CZ20032573A3 - Způsob výroby očkovací látky - Google Patents

Abstract

Způsob výroby autologní protilátku-obsahující očkovací látky, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje následující kroky: poskytnutí protilátku-obsahující tekutiny z autologní protilátku-obsahující tělní tekutiny nebo z autologního buněčného nebo tkáňového preparátu, uvedení do styku protilátku-obsahující tekutiny s pevným nosičem, na kterém jsou imobilizovány ligandy, které váží určitou skupinu protilátek, s výhradou, že se jako ligandy nepoužijí protilátky nebo jejich fragmenty se stejným idiotypem, které jsou řízeny proti s nádorem-sdruženými antigeny,získání protilátek, které jsou vázané na ligandech, a zpracování získaných protilátek na autologní očkovací látku, která obsahuje imunogenní množství více než jednoho mikrogramu protilátek.

Description

Způsob výroby očkovací látky

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby očkovací látky.

Dosavadní stav techniky

Vyšší organizmy jsou vybaveny imunitním systémem, který je chrání před potenciálně nebezpečnými látkami nebo mikroorganizmy. V případě, že nějáká látka (antigen) vnikne do těla, je rozpoznána jako cizí látka a je eliminována pomocí imunitního systému. Imunitním systémem jsou obvykle rozpoznámy také degenerované tělu vlastní buňky a tyto buňky jsou imunitním systémem rovněž eliminovány.

Adaptivní imunitní systém lidí je tvořen dvěma základními složkami, kterými jsou humorální a celulární imunita. Adaptivní imunitní odezva je založena na klonální selekci B- a T-lymfocytů a principiálně umožňuje rozpoznání každého libovolného antigenu a vytvoření imunologické paměti. Tyto znaky adaptivního imunitního systému jsou užitečně využívány při očkování.

Každá B-buňka produkuje protilátku s určitou vazebnou specifičností. Tato protilátka se nachází jako specifický receptor také na membráně B-buňky, která tuto protilátku produkuje. Humorální imunitní odezva proti antigenu • · a · ·· ···· rozpoznanému jako cizí subjekt je založena na selektivní aktivaci těch B-buněk, které produkují takové protilátky, které se mohou vázat na epitopech daného antigenu. Rozmanitost protilátek je rozhodující měrou způsobena DNA-přesmyky v průběhu diferenciování B-buněk.

V lidském krevním seru se nechází ve velkém množství protilátky s nejrůznějšími specifičnostmi, isotypy a podtřídami. Celková koncentrace veškerých imunoglobulinů v krevním séru činí 15 až 20 mg/ml, což znamená, že v lidské krvi trvale cirkuluje asi 100 g imunoglobulinu nejrůznějších specifičností. Není možné udat přesný počet všech protilátek s nejrůznější specifičností, přičemž repertoir různých klonů B-buněk v lidském těle činí asi 10^θ. Každá určitá protilátka se může obecně vázat různé vzájemně podobné antigeny, i když s různou afinitou a aviditou.

Imunitní systém musí pomocí endogenních regulačních mechanizmů udržet homeostázu, pokud jde o rozdělení a vyváženost uvedených různých specifičností. Základním mechanizmem pro tento účel je Immunol. 125C: 373-89 (1974).

protilátky, který určuje její anti-idiotypické protilátky, které se rovněž idiotyp prvně uvedené protilátky ve smyslu idiotypová síť’ (Ann. Proti každému idiotypu specifičnost, existují váží na rozpoznání antigenu. Podle tohoto výkladového modelu jsou za regulaci imunitního systému zodpovědné výměnné účinky mezi idiotypově-specifickými receptory na lymfocytech. K těmto výměnným účinkům zjevně skutečně dochází, poněvadž bylo prokázáno, že v průběhu imunitní odezvy vznikají také anti-idiotypové protilátky proti protilátkám primárně indukovaným imunitní odezvou. Poněvadž proti každé ·

* 9 protilátce existuje anti-idiotypová protilátka, nejsou lymfocyty zásadně tolerantní vůči idiotypům protilátek.

Existuje několik možnost, jak zasáhnout do imunitního systému.

1. Pasivní protilátková terapie

Za terapeutickým účelem je možné organismu dodat protilátky, které jsou nutné k tomu, aby splnily uvnitř organismu určitou úlohu. Tento způsob použití protilátek je nazýván pasivní imunoterapií a může být použit v rámci různých medicinálních indikací, například v rámci imunoterapie rakoviny (Immunol. Today (2000), 21:403), otrav (Toxicon )1998), 36:823; Therapie (1994), 49:41) a infekcí (Clin.Infect. Dis. (1995), 21:150). V těchto případech mohou být použity protilátky, které buď pochází z odpovídajících imunizovaných zvířat nebo mohou být získány imortalizací imunoglobulinových genů z buněk různými biologickými nebo molekulárně biologickými technikami (například technika hybridomů nebo technika typu Phage-Display, atd.).

Nevýhoda pasivního podání protilátek spočívá v tom, že nepůsobí dlouhodobě, poněvadž se jejich účinek snižuje přirozeným odbouráváním podaných protilátekm v organismu příjemce.

2. Aktivní imunizace «· ··«·

Za účelem modulace imunitního systému se může použiít imunizace pomocí antigenu. Antigeny jsou molekuly, molekulové komplexy nebo celé organizmy na které se mohou vázat protilátky.

Ne všechny antigeny vyvolávají inunitní idezvu, což znamená, že ne všechny antigeny jsou imunogenní. Určité malé molekuly nejsou imunitním systémem registrovány (hapteny), přičemž lze takové malé molekuly organizmu prezentovat ve vhodné formě a učinit je tak imunogenními. Takovou metodou je kopulace haptenů na imunogenní molekulu, která je označována jako nosičová molekula.

Jinými neimunogenními antigeny jsou tak zvané vlastní antigeny, tedy struktury, které jsou imunitním systémem rozpoznány jako látky, které jsou tělu vlastní. Imunizace takovými antigeny zpravidla nevede k žádné specifické imunoreakci. V případě nádorově-přidružených antigenů představuje skutečnost, že tyto antigeny jsou vlastně vlastními antigeny, jednu z hlavních potíží při vývoji potentní protirakovinové účinné látky.

Aktivní imunizace proti původcům nemocí, jakými jsou viry nebo bakterie, prostřednictvím kompletních antigenů je možná pouze v případě, kdy je původce nemoci zeslaben nebo usmrcen. U oslabených původců nemocí však hrozí nebezpečí, že dojde k reverzi, což znamená, že by oslabení původci nemoci mohli znovu konvertovat do virulentní formy. Řešením takovéhoto problému by mohlo být použití k imunizaci anti-idiotypových protilátek ve funkci náhradních antigenů (Int. Arch. Allergy Immunol. (1994), 105:211).

• · · ·

Aktivní imunizace pomocí anti-idiotypových protilátek byla navržena také pro léčení alergií (Int. Arch. Allergy Imunol. (1999), 118:119).

Protilátky proti tělů-vlastním antigenům jsou ostatně přítomné v krevním séru každého člověka a jsou označovány jako přírodní autoprotilátky.

Anti-idiotypové protilátky takových přirozených autoprotilátek se zúčastňují regulace uvedených autoprotilátek (Immunol. Reviews (1998), 110:135; Eur. J. Immunol. (1993), 23:783).

Určitá nedostatečná idiotypová regulace se zdá hrát určitou úlohu u řady autoimunitních onemocnění:

systemický Lupus Erythematodes (Autoimmunity (1994),

17:149);

autoimunitní thyroiditida (Eur. J. Immunol. (1993),

23:2945);

systémická vaskulitida (J. Autoimminity (1993), 6:221);

Guillain-Barrův syndrom (Clin. Immunol. Immunopathol.

(1993), 67:192);

anti-Faktor VII: C-autoimunitní onemocnění (Proč. Nati.

Acad. Sci., USA (1987), 84:828).

Imunizace pomocí idiotypových protilátek, které napodobují autoantigeny, již byla v rámci autoimunitních onemocněni provedena (J. Rheumatol. (1999), 26:2602). K indukci antiidiotypových protilátek byly již popsány také • · • · · · ·« ···· peptidy (Proč. Nati. Acad. Sci., USA (1993), 90:8747;

Immunology (1999), 96:333).

Rovněž již byla navržena imunizace v rámci autoimunitních onemocnění spočívají na receptorech T-buněk (J. Immunol. (1990), 144:2167; patent US 6 090 387, patent US 6 007 815).

Aktivní imunizace byla použita také za účelem ochrany před jedovatými látkami (například před bakteriálními toxiny). Kdyby přitom měly být použity toxiny jako očkovací látka, musely by být předběžně zeslabeny, popřípadě inaktivovány. Taková inaktivace však může ovlivnit účinnost imunitní odezvy. Jako očkovací látky byly navrženy anti-idiotypové protilátky, které napodobují toxiny (Int.

J. Clin. Lab. Res. (1992) 22:28; Clin. Exp. Immunol. (1992) 89:378; Immunopharmacology (1993) 26:225).

Rovněž bylo navrženo použít anti-idiotypové protilátky k prvotní imunizaci, aby se potom dosáhlo použitím očkovací látky, která byla sama o sobě příliš slabá, vyššího specifického imunizačního účinku (Virology (1984)136:247).

3. Odebrání protilátek a imunokomplexů z krve

Jednou z možností, jak oddělit protilátky z krve je použití perfuzních systémů (patent US 5 122 112), které byly především použity u autoimunitních onemocnění (The Lancet (20.10.1979), 824). Takové extrakorporální imunoadsorpce však představují velké zatížení a vysoké • ·

4 4 4 manipulační riziko pro pacienty, takže tato metoda není vhodná pro široké použití v klinické terapii.

Aktivní imunizace za účelem modulace imunitního systému může být toho času provedena použitím určitých antigenů, které jsou však příliš toxické nebo potenciálně infekční, nebo antigenů které po toxilogocké stránce sice přijatelné ale jsou neimunogenní. Částečné řešení tohoto problému představuje použití anti-idiotypových protilátek k imunizaci. Je ale nezbytné takové protilátky buď připravit v buněčné kultuře, popřípadě in vitro nebo indukovat v určitých organismech a potom podat dalšímu organizmu.

Je proto úkolem tohoto vynálezu, odstranit nedostatky dosavadního stavu techniky a poskytnou léčivé materiály a způsoby léčení množiny onemocnění za využití imunitního systému pacienta. Zejména by přitom měla být poskytnuta účinná léčebná strategie pro léčení autoimunitních onemocnění, alergií a podobných poruch.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je takto způsob výroby autologní, protilátku-obsahující očkovací látky, který je charakterizován provedením následujících stupňů:

poskytnutí protilátku-obsahující tekutiny z autologní, protilátku-obsahující tělesné tekutiny nebo z autologního buněčného nebo tkáňového preparátu, kontaktování tekutiny obsahující protilátku s pevným nosičem, na kterém jsou imobilizovány ligandy, které se váží s určitou skupinou protilátek, za předpokla-

du, že jako ligandy nejsou použity protilátky nebo jejich fragmenty stejného idiotypu, které jsou řízeny proti s nádorem-sdruženými antigeny, získání protilátek, které vstoupily do vazby s uvedenými ligandy, a zpracováni získaných protilátek na autologní očkovací látku, které obsahuje imunogenní množství více než jednoho mikrogranu účinné látky.

Takto získaná očkovací látka může být nyní podávána vhodným způsobem. Způsob podle vynálezu řeší výše uvedené problémy dosavadního stavu techniky tím, že k indukci protilátek proti cílové protilátce se použijí tyto cílové protilátky z téhož organizmu. Proto není nezbytná ani kultivace in-vitro buněk za účelem výroby protilátek, ani jejich produkce v cizím dárcovském organizmu. Cílové protilátky jsou asi abl-protilátky se specifičností pro antigen případně pro indukci anti-idiotypových protilátek nebo ab2-protilátky, rovněž anti-idiotypové protilátky, pro vytvoření imunitní odezvy případně řízené proti anti-idiotypům a také proti antigenu.

Rovněž již není potřebné získat protilátky připravené způsobem podle vynálezu z poolu nebo plazmapoolu (viz Zouali a kol., J. Immunol. 135 (2) (1985), str. 1091 až

1096). Na rozdíl od takových protilátkových preparátů z poolu, u kterých byly protilátky shromážěny od různých individuí, mohou být za použití protilátkových preparátů podle vynálezu připraveny očkovací látky obsahující stoprocentně autologní protilátky, jejichž účinek je v idiotypové síti ošetřovaného individua zcela specifický a tím i účinnější.

• · · · ·· ····

• ♦ * • ♦ · $ · · · · · ·

Tím je možné zacílit individuální specifickou modulaci imunitního systému k dosažení požadovaného cíle. Posunutím imunologické rovnováhy očkováním očkovací látkou vyrobenou způsobem podle vynálezu se zajistí selektivní stimulace těch B-buněk, které produkují protilátky s určitou specifitou. Tato specifita může být stanovena způsobem izolace protilátek (volbou ligandů z určitého individua).

Výhodně jsou tělesnými tekutinami obsahujícími protilátky samozřejmě krev, sérum, lymfatická tekutina cerebrospinální tekutina, kolostrum (výměšek žláz mléčných za těhotenství a krátce po porodu, mlezivo), sliznicové tělesné tekutiny, jako vaginální sekret nebo nosní sekret, krevní výron, stolice nebo moč, i když může rovněž jít o autologní buněčné nebo tkáňové preparáty, které mohou být získány biopsií, přičemž tyto tekutiny se zpracují některým z o sobě známých postupů na způsobem podle vynálezu použité tekutiny obsahující protilátky. Jako výchozí materiály se v rámci vynálezu použijí především ty tělní tekutiny, které mají obzvláště vysoký obsah protilátek, přičemž obzvlátě výhodnou tělní tekutinou je přirozeně v tomto případě lidské sérum nebo plazma.

Rozhodující pro specifičnost očkovacích látek získaných podle vynálezu při ovlivněvnění idiotypové sítě je samozřejmě vždy volba ligandů v rámci daného imunitněafinitního čistění. K získání specifických protilátkových frakci mohou být použity specifické monoklonální nebo polyklonální protilátky nebo antigeny. Monoklonální protilátky nebo jejich deriváty mohou být vyrobeny o sobě známými metodami, mezi které například patří hybridomová technologie, technologie typu Phage-Display nebo rekombinace (Immunology Today, 2000, 21: celý sešit 8) . Mohou být však také použity idiotypově ·· ·♦·· nezávislé ligandy, které mohou vázat určité specifické podtřídy nebo podtypy imunoglobulinu, jako například jeden nebo několik podtypů z množiny zahrnující IgGl, IgG2, IgG3 nebo IgG4, popřípadě IgA, IgG, IgM, IgR a IgD. Dále mohou být vybrány ligandy, které rozpoznávají určitou skupinu protilátkových fragmentů nebo řetězců nebo alespoň části lambda- nebo kappa-řetězců anebo Fc- nebo Fab-fragmentů. Rovněž vhodné ligandy váží selektivně nejen protilátky, nýbrž také odpovídající isotypy nebo paraglobuliny.

Způsob podle vynálezu může být dále ještě kombinován s některým obdobným způsobem výroby autologní očkovací látky, přičemž se jako ligandy použijí také prorilátky nebo jejich fragmenty se stejným idiotypem, které jsou řízeny proti s nádorem-sdruženým antigenem nebo/a protilátkou. Přitom je v rámci zjednodušení způsobu výhodné, když se odpovídající ligandy použijí ve formě směsi. Při nákladnějších způsobech se provádí postupné nebo paralelní zpracování tělní tekutiny s různými ligandy. Tím může být například získána ze séra určitá protilátková frakce se specifitou pro buněčné adhezní proteiny nebo/a Lewisovy Y-uhlohydrátové struktuy anebo se specifitou pro B-buněčný lymfom, která může být potom bezprostředně k dispozici jako autologní očkovací formulace.

Autologní čkovací látky vyrobené způsobem podle vynálezu, které obsahují protilátky, které vystupují v souvislosti s B-buněčným lymfomem, obsahují zejména pouze určité podskupiny nebo frakce sérové frakce obsahující IgG, aby bylo zaručeno dosažení cílené imunitní odezvy.

Pro izolaci podle vynálezu mohou být použity jak protilátky, tak i protilátkové fragmenty, jakými jsou • · · ·· · < ·· například Fc- nebo Fab-fragmenty. Ligandy mohou být však také další látky, na které se mohou vázat imunoglobuliny, například ligandy pro chromatografické čistění imunoglobulinů, afinitní peptidy, afinitní polypeptidy, proteiny, jako například protein A nebo protein G, nebo iontové struktury, které se také používají při iontoměničové chromatografii.

Při výběru vhodných imobílizovaných ligandů se obvykle dbá na to, aby se zabránilo nežádoucímu unikání (leakage) ligandů nebo komplexů ligand/protilátka do takto získané izolované protilátkové frakci. V některých případech může být také použito sériové čistění protilátek, aby se případně přítomné nečistoty oddělily imibilizovanými ligandy. Unikání uvedeného materiálu může být však také výhodné, když jsou v přípravku žádoucí určité komplexy ligand/protilátka.

Výroba kvalitativně obzvláště vysoce hodnotné očkovací látky může zahrnovat další čistění získaných protilátek o sobě známými metodami, mezi které patří chromatografie, gelová permeační chromatografie, srážení separace na kapalné nebo pevné fázi, zejména na ferromagnetických částicích, nebo ultra- nebo diafiltrace.

V průběhu zpracování může být také žádoucí vyrobit formulaci jako trvanlivý roztok a to buď přidáním konzervačních činidel nebo komplexujících látek, případně přísad. Při skladování stálá forma provedení autologní očkovací látky vyrobené způsobem podle vynálezu je zejména žádoucí v případě, kdy musí být pacient vícekrát imunizován stejným přípravkem v časových odstupech.

·· ····

Na druhé straně může být podání vždy čerstvě vyrobené očkovací látky výhodné tím, že jsou vždy znovu zohledněny změny imunitního systému a že může takto být dalekosáhle zabráněno výskytu ’’escape-mutantů z buněk produkujících protilátky nebo z infekčních činidel. Proto je vhodné jednoduché zpracování získaných protilátek na očkovací látku, které může být v nej lepším případě provedeno na místě samém. Takto může být očkovací látka vyrobená způsobem podle vynálezu použita bezprostředně po odběru krve ještě týž pracovní den nebo dokonce ještě během pacientova ošetření.

Další forma provedení způsobu podle vynálezu se týká deplece složek tělní tekutiny, které jsou v očkovací látce nežádoucí. Takto mohou být ligandy zvoleny tak, aby selektivně nevázaly určité protilátky, avšak vázaly pouze doprovodné látky, přičemž se uvedené určité protilátky získají z nevázané frakce.

Pod pojmem individua se v rámci vynálezu rozumí jednotlivé lidské nebo zvířecí organizmy, které vlastní tělní tekutiny nebo tkáně obsahující protilátky. Výhodně se způsob výroby očkovací látky samozřejmě aplikuje u obratlovců , obzvláště výhodně u savců, zejména lidí.

Izolace protilátek ze zvířecích tělních tekutin obsahujících protilátky (například lidské sérum) pomocí afinitního čistění může být přitom provedena o sobě známými postupy (Clin. Chem. (1999), 45:593; J.Chem. Technol. Biotechnol. 48 (1990), 105). Obzvláště výhodné je imunoafinitní čistění na pevné fázi. Při tomto postupu se na pevné fázi imobilizuje určitý specifický ligand nebo směs různých ligandů. Pevnou fází může být přitom membrána, • · · · · ·

gel, chromatografický materiál nebo obdobný materiál, na kterém mohou být ligandy kopulovány bez podstatné ztráty jejich specifických vazebných vlastností (Mol. Biotechnol. (1994) 1:59).

Za účelem bezprostřední výroby očkovací látky způsobem podle vynálezu může být k dispozici již hotová souprava. Tato souprava bude obsahovat následující složky:

a) přípravek s ligandy pro vázání určité skupiny protilátek z tekutiny individua obsahující protilátky,

b) prostředek pro získání protilátek, které jsou vázány ligandy a

c) prostředek pro zpracování získaných protilátek na autologní očkovací látku.

Přípravekem a) je zejména nádobka, přístroj nebo automat pro manuální nebo automatické ovládání. Přípravek

a) obsahuje předložené ligandy, které jsou případně imobilizovány na pevném nosiči. Rovněž může být přítomen pufr, který umožňuje adsorpci protilátek po přivedení tělní tekutiny do přípravku za kontrolovatelných podmínek.

Prostředek b) obsahuje látky nebo roztoky látek pro promývání nebo čistění, popřípadě desorpci protilátek. Pod tím se rozumí promývací nebo/a eluční pufr. Kromě toho je v soupravě podle vynálezu k dispozici také formulační prostředek včetně možného adjuvans, pokud toto formulační činidlo již není obsaženo v prostředku b) pro získání protilátky.

• · · · • · • · ··

Tak se například ukázalo, že protilátky mohou být například adsorbovány na obtížně rozpustnou sloučeninu hliníku, načež mohou být tyto protilátky v témže zařízení promyty, uvedeny do styku s jiným pufrem a konfekcionovány na hotovou očkovací látku, která již obsahuje sloučeninu hliníku jako adjuvans. Potom totiž může být v soupravě podle vynálezu zapotřebí pouze jeden jediný prostředek pro získání protilátek a jejich zpracování na očkovací látku namísto separátních složek b) a c) . V této soupravě mohou být případně přítomné dodatečná pomocná činidla, jakými jsou promývací a pufrovací látky.

Vhodné ligandy mohou být také vázány na magnetické kuličky, které mohou být za použití magnetu jednoduchým způsobem lokalizovány, popřípadě orientovány nebo polohovány. Určitý ligand se například váže na feromagnetické částice a takto předloží do sterilní nádobky určené pro pojmutí tělní tekutiny. Když se v nádobce uloží také magnetický transportní díl nebo transportní tyčinka, mohou být částice, na kterých jsou vázány protilátky z tělní tekutiny, zapnutím a vypnutím magnetu pomocí elektrických impulzů uvádějících v činnost elektromagnet shromážděny na transportním dílu. Potom mohou být částice odděleny, výhodně za udržování magnetického pole. V průběhu promývacího procesu nebo desorpce protilátek může být magnetické pole znovu zrušeno. Potom je opětovně účelná imobilizace částic na magnetu, aby bylo možné oddělit, popřípadě získat promývací roztok popřípadě s desorbovanou protilátkou.

Obzvláště výhodná forma provedení soupravy pro výrobu autologní vakcíny zahrnuje sterilní, endotoxinu-prosté nádobky, výhodně nádobky pro jedno použití, u kterých se předpokládá pouze jediná aplikace, jako jsou injekční • Φ ···· • · · φ φ · φ φ · • φ · · ·· ·· stříkačky, které jsou případně vzájemně spojeny a opatřeny přepážkou (viz obr.4).

Takto například první nádobka obsahuje ligandy potřebné pro adsorpci protilátek a vázané na ferromagnetické částice (tělíska). Komerčně dostupnými tělísky jsou aktivované porézní skleněné kuličky typu Prosep (Millipore, Durham, Velká Británie), Dynabeds (Deutsche Dynal GmbH, Hamburg, Spolková republika Německo) nebo podobný materiál od firmy Miltenyi (Bergisch Gladbach, Spolková republika Německo). Dále je v této nádobce, případně separátně, předložen adsorpční pufr. Přes přepážku se zavede lidské sérum. Dále se v uvedené nádobce nachází vhodný magnet pro imobilizování tělísek po adsorpci protilátek, případně po promytí a desorpci. Přes přepážku se zavede definované množství promývacího pufru. Přes fritu je potom promývací roztok z nádobky odveden. Eluce protilátek může být provedena v separátní eluční nádobce s eluční pufrem, do které se tělíska s naadsorbovanými protilátkami převedou. Po eluci protilátek se tělíska imibilizováním na transportním dílu a odstraněním tohoto transportního dílu oddělí od roztoku. Potom se přes přepážku přidá formulační roztok. Formulovaný roztok se natáhne do injekční stříkačky a je takto připraven k podání pacientovi. Jednotlivé nádobky jsou vždy vybaveny jednou nebo několika přepážkami pro převod roztoků nebo suspenzí, jakož i fritami pro oddělení fází.

V rámci specifické formy provedení má souprava formu nádobky, která obsahuje ligandy a prostředky b) a c) . V případě jediného prostředku namísto dvou různých prostředků

b) a c) může být rovněž výhodné použít toto činidlo ve formulaci také společně s ligandy. Takto může být zvolen nosič ligandů, který se také používá k získání protilátek a ·· ···· • · · • · · • ·

• · · • · · • · · · • · · • · · • · · · ·· ·· má adjuvantní účinek. Takovým nosičem je obtížně rozpustná sloučenina hliníku, jakou je alugel nebo hydroxid hlinitý. V tomto případě jsou sice ligandy obsaženy ve farmaceutickém přípravku společně se získanými protilátkami, což je však v případě komplexu protilátka-ligand, který jako takový působí jako očkovací antigen, naprosto žádoucí.

Vázání protilátek z tělních tekutin individuí k ligandům může být provedeno ve směsném loži (batchweise) nebo v průtokovém systému. Imunitně affinitní čistění může být provedeno na chromatografické koloně automaticky nebo za použití manuálního postupu; je však také myslitelné, že uvedený způsob se provádí za použití jednoduchého zařízení, které obsahuje imobilizované ligandy, manuálně, automaticky nebo poloautomaticky.

Konečně je pro izolaci protilátek podle vynálezu z individua nutné, aby mohly být požadované protilátky v podstatě odděleny od dalších nežádoucích látek z těla. Předpokládá se, že tohoto cíle může být dosaženo i dalšími separačními postupy, jakým je například výše popsané imunitně afinitní čistění, například reakcí ligandů s protilátkami a následným oddělením specifických imunokomplexů od látek, které do komplexu s ligandy nevstoupily. Protilátky mohou být také vázány na ligandy a popřípadě získány v kapalné fázi, v koloidním roztoku nebo v emulzi nebo postupem označovaným jako Immune Affinity Partitioning.

V souladu s tím se vynález také týká způsobu výroby autologní očkovací látky obsahující protilátky, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje následující stupně:

• · • · · · · · • · * ···· ·· · 4 4 4 4 4 4 4 4 • «4 4 * 4 4 4 4 4

44 444 4444

...... .........

poskytnutí tekutiny obsahující protilátky z individua, uvedení do styku uvedené tekutiny s ligandy, které se váží k určité skupině protilátek, za předpokladu, že se jako ligandy nepoužívají protilátky nebo jejich fragmenty stejného idiotypu, které jsou řízené proti antigenům sdruženým s nádorem, oddělení všech látek, které nejsou ligandy vázány, uvedení do styku protilátek vázaných na ligandech s elučním činidlem, takže dojde k eluci protilátek vázaných k ligandům, získání protilátek, které vstoupily do vazby s ligandy, v eluátu a zpracování získaného eluátu na autologní očkovací látku, která obsahuje imunogenní množství více než jednoho mikrogramu protilátky.

V podstatě se očkovací látkou podle vynálezu potlačují nežádoucí protilátkové aktivity. Inhibující protilátky mohou být například terčem ( targit) a mohou být v rámci vynálezu izolovány a formulovány na očkovací látku cílenou proti těmto nežádoucím inhibujícím protilátkám. Očkovací látka vyrobená způsobem podle vynálezu se používá pro profylaktickou nebo/a terapeutickou aplikaci u chorobných stavů, které souvisejí s nádorovými onemocněními, autoimunitními onemocněními , alergiemi nebo infekčními onemocněními. Nežádoucí imunitní reakce, ke kterým může docházet v souvislosti s transplantacemi, jsou další indikační oblastí očkovací látky vyrobené způsobem podle vynálezu.

Takto mohou být léčeny pacientky, u kterých se tvoří protilátky proti spermatu a které takto trpí získanou ·· 4444 · ·* 44 4444 • · 4 4444 44 4

444444

4 * 444444 4

44 444 4444

4444 4 4 444 44 4 4 44 sterilitou. Když se tyto autologní protilátky získají z odpovídající tělní tekutiny, jakou je vaginální sekret, a zpracují způsobem podle vynálezu na očkovací látku, může být tato očkovací látka bezprostředně použita pro léčení uvedených pacientek s cílem potlačit tvorbu uvedených nežádoucích protilátek. Získané očkovací přípravky obsahují zejména IgA-protilátky, které mohou být přijmuty především přes sliznice. Výhodným podáním je proto nasální nebo vaginální podání.

Pomocí očkovací látky s protilátkou vyrobené způsobem podle vynálezu může být také u pacientek léčena Rh-faktor-nesnášenlivostní reakce. Ženy, které jsou Rh-negativní a jsou přivedeny do styku s krví, popřípadě tkání Rh-pozitivních osob, vyvíjejí protilátku proti tomuto Rh-faktoru. Takto může například Rh-negativní pacientka, která v těhotenství nosila Rh-pozitivní plod, vyvíjet protilátky proti tomuto faktoru. Tyto protilátky je třeba potlačit, aby se zamezilo uvedené nesnášenlivostní reakci v průběhu druhého těhotenství s Rh-pozitivním plodem. Proto se způsobem podle vynálezu získá uvedená protilátka pro tomuto Rh-faktoru a formuluje se na imunogenní očkovací látku. Aktivní imunizace se potom výhodně provádí jako profylaxe před plánovaným těhotenstvím.

Očkovací látkou varobenou způsobem podle vynálezu může být také podpořena transplantace allogenních materiálů, jakými jsou například kostní dřeň nebo kmenové buňky. Případné odmítavé reakce indukované HLA-antigenovými strukturami mohou být potlačeny podáním očkovací látky, která obsahuje autologní protilátky proti cizím HLA-strukturám.

• · · 9 9 9 • 9 · 9 9 9 9 99 4

990044

4 · 099409 0

04 940 9044

9999 99 999 99 99 49

Příprava xenotransplantací je další oblastí, kde je možné potlačit možné odmítavé reakce vyvolané transplantáty. Vysoká hladina přírodních protilátek proti známému α-Gal-epitopu, které se nacházejí v krevním séru lidí, jsou spoluzodpovědny za akutní odmítavé reakce proti xenotransplantátům nebo allogenním transplantátům. Tyto přírodní anti-a-Gal-protilátky se způsobem podle vynálezu formulují na očkovací látku, která se potom podává pacientům, kteří se připravují k transplantaci tkáně, kostní dřeně nebo kmenových buněk. Snížení anti-a-Galaktivity by mělo napomoci zabránit odmítavým reakcím. Snížení hladiny cirkulujících anti-a-Gal-protilátek imunizací autologními anti-a-Gal-protilátkami by mělo umožnit významné prodloužení doby přežití xenotransplantátů.

Volba ligandů, určených pro izolaci protilátek způsobem podle vynálezu, závisí na odpovídajícím použití získané očkovací látky. V následující části popisu jsou tato použití očkovacích látek získaných v rámci vynálezu příkladně zmíněna.

Použití při autoimunitních onemocněních

Autoantigeny jako ligandy mohou být například použity pro izolaci autoimunospecifických protilátek z daného individua. Takto získané protilátky mohou při použití v rámci vynálezu vyvolat u individua imunitní odezvu , která zejména reguluje směrem dolů produkci specifických auto-protilátek mechanismem idiotypových interakcí.

·· · · • · · · · ·

U mnoha autoimunitních onemocněni není známa přesná specifita autoreaktivních protilátek. Není však bezpodmínečně nutné, aby byly k izolaci autoimunospecifických protilátek podle vynálezu použity autoantigeny jako ligandy. U autoímunitního onemocnění může existovat extrémně nadproporcionální protilátková specifita, takže čistěním celkové imunogiobulinové frakce (známými biochemickými postupy) u daného individua a následné formulování do formy očkovací látky a podání této očkovací látky dárcovskému individuu vyvolá především tvorbu anti-idiotypových protilátek proti nadproporcionálně zastoupené protilátkové specifitě.

Takto se například pacienti trpící chorobnými stavy, které souvisejí s inhibujíčími protilátkami proti srážecím faktorům, inzulínu nebo také revma-faktorům, léčí očkovací látkou vyrobenou způsobem podle vynálezu. K tomu účelu použité očkovací látky obsahují protilátky proti inhibujícím protilátkám nebo revma-faktorům.

Použití při alergiích

Za účelem výroby vakcíny s pro pacienta specifickými protilátkami proti alergiím lze jako ligand použít anti-IgE protilátky nebo části takových protilátek se stejnou specifitou. Jako ligandy jsou však také myslitelné alergeny nebo části alergenů.

Použití v rámci toxických látek • · ····

91 0 1 11

Za účelem čistění protilátek z daného individua, které by mohly spustit toxin-specifickou imunitní odezvu, mohou být jako ligandy použity toxin-specifické protilátky. Takové protilátky jsou v mnoha případech k dispozici jako monoklonální látky. Je však také myslitelné použít pro čistění jako ligand nikoliv protilátku, nýbrž jiné molekuly, které jsou schopné zcela specificky vázat určité toxiny (například bakteriální toxiny nebo nízkomolekulární jedy).

Namísto pouze jednoho ligandového druhu mohou být samozřejmě na pevném nosiči imobilizovány v rámci způsobu podle vynálezu také dva nebo více ligandů s různou specifitou a tímto způsobem se získají preparáty s protilátkami, které jsou obohaceny nebo ochuzeny, pokud jde o jednotlivé vazebné vlastnosti (protilátky s různou specifitou). Analogicky je také výhodné při výrobě multispecifických očkovacích látek podle vynálezu sériové řazení více imunoadsorpčních kroků s rozdílnými specifitami.

Je také možné opatřit pevný nosič více různými ligandy, které jsou všechny řízeny na stejnou nebo podobnou cílovou látku (v nejednodušším případě směs polyklonálních látek proti určité skupině protilátek). Stejně tak však mohou být na pevném nosiči imobilizovány například různé monoklonální protilátky proti jedné a téže cílové struktuře.

Obzvláště výhodnými ligandy jsou v rámci vynálezu autoantigeny, jako například dvouvláknová DNA, pro léčení pacientů trpících systemickým Lupus erythematodes podáním pro pacienta specifických protilátek proti ds-DNA. Faktor

VIII nebo jeho části mohou být použity jako ligand pro • Φ ···· · ·· ·· ΦΦΦΦ φ · Φ φ Φ Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦΦΦΦ»

Φ Φ» ΦΦΦΦΦΦ Φ φ · Φ ΦΦΦ · Φ 4 ·

............. ” izolování z daného individua protilátek silně vázajících faktor VIII, přičemž z těchto látek formulovaná očkovací látka snižuje patogenní reaktivitu anti-faktoru VIII u pacienta (Semin. Thromb. Hemost. (2000) 26:151). U pacientů s chorobným stavem myasthenia gravis mohou být vyčištěny individuální protilátky nebo jejich části imunoafinitním čistěním acetylcholinovým receptorem (Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1993) 90:8747), přičemž tyto protilátky se formulují jako autologní očkovací látka a takto zpětně očkují témuž pacientovi.

Inzulín může být použit jako ligand při výrobě autologní očkovací látky proti autoimunitnímu diabetes (Typ I inzulín-dependentní diabetes mellitus) (Diabetes Metab. Res. Rev. (2000: 16:338).

Myelinový bazální protein (MBP) nebo jeho části mohou být použity jako ligand při výrobě autologní očkovací látky pro léčení pacientů trpících roztroušenou sklerózou nebo pacientů s dalšími imunologicky podmíněnými neurologickými poruchami (J. Neuroimmunol. (2001) 113:163).

Jako ligandy mohou být rovněž použity různé gangliosidy u pacientů trpících Guillain-Barrovým syndromem (Intern.Med,. (1997) 36:599) a dalšími neuropathiemi.

Výhoda uvedeného autologního způsobu imunizace spočívá v inherentním zohlednění idiotypů specifických pro pacienta.

• tt ···· β ·· tttt ···· • « · tttt * « tttt · • · ······ • · · ······ tt

Dalším výhodným ligandem v rámci vynálezu je anti-lidská IgE-protilátka, přičemž za použití tohoto ligandu mohou být čištěny zcela specifické IgE-frakce, které mohou být znovu podány pacientovi ve vhodné imunogenní formě za účelem inhibice specifických buněk produkujících IgE. Přirozeně mohou být jak ligand rovněž použity části specifických Anti-IgE-protilátek, pokud ještě vlastní požadovanou specifitu.

V rámci alergií se předpokládá použití ve funkci ligandů zcela specifických alergenů, popřípadě jejich částí nebo anti-idiotopových protilátek, popřípadě jiných molekul, které alergeny napodobují.

příklady lze které mohou biochemickými

Výraz derivát protilátek, které

Poněvadž je imunitní odezva indukovaná očkováním autologními protilátkami určena vazebnou oblastí těchto protilátek, t.zn. jejich idiotypem, mohou být v podstatě namísto intaktních protilátkových frakcí k imunizování použity také fragmenty nebo deriváty těchto protilátek, pokud tyto frakce nebo deriváty podržely idiotyp příslušných výchozích protilátek. Pojem protilátka zahrnuje proto také fragmenty nebo deriváty takových protilátek se stejnou vazebnou specifitou. Jako neomezující uvést: F(ab)2'-fragmenty, F(ab)'-fragmenty, být například získány o sobě známými metodami (například enzymatickým štěpením, přitom zahrnuje například deriváty mohou být připraveny o sobě známými biochemickými metodami, například amidované na volných aminoskupinách mastnými za účelem zvýšení lipofilie při zabudování do

Uvedený výraz zejména také zahrnuje produkty, chemickými protilátky kyselinami liposomů nebo které mohou být připraveny chemickou kopulací protilátek nebo fragmentů protilátek s molekulami, které mohou zesílit • · 4 4 4 4 4 · · 4 4 ····

4 · · · 4 · · · ·

4 444444

4 4 444444 4

44 444 4444

4444 44 444 4# 44 44 imunitní odezvu, a kterými jsou například tetanus-toxoid, pseudomonas-exotoxin, deriváty lipidu A, GM-CSF, IL-2, IL-12 a C3d.

Prvním očkováním vyvolaný posun imunologické rovnováhy může být dále zesílen opakováním tohoto očkovacího postupu, například několik týdnů po získání první autologní vakcíny, opětovným imunitně afinitním čistěním tělní tekutiny, například krve, přípravou nové autologní vakcíny a podáním této vakcíny pacientovi. Tím se zajistí, že je vždy v individuelní vakcíně znovu zohledněm status imunologické rovnováhy. Tento postup může být vždy znovu proveden ve vhodných časových odstupech (například nejdříve každé 4 týdny až každých 8 týdnů a potom dále každých 6 měsíců podle průběžné kontroly imunitního stavu každého pacienta prováděné odpovídajícím specifickým testováním. Zde popsané nové složení a způsob očkování s autologními protilátkami jsou v podstatě vhodné jak pro terapeutické, tak i profyiaktické účely.

Hlavní výhodou zde popsané strategie individuálního autologního očkování je, že dochází ke zohlednění imunologického stavu každého individua, týkajícího se idiotypové sítě, poněvadž odpovídající očkovací látka je vždy vyrobena z individuálně tělní tekutiny, například z krevního séra. Kromě toho nepřichází imunizované individuum do kontaktu s cizími antigeny, nýbrž je léčeno složkami, které jsou jeho tělu vlastní, které jsou mu podány ve vhodné formě a které způsobí modulaci jeho imunologické rovnováhy.

Ke specifickému použití dochází při léčení pacientů, kteří na základě jejich imunizace vytvořili specifické ·

• · • · · · · · • ·

9 protilátky. Tak zvané hyperimunosérum se potom použije pro výrobu autologní vakcíny za účelem vyvolání imunitní odezvy proti autologním protilátkám v dané době.

V rámci výhodné formy provedení se protilátky získané v rámci vynálezu imunoafinitním čistěním formulují s vhodným očkovacím přísadami.

Jak je to běžné u očkovacích látek, mohou být protilátkové frakce nebo jej i fragmenty a deriváty formulovány společně s pomocnými látkami, které zesilují imunitní odezvu. Jako neomezující příklady těchto pomocných látek lze uvést: pomocné látky obsahující hliník, zejména hydroxid hlinitý (například alugel), deriváty lipopolysacharidu, Bacillus Calmette Guerin (BCG), saponiny a jejich deriváty (například QS-21), liposomové přípravky, formulace s dodatečnými antigeny, proti kterým si již imunitní systém vytvořil silnou imunitní odezvu, jako například tetanus-toxoid nebo složky chřipkových virů, případně v liposomovém přípravku.

Očkovací přípravek může být za účelem zesílení imunitní odezvy podáván také společně s odpovídajícími, výhodně lidskými, cytokiny, které podporují výstavbu imunitního systému. V této souvislosti lze zejména neomezujícím způsobem zmínit faktor stimulující granulocyty/makrofagy (CM-CSF). Tento cytokin stimuluje účinnou imunitní odezvu aktivací antigen-procesních buněk (například dendritické buňky). Autologní protilátkové frakce mohou být také případně o sobě známými způsoby inkubovány s autologními ex-vivo kultivovanými dendritickými buňkami. Tyto dendritické buňky jsou potom opětovně podány danému • · · · · · ·· ·· · ··· • · · · · • · · · · individuu. Tímto způsobem může být dosaženo obzvláště účinné imunitní odezvy.

V rámci výhodného formy provedení způsobu podle vynálezu zahrnuje zpracování protilátkového eluátu přidáním látky zvolené z množiny zahrnující pomocné látky, zejména pomocné látky obsahující hliník, lipopolysacharidové deriváty, Bacillus Calmete Guerin, liposomy nebo QS-21 (další výhodné pomocné látky jsou popsané mezi jiným v: Singh a kol., Nat.Biotechol.17 (1999) , str. 1075 až 1081), imunostimulující buňky, zejména dendritické buňky nebo další antigen-prezentující buňky, aktivní činidla, výhodně cytokiny, zejména faktor stimulující granulocyty/makrofagy, formulační látky, zejménma pufrovací látky, stabilizátory nebo solubilizační činidla a směsi uvedených látek.

V rámci výhodné formy provedení způsobu podle vynálezu se v kompozici obsažené protilátky smísí s pomocnou látkou (adjuvans) a následně vystaví tepelnému zpracování, výhodně při teplotě vyšší než 80 °C, zejména při teplotě mezi 90 a 130 °C. Použitou pomocnou látkou je výhodně pomocná látka obsahující hliník. Je možné, že takové tepelné zpracování sice denaturuje proteinový antigen, ale imunogenní části proteinu vazbou na pomocnou látku prezentují imunitní systém ve správné formě. K dosažení výhod tepelného zpracování však není bezpodmínečně nutné proteiny denaturovat. Je známo, že tepelná denaturace proteinů závisí nejen na teplotě, nýbrž také na době, po kterou je protein uvedené teplotě vystaven. Kromě toho jsou za denaturaci proteinu zodpovědné ještě další fyzikálně-chemické parametry, jako například iontová síla, složení iontů, hodnota pH a typ a velikost aktivního povrchu ve směsi. Jsou známé podmínky, které jsou odborníkem snadno optimalizovatelné pro libovolný eluát,

při kterých nejsou protilátky denaturovány nebo nejsou zcela denaturovány, nebo/a mohou být použity další efekty, jako například mírnější desorpce z povrchové plochy pomocné látky.

Další výhodou takového způsobu výroby formulace očkovací látky s pomocnou látkou a následného tepelného zpracování je, že v celé formulaci mohou být původci infekce zeslabeny, popřípadě inaktivovány. Tato výhoda může hrát roli jak při výrobě, tak i při skladování a distribuci formulace očkovací látky. Tím je poskytnuta větší bezpečnost, pokud jde o známé i neznámé původce přenosných chorob. Takto je možné při odpovídajícím obalu realizovat formulaci bez konzervačních látek, poněvadž působením horka dochází k mikrobiální konzervaci očkovací látky.

Další výhodou takové formulace je pravděpodobná zvýšená imunogenita protilátek, neboť zahřátí může způsobit alespoň částečnou denaturaci účinných látek. Tato zvýšená antígenita může zvýšit imunogenitu zejména u proteinů, které byly imunitním systémem klasifikovány jako vlastní proteiny.

Další výhoda spočívá v dodatečné stabilizaci komplexu protilátka-adjuvans inaktivováním teplem, t.zn. že desorpce protein-antigenu již neprobíhá rychle, jako ve formulacích antigen-adjuvans, které nebyly tepelně zpracovány. Tato výhoda také umožňuje delší časový odstup nezi jednotlivými imunizacemi.

V souladu s tím se specifická forma způsobu podle vynálezu týká způsobu, při kterém se protein-denaturační

.............

krok provádí zejména tepelným zpracováním, při kterém jsou proteiny obsažené v eluátu převedeny alespoň částečně do jejich trojrozměrné struktury, přičemž se výhodně zesílí jejich imunologické vlastnosti.

Kompozice vyrobená způsobem podle vynálezu může být podávána obvyklými způsoby, například jako očkovací látka subkutánní, intramuskulární nebo intradermální injekcí. Další způsob podání se realizuje aplikací na sliznice, čemuž odpovídá vakcinace nasálním nebo perorálním podáním

Vynález se rovněž týká farmaceutických kompozic obsahujících protilátky, které byly získány ze zvířecích tělních tekutin obsahujících protilátky imunitně afinitním čistěním, pro použití jako autologní očkovací látky.

Dále se vynález týká způsobu terapeutického nebo profylaktického očkování proti autoimunitním nemocen, infekčním nemocem, různým intoxikacím a alergiím.

V souladu s tím se vynález týká také autologní očkovací látky, která se získá způsobem podle vynálezu.

Předmětem vynálezu je také způsob léčení individuí, jehož podstata spočívá v tom, že individuu, kterému byla v rámci výroby přípravku odebrána tělní tekutina, podá přípravek vyrobený způsobem podle vynálezu v účinném množství, výhodně v množství několika mikrogramů až deseti gramů. Účinnost se vyhodnocuje především se zřetelem na imunogenitu. Osvědčilo se použít alespoň jeden mikrogram protilátky v očkovací dávce, který může být podán v ·· ···· 4 ·· ·· 4444

4 4444 44 4

4 4 4 4 4 4

4 · ······ 4 • 444 4· 44· 4 4 44 44 hotových dávkovačích jednotkách od 0,01 do 1 ml, výhodně v rozmezí od 0,1 do 0,5 ml. Výhodné množství se předevšín řídí podle podpůrného účinku adjuvantních látek a leží v rozmezí od 3 mikrogramů do 1 gramu, obzvláště v rozmezí od 10 mikrogramů do 750 mikrogramů, obzvláště výhodně v rozmezí od 250 mikrogramů do 500 mikrogramů.

Tento způsob léčení je především také obzvláště účinný u autoimunitních onemocnění, mezi která patří například systemický Lupus erythematodes, autoimunitní thyroiditída, systemická vaskulitída, Guillain-Barrův syndrom a autoimunitní onemocnění anti-faktor VII:C, dále u alergií, u nádorových onemocnění, popřípadě při profylaxi nesnášenlivostních reakcí v rámci transplantací, jakož i při otravách (například bakteriálními toxiny).

V rámci dalšího předmětu vynálezu se vynález týká použití autologních protilátkových přípravků pro výrobu prostředku pro imunomodulaci.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí příkladů jej o konkrétního provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně výmezem formulací patentových nároků a obsahem popisné části. Vynález bude rovněž ilustrován pomocí připojených výkresů.

Popis obrázků na výkresech

Na připojených výkresech

44· 44 obr.l znázorňuje blokové schéma získání očkovací látky;

4 44 444444

44 · 4 4 4 4

444 4444

444 44 44 44 obr.2 znázorňuje změnu specifických protilátkových reaktivit po imunizaci autologní očkovací látkou, vyrobenou za použití anti-bovinního sérového albuminu jako ligandů, popřípadě za použití sepharosy;

obr.3 znázorňuje změnu specifické protilátkové reaktivity po imunizaci pomocí autologní očkovací látky vyrobené za použití myšího IgG2a jako ligandů;

obr.4 znázorňuje nádobkový systém pro výrobu autologní očkovací látky za použití magnetických částic .

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Tento příklad ukazuje, že je možné specificky modulovat imunitní systém vůči libovolnému proteinu (v tomto případě se jedná o bovinní sérový albumin, BSA)

Dvě skupiny po třech králících byly imunizovány očkovací formulací vyrobenou způsobem podle vynálezu.

• · ··»· ···· · ·

Autologní očkovací látka pro první skupinu pokusných zvířat byla vyrobena čistěním imunoglobulinu z králičího séra na afinitně chromatografickém sloupci (králičí anti-BSA imobilizován na sepharose). Autologní očkovací látka pro druhou skupinu pokusných zvířat byla vyrobena z králičího séra a jiném afinitně chromatografickém sloupci (sepharosa bez specifických ligandů).

Takto získané imunoglobuliny byly formulovány jako očkovací látka adsorpci na aluminiumhydroxidovém gelu a tato očkovací látka byla králíkům podána subkutánně.

Schéma odběrů krve a očkování:

den -21:	získání séra,
den -14:	získání séra,
den -7 :	získání séra;
z poolu	sér získaných ve dnech
očkovací	látka;
den 0:	získání séra,
den 0:	subkutánní imunizace;
den 14:	získání séra,
den 21:	získání séra.

-14 a -7 se vyčistí

Výroba afinitní matrice:

V prvním kroku se vyčistí králičí anti-BSA-sérum následující způsobem.

···· králičí anti-BSA-protilátky pH 2,9, objem 4 ml) se ·· ·· 9999 • · · 99 9 9 9 9 · • 9 ······ • ·· 9 9 9 ····

9999 ·· ··· 99 99 99

Polyklonální glycin-HCl-pufru, (v O,1M dialyzuj i (Slide-A-LyzerO 10K, Pierce/USA) proti dialyzovému pufru (0,1 M NaHCO, + 0,5 M NaCl pH = 8,0).

Metoda:

Dialyzuje se v 800 ml kádince s magnetickou tyčinkou, přičemž kádinka je postavena na plotně magnetického míchadla a dialýza se provádí při teplotě 4 °C; dialyzační pufr se čtyřikrát obnoví;

Vzorky se potom koncentrují odstředěním (Centricon 10K (Amicon)) k dosažení koncového objemu 0,4 až 0,6 ml.

Imobilizace na aktivované CH-sepharose:

Materiály:

Aktivovaná CH-sepharosa 4B; Pharmacia Biotech (kód č. 17-0490-01, ligand: polyklonální anti-BSA-protilátky (6,6 mg/ml v kopulačním pufru), kopulační pufr: 0,1 M NaHCO₃ + 0,5 M NaCl, pH=8,0, mM HCI,

M ethanolaminový roztok,

0,1 M Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl)aminomethan)-pufr, pH = 8,0,

0,1 M Tris-HCl-pufr + 0,5 M NaCl, pH = 8,0,

0,1 M acetátový pufr + 0,5 M NaCl, pH = 4,0.

Kopulační metoda:

β · · · · ·

• · · · « ·

0,25 g lyofilizované CH-sepharosy 4B se suspenduje v asi 20 ml 1 mM HCI, promyje 50 ml 1 mM HCI a potom promyje 50 ml kopulačního pufru. Sepharosa se potom převede do 50 mi Falconovy trubičky a přidá se k ní roztok protilátky. Poměr gel:pufr = 1:2 poskytne vhodnou suspenzi pro formulaci. Suspenze se protřepává po dobu asi 1 hodiny. Nadbytečná protilátka se odstraní promytím 1 x 10 mi kopulačního pufru. Zbylá aktivní vazebná místa se blokují pomocí jednohodinové inkubace v třepačce s 1 M ethanolaminem. Potom následuje jednohodinová inkubace sepharosy s 0,1 M Tris-HCl-pufrem (pH =8,0) v třepačce a následný promývací cyklus: nejdříve promytí 0,1 M acetátovým pufrem (pH = 4,0) + 0,5 M NaCl a potom promytí 0,1 M Tris-HCl-puf rem (pH = 8,0) + 0,5 M NaCl. Uvedený promávací cyklus byl opakován třikrát.

Výroba afinitní matrice pro druhou skupinu králíků:

Afitní matrice pro druhou skupinu pokusných zvířat (kontrolní skupina) byla vyrobena způsob, který je identický s výše popsaným způsobem. Avšak namísto roztoku protilátky byl použit pouze pufr. Aktivovaná sepharosa se takto výlučně blokuje pouze ethanolaminem.

Výroba autologní očkovací látky:

Na příslušné afinitní matrici (objem sloupce: 0,5 ml) bylo vždy vyčištěno 10 ml séra odpovídajících králíků (pool získaný ze dnů -21, -14 a -7).

Materiály:

Nanášecí pufr: PBS + 0,2 M NaCl, pH = 7,2, eluční pufr: 0,lM glycin/HCl-pufr, pH = 2,9.

9 · C 0 0 9 ·9· 999

9« 9 9 9 9

999 99 99 99

Metoda:

Nanesení na sloupce bylo provedeno při. inkubační době 30 minut při teplotě 4 °C. Promytí bylo provedeno za použití nanášecího pufru (1 promývací krok = 5 ml; 5 promývacích kroků). Eluce byla provedena 1 ml elučního pufru. Eluát byl potom neutralizován uhličitanovým roztokem (0,5M NaHCO₃) a vyčištěné proteiny byly analyzovány rozdělovači chromatografii.

Rozdělovači chromatografie:

Chromatografie byla provedena za použití sloupce ZORBAX GF-250 a systému DIONEX-HPLC. Jako kvantitativní standardy byly použity následující imunoglobuliny:

lidský IgG-standard (20 mg/ml; Sandoglobulin,

3.590.009.0), lidský IgM-Standard (1,1 mg/ml; SIGMA, kat.1-8260), sloupec: ZORBAX GF 250 (PN: 884973.901) eluční pufr: 220 mmol NaPO₄-pufr, pH = 7,0 + 10 % acetonitrilu, průtok: 1 000 ml/min, vlnová délka: 214 nm, šířka pásma: 5 nm, nástřikový objem: 50 mikrolitrů.

Formulování s hydroxidem hlinitým:

Formulování vyčištěných, neutralizovaných imunoglobulinů do formy očkovací látky bylo provedeno následujícím způsobem.

Pro každou očkovací látku byla použita jedna ultrafiltrační jednotka Centricon (Centricon 10K od

···· ·· ··· · · společnosti Amicon, USA) . Nejdříve se ultrafiltrační jednotka promyje (odstředěním 1 mM Na-fosfátového pufru, 0,86 % NaCl, pH 6 (NBK)). Potom se předloží 400 mikrolitrů pufru a alhydrogelu (27 mikrolitrů (pro 400 mikrolitrů), Superfos, Dánsko), přidá se zneutralizovaný eluát, provede se odstředění a promytí (5 ml pufru), přičemž koncový objem činí 300 mikrolitrů. Potom následuje resuspendování vakcíny a doplnění pufrem na objem 396 mikrolitrů, přidání 4 mikrolitrů Thimerosal-kmenového roztoku (10 mg/ml), přičemž sterilně plněno bylo 350 mikrolitrů. Koncentrace proteinů v jednotlivých očkovacích látkách se vždy pohybovaly v rozmezí 40 až 50 mikrogramů.

BSA-ELISA

Systémem ELISA byly analyzovány následující vzorky: den 0, jakož pool dnů 13 a 21. Plotny ELISA (NUNC, Maxisorp (F=96), Dánsko) byly ovrstveny 100 mikrolitry BSA-roztoku (100 μΐ/jamka) (BSA-roztok: BSA (společnost Sigma Kat.No A-7638); 10 pg/ml v ovrstvovacím pufru). Byla provedena inkubace při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Po promytí bylo v PBS blokováno 5 % sušeného mléka (200 μΐ/jamka). Inkubace: 30 minut při teplotě 37 °C.

Promývací schéma:

po ovrstvení, blokování a inkubaci vzorku: 6 krát promývacím pufrem, po 4. promytí jednominutová inkubace, po konjugaci: 4 krát promývacím pufrem, 2 krát barvícím pufrem.

tt • · · ···· ·*

Vzorky séra byly sériově zředěny (ve 2% systému sušené mléko/PBS) Jednotlivá zředění vzorků (100 μΙ/jamka) byla inkubována po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Jako pozitivní kontrola a jako standard pro kvantitativní stanovení ELISA sloužila řada zředění polyklonálního králičího anti-BSA-séra, které bylo použito pro afinitní čistění. Po promytí byl enzymový konjugát (anti-králičí Ig HRP (Nordic Immunology, #4694)) nanesen (100 μΙ/jamka) ve vhodném zředění (1:1000 ve zřeďovacím pufru). Po 30 minutové inkubaci při teplotě 37 °C bylo provedeno opětovné promytí a byl přidán substrát (na jamku: 100 μΐ TMB Microwelll (BioFX, kat.č.: TMBW-0100-01, #0034302)), načež byla reakce po odpovídajícím vybarvení zastavena (za použití 30% kyseliny sírové v množství 50 μΙ/jamka) a získané vybarvení bylo změřeno fotometrem (450 nm). Byl stanoven titr každé zřeďovací řady při polomaximální adsorpci. Relativní změny titru k nulové řadě (den 0; = časový okamžik imunizace) pro jednotlivé pokusné králíky jsou zobrazeny graficky na obr.2. Z tohoto obr.2 je zřejmé, že pokusní králíci s autologní očkovací látkou vyrobenouza použití anti-BSA-afinitní chromatografie vykazují výrazný posun titru při zkoušce BSA-ELISA.

Příklad 2

Tento příklad má ukázat, že je možné u každého individua specificky snížit již existující imunitní odezvu. Za tím účelem byla použita opice makak rhesus, která byla imunizována monoklonální protilátkou (HE2, myšší-IgG2a) a která vyvinula silnou IgG-imunitní odezvu. Sérum této opice bylo vyčištěno na imunoafinitním sloupci, na kterém byl imobilizován myšší-IgG2a (HE2) jako ligand. Takto vyčištěné imunoglobuliny byly potom formulovány jako očkovací látka na hydroxidu hlinitém a subkutánně aplikovány dárcovské ·· 444· « ·· ·· 4··· • · · · · · · · · · ······ • · * 4 4 · 4 4 · 4 opici. V době imunizace (před očkováním), jakož i 2 týdny potom byla zvířeti odebrána krev za účelem stanovení specifické odezvy proti myššímu-IgG2a.

Materiály a metody:

Mikrotitrační plotny pro stanovení ELISA: Immuno Plate F96 MaxiSorp (Nunc);

kopulační pufr: 0,1 M NaHCO₃,

0,5 M NaCl, hodnota pH = 8,0;

čistící pufr A: PBS + 0,2 M NaCl;

čistící pufr B: 0,1 M glycin/HCl,

0,2 M NaCl, hodnota pH = 2,9;

vazebný pufr: 15 nM Na₂CO₃, nM NaHCO₃, nM NaN₃, hodnota pH = 9,6;

PBS:	138	mM	NaCl·,
	1,5	mM	kh2po4,
	2,7	mM	KC1,
	6,5	mM	Na2HPO4,

hodnota pH = 7,2;

Promývací pufr A: 2 % NaCl,

0,2 % Triton X-100, v PBS;

promývací pufr B: 0,05 % Tween 20 v PBS;

blokovací pufr A: 5 % fetální telecí sérum (inaktivované teplem) v PBS;

• · · 4 4 ·

4 4

4 4 ♦

• •44

4 4

44 blokovací pufr Β: 1 % hovězí sérový albunín,

0,1 % NaN₃ b PBS;

zřeďovací pufr A: 2% fetální telecí sérum (inaktivované teplem) v PBS;

zřeďovací pufr B: PBS barvící pufr: 24,3 mM kyselina citrónová,

51,4 mM Na₂HPO₄, hodnota pH: 5,0;

substrát: 40 mg o-fenylendiamin-dihydrochlorid,

100 ml barvící pufr, μΐ H₂O₂ (30%);

Stop-roztok: 4 N H₂SO₄;

formulační pufr: 10 % PBS, pH = 5,5, % fyziologický roztokk NaCl.

Provedení:

Zde popsaná metoda autologního očkování byla vyzkoušena na opici makak rhesus, která vykazovala silnou imunitní odezvu proti myšímu-IgG2a (0,5 mg myššího-IgG2a (HE2) adsorbovaného na 1,67 mg hydroxidu hlinitého v 0,5 ml 1 mM fosfátového pufru, pH 6,0/155 mM NaCl). Očkování bylo aplikováno jedné opici makak rhesus subkutánně ve dnech 1, 15, 29 a 57. Séra z různých časových okamžikl byla testována systémem ELISA za účelem stanovení myšší-IgG2A-specifických protilátek (viz níže). Protilátky byly na konci očkovacího schématu především IgG-typu. Uvedené opici bylo odebráno 10 ml periferní krve a z této krve bylo získáno sérum. Za účelem imunitně afinitního čistění protilátkové frakce ze séra uvedené opice byla

nejdříve vyrobenna imunitně afinitní matrice podle následující předpisu.

Celá procedura byla prováděna za sterilních podmínek.

7,5 g CH-sepharosy 4B (Pharmacia) bylo suspendováno po dobu 15 minut ve 20 ml lmM HCI. Získaný gel byl potom promyt 1 litrem lmM HCI a potom 200 ml kopulačního pufru na filtru AG3 ze slinuté skleněné frity. 100 mg murinní protilátky HE2 (myšší-IgG2a) se dialyzuje proti 5 litrům kopulačního pufru a nastaví kopulačním pufrem na 5 mg/ml. Tento roztok se smísí s uvedenou gelovou suspenzí v uzavřené nádobě. Poměr gel:pufer 1:2 poskytuje vhodnou suspenzi pro kopulaci. Tato suspenze se rotačně třepe po dobu 24 hodin při teplotě 4 °C. Potom se přebytek ligandů třikrát promyje vždy 30 ml kopulačního pufru. Zbylé reaktivní skupiny se po jednohodinové inkubaci při teplotě 4 °C blokují 1M ethanolaminem. Potom se gel rotačně třepe po dobu jedné hodiny při teplotě okolí s 0,lM Tris-HCl-pufrem. Nakonec se gel promyje ve třech cyklech pufry s měnící se hodnotou pH. Každý cyklus sestává z 0,lM natriumacetátového pufru, pH 4, s 0,5M chloridem sodným a potom 0,lM Tris-HCl-pufru, pH 8, s 0,5M chloridem sodným. Gel se potom přechovává při teplotě 4 °C.

Imunitně afinitní čistění protilátkové frakce ze séra opice makak rhesus se provádí za sterilních podmínek podle následujícího předpisu.

Imunitně afinitní čistění bylo provedeno za použití systému FPLC (Pharmacia). 1 ml gelu získaného výše uvedeným způsobem bylo naplněno do kolony Pharmacia HR5/5. 5 ml uvedeného séra bylo zředěno 1:10 čistícím pufrem A. Získaný roztok byl rychlostí 1 ml za minutu přiveden na sloupec v

uvedené koloně a promyt čistícím pufrem A až do okamžiku, kdy se znovu dosáhne UV-základní hodnoty detektoru (280 nm). Vázané imunoglobuliny se potom eluují čistícím pufrem B a získaná frakce se bezprostředně po desorpci neutralizuje 1M Na₂HPC>₄. 50 mikrolitrů takto vyčištěné protilátkové frakce se analyzuje rozdělovači chromatografii na sloupci SEC, Zotbax 250 GF. Jako eluční činidlo se použije 220mM fosfátový pufr, pH 7 + 10 % acetonitrilu. Celkové množství protilátkové frakce činí asi 40 mikrogramů (stanoveno pomocí SEC ve srovnání se standardem).

Takto získaná protilátkové frakce byla testována systémem ELISA s cílem stanovit vazbu na protilátku HE2 (která byla při afinitním čistění použita jako ligand): 100 mikrolitrový alikvot myší IgG2a protilátky použité pro afinitní čistění (protilátka HE2; roztok s 10 μρ/ιηΐ ve vazebném pufru) se v jamce mikrotitrační plotny inkubuje po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Po šestinásobném promytí titrační plotny promývacím roztokem A se přidá 200 mikrolitrů blokovacího pufru a směs se inkubuje po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Po promytí titrační plotny výše uvedeným způsobem se vždy 100 mikrolitrový alikvot testované afinitně vyčištěné protilátkové frakce, jakož i normální lidský imunoglobulin ve stejné koncentraci jako negativní kontrola ve zředěních 1:4 až 1:65 000 inkubují ve zřeďovacím pufru A po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Po promytí titrační plotny výše uvedeným způsobem se přidá vždy 100 mikrolitrů s peroxidázou konjugované kozí-anti-lidské-Ig-protilátky (Zymed) zředěných 1:1000 zřeďovacím pufrem A a směs se inkubuje po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Titrační plotna se potom promyje čtyřikrát promývacím pufrem A a dvakrát barvícím pufrem.

I

2_ «··· ·· 4·· 44 44

Protilátková vazba se stanoví přidáním vždy 100 mikrolitrů specifického substrátu a barvící reakce se zhruba po 3 minutách přeruší přidáním vždy 50 mikrolitrů přerušovacího roztoku (stop-roztok). Vyhodnocení se provede změřením optické hustoty (OD) při 490 nm (vlnová délka referenčního měření je rovna 620 nm) . Afinitně vyčištěná protilátková frakce vykazuje výraznou vazbu na myší-IgG2a-protilátku, zatímco normální lidský imunoglobulin se prakticky neváže.

Protilátková frakce získaná afinitním čistěním byla formulována za použití hydroxidu hlinitého jako adjuvans následujícím způsobem.

ml protilátkového roztoku získaného po afinitní chromatografií (získá se asi 40 mikrogramů protilátky) bylo přidáno k 1 mg hydroxidu hlinitého (vodná suspenze; Alhydrogek, Superfos) a získaná suspenze byla odstřeďována v odstředivkové kyvetě FILTRON (Microsep TM, prahová hodnota: 10 kD) při 4000 x g po dobu 30 minut. Odstředěná peleta byla potom dvakrát rozmíchána vždy s 1 ml formulačního pufru a potom znovu odstřeďována při 4000 x g po dobu 30 minut. Získaná suspenze byla potom doplněna formulačním pufrem na objem 0,5 ml a takto získana suspenze byla rozplněna za sterilních podmínek. Opice makak rhesus, z jejíhož séra byla výše uvedená autologní očkovací látka získána, byla touto očkovací látkou očkována subkutánně do hřbetu. Před tímto prvním očkováním bylo opici odebráno 5 ml krve za účelem získání séra (pro stanovení výchozí hodnoty pro charakterizování imunitní odezvy). Po dvou týdnech bylo zvířeti opětovně odebráno tentokrát 10 ml krve opět za účelem zísání séra.

4 · · · · ···· 4 · ······ · • · · · · · ······ · • · · · · · · • · · 9 9 · * 4«

Následně se stanoví vazba sérového imunoglobulinu uvedené imunizované opice na myší-IgG2a způsobem, který již byl popsán výše. Jak je to zřejmé z obr.3, klesá po imunizaci autologní očkovací látkou myŠí-IgG2a reaktivita.

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby autologní protilátku-obsahující očkovací látky, vyznačený tím, že zahrnuje následující kroky:

   poskytnutí protilátku-obsahující tekutiny z autologní protilátku-obsahující tělní tekutiny nebo z autologního buněčného nebo tkáňového preparátu, uvedení do styku protilátku-obsahující tekutiny s pevným nosičem, na kterém jsou imobilizovány ligandy, které váží určitou skupinu protilátek, s výhradou, že se jako ligandy nepoužijí protilátky nebo jejich fragmenty se stejným idiotypem, které jsou řízeny proti s nádorem-sdruženými antigeny, získání protilátek, které jsou vázané na ligandech, a zpracování získaných protilátek na autologní očkovací látku, která obsahuje imunogenní množství více než jednoho mikrogramu protilátek.
2. 2. Způsob výroby autologní protilátku-obsahující očkovací látky, vyznačený tím, že zahrnuje následující kroky:

   poskytnutí protilátku-obsahující tekutiny z individua, uvedení do styku této tekutina s ligandy, které váží určitou skupinu protilátek, s výhradou, že se jako ligandy nepoužijí protilátky nebo jejich fragmenty se stejným idiotypem, které jsou řízeny proti s nádorem-sdruženými antigeny, • · · · · · · · ·

   99 9 9 9 9 9

   9 9 9 9 9 9 9

   9 99 9 9 9 9 99 oddělení všech látek, které se neváží na ligandy, uvedení do styku protilátek vázaných na ligandy s elučním pufrem, takže se protilátky vázané na ligandy eluují, získání protilátek, které se vázaly na ligandy, v eluátu a zpracování získaného eluátu na autologní očkovací látku, která obsahuje imunogenní množství více než jednoho mikrogramu protilátky.
3. 3. Způsob podle některého z nároků 1 nebo 2, vyznačený t í m, že se vyrobí autologní očkovací látka obsahující imunogenní množství protilátek v rozmězí od 3 mikrogramů do 3 gramů.
4. 4. Způsob podle některého z nároků laž3, vyznačený t í m, že se jako ligandy zvolí prostředek pro vázání protilátek, které se vyskytují při autoimunitních nemocech.
5. 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačený t í m, že se jako ligandy zvolí prostředek pro vázání protilátek, které se vyskytují při alergických nemocech.
6. 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačený t í m, že se jako ligandy zvolí prostředek pro vázání protilátek, které jsou řízeny proti α-Gal-epitopu.
7. 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačený t í m, že se jako ligandy zvolí prostředek pro vázání protilátek, které jsou řízeny proti lidskému spermatu.

   • · · · · · • · · ······ · • * · ·······

   45 ...............
8. 8. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačený t í m, že se jako ligandy zvolí prostředek pro vázání protilátek, které jsou specifické pro nemoci typu B-buněčného lymfomu.
9. 9. Způsob podle některého z nároků laž8, vyznačený t í m, že tělní tekutinou je sérum nebo plazma.
10. 10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačený t í m, že individuem je člověk.
11. 11. Způsob podle některého z nároků 1 až 10, vyznačený t í m, že ligandy jsou zvoleny z více než jednoho typu, přičemž zejména jsou těmito ligandy ligandy, které váží protilátky s různou specifitou.
12. 12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11, vyznačený t í m, že ligandy váží určitou podskupinu imunoglobulinů.
13. 13. Způsob podle některého z nároků 1 až 12, vyznačený t í m, že ligandy váží určité imunoglobulinové řetězce.
14. 14. Způsob podle některého z nároků 1 až 13, vyznačený t í m, že se jako ligandy použijí protilátky, zejména monoklonální protilátky, antigeny, autoantigeny, hepteny, alergeny nebo jejich směsi.

    ·· ···· · ·· ·· ···· • · · *····· · • · ······ • · · ······ · • ·· · · · ···· ···· »· ··· ·· ·· ··
15. 15. Způsob podle některého z nároků 1 až 14, v y z n a č en ý t í m, že zpracování zahrnuje přidání látky zvolené ze skupiny adjuvantních látek, zejména přidání adjuvantních látek obsahujících hliník, lipopolysacharidových derivátů, Bacillus Calmette Guerin, liposomů, saponinů a jejich derivátů, imunostimulujících buněk, zejména dendritických buněk, aktivních agencií, výhodně cytokinů, zejména faktoru stimulujícího granulocyty/makrofagy, formulačních látek, zejména pufrů, stabilizátorů nebo solubilizačních činidel nebo směsí těchto látek.
16. 16. Způsob podle některého z nároků 1 až 15, vyznačený t i m, že zahrnuje krok denaturace proteinu, zejména tepelné zpracování.
17. 17. Autologní očkovací látka, vyznačená tím, že je získána způsobem podle některého z nároků 1 až 16.
18. 18. Použití autologní očkovací látky podle nároku 17 při výrobě prostředku pro imunomodulaci, zejména pro snížení nežádoucích protilátkových aktivit.
19. 19. Souprava pro výrobu autologní očkovací látky obsahující následující složky:

    a) přípravek s ligandy pro vázání specifické skupiny protilátek z protilátku-obsahující tekutiny z individua,

    b) prostředek pro získání protilátek, které se váží na ligandy, a

    c) prostředek pro zpracování získaných protilátek na autologní očkovací látku.

    ·· ···· ·· *· ···· • ······ · • ······ • · · · · · ···· ···· ·· 999 99 99 99
20. 20. Souprava podle nároku 19, vyznačená tím, že složka a) zahrnuje nádobku pro pojmutí ligandů a protilátku-obsahující tekutiny.
21. 21. Souprava podle nároku 20, vyznačená tím, že nádobka obsahuje ligandy vázané na pevný nosič.
22. 22. Souprava podle nároku 21, vyznačená tím, že nádobka obsahuje magnetické kuličky a že souprava dále zahrnuje magnet pro lokalizování magnetických kuliček.
23. 23. Souprava podle některého z nároků 19 až 22, vyznačená t i m, že složka b) zahrnuje prostředek pro čistění protilátek.
24. 24. Souprava podle některého z nároků 19 až 23, vyznačená t i m, že složka c) obsahuje adjuvans.
25. 25. Souprava podle některého z nároků 19 až 24, vyznačená t í m, že jako složky b) a c) jsou obsaženy jediný prostředek pro získání a zpracování získaných protilátek a případná pomocná látka.
26. 26. Souprava podle nároku 25,vyznačená tím, že prostředek obsahuje obtížně rozpustnou sloučeninu hliníku pro získání a zpracování získaných protilátek.
27. 27. Souprava podle některého z nároků 19 až 26, vyznačená t í m, že přípravek a) zahrnuje nádobku obsahující ligandy, prostředek b) a prostředek c).

    fy «· 4444

    • • • ·· 44 • · • · 4444 4 4 ·· · • · • • • • 4 • • · 4 4 ··· ·· • 4 44
28. 28. Souprava podle nároku 27,vyznačená tím, že přípravek zahrnuje injekční stříkačku obsahující očkovací látku a adjuvans.