liberación sostenida.

Las proteínas y péptidos pueden ser difíciles de formular en composiciones solubles dado que un péptido puede no ser soluble en cualquier intervalo de pH deseado o puede ser soluble sólo en un pequeño intervalo de pH. Resulta particularmente difícil cuando se formulan múltiples péptidos juntos en una única formulación de múltiples péptidos, dado que cada péptido puede ser soluble en un intervalo de pH que no solapa con los de los otros péptidos en la formulación. Como resultado, el requisito de "solubilidad superior" es el que requiere la mayor flexibilidad de formulación ya que puede ser necesaria una modificación considerable de los péptidos candidatos objetivo para formular satisfactoriamente un producto farmacéutico de múltiples péptidos.

Algunos de los péptidos únicos de la invención son el producto de múltiples modificaciones de aminoácidos de la secuencia de péptidos candidatos objetivo original ("original") a partir de la que se derivaron originalmente los péptidos únicos modificados de la invención. Tales péptidos "únicos" modificados de uso en la invención incluyen DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30). DPII-20.9 (SEQ. ID. NO: 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) todos tal como se muestran en la figura 1. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de DpII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) se derivó de la secuencia proteica de Der p II identificando en primer lugar las regiones de la proteína nativa con elevada reactividad de células T usando un conjunto de péptidos solapantes que cubrían toda la secuencia proteica. Se encontró que varios péptidos elevada reactividad de células T, correspondiente a tres localizaciones/zonas en la proteína. Una de estas zonas se cubrió con tres péptidos adyacentes siendo cada uno de aproximadamente 25-29 aminoácidos de longitud y con 10-15 aminoácidos solapando, DpII-3.1 (SEQ. ID. NO. 20), DpII-4 (SEQ. ID. NO. 21) y DpII-5 (SEQ. ID. NO. 22) (figura 2) que todos mostraban elevada reactividad de células T. Basándose en este mapa de células T se sintetizó un nuevo péptido, con la secuencia de aminoácidos QLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEV (SEQ. ID. NO. 34), de 28 aminoácidos de longitud, que muestra la mayor parte de la reactividad encontrada en los péptidos individuales (datos no mostrados) y contiene todo el DpII-4 (SEQ. ID. NO. 21) y partes de DpII-3.1 (SEQ. ID. NO. 20) y DpII-5 (SEQ. ID. NO. 22). Sin embargo, este péptido no cumplió el requisito de "solubilidad superior" de 3 mg/ml para un péptido "único" de la invención ni cumplió el requisito de estabilidad. Por tanto se prepararon dos análogos con adición de uno o dos residuos cargados en cada uno de los extremos, DpII-22.2 KQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVK (SEQ. ID. NO. 35) y DpII-22.6 DKQLEAVPEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVD (SEQ. ID. NO. 36) y la estabilidad mejoró sustancialmente pero la solubilidad no alcanzó el criterio de una "solubilidad superior". En el segundo intento se añadieron a los extremos una serie de análogos truncados con hasta cinco residuos de aminoácidos argados
(Tabla I).

TABLA 1

1

De éstos, el DpII-22.5, DKQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDE (SEQ. ID. NO. 38), era prometedor dado que conservaba la reactividad de células T del péptido "original", DPII-22, (SEQ. ID. NO. 34) y era muy soluble, pero era muy difícil de sintetizar. Se encontró que las dificultades para sintetizar esta secuencia desaparecieron con la sustitución de la isoleucina hidrófoba por la alanina menos hidrófoba y simultáneamente la solubilidad aumentó en un orden de magnitud. Se encontró que el péptido DpII-22.14, DKELEAVFEANQNTKTAKAE (SEQ. ID. NO. 32), tenía casi la misma de reactividad de células T que el péptido "original" DpII-22 (SEQ. ID. NO. 34) así como que era soluble por encima de 3 mg/ml a un pH en el intervalo de pH de 6,0 a 8,0, y era fácil de sintetizar y purificar. Por tanto, se eligió DPB-22 (SEQ. ID. NO. 34) como un péptido "único" cuando se determinó que era estable en un intervalo de pH de 6,0 a 8,0. El desarrollo de otros péptidos "únicos" modificados, DpI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DpI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30) y DpII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33), siguió un proceso similar al descrito anteriormente para DpII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32). Los péptidos DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32), DpI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DpI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30) y DpII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33), todos tal como se muestran en la figura 1 son péptidos modificados novedosos de esta invención.

El tercer criterio que los péptidos únicos de esta invención deber cumplir es estabilidad, particularmente la estabilidad de la solución, en un intervalo de pH fisiológicamente aceptable de pH 6 a pH 8. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y en condiciones de reconstitución si es necesario. La prueba de la estabilidad establece el periodo de tiempo para el que la integridad, calidad y pureza del producto farmacéutico se conserva en su forma farmacéutica terminada. La prueba de estabilidad puede realizarse simultáneamente con estudios de solubilidad tal como se trata en el ejemplo 3. Una composición de igual concentración que comprende cada uno de los péptidos candidatos de la invención permaneció estable (por ejemplo sin degradación significativa) en solución a una "ventana" común en el intervalo de pH desde pH 6-pH 8 a aproximadamente temperatura ambiente y a aproximadamente 5ºC durante al menos 24 horas (véase la figura 6).

Por tanto, los péptidos candidatos DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) tienen cada una de las tres características "únicas" requeridas señaladas anteriormente, lo que indica que esta combinación de péptidos es adecuada para la formulación como un producto farmacéutico terapéutico optimizado para la administración a seres humanos para el tratamiento de la alergia a alérgenos de los ácaros del polvo doméstico.

Pueden producirse péptidos sumamente purificados de esta invención, de manera sintética mediante síntesis química usando técnicas habituales. En la técnica se conocen diversos métodos para sintetizar químicamente péptidos tales como síntesis en fase sólida que se ha automatizado total o parcialmente en sintetizadores de péptidos disponibles comercialmente. Los péptidos producidos de manera sintética pueden entonces purificarse hasta homogeneidad (es decir al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 97% de pureza), libre de todos los otros polipéptidos y contaminantes usando cualquier número de técnicas conocidas en la bibliografía para la purificación de proteínas.

Según un procedimiento para producir péptidos homogéneos sumamente purificados de la invención, un péptido producido por medios químicos sintéticos (o bien anclado a un soporte polimérico "síntesis en fase sólida" o bien mediante reacciones químicas homogéneas convencionales "síntesis en solución") puede purificarse mediante cromatografía preparativa en fase inversa. En este método, el péptido producido sintéticamente en la forma "bruta" se disuelve en un disolvente apropiado (normalmente un tampón acuoso) y se aplica a una columna de separación (normalmente un medio basado en sílice de fase inversa, además, puede usarse un medio basado en polímeros o carbono). Se eluye el péptido de la columna aumentando la concentración de un componente orgánico (normalmente acetonitrilo o metanol) en un tampón acuoso (normalmente TFA, fosfato de trietilamina, acetato o tampón similar). Se recogerán fracciones del eluato y se analizarán mediante métodos analíticos apropiados (normalmente HPLC en fase inversa o cromatografía ECZ (electroforesis capilar zonal). Se reunirán las fracciones que tienen la homogeneidad requerida. El contraión presente puede cambiarse mediante cromatografía en fase inversa adicional en la sal de elección o mediante resinas de intercambio iónico. Después puede aislarse el péptido como su acetato u otra sal apropiada. Después se filtra el péptido y se elimina el agua (normalmente mediante liofilización) para dar una composición peptídica homogénea que contiene al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 97% del componente peptídico requerido. Opcionalmente, o junto con la HPLC en fase inversa tal como se describió anteriormente, puede lograrse la purificación mediante cromatografía de afinidad, de intercambio iónico, exclusión molecular, sistemas de separación de fase normal o contracorriente, o cualquier combinación de estos métodos. El péptido puede concentrarse adicionalmente usando ultrafiltración, evaporación rotatoria, precipitación, diálisis u otras técnicas similares.

La composición peptídica homogénea sumamente purificada se caracteriza entonces mediante cualquiera de las siguientes técnicas o combinaciones de las mismas: a) espectroscopia de masas para determinar el peso molecular para comprobar la identidad del péptido; b) análisis de aminoácidos para comprobar la identidad del péptido a través de la composición de aminoácidos; c) secuenciación de aminoácidos (usando un secuenciador de proteínas automatizado o manualmente) para confirmar la secuencia definida de los residuos de aminoácidos; d) HPLC (sistemas múltiples si se desea) usada para comprobar la identidad peptídica y pureza (es decir identifica impurezas peptídicas); e) contenido en agua para determinar la concentración de agua de las composiciones peptídicas; f) contenido iónico para determinar la presencia de sales en la composición peptídica; y g) sustancias orgánicas residuales para comprobar la presencia de reactivos orgánicos, materiales de partida y/o contaminantes orgánicos residuales.

Un péptido de la invención también puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante en una célula huésped transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica para tal péptido. Cuando se producen mediante técnicas recombinantes, las células huésped transformadas con ácidos nucleicos que codifican para el péptido deseado, se cultivan en un medio adecuado para las células y los péptidos aislados pueden purificarse a partir del medio de cultivo celular, células huésped, o ambos usando técnicas conocidas en la técnica para purificar péptidos y proteínas incluyendo cromatografía de intercambio iónico, ultra filtración, electroforesis o inmunopurificación con anticuerpos específicos para el péptido deseado. Pueden aislarse péptidos producidos de manera recombinante y purificarse hasta homogeneidad, sin material celular, otros polipéptidos o medio de cultivo para su uso según los métodos descritos anteriormente para péptidos producidos de manera sintética.

En determinadas circunstancias limitadas, los péptidos de esta invención también pueden producirse mediante escisión química o enzimática de una proteína nativa o de longitud completa sumamente purificada de la que se han predeterminado los sitios de digestión química o escisión enzimática y el digesto resultante es reproducible. Los péptidos que tienen secuencias de aminoácidos definidas pueden purificarse mucho y aislarse libres de cualquiera de los otros polipéptidos o contaminantes presentes en el digesto químico o enzimático mediante cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para los péptidos sumamente purificados, y aislados de manera sintética o producidos de manera recombinante.

La presente invención también se refiere a composiciones terapéuticas y formulaciones terapéuticas de múltiples péptidos que comprenden los péptidos únicos de la invención. Las composiciones terapéuticas de la invención pueden comprender uno o más de los péptidos únicos de la invención que pueden administrarse simultánea o secuencialmente como un único episodio de tratamiento para el tratamiento de la alergia a alérgenos de los ácaros del polvo doméstico en un ser humano u otro mamífero. Un régimen de tratamiento de este tipo puede no ser necesariamente una mezcla física de más de un péptido de la invención, pero comprende una combinación de tales péptidos administrados simultánea o secuencialmente como un único episodio de tratamiento con el fin de lograr el efecto terapéutico máximo que proporciona la combinación de péptidos únicos, DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) (por ejemplo solubilidad y estabilidad en un intervalo de pH fisiológico aceptable así como que tiene un intervalo de reactividad de células T del 38-67% de la reactividad de células T total del alérgeno proteico de ácaros del polvo doméstico del grupo I y una frecuencia de respuesta del 91% para al menos un péptido de Der p I sometido a prueba en una población de individuos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico y de manera similar, tienen un intervalo de reactividad de células T del 37-51% de la reactividad de células T total del alérgeno proteico de ácaros del polvo doméstico del grupo II y una frecuencia de respuesta del 63% para al menos un péptido de Der p II sometido a prueba en una población de individuos alérgicos a los ácaros del polvo
doméstico).

Las composiciones terapéuticas de la invención comprenden uno o más de los péptidos DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) también comprenden uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables tales como excipientes que son compatibles con péptido o péptidos presentes en una única composición. Cuando la composición es una formulación de múltiples péptidos, el vehículo farmacéuticamente aceptable debe ser compatible con todos los péptidos en la formulación de múltiples péptidos. Los excipientes preferidos incluyen pero no se limitan a agua estéril, fosfato de sodio, manitol o tanto fosfato de sodio como manitol o una combinación de los mismos. Otros excipientes adecuados incluyen pero no se limitan a sorbitol, sacarosa, dextrosa, lactosa, dextrano y PVP. Adicionalmente, debido al potencial para la dimerización de los péptidos en una formulación de múltiples péptidos, también puede incluirse un agente tal como EDTA para evitar la dimerización. Alternativamente, puede usarse cualquier otro material o procedimiento conocido en la técnica para evitar la dimerización. Además, pueden añadirse contraiones farmacéuticamente aceptables durante la preparación de la formulación de múltiples péptidos. Ejemplos de contraiones farmacéuticamente aceptables incluyen acetato, HCl y
citrato.

Una composición terapéutica de la invención debe ser estéril, estable en condiciones de fabricación, almacenamiento, distribución y uso y debe protegerse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. Un medio preferido para la fabricación de composiciones terapéuticas de la invención con el fin de mantener la integridad de la composición (es decir evitar la contaminación, prolongar el almacenamiento, etc.) es preparar la formulación de péptido y vehículo(s) farmacéuticamente aceptable(s) de manera que la composición pueda estar en la forma de un polvo liofilizado que se reconstituye en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, justo antes de usarse. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío, liofilización o secado por centrifugación que dan un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada de manera estéril del mismo.

Una formulación de múltiples péptidos preferidos comprende los siguientes péptidos únicos DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) y fosfato de sodio y manitol y opcionalmente puede comprender además DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31). Para esta realización, se añade EDTA a la formulación. También puede añadirse un contraión adecuado tal como acetato durante la preparación de la formulación. La formulación se prepara preferiblemente en forma de un polvo liofilizado que se reconstituye en un vehículo fisiológicamente aceptable, tal como agua estéril, antes de usarse. A continuación se describen varios ejemplos no limitativos de formulaciones preferidas de múltiples péptidos de esta invención. Los péptidos únicos de alérgenos proteicos de ácaros del polvo doméstico se combinarán preferiblemente durante la fabricación con el contraión apropiado para producir un vial que contiene polvo estéril, sin pirógeno y preferiblemente liofilizado de la formulación deseada:

Principio activo:: péptidos DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) de Der p I, Der f I y Der p II en concentración de 0,75 mg por péptido

Compuestos no activos:: fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.

\quad: manitol al 5% p/v, U.S.P.

\quad: EDTA de disodio dihidratado 0,1 mg/ml U.S.P.

\quad: pH final 7,2 -7,4

Diluyente:: Agua estéril para inyección, U.S.P.

Opcionalmente pueden añadirse 0,75 mg de DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31) a los principios activos.

Una combinación preferida de formulaciones de múltiples péptidos adecuada para la administración simultánea o secuencial como un único episodio de tratamiento y contenida en dos viales estériles sin pirógeno, separados preferiblemente en forma de polvos liofilizados incluye las siguientes formulaciones:

Vial nº 1

Principio activo:: péptidos DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29) y DPH-22.14 (SEQ. ID. NO. 32)de Der p I, Der f I y Der p II en concentración de 0,75 mg por péptido

Componentes no activos:: fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.

\quad: manitol al 5% p/v, U.S.P.

\quad: EDTA de disodio dihidratado 0,1 mg/ml

\quad: pH final 7,0

Diluyente:: agua estéril para inyección, U.S.P.

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Vial Nº 2

Principio activo:: péptidos DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII 20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) de Der p I, y Der p II en concentración de 0,75 mg por péptido

Componentes no activos:: fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.

\quad: manitol al 5% p/v, U.S.P.

\quad: EDTA de disodio dihidratado 0,1 mg/ml U.S.P.

\quad: pH final 6,2

Diluyente:: agua estéril para inyección, U.S.P.

Las formulaciones de múltiples péptidos de la invención también pueden proporcionarse en forma de un kit, que incluye instrucciones para su uso.

La administración de las composiciones terapéuticas y formulaciones de múltiples péptidos descritas anteriormente a un individuo, preferiblemente en forma no inmunogénica, puede llevarse a cabo usando procedimientos conocidos en dosificaciones y periodos de tiempo eficaces para producir la regulación por disminución de la respuesta inmunitaria específica frente a los ácaros del polvo doméstico (es decir, reducir los síntomas alérgicos producidos por el alérgeno proteico de los ácaros del polvo doméstico del individuo). La regulación por disminución de la respuesta inmunitaria alérgica frente al alérgeno de los ácaros del polvo doméstico en seres humanos puede determinarse clínicamente siempre que sea posible (véase por ejemplo, Varney et al, British Medical Journal, 302:265-269 (1990)), o puede determinarse subjetivamente (es decir el paciente siente como si algunos o todos los síntomas alérgicos producidos por los alérgenos de los ácaros del polvo se hubiesen aliviado).

Una de las características únicas de cada péptido único según la invención es que cada péptido tiene "solubilidad superior". Por tanto, las composiciones y formulaciones de múltiples péptidos de la invención son particularmente adecuadas para la administración por inyección (por ejemplo subcutánea o intravenosa). Sin embargo, las composiciones y formulaciones de múltiples péptidos optimizadas de la invención pueden administrarse de cualquier manera conveniente en la que la solubilidad del principio activo del fármaco es o bien deseable o bien aceptable, tal como mediante inyección (subcutánea, intravenosa, etc.), administración oral, aplicación transdérmica, sublingual, inhalación, administración rectal, o cualquier otra ruta de administración conocida en la técnica para administrar agentes terapéuticos solubles. Puede ser deseable administrar simultánea o secuencialmente una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más de las composiciones terapéuticas de la invención a un individuo como un único episodio de tratamiento. Cada una de tales composiciones para la administración simultánea o secuencial como un único episodio de tratamiento, puede comprender sólo un péptido único de la invención o puede comprender una formulación de múltiples péptidos optimizada según la invención.

Para la inyección subcutánea de una o más composiciones terapéuticas y formulaciones de múltiples péptidos de la invención, pueden administrarse preferiblemente aproximadamente 1 \mug - 3 mg y más preferiblemente desde aproximadamente 20 \mug - 1,5 mg, e incluso más preferiblemente aproximadamente 50 \mug - 750 \mug de cada principio activo (péptido) por unidad de dosificación. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en formas farmacéuticas unitarias para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria tal como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos que van a tratarse; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico deseado. Las especificaciones para las formas farmacéuticas unitarias de la invención están dictadas por y directamente dependientes de (a) las características únicas del principio activo y el efecto terapéutico particular que ha de lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de combinar tal principio activo para el tratamiento de sujetos
humanos.

Para administrar una composición de la invención por otra administración distinta de la parenteral, (es decir mediante administración oral) puede ser necesario recubrir la composición con, o administrar conjuntamente la composición con, un material para evitar su inactivación o potenciar su absorción y biodisponibilidad. Por ejemplo, puede coadministrarse una formulación peptídica con inhibidores enzimáticos o en liposomas. Los inhibidores enzimáticos incluyen inhibidor de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DEP) y trasilol. Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua en aceite en agua así como liposomas convencionales (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol., 7:27). Cuando se protege adecuadamente un péptido, el péptido puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El péptido y otros componentes también pueden encerrarse en una cápsula de cubierta de gelatina dura o blanda, comprimida en comprimidos o directamente incorporada a la dieta del individuo. Para administración terapéutica oral, puede incorporarse el principio activo con excipientes y usarse en forma de comprimidos que se pueden ingerir, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, soluciones, geles, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos el 1% en peso de principio activo. El porcentaje de la composición y preparaciones puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente el 5 al 80% del peso de la unidad. La cantidad de principio activo en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación adecuada. Además, puede incorporarse el principio activo a preparaciones y formulaciones de liberación sostenida o liberación controlada (liberación de estado estacionario o pulsátil).

Las cantidades eficaces de las composiciones farmacéuticas optimizadas de la invención variarán según factores tales como el grado de sensibilidad del individuo frente al antígeno, la edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del péptido para producir la regulación por disminución de la respuesta inmunitaria específica del antígeno en el individuo. Puede ajustarse el régimen de dosificación para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del transcurso de los días, semanas, meses o años, o puede aumentarse o reducirse proporcionalmente la dosis con cada inyección posterior tal como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. En un régimen terapéutico preferido, las inyecciones subcutáneas de composiciones terapéuticas se administran una vez a la semana durante 3-6 semanas. La dosificación puede permanecer constante para cada inyección o puede aumentar o disminuir con cada inyección posterior. Puede administrarse una inyección de refuerzo a intervalos de aproximadamente tres meses hasta aproximadamente un año después del tratamiento inicial y puede implicar sólo una inyección única o puede implicar otra serie de inyecciones similares a las del tratamiento inicial.

Esta invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

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Ejemplo 1

Determinación del porcentaje de reactividad de células T del grupo I de los ácaros del polvo doméstico total y cobertura del paciente de la combinación de péptidos de Der p I y Der f I únicos Síntesis de péptidos solapantes

Se dividió Der p I en un conjunto de 17 péptidos solapantes. Se sintetizaron péptidos solapantes y péptidos únicos de Der p I y Der f I (es decir DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30)) usando química sintética habitual de Fmoc/tBoc y se purificaron mediante HPLC en fase inversa. La figura 1 muestra los péptidos de Der p I y Der f I únicos y la figura 2 muestra los péptidos de Der p I solapantes usados en estos estudios. Los nombres de los péptidos coinciden en todos los ejemplos.

Respuestas de las células T frente a péptidos únicos y péptidos solapantes del grupo I

Se purificaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación Ficoll-Hypaque de 60 ml de sangre periférica heparinizada de individuos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico que mostraban síntomas clínicos de alergia a los ácaros y que dieron positivo en las pruebas cutáneas para los ácaros del polvo doméstico.

Se cultivaron 10^{7} PBMC de cada paciente en 5 ml de RPMI-1640 que contenía suero AB humano reunido al 5% y complementado con glutamina, penicilina, estreptomicina y tampón HEPES en presencia de 20 \mug/ml de Der p I nativo purificado/ml a 37ºC durante 6 días. Después se purificaron las células viables mediante centrifugación Ficoll-Hypaque y se cultivaron durante otras 2-3 semanas en RPMI-1640/suero AB al 5% que contenía 5 unidades de IL-2 humana recombinante/ml y 5 unidades de EL-4 humano recombinante/ml. Entonces se sometieron a prueba las células T restantes en un ensayo de proliferación secundaria para evaluar las respuestas de las células T frente a Der p I nativo purificado, péptidos solapantes y péptidos únicos. Para el ensayo, se cultivaron 2 X 10^{4} células T restantes en 200 \mul de RPMI-1640/suero AB al 5% durante 3 días a 37ºC en presencia de 2 X 10^{4} células B transformadas del virus de Epstein-Barr autólogas (20.000 rads) o en presencia de 5 X 10^{4} PBMC (3500 rads) como células que presentan antígenos con diversas concentraciones de Der p I nativo purificado o péptido único de Der p I sintético o péptidos solapantes. Entonces cada pocillo recibió 1 \muCi de timidina tritiada durante 16 horas. Se recogieron las cuentas incorporadas sobre filtros de fibra de vidrio y se procesaron para recuento por centelleo líquido. El medio solo, actuando como control negativo, no contenía ni alérgeno ni péptido. Los resultados se muestran en la figura 3. Se registró el mayor índice de estimulación superior a o igual a 2,0 en respuesta frente a cada péptido para cada sujeto sometido a prueba. Luego se analizaron los datos mediante las ecuaciones descritas anteriormente en la memoria descriptiva.

La combinación de péptidos candidatos del grupo I DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), tenía un intervalo de reactividad de células T de aproximadamente un 38-67% basándose en el análisis de 39 pacientes, la frecuencia de respuesta al 82% representa reactividad frente a al menos uno de los péptidos candidatos, indicando que esta combinación de péptidos se ajusta al primer criterio de péptidos "únicos" de la invención porque la combinación de péptidos DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), comprende un porcentaje suficiente de reactividad de células T total frente a los alérgenos proteicos del grupo I de Der p y Der f en un porcentaje sustancial de la población sometida a prueba.

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Ejemplo 2

Determinación del porcentaje de la reactividad de células T del grupo II de los ácaros del polvo doméstico total y cobertura del paciente de la combinación de péptidos candidatos de Der p I únicos Síntesis de péptidos solapantes

Se dividió Der p II en un conjunto de 9 péptidos solapantes. Se sintetizaron péptidos de Der p II solapantes y péptidos únicos de Der p II (es decir DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33)) usando química sintética habitual de Fmoc/tBoc y se purificaron mediante HPLC en fase inversa. La figura 1 muestra los péptidos de Der p II únicos y la figura 2 muestra los péptidos de Der p II solapantes usados en estos estudios. Los nombres de los péptidos son consistentes en todos los ejemplos.

Respuestas de las células T frente a péptidos candidatos únicos y péptidos solapantes del grupo II

En segundo lugar se analizaron cultivos de células T reactivas de Der p II derivados de 30 pacientes alérgicos a los ácaros para determinar la reactividad frente a un conjunto solapante de péptidos de Der p II y péptidos candidatos de Der p II en un ensayo de proliferación de células T in vitro tal como se describió en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la figura 4. Se registró el mayor índice de estimulación superior a o igual a 2,0 en respuesta frente a cada péptido para cada sujeto sometido a prueba. Después se analizaron los datos mediante las ecuaciones descritas previamente en la memoria descriptiva.

La combinación de péptidos candidatos DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33), tenía un intervalo de reactividad de células T de aproximadamente el 36%-51% basándose en un análisis de 30 pacientes (figura 4). La frecuencia de respuesta frente a al menos uno de los péptidos candidatos fue de aproximadamente el 63%, indicando que esta combinación de péptidos se ajusta al primer criterio de péptidos "únicos" de la invención, siempre que la combinación de péptidos de Der p II DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33), comprenda un porcentaje suficiente de reactividad de células T total frente a Der p II en un porcentaje sustancial de la población sometida a prueba.

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Ejemplo 3

Determinación de perfiles de pH-solubilidad y pH-estabilidad de péptidos candidatos de la invención 1. Preparación de tampón

Soluciones madre de fosfato de sodio 50 mM

Solución madre A: se disolvieron 0,66 g (0,05 moles) de fosfato de sodio monobásico monohidratado U.S.P. y 50 mg de EDTA de disodio dihidratado U.S.P. en 100 ml de WFT. Se filtró la solución a través de un filtro de 0,2
micras

Solución madre B: se disolvieron 0,71 g (0,05 moles) de fosfato de sodio dibásico U.S.P. en 100 ml WFI. Se filtró la solución a través de un filtro de 0,2 micras.

2. Dispersiones peptídicas iniciales

Dispersión A: se pesaron por separado 3,0 mg de cada péptido candidato, DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33), y se colocaron en viales eppendorf de 1,5 ml separados con 600 \mul de solución madre A. Se agitó la composición durante 5 segundos para mezclar bien.

Dispersión B: se pesaron por separado 3,0 mg de cada péptido, DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33), y se colocaron en viales eppendorf de 1,5 ml separados con 600 \mul de solución madre B. Se agitó la mezcla durante 5 segundos para mezclar bien.

Se sonicaron las dispersiones A y B durante 2 minutos para lograr buena homogeneidad. Se pipeteó un pequeño volumen de cada dispersión en un vial eppendorff marcado según la siguiente razón de volumen:

2

Las soluciones/suspensiones resultantes se almacenaron en la oscuridad a aproximadamente 22ºC \pm 2 durante 24 horas sin agitación. Se filtraron las soluciones y se analizaron los filtrados para determinar el pH y la concentración peptídica.

Se determinó la concentración de las soluciones peptídicas filtradas mediante análisis de HPLC. En este experimento, se define la solubilidad del péptido a cada pH como la cantidad de péptido que permanece en solución tras la filtración a través del filtro de membrana que tiene un tamaño de poro de 0,2 micrómetros. Se estimó el grado de degradación de los péptidos calculando el porcentaje de área de pico degradante total sobre el área de pico total.

Se representaron los valores de pH con respecto a los valores de solubilidad y se muestran en la figura 5 para cada péptido respectivo. Tal como se muestra en la curva de solubilidad para cada péptido tal como se representa en la figura 5, los péptidos DPI-21.2 (SEQ. ID. NO.27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-20.9 (SEQ. ID. NO.31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) son cada uno solubles a más de 3 mg/ml a un pH en el intervalo de pH de pH 6 a pH 8.

Se calcularon y tabularon los perfiles de pH-estabilidad para cada péptido DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPH-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) en idéntica combinación de concentración a 3, 2 y 1 mg/ml por péptido y preparados por duplicado tal como se describió anteriormente con un conjunto almacenado a aproximadamente 5ºC durante 24 horas y un conjunto almacenado a aproximadamente 22ºC\pm2 durante 24 horas, como una función del porcentaje del área de pico degradante total (figura 6). Tal como puede observarse a partir de los datos en la figura 6, la degradación porcentual del péptido a cada concentración fue inferior para los péptidos almacenados a aproximadamente 5ºC durante 24 horas si se compara con los péptidos almacenados a 22ºC\pm2 durante 24 horas durante el intervalo de pH crítico de pH 6,0 a pH 8.0. Sin embargo, se demuestra la estabilidad de la solución aceptable para todos los péptidos en una "ventana" común en el intervalo de pH de pH 6 a pH 8 a cualquier temperatura.

Por tanto, se determinó que cada uno de los péptidos DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27), DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28), DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29), DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30), DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31), DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) y DPII-25.15 (SEQ. ID NO. 33) tenía la solubilidad apropiada y estabilidad requerida para un péptido único para usarse en una composición de la invención.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: IMMULOGIC PHARMACEUTICAL CORPORATION

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(B): CALLE: 610 Lincoln Street

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(C): CIUDAD: Waltham

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(D): ESTADO: MA

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02154

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(G): TELÉFONO: (617) 466-6000

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(H): FAX: (617)466-6040

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: FORMULACIONES FARMACÉUTICAS DE PÉPTIDOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA ALERGIA A LOS ÁCAROS DEL POLVO

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 54

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(iv): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº1.0, versión nº1.30 (EPO)

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(vi): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/227.772

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 14 de abril 1994

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(viii): ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

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(A): NOMBRE: Vanstone, Darlene A.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 35.279

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(C): REFERENCIA/NÚMERO DE DOCKET: 017.5 PCT

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: (617) 466-6000

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(B): FAX: (617) 466-6010

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: I:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

3

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

56

Claims

1. Composición terapéutica que comprende al menos un péptido aislado seleccionado del grupo que consiste en: DPI-21.2(SEQ ID NO:27) y DFI-22.2 (SEQ ID NO:28), y al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-20.9 (SEQ ID NO:31), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33).

2. Composición terapéutica que comprende:

a) péptidos DFI-22.2 (SEQ ID NO:28); DPI-23.1 (SEQ ID NO:29) y DPII-22.14 (SEQ ID NO:32);

b) péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO:27), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33);

c) péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO:27), DFI-22.2 (SEQ ID NO:28), DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33); o

d) péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO:27), DFI-22.2 (SEQ ID NO:28), DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-20.9 (SEQ ID NO:31), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33).

3. Composición según la reivindicación 1 o reivindicación 2, para su uso en tratamientos.

4. Composición según la reivindicación 1 o reivindicación 2, para su uso en:

a) un método para tratar la sensibilidad a los alérgenos de los ácaros del polvo doméstico en un mamífero que comprende administrar simultánea o secuencialmente al menos dos composiciones diferentes según la reivindicación 1; o

b) un método para tratar la sensibilidad a los alérgenos de los ácaros del polvo doméstico en un mamífero que comprende administrar una composición terapéutica según la reivindicación 2.

5. Formulación de múltiples péptidos para la administración farmacéutica que comprende:

a) al menos un péptido aislado seleccionado del grupo que consiste en DPI-21.2 (SEQ ID NO:27) y DFI-22.2 (SEQ ID NO:28), y al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-20.9 (SEQ ID NO:31), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33), siendo cada péptido soluble y estable a un pH en el intervalo de pH 6,0 a pH 8,0 y en la que dicha formulación comprende un porcentaje suficiente de actividad de células T de alérgenos de los ácaros del polvo doméstico de Der f y Der p del grupo I y grupo II;

b) un vehículo farmacéuticamente aceptable; y opcionalmente

c) uno o más de EDTA y un contraión farmacéuticamente aceptable.

6. Formulación según la reivindicación 5, que comprende al menos el 37% de actividad de células T de alérgenos de los ácaros del polvo doméstico de Der f y Der p del grupo I y grupo II.

7. Formulación de múltiples péptidos según la reivindicación 5 o reivindicación 6, que comprende:

a) péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO:27), DFI-22.2 (SEQ ID NO:28), DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33); o

b) péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO:27), DFI-22.2 (SEQ ID NO:28), DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-20.9 (SEQ ID NO:31), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33).

8. Formulación de múltiples péptidos optimizada adecuada para el tratamiento terapéutico de seres humanos que padecen alergia a los ácaros del polvo doméstico que comprende:

a) péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO:27), DFI-22.2 (SEQ ID NO:28), DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33); y opcionalmente DPII-20.9 (SEQ ID NO:31);

estando cada péptido en una concentración de 0,75 mg por péptido;

fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.;

manitol al 5% p/v U.S.P.;

EDTA de disodio deshidratado 0,1 mg/ml U.S.P.; y

agua estéril para inyección U.S.P.;

en la que dicha formulación tiene un pH final de 7,2-7,4; o

b) péptidos DFI-22.2 (SEQ ID NO:28); DPI-23.1 (SEQ ID NO: 29) y DPII-22.14 (SEQ ID NO:32);

estando cada péptido en una concentración de 0,75 mg por péptido;

fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.;

manitol al 5% p/v U.S.P.;

EDTA de disodio deshidratado 0,1 mg/ml U.S.P.; y

agua estéril para inyección U.S.P.;

en la que dicha formulación tiene un pH final de 7,0; o

c) péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO:27), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33);

estando cada péptido en una concentración de 0,75 mg por péptido;

fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.;

manitol al 5% p/v U.S.P.;

EDTA de disodio deshidratado 0,1 mg/ml U.S.P.; y

agua estéril para inyección U.S.P.;

en la que dicha formulación tiene un pH final de 6,2.

9. Formulación según la reivindicación 8 para su uso en tratamientos.

10. Formulaciones de múltiples péptidos optimizadas primera y segunda para su uso simultáneo o secuencial en tratamientos, en las que dicha primera formulación comprende:

péptidos DFI-22.2 (SEQ ID NO:28); DPI-23.1 (SEQ ID NO: 29) y DPII-22.14 (SEQ ID NO:32);

estando cada péptido en una concentración de 0,75 mg por péptido;

fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.;

manitol al 5% p/v U.S.P.;

EDTA de disodio deshidratado 0,1 mg/ml U.S.P.; y

agua estéril para inyección U.S.P.;

teniendo un pH final de 7,0;

y en las que dicha segunda formulación de múltiples péptidos optimizada comprende:

péptidos DPI-21.2 (SEQ ID NO:27), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33);

estando cada péptido en una concentración de 0,75 mg por péptido;

fosfato de sodio 0,05 M U.S.P.;

manitol al 5% p/v U.S.P.;

EDTA de disodio deshidratado 0,1 mg/ml U.S.P.; y

agua estéril para inyección U.S.P.;

teniendo un pH final de 6,2.

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11. Formulación según la reivindicación 9 o reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de la sensibilidad a los alérgenos de los ácaros del polvo doméstico.

12. Uso de una formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5 a 8 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la sensibilidad a los alérgenos de los ácaros del polvo doméstico.

13. Péptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en DPI-23.31 (SEQ ID NO:29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:30), DPII-20.9 (SEQ ID NO:31), DPII-22.14 (SEQ ID NO:32) y DPII-25.15 (SEQ ID NO:33).