KR0184598B1 - 이입인자 및 사용방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 214 nm에서 흡광 단위당 적어도 5000단위의 비활성을 갖는 실질적으로 순수한 이입인자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 세포 용해질로부터 이입인자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 전염병을 치료하기 위한 214 nm 에서 흡광단위당 적어도 5000단위의 비활성을 갖는 실질적으로 순수한 이입인자의 사용을 포함한다.
Description
[발명의 명칭]
이입인자 및 사용방법
[발명의 분야]
본 발명은 실질적으로 순수한 이입인자를 사람 또는 동물에게 투여하는 세포 조정 면역의 이입에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 그것은 실질적으로 순수한 이입인자를 얻는 방법, 실질적으로 순수한 이입인자 자체, 및 질병을 치료하기 위해 실질적으로 순수한 이입인자를 사용하는 방법에 관한 것이다.
[발명의 배경]
용어 항원성 결정인자 및 에퍼토프 는 면역반응과 관련되는 세포 또는 체액 생성물과 특이적으로 상호작용할 수 있는 분자의 일부로서 정의된다. 용어 항원은 면역반응을 위한 표적으로서 기여할 수 있는 임의의 것으로서 정의된다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 일 수 있다. 용어 세포 조정면역은 항체에 의해서 보다는 세포에 의해 조정되는 면역반응으로서 정의된다. 용어 지연성 과감작은 자극항원의 주입 또는 적용 부위에 아주 근접하여 일어나는 T입파세포 조정 염증반응으로서 정의된다. 그것은 지연형 과감작 및 세포독성 T세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 여기에서 합텐 은 적당한 항체 또는 T 세포와 선택적으로 반응하는 물질로서 정의되나, 합텐 자체는 보통 면역원성이 아니다. 대부분의 합텐은 소분자 또는 대분자의 소부분이나, 몇몇 거대 분자 또한 합텐으로서 작용할 수 있다. 용어 항체는 또한 항원과 결합하는 분자를 의미하나, 그들은 항체의 분자량이 약 160,000 달톤 내지 1, 000, 000 달톤이라는 점에서 이입인자와 구별된다.
이입인자는 사람 및 몇몇 다른 동물의 임파세포로부터 추출할 수 있고 면역 반응을 한 개체에서 다른 개체로, 심지어 종간에 이입시키는 능력을 갖는 투석가능한 물질 또는 물질 군으로서 정의되었다. 상기 물질은 보통 자극 항원에 대해 지연형 과감작 또는 다른 세포조정반응을 나타내도록 자극된 사람 및 다른 척추동물로부터 용해된 임과구로부터 얻은 물질이다. 이입인자는 상동항원과 결합하여 한 개체에서 다른 개체로 지연형 과감작 및 다른 세포조정 면역반응의 이입을 조정하는 능력을 갖는다. 상기 상황에서 이입인자가 얻어지는 개체를 관심사가 되는 항원에 감작시켰다.
상기 성질에도 불구하고, 이입인자는 항체보다 작고, 항체 조정 반응을 이입시키지 않으며 그들은 항체 생산도 유발하지 않는다.1,2,3이입인자의 이들 성질은 또한 건강한 제공자의 임파구로부터 지켜지는 이입인자를 논의하는 스피틀러 일동에 의해서 설명된다.4상기 물질은 질병의 증세를 막는다. 스피틀러 일동은 열에 안정하고 20, 000달톤 이하의 분자량을 갖는 물질을 설명한다. 그것은 임파구를 용해하여 용해물을 Hg+2및 DNase와함께 항온처리한 후, 밀리포어 필터를 통한 여과에 의해 지켜진다.
이입인자로 불리는 물질을 특성결정하려는 수많은 부가의 시도가 있었고, 이들은 과학 및 특허문헌 둘다에서 보고되어 있다. 모든 이들 보고물에서, 이입인자 물질은 세포 용해질의 조 분류물이었다. 본 발명자들이 알기에, 어떤 사람도 실질적으로 순수한 이입인자를 생산하지 못했다. 바람 일동은 디에틸아미노에틸 셀룰로오스(USAS)를 사용하는 이온 교환 크로마토그래피를 통해 사람의 임파세포 추출물을 분류하였다.5이 연구는 계속되었고 바람일동에 의해 보고된 바와같이, 겔여과 및 페이퍼 크로마토그래피를 사용하여 사람의 임파세포 추출물을 추후에 분류하였다.6이 연구에 의해 제출된 결론 중에는 이입인자가 뉴클레오시드를 함유한다는 것이 있다. 감작된 사람의 임파세포 추출물에 대한 겔여과 크로마토그래피를 사용하는 로우렌스 일동의 연구는 이입인자가 (i) 수용성이고, (ii) 투석가능하고, (iii) 10, 000 달톤 이하의 분자량을 가지 며, (iv) 데옥시리보뉴클레아제, 리보뉴클레아제 및 트립신 소화에 내성이 있고, (V) 280nm에서보다 260nm 에서 더 큰 흡광도를 나타내는 크로마토그래피 피크를 가진다는 제안에 이르렀다.7,8,9이 요소들의 조합은 이입인자가 작은 리보뉴클레아제 내성 폴리리보뉴클레오티드라는 제안에 이르렀다.
이입인자의 분자 특성 결정으로 향한 진보는 적당한 정제 방법학의 결여 및 정량 검정법의 필요성으로 느리며 크게 제한되었다. 이입인자의 활성을 가진 분자는 비교적 작온, 즉 6000 달톤 이하이고, 친수성이며 자연형태에서 극성인 것으로 나타났다. 더욱이, 이입인자의 활성은 56℃ 에서 30분 동안의 가열에 견디나 75℃에서는 견디지 못하고 95% 에탄올에 적어도 짧은 노출에 견딘다. 효소감작 및 활성 고갈연구로부터의 결과는 이입인자의 구조에 관한 뉴클레오펩티드 또는 뉴클레오단백질 모델과 일치하는 결과를 나타냈다. 그러나, 불순한 조제물이 연구되었고 정량측정법이 수행되지 않았기 때문에, 종래 기술의 결과를 해석하는데 주의해야 한다. 따라서, 이입인자의 분자성질은 지금까지 잘 이해되지 않는다.
뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 이입인자 분자의 일부라는 가정에 대한 경향은 고틀리엡 일동에 의해 계속되었다.18,11,12고틀리엡은 이입인자를 면역조절자 ('379특허) 및 증폭자 ('079 특허)와 구별하였다. Lancet 발표에서, 고틀리 엡은 이입인자가 12 아미노산 및 올리고뉴클레오티드로 구성됨을 가정했다. 그 결과, 연구는 254nm 이상의 과장에서의 용출액의 연구에 촛점을 맞췄다. 많은 보고들은 높은 254/260nm 대 280nm 흡광 비율을 나타내어, 다시 이입인자 분류물의 일부로서 올리고뉴클레오티드를 시사했다.13,14,15,16,17,18,19,28,21유사하게, 와렌은 단백질 및 RNA를 함유하는 5000 내지 10,000 달톤 분자량의 분자를 가정한다.22고우스트 일동은 투석가능한 이입인자를 일반적으로 4000 내지 7000달톤 분자량의 분자들 및 리보뉴클레오티드의 혼합물로서 설명한다.23다시, 월슨일동24은 세가지 형태의 이입인자를 설명하며, 이들 전부는 뉴클레오티드 성분 및 펩티드 성분을 가진다 (이 참고문헌의 11단을 주목).
불순한 이입인자 물질을 특징으로 하여 행해졌던 방법은 키르크패트럭(KirkBatrick)25의 평론에서 요약된다. 상기 평론에서, 이입인자 활성을 갖는 투석가능 물질은 4000 내지 6000 달톤의 분자량을 갖는 폴리펩티드로서 기술되고 프로테아제 감작이다. 외관상으로 이입인자 물질은 항원에 특이하게 결합한다. 평론은 핵산, 리보오스, 및 포스포디에스테르기의 존재 가능성은 배제되지 않는다고 한다.25따라서, 실질적으로 순수한 물질은 분리되지 않기 때문에 이입인자 물질의 물리적 특성은 명확하게 결정될 수 없었다.
당 분야의 선행 기술은 이입인자가 누클레오티드/단백질 복합체라고 제안한다는 것을 알 것이다. 그러나, 실질적으로 순수한 이입인자는 분리되지 않기 때문에, 이입인자 물질을 확정적으로 특징지울 수 없다.
분자 및 그의 구조에 대한 관심은, 오히려 그의 치료학적 효능 때문에 증가한다. 상기된 참조 문헌에 의해 기술된 치료학적 사용이외에도, 예를들면, 단순포진 비루스에 대한 이입인자 요법을 제시하는 비자(Viza)일행25을 참조할 수 있다. 또한, 흠, 좌창, 습우(濕雨) 및 HSV에 대한 피부과학적 효능을 기술하는 워렌(Warren)29을 주목한다. 이입인자 단편은 키르크패트릭 일행 38에 제시된 바와같이, 백체에 대해 효능이 있다고 설명되며, 이의 출원서는 참조 문헌으로서 첨부된다. 단순포진에 대한 효능의 부가적인 설명은 밝혀쳐질 수 있다.31,32,33이입인자는 AIDs 환자의 크립토스포리디오시스에 대한 효능을 설명한다. 이들 연구 모두 불완전하게 정제된 이입인자 단편만으로 실행되었다. 순수한 이입인자 물질을 분리하고 특징짓는 것이다. 순수한 이입인자 물질을 분리하고 특징짓는 것이 어렵기 때문에 실질적으로 순수한 이입인자 물질을 추정하기 위한 어떠한 임상적 또는 생화학적 연구도 수행되지 않았다.
이입인자에 대한 전술한 평론 문헌에 의해 알 수 있는 바와같이, 실질적으로 순수한 이입인자 물질의 분리 및 특성결정은 30년 동안 학술 연구회에게 인지되지 않았다. 격렬한 과학적 및 임상적 관심에도 불구하고, 및 파악하기 어려운 이입인자 물질에 관한 몇가지 중요한 물리적 변수들을 추론한 후, 실질적으로 순수한 물질의 실제 물리적인 분리는 가능하지 않았다.
필요한 것은 실질적으로 순수한 이입인자 물질이다. 수중의 실질적으로 순수한 물질을 가지고, 상기 물질을 서열화하고 화학적으로 또는 제조합 방법에 의해 물질을 생산하는 것은 가능하다. 그런 다음 물질을 사람 또는 동물에게 투여함으로써 특이 항원 또는 에피토프에게 면역성을 이입할 수 있다. 실질적으로 순수한 이입인자는 이미 감염된 사람 또는 동물을 치료하도록 제조될 수 있거나 질병을 예방하도록 사용될 수 있다. 실질적으로 순수한 이입인자의 분리 및 정제는 질병의 치료에 많은 도움이 될 것이다.
[발명의 요약]
본 발명은 정제된 이입인자, 정제된 이입인자를 생산하는 방법, 및 정제된 이입인자로 각종 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 출원에 공개된 정계 방법은 임의 항원에 특이 성 인 임의 이입인자의 분리 에 적용되기 때문에, 본 밭명은 AU214당 5,000 단위 이상의 특이 특성을 지닌 실질적으로 순수한 임의 이입인자를 포함한다고 예기된다. 발명자에게 공지된 선행 기술의 이입인자 제제는 2l4nm에서 흡광 단위 당 대략 1, 000단위 이하의 특이 합성을 갖는다고 평가된다.
본 발명은 천연 공급원으로부터 분리되거나 합성적으로 생산된 실질적으로 순수한 이입인자를 포함한다. 어느 한 쪽의 공급원으로부터의 실질적으로 순수한 이입인자는 본 발명에 따라 사용되어 다양한 병리학적 상황을 치료할 수 있다. 예를들면, 단순포진에 대한 세포 조정 면역을 이입하는 이입인자 또는 인자들은 단순포진 감염을 치료하거나 사람을 단순 포진 감염으로부터 예방할 수 있다.
그 면역성을 부여하기 위한 이입인자 사용의 이점은 많다. 그들은 면역성 이입의 신속성을 포함한다. 특이항원에 대한 면역성은 이입인자의 투여 후 수 시간만큼의 짧은 기간 내에 검출될 수 있다. 이것은 수 주 또는 개월이 걸려 보호를 부여할 수 있는 통상적인 면역법 이상의 대단한 개선점이다.
각각의 독특한 이입인자 분자는 특이 항원 또는 에피토프에 면역성을 부여한다고 생각되기 때문에, 상이한 항원에 특이성인 몇가지 상이한 이입인자 분자는 혼합되어 복합 면멱 반응을 관례적으로 계획할 수 있다.
실질적으로 순수한 이입인자는 특정한 이입인자의 아미노산 서열을 결정할 수 있고, 상기 주어진 정보로, 이입인자를 화학적으로 또는 제조합 방법으로 합성할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명의 결과로서, 이제 다량의 이입인자를 생산할 수 있다. 이것은 다수의 사람 또는 동물에게 원하는 면역 반응의 이입을 허락할 것이다.
더욱이, 이입인자의 저장은 또 하나의 이점이다. 본 발명의 일부로서 예기되는 이입인자 분자는 매우 안정하다. 따라서, 본 발명에 따라, 이입인자 분자는 물질을 유지하거나 투약하는 특별한 주의를 요구하지 않는다.
따라서, 븐 발명의 목적은 실질적으로 순수한 이입인자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 AU214당 적어도 5000 단위을 특이활성을 지닌 실질적으로 순수한 이입인자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 또는 동물에게 투여되며 원하는 면역반응을 이입할 수 있는 실질적으로 순수한 이입인자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포 용해물로부터 실질적으로 순수한 이입인자를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전염병을 치료하기 위한 실질적으로 순수한 이입인자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전염병에 대한 예방을 위한 실질적으로 순수한 이입인자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 단순포진, 대상포진, 사이토메갈로비루스마진, HIV, 및 사람 또는 동물에서 병을 유발하는 그 밖의 비루스와 같은 비루스에 특이성인 실질적으로 순수한 이입인자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 히스토플라스마 캡슐라툼 (HistoplasRa capsulatun), 코씨디오이디에스 임미티스(Coccidioides imRitis)및 네운모시스터스 카리니(Pneunocystus carinii)이와 같은 진균에 대해 특이성인 실질적으로 순수한 이입인자를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 미코박테리아 레프라에(Hycobacteria leprae), 미코박테리움-투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 미코 박테리움 아비움 컴플럭스(Mycobacterium avium complex)를 비롯한 미코박테리아에 특이성인 실질적으로 순수한 이입인자를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 크립토스포리디아(cryptosoridia), 이소스포라(isospora), 레이스마니아 종 (leishHania species), 코시디오이데스(cocidioides) 및 사람 및 동물을 감염시키는 기타 기생균과 같은 기생균에 대해 특이성인 실질적으로 순수한 이입인자를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 원생동물에 대해 특이성인 실질적으로 순수한 이입인자를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 한 종으로부터 분리되어 또 다른 종에 대한 면역성을 이입시키는데 사용될 수 있는 실질적으로 순수한 이입인자를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 경구적으로 투여될 수 있는 실질적으로 순수한 이입인자를 제공하는데 있다.
본 발명의 상기와 같은 목적 및 그 밖의 목적, 특징 및 장점들은 하기의 예시된 구체예의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구 범위로부터 명백해 질것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 이입인자를 정제하는데 사용되는 전략의 개략도이다.
제2도는 이입인자를 함유하는 용해된 비세포의 투석물에 대한 투여-반응 관계를 도시한 도면이다.
제3도는 친화 정제후 이입인자에 대한 투여-반응 관계를 도시한 도면이다.
제4도는 친화 정제된 페리틴 특이 이입인자의 역상 고압 액체 크로마토그래피를 도시한 도면이다.
제5도는 친화 정제된 오브알부민 특이 이입인자의 역상 고압 액체 크로마토그래피를 도시한 도면이다.
제6도는 역상 고압 액체 크로마토그래피 정제 이입인자에 대한 투여-반응 관계를 도시한 도면이다.
제7도는 페리틴 특이 이입인자의 역상 고압 액체 크로마토그래피 분류물의 분석을 도시한 도면이다.
제8도는 겔 여과 고압 액체 크로마토그래피 컬럼의 친화 및 역상 고압 액체 크로마토그래피 정제 미입인자의 다형 크로마토그래피를 도시한 도면이다.
제9도는 다형 겔 여과 고압 액체 크로마토그래피의 각 분류물로부터 산출된 페리틴에 대한 이입인자의 활성도 데이타를 도시한 도면이다.
제10도는 제8도에 도시된 분류물에 대한 투여-반응 관계를 도시한 도면이다.
제11도는 제8도에서와 같은 이입인자 분류물의 겔 여과 크로마토그래프를 도시한 도면이다.
제12도는 분자 중량 마아커의 겔 여과 크로마토그래피로부터 산출된 표준 곡선이다.
제13도는 페리틴 특이 이입인자의 UY 홉광 스펙트럼을 도시한 도면이다.
제14도는 고도로 정제된 이입인자에 대한 항원 특이성을 도시한 도면이다.
제15a도는 환원 및 알킬화 공시험 샘플로부터 산출된 용출 프로필을 도시한 도면이다.
재15b도는 이입인자의 환원 및 알킬화 샘플로부터 산출된 용출 프로필을 도시한 도면이다.
제16a 도는 대조용 시료에 대한 세파덱스(Sephadex) G 10 용출 프로필을 도시한 도면이다.
제16b도는 분류물 III 이입인자에 대한 세파덱스 G 10용출 프로필을 도시한 도면이다.
제17도는 비환원 조건하에서 이입인자의 SDS-폴리 아크릴아미드 겔 전기 영동 프로필을 도시한 도면이다.
제18a도는 이입인자의 트립신 분해에 -대한 대조용 용출 프로필이다.
제18b도는 트립신 분해후 둔류물 AIII 페리틴 특이 이입인자에 대한 용출 프로필이다.
제19a도는 V8 프로테아제로 분해된 이입인자에 대한 대조용 용출프로필이다.
제19b도는 V8 프로테아제로 분해된 계란의 알부민 특이 이입인자의 용출 프로필이다.
제19c도는 V8프로테아제로 분해된 페리틴-특이 이입인자의 용출 프로필이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 실질적으로 순수한 이입인자 및 천연 슈크로스로부터 실질적으로 순수한 이입인자를 제조하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 실질적으로 순수한 이입인자를 각종 질병을 치료하는 방법을 포함한다.
특히, 본 발명은 AU214당 적어도 5000 단위의 특이 활성도를 지닌 실질적으로 순수한 이입인자를 포함한다. 바람직한 특이 활성도는 AU214당 적어도 10, 000 단위, 가장 바람직하게는 AU214당 적어도 20, 000 단위, 내지 AU214당 60, 000단위이다. 실질적으로 순수한 이입인자는 약 4900 내지 5500 달톤의 분자량을 지닌 폴리펩티드이다. 실질적으로 순수한 이입인자는 비 면역성의 사람 또는 동물에게 지연형 세포 조정 면역성을 이입할 수 있다.
실질적으로 순수한 이입인자는 사람 또는 동물에 있어서 각종의 항원 또는 에피토프에 대한 세포 조정 면역을 이입하는데 효과적이다. 실질적으로 순수한 이입인자는 주사에 의해 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 주사는 정맥내, 근육내 또는 피하 방식에 의해 혹은 이러한 방식들의 조합에 의해 이루어질 수 있다.
주사시, 사람에게 면역성을 부여하는데 필요한 이입인자의 투여량은 약 Ing 내지 500ng 이 며, 바람직한 투여량은 25ng 내지 250ng, 가장 바람직한 투여량은 50ng이다. 어떤 특정 이입인자의 최적 투여량은 전술된 범위내에서 변할 수 있다.
임의 비루스, 특히 사람의 포진 비루스에 대한 면역성은 세포 조정 면역계에 따라 다르다는 명백한 증거가 있다. 특이 이입인자로의 세포 조정 면역 특성은 명백한 활성 비루스성 감염으로 작용하는 정상 메카니즘을 향상시키는 것으로 기대된다. 이입인자에 대한 특이 면역의 유사 활성은 비루수로 감염되기 전에도 비루스에 대한 보호 면역을 제공할 수 있다. 후자의 이와 같은 제안은 스틸(Steele)일행의 보고에 의해 지지되는데, 이에 따르면 급성 백혈병을 지닌 어린이는 바리 셀라 대상포진 (Varicel la zoster)(수두) -특이 이입인자 분류물의 투여에 의해 수두 전염병으로부터 보호된다고 보고하고 있다 (37). 따라서 이입인자의 활성에 대한 신속성이 중요하다고 생각된다. 수용체는 24 내지 48 시간 후에 특이 면역성을 얻는다. 이것은 통상의 백신의 유도에 필요한 2 내지 6주일보다 휠씬 빠른 시간이다.
결핵, 나(癩) 및 이형성미코박테리아(예, 미코박테리움 아비움 컴플렉스)에 의해 유발된 감염은 환자에게 있어 면역 결핍을 생성할 수 있거나, 환자가 유기체에게 감염을 일으키도록 하는 면역 결핍을 가지므로 일어날 수 있다. 이들 질병을 갖는 많은 환자들은 손상된 세포 조정 면역성을 갖고 이들 면역 결핍은 특정 이입인자로 고칠 수 있다는 증거가 있다.
장 기생균에 대한 면역 메카니즘은 가변성이다. 그러나, AIDS, 세포-조정 면역이 심히 손상된 질병은 사람의 특정 기생균 질병이 세포-조정면역 반응과 관련된다는 증거를 제공하였다. 이들은 크립토스포리디오시스(Cryptosporidiosis) 및 이소스포로시스(isosporosis)를 포함한다. 장 크립토스포리디오시스를 갖는 환자에게 있어 특정 이입인자의 위약 조절된 임상 시도는 이입인자 수용자38에게 유의하게 이로운 반응을 보였다.
적합한 이입인자로 어린이를 예비 치료함으로써 닭 발진 감염이 예방될 수 있다는 스티일 일동38의 관측은 특정 전염병을 예방하기 위한 제제로서의 이입인자의 중요한 역할을 지시한다. 이입인자는 세포 조정 면역 체계를 활성화시키고 매우 신속히 작용하므로, 현재 사용되는 백신(항체 생성을 자극하기 때문에 사용되는)에 의해 제공되지 않는 예방 면역에 대한 중요한 신규 접근을 제공한다. 특정예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 :
a. 수두의 예방 ;
지방 유행 지역의 여행자에게 있어 기생균 감염 즉, 피부 레이슈마니아증의 예방 ;
c. 장기 이식 조직의 수용자에게 있어 거대세포비루스 감염의 예방 ;
d. 비루스 감염 (예, HIV) 또는 면역 억제 치료 때문에 세포 면역 결핍을 갖는 환자에게 있어 뉴모시스터스 카니이(Pneunocystis Carninii) 페염의 예방 ;
e. 특정 지리학적 지역에서 지방 유행성인 특정 전염병 (즉, 레히슈마니아증)에 대한 예방
본 발명의 실질적으로 순수한 이입인자는 사람 및 동물에게 있어 광범위하게 다양한 병리학적 상태를 치료하는데 유용하다. 예를들어, 본 발명의 실질적으로 순수한 이입인자는 단순 포진 유형 I 및 II, 엡스타인-바아 비루스, 거대세포 비루스 마진, 사람 면역 결핍 비루스(HIV), 및 사람 및 동물에게 있어 질병을 유발하는 다른 비루스를 포함하나 제한되지 않는 비루스 감염을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 실질적으로 순수한 이입인자는 아구창 칸디다, 히스토플라스마 캡슬라툼(Histoplasma capsul atum) , 콕시터오이데스 이미터스(coccidioidies imnitis), 및 뉴모시스투스 카니이를 포함하나 이에 제한되지 않는 진균 감염을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 실질적으로 순수한 이입인자는 나균, 결핵균, 및 미코박테리움 아비움 컴플렉스를 포함하나 이에 제한되지 않는 미코박테리움 감염을 치료하거나 에방하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 실질적으로 순수한 이입인자는 크립토스포리디아, 이소스포라, 레이슈마니아종, 코시디아, 및 사람 및 동물을 감염시키는 다른 기생균을 포함하나 이에 제한되지 않는 기생균 감염을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.
특정 면역 결핍 증후군은 세포-조정 면역에서 선택적 결함에 의해 특성화된다. 이들 질병을 갖는 환자는 아구창 칸디다, 포진 비루스, 뉴모 시스티스 카니이 및 특정 장 기생균과 같은 일반적 편재 미소유기체에 의해 감염되기 쉽다
위스코트-알드리히(Wiskott-Aldrich)증후군 및 만성 점막 피부 칸디다증과 같은 특정 질병에 있어 면역 결핍은 유전학적으로 측정되고 대개 수명의 초기 몇 년 내에 진단된다. 다른 것들은 면역 억제 치료, 면역 억제 질병을 통해 또는 알려지지 않는 메카니즘을 통해 얻어진다.
커크패트릭 일동은 특정 이입인자 치료가 만성 점막 피부 칸디다증을 갖는 환자에게 있어 면역 결핍을 고치고 이들 환자는 이들의 감염이 항 진균제로 일소된 후 재발에 저항함을 보였다. 본 발명의 실질적으로 순수한 이입인자로 치료될 수 있는 면역 결핍 질병의 특정예는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
a. 만성 점막 피부 칸디다증 ;
b. 과잉 IgE 증후군 ;
c. 위스코트-알드리히 증후군 ;
하기 가설에 의해 제한되지 않기를 원하나, 이입인자는 특별한 항원 또는 에피토프에 대해 특이한 것으로 여겨진다. 본 발명에 따라 제조된 실질적으로 순수한 이입인자로부터 얻어진 데이타로부터 각각의 이입인자 분자는 일정한 아미노산 서열을 갖는 영역을 갖는다고 여겨진다. 다른 영역에서, 아미노산 서열은 가변성이다. 이는 특별한 항원에 대한 특이성을 제공하는 가변 영역이다.
특별한 에피토프에 대해 특이한 실질적으로 순수한 이입인자를 분리함으로써, 그런다음 이입인자를 서열화하고, 서열 데이타를 이용하여 화학합성에 의해 또는 재조합 기술에 의해 다량으로 이입인자를 생성할 수 있다.
또한, 본 명세서에 기술된 방법에 의해 면역화된 동물로부터 다량의 실질적으로 순수한 이입인자를 생성하는 것이 본 발명의 일부로 생각된다. 그리고 나서, 이 실질적으로 순수한 이입인자는 다른 비-면역 동물, 또는 사람에게 면역성을 이입시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 실질적으로 순수한 이입 일자는 한 종, 예를들어, 소로부터 생성될 수 있고, 소 원천으로부터의 실질적으로 순수한 이입인자는 다른 종, 예를 들어, 사람에게 특이 면역성을 이입시키기 위해 사용될수 있다.
하기 가설에 의해 제한되지 않기를 바라나, 결과는 전이 인자가 CD 4+ (L3T4+)주변 T 세포에 의해 생성됨을 시사한다. 활동적으로 감작된 생쥐로부터 대식세포, B 세포, CD 4 + T 세포, 및 CD 8 + T 세포를 분리하고, 이들 세포로부터 투석물을 제조하고, 순수한 수용자 생쥐에게 이들 재제를 사용한 이입인자 활성에 대한 투여 반응 연구를 수행함으로써 이들 실험을 수행한다.
각각의 투석물 제제를 위한 적정 곡선과 각각의 세포 제제 (시토플루오로그래피로부터)의 순도에 대한 데이타의 비교는 모든 이입인자 활성이 CB 4 + T세포에 의해 제공되었음을 시사한다. 이입인자의 주요한 조직 적합성 복합체 제한 생성은 이들이 T 세포에 의해 생성된다는 생각과 양립된다. 다른 항원 특이 분자의 재배열을 실시하기 위해 공지된 것과 유사한 방법을 통해 재배열되는 CO 4 + 세포내에 한 세트의 생식 세포계 유전자에 의해 전이 인자가 암호화된다고 여겨진다. 항원 특이성을 달리하는 이입인자들의 유사한 물리화학적 성질은 이입인자에 대한 일정하고 가변성 영역을 암호화하는 유전자를 시사할 수 있다. 더욱이, 이입인자는 분지계 방식으로 생성되고, 특정 T 세포을 의해 생성된 이입인자는 그 T 세포에 대한 T 세포 수용체 (TCR)와 동일한 항원의 에피토프에 대한 특이성을 갖는 것으로 시사된다. 이입인자 생성에 대한 분지계는
이입인자의 항원-특이 활성과 양립된다. 이에 관해서는, 동일한 에피토프-함유 펩티드에 대한 상이한 아미노산 잔기가 이입인자 및 이의 상응하는 TCR에 의해 인지되는 것으로 시사된다.
이들 제안점에 의해 야기된 아마도 가장 자극적인 문제점은 T 세포수용체 유전자의 랜덤 재배열이 이입인자 유전자의 재배열과 통합될 수 있는 매카니즘이다. 이 모델로부터 함축적인 것은 TCR과 이입 인자 유전자 간의 특이 신호법 메카니즘이다. 문헌 상에 이와 같이 복잡한 체개의 통합에 대한 데이타는 없다. 이에 관해서는, 이입인자 유전자 재배열을 조절하는 고유한 처리 인자 세트를 생각할 수 있다. 대안적으로, 항원, 재순환 TCB, 또는 이 목적을 제공하는 이들 중 하나의 단편을 생각할 수 있다. 메카니즘이 무엇이든, 이는 이 모델에 대한 가장 불가사의한 양상이다. 랜덤 이입인자 유전자 재배열 모델에 반하여, 이 모델은 그렇지 않으면 자지 (自知) 항원에 대한 특이성을 갖는 이입인자를 생성할 수 있는 세포의 제거를 제공한다. 즉, 이들의 TCR 반응성에 기준한 자동반응 T 세포의 분지계 제거는 또한 상응하는 특이성을 갖는 이입인자를 제거할 것이다. 이에 관해서는, 버넷48이 이입인자 유전자에 대한 생식 세포계 모델을 제안하고, 조한 종종 소형 수용체 가설 로 칭하는 것의 일부로서 이입인자의 분지계 생성을 제안하였다. 유전자 재배열의조합된 조절의 문제점 외에, 이 모델은 면역글로불린 및 TCR 유전자 조직 및 재배열로 공지된 것과 매우 유사하다.
이입인자는 구조적으로 생성되지 않고, 일차 면역 반응의 유도에 필수적이 아닌 것으로 여겨진다. 생체계의 실험에서의 이입인자 활성은 감작된 공여체로부터의 제재에 대해 단지 명백하다. 최소로, 상기 제제에 대한 이입인자 활성의 10, 000배 강화가 제안된다. 또한, 이입인자 수용자에서 DTH 반응성의 신속한 (24시간) 유도는 일차 면역 반응의 유도에 있어 이입인자의 자연적 역할과 일치하지 않는다.
이입인자는 기억 T임파구로부터 얻을 수 있는 것으로 여겨진다. 생체 실험 모델을 사용하여 이입인자 활성에 대해 관측된 운동학(즉, 24시간 내 반응 유도)은 이차 면역 반응 운동학과 일치한다. 생체내 T 세포 증식을 유도하려 한 이입인자의 실패는 기 억 T 세포가 이입인자 활성을 함유한다는 생각과 양립가능하다. 주기적 항원-추진 T 세포 활성화의 부재시 항원 공격에 대한 기억 T세포 반응의 감소는 동일한 조건하에 시간에 따른 이입인자 수용자의 유사한 DTH반응 감소와 양립한다. 고도로 정제된 이입인자의 투여에 이은 DTR 반응의 신속한 유도는 이들 분자가 이차 면역 반응에 중추적 역할을 함을 시사할수 있고, 이는 또한 이입인자가 기억 T세포내에 존재할 수 있다는 생각과 양립 가능하다.
요약하여, 이입인자는 CD4 + T 세포내의 재배열된 생식 세포계 유전자에 의해 암호화되는 것으로 여겨진다. 더욱이, 일차, MHC -제한된 감작후에 생성되고, 기억 T세포로부터 얻어질 수 있는 것으로 여겨진다.
자연 조건하에서, 이입인자는 적합한 이입인자-함유 T세포에 대한 관능가 후속 MHC-제한 항원 표시이다. 실험 생체 내 모델로부터의 결과는 동종 및 심지어 이종 수용자에서의 이입인자 기능을 나타낸다. 반면, DTH 를 조정하는 것으로 나타난 분지화된 CD4 + T 세포를 사용하는 DTH의 소극적 이동은 MHC - 제한 방식으로 기능한다. 이들 결과는 실험 생체내 모델에 대한 외인성 이입인자의 투여가 이입인자 관능가 활성이 발현되기 전에 달리 MHC- 제한 항원 제제에 대한 자연적 요구를 우회할 수 있음을 제안함으로써 조정될 수 있다.
더욱이, TCR 에 대한 후속되는 MHC- 제한 항원 제제가 이입인자- 함유 T 세포에 대한 이차 면역 반응 표현형을 결과시키는 반응에 참여하는 것으로 여겨진다. 더욱이 이입인자는 이입인자 -함유 T세포에 의해 세포외 환경으로 방출되고, 순수한 T 세포 근처로 도입되고, 이들이 이입인자 생성 세포에 작용하는 바와 같이 이들 세포에 대해 유사한 효과를 행사할 수 있는 것으로 여겨진다. 이는 외인성 전이 인자가 순수한 수용자 동물 또는 사람에 대한 DTH 반응을 자극함을 보이는 실험 생체 내 모델로부터의 결과와 상응할 것이다. 순수한 T 세포내의 유입은 이입인자를 결합시키는 이들 세포의 표면상에 아직 규정되지 않은 수용체를 포함할 수 있다. 버어넷41은 이입인자에 대해 구조에 있어 상보적인 소형 수용체의 존재를 제안하였다. 그러므로, 특정 항원 특이성의 이입인자에 대해 그 이입인자를 특이적으로 결합할 소형 수용제가 존재할 것이다. 본 명세서에 설명된 모델에 대해, 비 -다형성 수용체가 제안된다. 상기 이입인자 수용체에 대한 어떠한 증거도 소용없으나, 수용체에 대한 후보자로서 기억 T 세포보다 순수한 T 세포로 더욱 다량으로 표현되는 CD-45R 과 같은 분자를 생각할 수 있다.
이입인자는 이입인자에 상응하는 항원에 대한 특이성을 갖는 T세포 내에서만 단지 작용하는 것으로 여겨진다. 그러므로, 이입인자-방출 T세포 근처의 임의의 T세포가 임의의 이입인자를 결합하고 흡수하는 능력을 가질 수 있으나, 적합한 이입인자를 흡수하고 이어서 공통 유전형 항원 제공 세포(APC)에 의해 적합한 항원이 제공되는 것만 이입인자 특성에 대해 반응할 것이다.
이입인자는 항원에 대한 이입인자의 특이 결합을 통해 T세포 활성화에 참여하는 것으로 여겨진다. 이입인자 활성의 유전학적 조절 연구로부터의 결과는, 그렇지 않으면 내인성이 결정성 선택 메카니즘을 통해 분명한 시스템에서 낮은 반응자 생쥐에게 높은 반응자 표현형을 수여할 수 있음을 지시한다.
한 실험에 있어서, DTH 반응성이 고 반응체 BALB/c By (H - 2d)생쥐로부터 이입인자 제제를 사용하여 저반응체 CBA/J (H - 2k)쥐에서 당 오브알부민 또는 오브알부민 면역우성 펩티드에 대해 실시되었다. 이러한 실험으로부터 H - 2k 생쥐의 상기 항원에 대한 반응의 실패는 H - 2k류 II 항원에 결합하는 항원성 오브알부민 펩티드의 활성에 기인된다는 것을 알수 있다. 또한, 이러한 결과는 특정 방법에 따라 이입인자들이 손상되지 않은 단백질 항원(닭의 오브알부민)에 결합 한다는 것을 시사한다. 부가적으로, 이러한 결과들은 T세포에 항원을 부여하는 이입인자에 대한 역활과 부합되는 것이다. 이것은 APC 8면에서의 MHC 생성물/이입인자/항원 컴플렉스의 형성을 통해 일어날 수 있다. 이질 유전체 및 외래 유전계에서의 이입인자 활성의 관찰은, 이입인자가 MHC생성물에 결합하는 초항원에 제시되었던과 것과 유사한 방법에 따라 항원 -결합 단편 단부에서 MHC-암호화 분자의 보존 부와 상호 작용한다는 의견과 일치한다. 따라서 이입일자 결합 항원이 항원 - 결합 단편에 위치하는 배향으로 항원 - 결합 단편단부에서 이입인자가 결합하고 있는 MHC -암호화 분자는 작용성 MHC 생성물/이입인자/항원 컴플렉스의 배열로 이루어진다.
실험적 생체내 모델로부터, 이입인자 활성이 폐지되는 수용체에게 투여하기 전에 용액중의 손상되지 않은 균질의 항원과 이입인자가 상호 작용한다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 이입인자가 항원과의 상호 작용전에 면역계 성분과 상호 작용해야 한다는 것을 시사해준다. 이것은 계속 관찰되는 DTH 반응에 대한 항원 도전 전에 이입인자를 투여라야 한다는 것을 보여주는 결과와 일치한다. 또한, 이러한 현상은 생리학적 조건과는 관련 없으며, 이입인자는 이입인자 활성의 완전한 보유와 함께 생체내에서 항원과 정상적으로 상호 작용할 수 있다. 이입인자 항원 - 결합 작용의 유용성은 항원 부여에 대한 항원 경쟁을 감소시킬 수 있다. 즉, 이입인자의 다른 항원과의 결합이, 그렇지 않으면 많은 자기 항원들이 MHC 분지와 결합하기 위해 효과적으로 경쟁해야하는 조건하에서 상기 항원들의 T 세포에의 부여를 용이하게 해준다.
요약하면, 이입인자의 기능적 활성은 다음의 MHC 제한 항원의 이입 인자 함유 T 세포로의 제시를 가능케한다고 생각된다. 이 활성은 이들 세포에 관한 이차 면역반응 표현형을 결과시키는 메카니즘을 통해 이입인자 함유 T세포에서 발현될 것이다. 또한 이입인자는 자극.된 T세포에 의해 부근의 소박한 T 세포 표면상의 이입인자 수용체 분자와 결합하는 세포외 환경으로 방출된다고 생각된다. MHC 제한 항원제시 후, 이들 세포는 또한 이차 면역반응 표현형을 채택할 것으로 생각된다. 또한 T세포에 의해 방출된 이입인자는 이입인자의 특이항원 결합활성을 통해 발현되고 항원 제시세포의 표면에서 MHC 생산물/이입인자/항원 복합체의 형성을 통해 용이하게될 수 있는 항원 제시에서 역할을 하는 것으로 생각된다.
정제 전략은 종래 기술에 의해 고찰되지 않은 몇몇 고찰을 근거로 했다. 이입인자에 관해 한정하고 가장 잘 확립된 검정은 지연형 과감작에 관한 생체내 검정이다. 그러므로, 정제공정동안 내내 이입인자의 생물학적 활성을 보존할 필요가 있었다. 둘째로, 이입 활성에 관한 생제 내 검정은 전통적으로 일회 투여량 샘플을 사용하여 수행하였다. 이 방법은 이입인자 활성의 존재에 관해 중요한 정성적 정보를 제공하는 반면에, 정제 공정을 적절하게 감시하기 위해서 정량 검정을 개발하는 것이 필요했다. 셋째로, 이입인자의 퍼코몰 양을 나타내는 초기의 실험은 조직의 그램양으로부터 얻었다. 더욱이, 생화학적 특성결정 및 구조 연구를 위해 충분한 질 및 양의 물질을 제공하는 방법이 조사되었다.
시료 취급을 최소화하는, 따라서 비특이적 샘플의 손실을 최소화하는 관심사에서, 휘발성 완충액을 정제공정동안 내내 사용하였다. 또한 트리플루오로아세트산 및 아세토니트릴 같은 통상의 고압 액체 크로마토그래피 용매는 이입인자를 불활화하는 것으로 밝혀졌다. 그러므로 생물학적 활성에 영향을 미치지 않으면서 이입인자의 정제를 가능케하는 새로운 용매계를 고안하는 것이 필요했다.
넷째, 예비 자료는 비교적 대량의 이입인자 활성을 가진 시료조차 235nm 이상의 파장에서 단지 소량의 빛을 흡수함을 나타냈다. 따라서, 단파장에서의 유용성을 갖는 크로마토그래피 용매개가 선택되었다. 개발된 전략은 제1도에서 나타낸다. 제1도에서, 2개의 고압 액체-크로마토그래피 단계는 반대로 될 수 있다. 즉, 다형 (갤 여과) 고압 액체 크로마토그래피가 먼저 수행될 수 있고 역상 고압 액체 크로마토그래피가 두번째로 수행될 수 있음을 주목해야 한다. 몇몇 경우에, 원하는 비활성은 친화정제 단계 후에 얻을 수 있다.
비활성은 214nm 에서 흡광 단위당 이입인자 활성으로 환산하여 정의된다. 실질적인 분량의 샘플이 통상의 단배질 측정에 필요했기 때문에, 및 팹티드 및 단백질의 검출을 위한 비파괴적 수단인 단파장의 UV광선의 흡광이 허용되기 때문에 이 비활성의 측정이 개발되었다. 단백질 농도와 이입인자 활성 단위를 관련시키는 이 계의 개발은 비활성이 정제공정 동안 내내 감시되도록 했다.
요컨데, 분리 절차는 항원 특이적 이입인자의 항원과의 결합을 유리하게하는 조건 하에서 이입인자가 특이적으로 결합하여 이입인자 : 항원 복합체를 형성하는 고착된 항원에 이입인자 함유 샘플을 접촉시키는 단계로 구성되는, 실질적으로 순수한 이입인자의 생산 방법이 다. 그런다음 항원 특이적 이입인자는 복합체로부터 분리된다. 그런다음 항원 특이적 이입인자는 첫번째의 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼에 적용시킨다. 항원 특이적 이입인자를 첫번째의 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리한 다음 두번째의 겔여과, 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼에 적용시킨다. 2개의 고성능 액채 크로마토그래피 컬럼 단계는 반대로 될 수 있다. 그런다음 실질적으로 순수한 이입인자를 두번째의 고성능 액체 코로마토그래피 컬럼으로부터 용리하며 항원 특이적 이입인자는 214nm에서 흡광 단위당 적어도 5, 000단위의 비활성을 갖는다.
다음의 특정한 실시예는 소합텐에 대한 생물의 면역반응을 강화시키기 위해 사용되므로 본 발명을 설명할 것이다. 다른 실시예는 당분야의 업자에게 명백할 겆이고 본 발명은 이들 특정한 설명적 실시예에 제한되지 않음을 알 것이다.
[실시예 1]
이 실시예는 이입인자를 함유하는 조 투석물의 조제를 설명한다.
피터센 일동42에 따라서, 임의로 물과 펠렛 사료로 사육한 8 - 14주령의 100 - 150 BALB/cByJ 생쥐군을 감작시켰다. 이것은 수용액 내의 페리턴 또는 계란 알부민을 동량의 한크의 균형잡힌 염용액 (HBSS) 및 프로인드 완전 보조제에 유화시켰음을 의미한다. 각 생쥐는 40㎕부피로 감작 항원 100㎍을 받았고, 이는 꼬리 기부의 두 부위에 피하주사 되었다. 3주후, 6마리 생쥐를 무작위로 선택하여 진연형 과감작 검정을 했다. 이 검정은 HBSS 25㎕ 내의 항원 100㎍ 주사를 포함했고, 이는 뒷발바닥으로 피하 주사하였다. 반대쪽 발다닥을 HBSS 25㎕로 주사하였다. 검정에서 사용된 항원은 앞서의 생쥐에게 투여된 것과 동일하였다. 발바닥의 두께는 숫자 계기 측미계를 사용하여 주사전 및 18시간 후에 측정하였다. 이들 값 간의 차이로부터 접수를 취했다. 퍼터슨 일동에 의한 이전의 실험연구는 최대 팽윤이 주사 18 - 24시간 후에 일어남을 나타냈다.
피험 생쥐가 희석제에 대한 반응보다 항원에 대해 상당히 큰 발바닥 팽윤 반응을 가지면 (p 0.05), 군내의 모든 생쥐를 희생시켰다. 비장을 무균적으로 제거하고, 세포를 살균 60 메쉬 스테인래스강 스크린을 통해 부드럽게 밀어냄으로써 단일세포 현탁물을 조제하였다. 세포를 HBSS로 3회 세척하고, 부분표본을 제거하고 생체 배제 염료로서 트리판 블루를 사용하여 단핵 세포를 계수했다. 전체의 생육성은 언제나 90%이상이었다. 그런다음 세포는 304 살균 프로필렌 원심분리관 내의 무균 정제수에 현탁했고, 반복된 드라이 아이스 에탄올욕조에서의 동결 및 37℃ 수욕조에서의 해빙에 의해 용해시켰다. 현미경 관찰이 용해가 본질적으로 완료되었음을 확인할 때, 정제수에서 이미 끓인 투석 주머니에 용해물을 넣었다 이들 주머니는 6000 - 8000 달톤의 분자량을 차단했다. 투석은 지속적인 교반 하에 24시간동안 살균 정제수 50부피에 대해 4℃에서 수행하였다. 이것은 연속적으로 2회 수행했다. 결과된 투석물을 모으고 동결건조하고, 동결건조된 물질은 정제된 살균수를 사용하여 108단핵세포 당량(ce)/㎖으로 재구성 했다. 0.22㎛ 필터를 통한 통과에 의한 살균, 및 혈액아가 플레이트 상에서 부분표본을 시험하는 살균성와 확인 후, 세포를 -20℃에서 보관하였다.
[실시예 2]
투석물은 커크파트릭 일동에 의헤 설명된 바와 같이 이입인자 활성에 관해 검정하였고, 이의 설명서는 참고문헌에 의해 병합된다.
휘발성 용매는 동결 건조에 의해 시료로부터 제거하였다. 샘플은 희석제로서 살균 정제수를 사용하여 밀리터당 108 단핵세포 당량의 농도가 되게 했다. 시험 물질은 생쥐당 1,0㎖ 샘플의 복막내 주사에 의해 생쥐에게 투여되었다. 다른 표시가 없으면, 6마리 생쥐가 각각의 자료점을 위해 사용되었다. 지연형 과감작에 관한 검정은 이입인자 샘플 주사 24시간 후에 개시하였다.
정제단계 사이에서 회수를 정량하기 위하여, 이입인자 1 단위는 단핵 비세포 당량 대 발바닥 팽윤 증가의 10g 10 의 투여량 반응곡선으로부터 반 최대 발바닥 팽윤반응을 일으키는 물질로서 정의하였다. 조 투석물을 제외하고, 여러가지 정제된 제제는 너무 소량의 단백질을 함유하여 실질적인 분량의 샘플이 통상의 단백질 검정에 필요하였다. 이 사용을 위하여, 제제의 비활성은 214nm에서의 흉광단위 당 이입인자 활성 단위수로 환산하여 설명된다. 여러가지 휘발성용매는 동결건조를 통해 샘플로부터 제거하였다. 샘플은 흡광도 측정을 위해 정제수에 용해시켰다. 이들 흡광또 측정은 자가차단 석영유리 마이크로큐베츠(18M-S 형 ; NSG Precision Cells, Inc., FarHingdale, NY) 및 Gilford 모델 260 UV 분광광도계(Gilford Instrument Laboratories, Inc. Oterlin, OR)를 사용하여 수행하였다.
이 검정은 참고문헌이 생채내 이입인자 검정 으로 되어질 때마다, 여기에서 설명되는 모든 활성 시험을 위해 사용되는 원안이다.
[실시예 3]
본 실시에는, 참조문헌44으로 본 명세서에 첨부된 커크패트릭 일행을 따라, 이입인자의 친화 정제를 기술한다. 이뮬론 2리무바웰 스트립(Immulon 2 Rewovawell strips)을, pH 9.6의 0.05M 탄산나트륨 완충액 내 100 - 200㎛ 농도에서 항원으로 채웠다. 웰을 4℃의 습기 찬 방에서 밤새 항온처리한 후 PBS - TWEEN 20 용액(0. 15M PBS, pH 7.4, 0.5㎖ TWEEN-20/리터)으로 3회 세척하였다. 그런다음 소의 혈청 알부민을 100㎎/㎖의 농도로 첨가하였다. 웰을 실온에서 1 시간 동안 항온처리하여 남아 있는 단백질 결합 부위를 포화시 됐다.
상기를 PBS - TWEEN 용액으로 세번이상 세척하였다. 그런 다음, 이입인자를 함유한 비세포 투석물을 108단핵 ce(세포 당량)/㎖ 및 300㎕의 부피로 적용하였다. 먼저 첨가되었던 항원에 상응하는 투석물, 예컨대, 페리틴으로 면역된 동물로부터의 세포 용해물을 페리틴 처리 스트립과 함께 사용하였다. 그런다음 스트립을 4℃의 습기찬 방에 24시간 동안 항온처리하였다.
웰을 PBS - TWEEN 20 으로 2회이상 세척한 다음 PBS 로 1회 이상 세척하였다. 상기 후, 아세토니트릴 300㎕를 첨가하였고, 웰을 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 상청액을 제거하고, 2.4 × 108cc (2.4㎖)에 상응하는 양을 상기된 생체 내 이입인자 검정을 위해 따로 제쳐두었다. 샘플을 37℃ 수욕내 질소하에서 건조시켰다. 검정용 샘플을 정제수를 사용하여 107ce/㎖로 재구성하였다. 부가의 정제 단계에서 사용된 물질을 5mM 이탄산 암모늄 1 내지 5㎖ 에 용해하였다. 상기 물질의 사용은 본 명세서에 기술된다.
[실시예 4]
그런다음 친화 정제 이입인자를 역상 고압 액체 크로마토그래피에 적용하였다. 여기에서 통상적인 컬럼 용매, 즉 트리플루오모아세트산 및 아세토니트릴의 사용은 이입인자의 불활성화를 결과시킴을 주목해야 한다. 그러므로, 컬럼을 진행시키기 위한 새로운 용매계는 이입인자 활성을 보존하도록 고안되어야 한다.
10 내지 30 × 108ce 를 정제수 0, 2 내지 0.5㎖ 부피에 용해하고, 상기를 유량 1.0㎖/min 의 5.0mM 이탄산 암모늄을 사용하여, 4.6 × 250mm Vydac, 218 TP 54 옥타데실실란 컬럼에 적용하였다. 분류물을 1분 간격으로 수집하고, UV 자료는 검출을 허용하였다. 상기를 203 내지 280nm, 및 감시 흡광도 214nm 에서 1.0초 간격 이상으로 취해진 UV 스펙트럼 자료를 경유하여 행해졌다.
여기에 제시되지 않은 결과는, 5mM 이탄산 암모늄 및 아새토니트릴을 사용할 때, 용출액의 0 - 60%범위의 아세토니트릴로, 모든 이입인자 활성은 기공률로 용리하였음을 증명하였다. 결과로서, 5nM 이탄산암모늄을 평등적으로 사용하여 용리를 실행하였고, 보유되지 않은 피이크를 수집하였다. 보통 2.5 × 108ces 를 함유하는 부분표본은 생체내 이입인자 검정에서 이입인자를 따로 제쳐두었다. 잔류물을 친액성화(親液性化)하였고, 10mM 포름산 1.0㎖를 사용하여 재구성하였으며, 겔 여과 컬럼상의 다형 고압 액채 크로마토그래피에 의한 부가의 정제를 위해 -20℃로 유지하였다.
[실시예 5]
본 실시예는 겔 여과 컬럼상의 다형 고압 액체 크로마토그래피를 사용하는 이입인자의 정제에 관한 것이다.
컬럼의 제조업자는 샘플 성분들 및 컬럼 베드 울질 사이의 비 - 특이 상호 작용을 최소화하는 적어도 0. 1M 의 용리제 이온 강도를 추천한다. 제조업자가 추천한 것 보다 10배 더 낮은 이온 강도를 사용하여 이입인자의 최적 분해를 이루었다.
상기를 실행하기 위해, 단핵-세포 20 - 30 × 108ces를, 일련으로 연결된, 2개의 7.8 × 300mm 겔 여과 고압 액체 크로마토그래피 컬럼에다 0.2 내지 0. 5㎖ 부피로 적용하였다. 상기를 0.5㎖/㎜ 의 유량에서 펌핑된 10mM 포름산으로 용리시켰다. 이 계를 12.2㎖의 기공률을 가졌고 획분을 1.0분 간격으로 수집하였으며, 검출은 상기 지시된 바와 같이 실행하였다.
[실시예 6]
역상 고압 액체 크로마토그래피의 경우 4. 0 × 300mM 옥타데실실란 컬럼 및 이온 쌍 결합제(ion pairing agent) TBAP 사용에 의해 비교 자료를 얻었다. 출발 용매로서 5mM TBAP 및 최종 용매로서 80% 아세토니트릴을 사용하는 파일럿 실험에서 구배 용리는, 25% (v/v) 아세토니트릴 농도 이전에 모든 이입인자가 용리되었음을 지적하였다. 용매. A 로서 5mM TBAP/아세토니트릴 (92 : 8 ; v/v) 및 용매 B 로서 5mM TBAP/아세토니트릴(75 : 25 ; v/v)를 사용하여 선형 구배를 실행하였다. 구배의 형태 : 0% B(10분), 0 - 100% B (5분) 및 100% B (5.5분). 검출은 상기 된 바와 같이 실행되 며, 유량은 0.5㎖/min 이 었다.
[실시예 7]
매이에르손(Meyerson) 일행45에 의헤 개발된 겔 여과 고압 액채 크로마토그래피 방법학을 응용하여 분자량 결정을 실행하였다. 개개의 샘플을 일련으로 연결된 2개의 7.8 × 300mm 겔 여과 고압 액채 크로마토그래피 컬럼을 통해 통과시켰으며, 용리재로서 200mM NaCl 과 함게 50mM 인산칼륨 완충액을 사용하였다. 샘플을 용해도에 따라, 용리제 또는 1.0mM HCI에서 용해시켰다. 용리제의 경우 경험적으로 결정된 유량 0.49㎖/min을 사용하였다. 기공률은 12.0㎖(24.4 min)이었고, 총 투과 부피는 22.5㎖(46.0 min)이었다.
[실시예 8]
정제된 이입인자 재제를 분석하기 위해 미소투석 방법을 사용하였다. 미소투석 방법은 오버을 (Overall)46에 기술된 것의 변형이었다. 스펙트라/포어 7 투석 튜빙을 작은 사각형으로 자르고 정제수에 세척하였다. 잠재성 펩티드 결합 부위를, 펩티드 LWMRFA, Mr 823 25㎖와 함께, Mr 405 의 글루탐산 터어폴리머 25㎍/㎖를 함유한 0.1% (w/v) Na3N 용액으로 16시간 동안 4℃의 헹구어진 투석막을 항온처리함으로써 포화시켰다. 상청액을 버리고, 정제수를 관에 첨가한 후 적당하게 흔든다. 헹굼을 적어도 8회 반복하였다.
상기에 이어서, 가열된 파스퇴르 피펫의 폭넓은 말단을 사용하여 1.5㎖ 미소원심분리기 관의 뚜껑에 구멍을 뚫었다. 200 내지 1000㎕ 범위의 투석용 샘플을 관에 넣었고, 투석막 조각을 개봉된 말단을 가로질러 놓았다. 뚜껑을 닫았고, 튜브를 거꾸로하여 고정시켰으며, 500㎖ 순수한 물을 함유하는 투석 방의 내부 벽에 테이프를 사용하였다. 트랩으로 막아진 공기를 첨단부가 V 또는 후크 모양인 파스퇴르 피펫을 사용하여 제거하였고 튜빙의 작은 조각으로 덮었다.
샘플 부피에 따라, 2-6 시간 동한 일정한 3반하에 4℃에서 투석을 실행하였다. 투석물을 버리고, 필요에 따라, 상기를 반복하였다. 미소원심분리기 관을 제거하였고 미소원심분리기에서 10분 동안 원심분리하였다. 샘플을 살균 첨단부미소피펫을 사용하여 주위 깊게 제거하였다.
[실시예 9]
투여량 - 반응 연구를 스플레노사이트 투석물 및 친화 정제 물질을 사용하여 실행하였다. 상기 실험에서, 상기된 발바닥 지연형 과감작 검정을 실행하였다. 6마리의 생쥐들의 군을 각각의 자료점을 위해 사용하였고, 샘플의 i.p. 감염 24시간 후 항원을 주입시킴으로써 시험을 실행하였다. 반응은 상기 18 시간 후 취하였다.
바탕 발바닥 반응은 i.p. 샘플을 받지 않은 새앙쥐를 나타낸다. 상기는 제2도 및 3도에서 0 ce에 의해 나타내어진다. 결정 계수는 r2로 표현된다.
제2도 및 3도는 이들 자료를 제공한다. 각각의 경우에서, A는 오브알부민 특이 이입인자를 사용하여 얻어진 결과를, B는 페리턴 특이 이입인자를 사용하여 얻어진 결과를 나타낸다.
이들 자료에서, 발바닥 팽윤의 규모는 조 투석물이 사용될 때 투여량의 로그 10 에 비례한다. 상기는 로조(Rozzo) 일행에 의해 이미 관찰되었다. 결정 계수(r2)는 0.97 (제2a도) 및 0.99 (제2b도) 이었고 ; 그러므로, 자료는 그 관계를 잘 나타낸다.
제3도에 설명된 바와 같이, 곡선은 유사하지만, 결정 계수는 제3a도의 경우 0, 80 및 제3b도의 경우 0.82 로 더 낮았다.
[실시예 10]
상기된 정제 원안에 따라, 또한 상기 지적된 바와 같이, 수율 및 특이 활성도를 계산하였다. 상기 결과는 하기의 표1에 제공된다. 오브알부민 이입인자는 66%수율과 함께 특이 활성도의 46 -배향상을 제시한 반면, 페리틴 이입인자는 59% 및 53 배의 값을 제공하였다.
표 1 에서, RPLC는 역상 액체 크로마토그래피를 말하고, GFC는 겔 여과 컬럼상의 다형 고압 액체 크로마토그래피를 말한다.
1. 이입인자 활성의 단위는 ½ 극대 발바닥 팽윤 반응을 생성하는데 요구된 이입인자 함유 샘플의 양 (유도되는 단핵 세포 당량의 수로써 표현)으로서 정의된다. 비활성은 214 nm에서 흡광 단위당 이입인자 활성의 단위수로서 정의된다.
2. 중탄산 암모늄-기재 역-상 고압 액체 크로마토그래피법을 사용하여 제조.
3. 다형 적용으로 겔 여과 고압 액체 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 제조.
[실시예 11]
상기 정의된 바, 친화 정제 물질은 이온 쌍생성제로서 5mM TBAP을 혼입하는 rplc를 사용하는 크로마토그래피 분석에 적용시켰다. TBAP는 테트라부틸 암모늄 포스페이트 기재 용매계를 말한다. 이들 실험에서, 43.2 × 10 ces 400㎕부피로 적용했다. 실시예 6을 참고로 분류물을 분석했다. 주요 크로모포어는 214 nm에서 탐지하고(분류물 3, 시간=26.4분) 이입인자 활성을 함유했다. 또한 분류물 1 및 5는 페리틴 특이 이입인자를 사용하여 얻어진 자료를 나타내는, 제4도를 참고로 알 수 있는 바와 같이, 매우 낮은 수준의 활성을 나타낸다. 활성은 상기 언급된 발바닥 분석을 사용하여 측정했다.
이들 결과는 분류물 3 상에 놓이게 될 촛점을 야기 했다.
[실시예 12]
친화 이입인자의 용출 프로필을 얻었고, 전형적인 것은 제 5도에 나타내었다. 이것을 얻기 위헤, rplc를 사용하여 친화 정제 알부민 특이이입인자 23.3 × 10 ce 을 50㎕ 부피로 적용했다. 모든 이입인자 활성은 보유되지 않은 피이크 (분류물 A)에서 용출되며, 오염물은 보유된다. 이입인자 촬성을 상기 언급된 발바닥 분석을 사용하여 측정했다. 분류물 A는 17.33±1.20×10 mm(P0.001) 팽윤을 나타냈으며, 분류물 B(불순물)는 5.5±1.61×10 mm를 나타냈으며 P는 중요하지 않다.
[실시예 13]
상기 기술된 분류물 A를 검정했고, 단지, 비활성 7% 향상을 나타냈다. 그러나, 표 1에서 나타내는바, 수율은 100% 였다. 이들 자료는 동결 건조된 재구성 분류물 A 샘플의 재크로마토그래피가 필수적으로 보유되지 않은 동일 피이크를 나타냄을 보이는 연구에 의해 확인했다.
[실시예 14]
분류물 A유형 물질은, 오브알부민 특이 이입인자를 얻은 바대로 페리틴 특이 이입인자에 대해서 얻었다. 이 분류물은 2.75배 향상을 나타냈다 (표1). 그러나, 친화 정제 샙플에 비해 2배 (212%), 및 조 투석물에 비해 125% 수율임을 알 수 있다.
[실시예 15]
실시예 9에서 열거한 바와 같이, 오브알부민 및 페리틴 특이 이입인자 모두에 대해서 분류물 A에 대한 투여 반응 곡선을 얻었다. 결과는 제6a도 및 제6b도 (오브알부민 및 페리틴, 각각)에 묘사했다. 결정 게수는 각각 0. 96 및 0. 97 이다.
[실시예 16]
분류물 A페리틴 특이 이입인자 물질을 TBAP계 사용하여 분석했다.
10.5 × 10 ce 를 100㎕ 부피로 컬럼에 적용했다. 제7도에 지시하는 바, 분석은 4.7, 16. 1, 21.3 및 26.4 분에 용출하는 4개 성분을 함유했다. 이입인자 활성을 이들 마지막에 발견되었다. 구배의 용매 기선 흡광도 특성을 보정한 후, 이는 214 nm 흡광 물질의 대략 90% 에 상당한다.
[실시예 17]
분류물 A 물질은 다형 겔 여과 고압 액체 크로마토그래피를 사용하여 더 정제했다. 그렇게 하기 위해, 25.4 × 10 ce를 200㎕ 부피로 컬럼에 적용했다. 용출제는 10 nM 포름산이고, 페리틴 특이 이입인자 분류물 A에 대한 용출 프로필은 제 8도에 나타내었다. 분류물 AIII, 즉, 용출물의 제 3 분류물은, 모든 이입인자 활성을 함유하며, 더 연구했다.
[실시예 18]
겔 여과 고압 액체 크로마토그래피로부터의 페리틴 특이 이입인자 분류물 AIII를, 50 mM 중탄산 암모늄으로써 개별 분류물로부터의 50㎕ 부분표본을 중화함으로써 분석하고, 살균 정제수로 1.8 × 10 ce/ml로 희석했다. 활성을 각 분류물에 대해 분석했다. 프리 분류물은 분류물 24 - 32의 푸울을 나타내며 포스트 분류물은 47 - 60 이다. 이입인자 활성은 단지 분류물 39-42 (제9도)에서 발견된다.
[실시예 19]
투여 반응 곡선을 선행 실시예에서 실행된 바와 같이 분류물 AIII 물질 (두가지 유형)에 대해 유도했다. 이들 결과를 오브알부민 핀 페리틴 특이 이입인자 각각에 대해, 제10a도 및 제 10b도에 나타내었다. 오브 알부민의 경우, 결정 계수, Y 는 0.86 이고 1 활성 단위/1.3 × 10 ce이다. 페리틴 특이 이입인자는 0. 99의 Y 및 1 단위/1. 68 × 10 ce를 나타냈다. 이들 결과로 단일 감작 투여량의 항체가 주어지고 0.5-2.0 × 10 단핵 백혈구를 함유하는 생쥐로 부터의 비장이 알부민에 대한 이입인자의 3.8 × 10 - 1.5 × 10 단위를 생성한다는 결론을 얻었다. 페리틴에 대한 자료는 비교가능한 생쥐에 대한 3 × 10 - 1.5 × 10 단위를 제안할 것이고, 제1도의 정제 도표를 사용한다.
알부민 특이 분류물의 비활성은 분류물 A 물질의 11% 이하이나, 수율은 85% 였고, 이는 44 배 향상을 제안했다. 페리틴 특이 분류물에 관하여, 비활성 분류물 A 보다 48% 낮았으나, 친화 정제 물질보다 1.4 배, 투석물보다 75배 더 높았다. 수율은 47%였고, 누적 수율은 50% 였다
[실시예 20]
Heyerson일행 의 겔 여과 고압 액체 크로마토그래피법을, 이입인자의 분자량을 결정하는 것 뿐만 아니라 분류물 AIII 의 순도를 분석하기 위해 사용했다. 이 계에 적용한 분류물 AIII 물질의 용출 프로필을 제11도에 나타내었다. 적분 피이크 면적에 의해 양을 표시할때 214 nm 흡광 물질의 98%를 나타내는 주요 크로모포어(피이크 b)를 가지는 두 피이크가 관찰되었다. 매우 적은 양의 단백질이 통상의 투석물일 때 적은 회수가 종종 관찰되기 때문에, 그러므로 이입인자 활성에 대한 생채내 검정전에 Overalls 48(86)에 의해 보고된 미소투석법의 변형에 의해 각 피이크로부터의 물질을 탈염하였다. 앞선 실험에서, 이 기술의 사용은 이입 전이 활성의 양적 회수로 귀결했다. (자료는 보이지 않음) 미소 투석후에, 샘플을 ㎖당 4 × 10 ce 의 농도로 만들고 이입인자 활성을 테스트했다. 활성은 피이크 b내 물질에 대해 단지 탐지되었다.
자료를 각 실행에서 8개별 분자량 마아커를 사용하여 얻는 표준 곡선 (log 10 분자량 = 5. 7769 - (0. 1159) (용출 부피); Y = 0.87 ; 제12도 형태)을 얻기위해 이 계를 사용했다. 달걀 알부민을 계의 공급 부피를 결정하기위해 사용하는 한편 (12.0 ㎖), 아세톤을 총 투과 부피를 결정하기 위해 사용했다 (22. 5).
피이크 b의 체류시간을 용출 부피를 결정하기위해 사용했고(17.98㎖), 이는 교대로 4,900 달톤의 이입인자에 대한 상대적 분자 질량을 계산하기 위해 사용했다. 페리틴 특이 물질 에 대한 이입인자 활성은 17. 98 ㎖ (분류물 b)의 용출 부피와 일치했다. 분류물 a에 대한 4 × 10 ce의 수용체에 의한 발바닥 반응은 5.83 ± 2.31 × 10 mm 였고 (p는 유의하지 않음) 및 분류물 b에 대해 19. 50 ± 1.82 × 10 mm (P0. 001)였다. 분류물 b를 나타내는 피이크는 214 nm 흡광 물질의 98%를 함유했다.
분자량을 결정하기 위해, 자료를 각각의 실행에서 분자량 마아커를 사용하여 얻은 제12도에 나타낸 표준 7선을 얻는데 동일한 계를 사용했다. 분석으로 약 4900 - 약 5500 달톤의 이입인자의 추정된 분자량을 얻었다.
[실시예 21]
[정제된 이입인자에 대한 스훽트렇 자료]
피이크 b의 최대에서 취한 자외선 스펙트럽 (용매 흡광도에 대해 보정한)을 제13도에 나타내었다. 2.5 × 10 단핵 세포 등량의 물질로 부터 얻은 이들 자료는, 254 nm, 260 nm, 및 280 nm같은 이입인자 정제를 검사하는데 전형적으로 사용되는 파장을 포함하는, 235 nm 보다 더 큰 파장에서 비교적 적은 흡광도를 보인다. 사실, 이입인자는 254 또는 280 nm 보다 214 nm 에서 약 100 배 더 큰 흡광도를 가진다. 이리하여, 214nm 같은 낮은 파장의 사용을 허용하는 크로마토그래피 용매는, 자외선 분광광도계를 사용하여 크코로마토그래피를 검사할때 이입인자 탐지의 감도에 있어서 실질적 이익을 제공하는 것으로 나타났다.
[실시예 22]
정제된 AIII 분류물 이입인자의 항원 특이성을 연구하였다. 생쥐에게 오브알부밈 또는 페리틴 (1.0 ml 내 10 cc) 중 하나에 반응하여 제조된 이입인자 제제를 접종하고, 그후 24시간 만에 오브알부민과 페리틴을 접종하였다. 어떤 제제도 이종 항원에 대한 반응을 유도하지 못했지만, 두가지 제제가 모두, 이입인자가 항원 특이성을 보유하는 동종 물질과의 지연된 과민반응을 보여주었다. (제14도)
여기에 설명된 이입인자 -함유 투석물은 매우 강력한 제제들이 나타내는 매우 유사한 비활성 (오브알부민 : 214 nm 에서 495 단위 ; 페리틴:214 nm 에서 436 단위)을 보여주었다. 표 I에서의 자료는, 약 10 개 단핵 백혈구를 함유하는 한 마리의 감작 생쥐 비장에서 적어도 1000, 아마도 10, 000개의 비감응 수용체만큼 많이 충분한 지연형 민감성을 전달하기에 충분한 이입인자가 생산됨을 제시하고 있다.
친화 정제 단계에서는, 즉 이입인자가 그의 항원과 반응하는 경우에는 약 40%의 이입인자 활성 손실이 야기되지만, 약 50배까지 비활성이 증진된다. 따라서 정제된 이입인자는 아주 특이하며 매우 활성적이다.
NHHCO기제 시스템에 사용될 때의 친화 정제 이입인자는 공극 용출물내에서 용출시켰으며, 이는 물질의 높은 극성을 나타낸다. 친화 정제 오브알부민 특이 이입인자에 대하여 얻 어진 자료는 비활성에 있어서의 약간의 증가와 활성물질의 무손실을 보여준다. 페리틴 특이 이입인자는 예측할 수 있는 결과를 더 적게 제공했다. 비활성에 있어서의 2.75 배 증가는 213%의 겉보기 수율로 취해지는 것으로서, 자외선 흡광도의 감소와 결부되며, 그 중에서도 특히 이입인자의 억제제가 재거되었음을 제시할 수 있다. 실제로, 로조 일행, 볼코브스키 일행 및 고틀리브가 그러한 인자들의 존재를 제시한다 (49,50,51).
초기 연구자는 이입인자 분자의 일부가 올리고뉴클레오티드 잔기임을 주장했음이 기록되어 있다. 그러나, 기술된 공정이 이 잔기를 제거하는 것은 가능하지만 280 nm 의 상당한 흡광성의 부재를 설명할 수 없으며 생물학적 활성의 보유도 설명할 수 없다. 따라서, 항원 특이 이입인자는 약 4900 내지 약 5000 달톤의 분자량을 갖는 펩티드 분자인 것으로 보인다. 이들 이입인자는 갑응 동물에 있어서 매우 작지만 매우 효과적인 양만큼 생산된다.
[실시예 23]
[정제된 이입인자의 아미노산 조성 분석]
정제된 이입인자를 분석하여 이들 분자들의 특징과 성질들에 대한 정보를 얻었다. 이러한 목적을 위해 분류물 III (세파덱스 G-10 상의 다형 크로마토그래피로부터 얻음) 및 분류물 AIII (다형 고압 액체 크로마토그래피로부터 얻음)의 샘플을 사용하였다. 가능하다면 언제든지, 최소량의 샘플 취급을 요구하고 높은 감응성을 제공하는 비파괴적 방법을 적용하였다. 이것은 구입가능한 물질의 적은 실제량에 기인하여 중요한 것이며 실로, 몇몇 경우에 생물학적 활성을 보존하기 위해 중요하다.
아미노산 조성 분석, 환원 및 알킬화에 이은 크로마토그래피 분석 및 질량 스텍트로스코피, 겔 여과, 고압 액체 크로마토그래피, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 및 자외선 스펙트럼 분석을 수행하여 이입인자의 분자 특성과 순도를 검사하였다. 또한 정제된 이입인자의 수용체에 의한 반응물들의 항원 특이성도 연구하였다.
일차적 구조 정보를 얻기위해 수개의 전략들이 사용되었고 분할을 실시하기 위해 시아노겐 브로마이드, 트립신 또는 V8 프로테아제를 사용한 일련의 펩티드 지도화 실험후 미소공 고압 액체 크로마토그래피를 실시하였다. 이러한 실험 산물에 대해 아미노산 서열 분석을 실시하였다.
5.3 × 10 ce 보정가로 이루어진 페리틴-특이 분류물 III 물질 샘플에 대해 아미노산 조성 분석을 실시하였으며 그 결과가 표 II 에 기재되어 있다. 이러한 결과들은 65% 극성 아미노산으로 구성된 이입인자의 단백질 성질과 일치했다. 즉, 이러한 자료들은, 10 단핵 세포로부터 약 0.5 pmol 의 이입인자가 산출됨을 시사해준다.
상기 자료를 페닐알라닌의 몰 함량에 대한 표준화를 통해 몰 분율값으로 환산시컸다. 몰 분율값을 기준으로, 이입인자는 약 5, 500 달톤의 분자량을 가짐이 추정된다.
정제된 이입인자의 효력을 연구하였다. 1 × 10 단핵 비세포로부터 약 6000 단위의 패리틴 이입인자 활성도가 산출되었으며 (표 II), 10 ce로부터 약 0.5 pmol 의 이입인자가 산출되었기 때문에 DTH 반응성 표현을 위해 중요한 감응도를 유발하는데는 10 몰의 이입인자로서 충분하다는 것을 상기 결과로부터 알 수 있다. 이러한 결과는 이입인자의 큰 생물학적 효력을 제시하는 것이다.
[실시예 24]
[환원 및 알킬화 이입인자의 크로마토그래피 분석]
구조 정보를 얻기 위해 각각 디터오트레이톨 및 4-비닐피리딘을 사용하여 분류물 III페리턴 -특이 이입인자를 환원 및 알킬화시켰다. 환원 및 알킬화된 샘플을 옥타데실실란 매트릭스를 함유한 고압 액체 크로마토그래피 컬럼에 적용시켰다. 출발 용매로서 5.0 mM 중탄산 암모늄을 사용하였고 0 내지 60%아세토니트릴의 선형 구배를 결합시켜 용출을 실시하였다. 제15a도는 환원 및 알킬화 공시험(blank) 샘플로부터의 용출 프로필을 도시한 것이며, 제 15b도는 환원 및 알킬화 분류물 III 이입인자의 용출 프로필을 도시한 것이다. 비 보유 피크가 공시험 샘플에서 보다 환원 및 알킬화 분류물 III 에서 매우 컸다. 두 크로마토그램에서 또다른 뚜렷한 차이는 없었다.
중탄산 암모늄-기재 역상 고압 액체 크로마토그래피계(제15b도)로부터 비보유 분류물의 판원 및 알킬화 분류물 III 용출은 소수성의 결핍 또는 작은증가와 일치했다.
비보유 피크들을 모아 각각 세파덱스 G 10 크로마토그래피계에 적용시켰다. 제16a도 및 제 16b도는 각각 대조 및 분류물 III샘플에 대한 용출 프로필을 도시한 것이다. 단일의 유의한 피크는 실험 샘플(tR = 67. 60 분)에 관한 것이다. 비보유 분류물을 세파덱스 G-10계에 적용하면 공시험(제16a도)에 비해 단일의 보유 피크 (제16b도)을 보여준다. 즉, 원래의 분류물 III 에 비해 환원 및 알킬화 분류물 III 에 비해 은원 및 알킬화 분류물 III 에서 보유시간의 더욱 급격한 차이를 보여준다.
[실시예 25]
[정제된 이입인자의 SDS - 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 분석]
비환원 조건하에서 분류물 AIII 의 SDS - 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 분석을 실시했다. 제 7도에 도시된 결과는 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분석을 사용하여 관찰된 결과들을 지지한다. 은 염색 반응을 사용하여 과현상시킨 후 각 제재에서 단일 밴드가 관찰되었다.
오브알부민 - 특이 이입인자에 패한 밴드가 페리 틴 - 특이 이입인자에 대한 밴드보다 더욱 뚜렷하다할지라도 이 두개의 제제에서 음화적으로 염색되었고 분리겔로의 동일한 이동거리를 가진 밴드들이 산출되었다. 은을 이온상태로 부터 금속 상태로 환원시킬 수 있는 아미노산의 이러한 명시적 상대 결핍때문에 코우마씨 블루(Coomassie Blue) R-350 을 사용하여 겔을 계속해서 염색했다. 그결과, 오브알부민 - 특이 이입인자에 있어서는 뚜렷한 영역으로 둘러싸인 양의 상을 얻었지만 뚜렷함이 적었던 페리틴 - 특이 이입인자 밴드에 있어서는 밴드/바탕 콘트라스트에서 약간의 감소가 있었다. 이러한 결과는 두 이입인자에서 상대 분자량이 5,400달톤이며 각 제제의 순도가 매우 크다는 것을 시사하는 것이다.
[실시예 26]
[이입인자의 펩티드 지도화 및 절단 분류물의 정제]
이입인자에 대한 펩티드 지도화는 이입인자를 절단하는 CNBr을 사용하여 행해진다. 페리틴-특이 또는 오브알부민-특이 분류물 AIII 이입인자를 산성 용액에 용해시키고 CNBr을 가한다. 배양후, 반응 흔합물을 친액성화시키고 재조성화하여 전환상 마이크로보어(microbore) 고압 액체 크로마토그래피에 적용시킨다. 수(water)중 0. 1% TPA로부터 수중 50% 아세토니트닐로의 선형 구배가 이 목적을 위해 사용된다. 대조표준과 비교된 실험 시료에서 주목할만한 유일한 피이크가 관찰되지 않았다.
펩티드 지도화를.행하기 위해 트립신의 존재하에 페리 틴-특이 이입인자의 분류물 AIII를 배양시켰다. 반응혼합물의 마이크로보어 역상 고압 액체 크로마토그래피로부터의 용출 그래프가 제23도에 나타나있다. 대조 샘플 (제18a도)와 비교된 샘플(제18b도)를 포함하는 이입인자에 대하여 두개의 유일한 피이크가 관찰되었다. 이들 퍼이크중 어느것으로부터도 아미노산 서열자료가 물질로부터 얻어지지 않았다.
페리틴-특이 또는 오브알부민-특이 분류물 AIII 이입인자 또는 크로마토그래피성 용출액 대조 샘플을 중탄산 암모늄 및 나트륨 도데실 설페이트의 용액에 용해시킨다. V8 프로테아제를 이들 용액에 가하고 용액을 18시간 동안 배양시킨다. 배양후, 샘플을 옥타데실실란 패킹을 함유하는 1, 0 × 100 mm 역-상 마이크로보어 고압 액체 크로마토그래피 컬럼에 직접 적용시킨다. 시작 용매로 0. 01%(W/v) SDS를 함유하는 5 mM 중탄산암모늄 및 최종 용매로 0.01% (W/v) SDS를 함유하는 아세토니트릴/5mM 암모늄 중탄산염 용액 (60:40:V/v)의 선형 구배를 사용하여 용출이 수행된다.
이들 시험으로 부터 얻어진 용출 그래프는 제19도에 나타나 있다. 페리턴-특이 이입인자에 대한 )개의 용출액 대조표준 및 오브알부민-특이 이입인자에 대한 2개의 용출액 대조표준의 V8프로테아재 소화물이 마이크로보어 고압 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석된다. 본질적으로 동일한 결과가 모든 다섯개의 대조표준 샘플에 대하여 얻어진다. 이입인자에서 생긴 여덟개의 피이크들이, 용출액 대조표준 (제19a도)에 비교될 경우, 계란 알부민-특이 이입인자 소화물(제19b도) 및 페리틴-특이 이입인자 소화물 (제19c도)에 대해 관찰된다. 이입인자 용출그래프를 다른것과 비교하면, 양 제제에 대해 3개의 피이크가 일반적이고 반면 5개는 일반적이지 않다 (표 III). 5개 피이크중, 4개는 현저하나 유사한 보유시간을 갖는 것으로 나타나고 각각의 그로마토그램에서 그들의 상대적인 위치에서 유사함을 나타낸다. 각 제제는 다른 제제의 임의의 것에 비교된 그의 보유특성에 있어 전혀 상관이 없음을 나타내는 하나의 피이크를 나타낸다.
상술한 바와같이, 펩티드 및 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 선행기술의 분자는 많은 병리학적 조건의 처리에서 관련되어왔다. 정제된 단백질성 이입인자는 특이 항원으로 지연형 민감성을 전달한다는 것이 여기에 나타내져 있다. 따라서, 본밭명은, 항원에 대해 세포 조정된 면역성의 표현을 일으키기에 충분한 양으로 비 민감성 개체에 이입인자의 일정량을 투여하여 면역 결핍성이 정정되어야하거나 면역 반응이 요구되는 병리학적 조건의 처리를 포함한다.
[실시예 27]
[해르페스-특이 이입인자에 의한 만성 또는 재발성 단순 포진 감염의 치료]
이러한 치료의 주안점은 HSV-1또는 HSV-2로 감염된 배양-증명된 피부, 입술 및/또는 성기의 감염이다. 면역 림프구로부터 추출된 이입인자의 수용자를 위한 용량은 5 × 10 림프구 당량이다. 이는 실시예 1 내지 20 에서 대략 설명된 병상기록에 따라 제조된 실질적으로 순수한 이입인자 50ng이다. 합성 이입인자의 수용체는 각 치료시 약 50ng 의 재료를 받는다. 모든 제제는 상술된 정량 밭바닥 팽윤 분석에 의한 효능 시험을 거친다. 주사는 달마다 행해진다. 반응의 감시는 병해 및 증상 접수카드로 그리고 단순 포진 항원에 대한 세포-조정된 면역 반응 감시에 의해 행해진다.
[실시예 28]
[특이 이입인자에 의한 만성 점막피부의 칸디다증의 치료]
일반적 병상기록은 커크패트릭 (Kirkpatrick) 및 그린 버그(Greenberg) 52에 의해 사용된 병상기록 후에 표준화된다. 주안점은 감염 유기체의 부담을 감소시키기 위해 암포테리신 B, 플루코나졸 또는 케토코나졸 등의 항진균제로 먼저 처리하는 것이다.
면역 림프구로부터 추출된 물질로의 특이 이입인자 치료는 6 × 10 림프구 당량의 투여량을 요구한다. 이 투여량은 정화된 이입인자 60ng으로 환산되고 이는 합성 이입인자에 대해 사응된 투여량이다. 환자는 1, 2, 3 및 4개월 동안 달마다 상기 투여량을 받는다. 연속적으로, 동일한 투여량으로의 지료는 통증의 진정을 유지하기 위해 4달 간격으로 투여된다.
[실시예 29]
[이입인자로의 미코박테리아 및 곰팡이 감염의 치료]
이러한 환자에서의 면역학적으로 맞춰진 치료의 사용을 위한 합리론은 세포-조정된 면역성 및 살균 활성이 결핍될 수 있다는 관찰결과에 근거한다. 면역 결핍을 나타내는 메카니즘은 단지 부분적으로 이해되고 환자에게 있어 다른 감염과는 다소 다른 메카니즘이 있음직하다.
특이 이입인자로의 치료는 투여량당 5 × 10 림프구 (50ng의 본질적으로 순수한 전달 인자) 당량을 사용한다. 합성 이입인자로의 치료는 환자에게 영향을 주는 감염에 대해 특이적인 물질 1.2pgm을 사용한다. 각 몫의 실제 투여량은 정량 발바닥 분석을 사용하여 효능 분석에 의해 결정된다. 치료약이 달마다의 간격으로 투여되고 감염이 치료될때까지 계속된다. 상기는 본 발명의 바람직한 실시양태에 관련될 뿐이고 수많은 수정과 변경이, 청구범위에 설명된 본 발명의 정신 및 영역으로부터 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것을 이해해야 한다.
Claims (3)
- 214nm에서 흡광 단위당 5000 단위 이상의 비활성을 갖는 실질적으로 순수한 이입인자.
- 제1항에 있어서, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 상의 단일 피이크로 이동하는, 아미노산 분석에 의해 측정된 바 약 4500 내지 5500 달톤의 분자량을 갖는 214nm에서 흡광 5000 단위 이상의 비활성을 갖는 실질적으로 순수한 이입인자.
- 214nm에서 흡광 단위당 5000 단위 이상의 비활성을 갖는, 미생물에 대해 특이한 실질적으로 순수한 이입인자의 치료학적 유효량을 인간을 제외한 동물에게 투여시키는 단계로 구성되는, 미생물에 의해 감염된 인간을 제외한 동물의 치료 또는 예방 방법.
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