JP2002511842A - 特異的免疫療法のためのイネ科花粉アレルゲン変異体及びそれらの製造及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、オオアワガエリ(Phelum pratense)種の花粉等の天然の原料から抽出によって得たアレルゲンから誘導される組換えアレルゲンから得ることのできる修飾された組換えアレルゲン変異体に関する。これらの修飾された組換えアレルゲンは、花粉アレルギーを患うヒトのリンパ球を刺激し、増殖及びサイトカイン合成をもたらすが、リンパ球ドナーの血清に含まれるＩｇＥ抗体及び草花粉アレルゲン特異的ＩｇＥとの結合能を顕著に減少させる。従って、本発明の修飾された組換えアレルゲンは、特異的な、個々のアレルギー治療のために使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 特異的免疫療法のためのイネ科花粉アレルゲン変異体 及びそれらの製造及び使用 本発明は、抽出により天然の原料から得ることのできるアレルゲンから誘導さ れる修飾された組換えアレルゲン（mra）に関する。とりわけオオアワガエリ(Ph leum pratense)、ホソムギ(Lolium perenne)、カモガヤ(Dactylus glomerata)、 ナガハグサ(Poa pratensis)、ギョギシバ(Cynodon dactylon)およびシラゲガヤ( Holcus lanatus)等のイネ科からの花粉粒子が天然の原料として使用される。 検査および治療用途のために用いられるイネ科花粉の抽出物は、タンパク質お よび糖タンパク質の不均一な混合物からなり、そのいくつかはアレルギー患者の ＩｇＥ抗体と反応し、定義によってアレルゲンと名づけられる。これらの抗原の 分子的性質によって、問題のイネ科種の交差反応性が相対的に高いことに伴い、 それらを６グループに分類することができる。優性アレルゲングループ（主アレ ルゲン）は、通常のアレルゲン分類(Ｌｉｅｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ.，Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐｅｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２６，４９４−５１６（１９９６）)によってグ ループ５および１である。Ｎ末端アミノ酸配列および／または主アレルゲンのグ ループ５および１の部分的または完全推定アミノ酸配列が知られている(Ｖｒｔ ａｌａ ｅｔ ａｌ.，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５１，４７７３−４７８ １（１９９３）およびＢｕｆｅ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．２６３，６ −１２(１９９５))。さらに、これらの主アレルゲンをクローニングする方法が 記載されている(Ｓｃｈｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ Ａｌｌｅ ｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８，９３−９６(１９９２))。 現在、イネ科花粉の水抽出物が、タイプ１アレルギーの体外診断に使用されて いる。これらの水抽出物はまた、体外診断および続く特異的免疫療法の基礎であ る(Ｆｉｅｂｉｇ．Ｈ.，Ａｌｌｅｒｇｏ Ｊｏｕｒｎａｌ ７，３７７−３８２ (１９９５))。 特異的免疫療法のために天然のアレルゲン抽出物を使用することは、これらの 状況において誘発されるＩｇＥ依存性アレルギー反応（副作用）によって制限さ れる。この理由で、天然のアレルゲン抽出物を副作用閾値以下の用量しか投与で きない。治療効果に必要とされる高いアレルゲン濃度を得るためには、抽出物を 維持用量まで増加する濃度に数回の連続的注射によって達成される。ゲルに吸収 させることによって、より効果的で副作用をより起さない方法で減感作のアレル ゲン抽出物を使用することが可能である。 さらなる改良は、ＩｇＥとはより低い反応性を有するが、免疫原性を大部分残 しているアレルゴイドを生成するためにアレルゲンを化学的に修飾することによ って達成された(Ｆｉｅｂｉｇ Ｈ.，Ａｌｌｅｒｇｏ Ｊｏｕｒｎａｌ ７，３ ７７−３８２（１９９５）およびＭａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ.，Ｃｌｉｎ．Ｒｅ ｆ．Ａｌｌｅｒｇｙ ５，８９−１０６(１９８７))。 ハウスダストダニアレルゲンに関する初期の研究において、ＩｇＥ反応性の減少 は、指向されたアミノ酸置換によって達成できるという証拠がある(Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ.，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，３３９−４０５（１９９６） およびＮｉｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ.，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，１ ０２１−１０２９(１９９５))。 現時点では、イネ科花粉にアレルギーである患者の確立された減感作は、すべ ての知られたアレルゲンそしてまた非アレルギー性だが免疫原性のマイナー成分 をある程度の濃度で含む天然抽出物を使用して行われるが、アレルゲン特異的療 法には、特定の患者が実際に感作されているアレルゲン分子だけが必要とされる 。このことはアレルギー患者が彼の減感作に寄与しないそして副作用を起しうる 成分で不可避的に治療されていることを意味する。 修飾された組換えアレルゲンの入手の結果として、個々のアレルゲンまたは特 定の混合物を、個々の感作スペクトルに合わせた減感作のための医薬品として使 用できる。 このことは特異的で適切な治療の可能性を提供する。 本発明は、価値ある性質を有する新規化合物、特に医薬品を製造するために使 用できる化合物を発見するという目的に基づいている。 修飾された組換えアレルゲンの形態の本発明の化合物、そしてそれらの塩およ び溶媒和物は、非常に価値ある薬理学的性質を有すると同時に良好な耐容性を有 することが分かった。特に、それらは減感作効果を有する。 この化合物は、ヒト医学および獣医学において、特にアレルギー疾患の治療お よび減感作アレルギー患者のための医薬活性化合物として使用できる。 驚くべきことに、それ自体公知の遺伝子操作方法により、草花粉にアレルギー である患者のＴリンパ球と特異的に反応し、すなわち増殖するＴリンパ球を刺激 したり、サイトカインを合成し、またはＴリンパ球においてアネルギーを起こす が、Ｔリンパ球ドナーの血清に存在するＩｇＥ抗体に、および草花粉にアレルギ ーである他の患者の血清からの草花粉特異的ＩｇＥに結合するには著しく減じら れた力を示す変異体を構築するために、そのアミノ酸配列が、天然抽出物中でお こるアレルギー分子のそれと同一である組換えアレルゲンを使用する本発明に関 連して成功がもたらされた。 天然におこるアレルゲンの場合または組換えアレルゲンの場合のいずれにおい ても見られないこの効果は次の理由により、望ましい。 − 減感作中におこるＩｇＥ仲介副作用が避けられるか、または少なくとも大 きく減少する、 − アレルギー患者のＴＨメモリーリンパ球による修飾された組換えアレルゲ ンの認識を確かにする、 − アレルギー患者で妨害されている種々に分化したＴＨサブポピュレーショ ンのバランスを正常化するための条件をつくる、 − アレルゲン反応性Ｔ細胞をアネルギー化したり、および／または除いたり 、ＴＨ０／ＴＨ１配列のものにＴＨ２主体の特異的Ｔ細胞ポピュレーションを機 能的に再配列することによって治療効果を可能にする、 − 免疫グロブリン合成を、アレルギー患者に典型的な特異的ＩｇＥ抗体（Ｔ Ｈ２のコントロール）の形成からＩｇＧ抗体（ＴＨ１のコントロール）の好まし い合成へスイッチできる、 − そして、結果として、患者の状態は、かれらがこの新規な修飾された組換 えアレルゲンで治療されると著しく改善されるものと期待できる。 本発明は、天然の原料から抽出により得られるアレルゲンから誘導される修飾 された組換えアレルゲンに関する。とりわけオオアワガエリ、ホソムギ、カモガ ヤ、ナガハグサ、ギョギシバ、およびシラゲガヤ等のイネ科からの花粉粒子が天 然の原料として使用される。特に、本発明は、グループ１−６の主アレルゲンか ら誘導される修飾された組換えアレルゲンに関し、そして草花粉にアレルギーで ある患者のＩｇＥ抗体との反応性が除かれているか、または少なくとも減じられ ているが、一方Ｔリンパ球とのそれは未だ残っている。修飾された組換えアレル ゲンは、アレルゲンの遺伝子が遺伝子操作法によって修飾されているため、それ らがコードするポリペプチドが野性タイプと比較して１個または数個のアミノ酸 の置換、欠失、および／または付加を示すという点で、野性型と異なる。同時に 、修飾された組換えアレルゲンの主たるＴ細胞反応性領域(T細胞エピトープ）は 、遺伝子操作によって変えられていない。 好ましくは、修飾された組換えアレルゲンは、グループ５または他にはグルー プ１の主アレルゲンから誘導される。特に、新規アレルゲンは、主Ｐｈｌ ｐ ５ｂアレルゲンから誘導される。 アミノ酸の単一文字コードを使用すると、Ｐｈｌ ｐ ５ｂの配列は以下のよ うである。即ち、 本発明は、特に全体で２６５個のアミノ酸からなるＰｈｌ ｐ ５ｂポリペプ チドの領域１６−４２、１３５−１４９および１８０−２０６の少なくとも１つ または組み合わせたものが変えられていない修飾された組換えアレルゲンに関す る。保存されるべきセグメントは、Ｔ細胞エピトープ領域である。 該アミノ酸残基はまた、誘導体化されてもよい。側鎖の修飾は、この意味で特 に適当である。 本明細書中、アミノ酸残基の略号は、以下のアミノ酸の残基を表わす。即ち、 Ａｌａ＝Ａ アラニン Ａｓｎ＝Ｎ アスパラギン Ａｓｐ＝Ｄ アスパラギン酸 Ａｒｇ＝Ｒ アルギニン Ｃｙｓ＝Ｃ システイン Ｇｌｎ＝Ｑ グルタミン Ｇｌｕ＝Ｅ グルタミン酸 Ｇｌｙ＝Ｇ グリシン Ｈｉｓ＝Ｈ ヒスチジン Ｉｌｅ＝Ｉ イソロイシン Ｌｅｕ＝Ｌ ロイシン Ｌｙｓ＝Ｋ リジン Ｍｅｔ＝Ｍ メチオニン Ｐｈｅ＝Ｆ フェニルアラニン Ｐｒｏ＝Ｐ プロリン Ｓｅｒ＝Ｓ セリン Ｔｈｒ＝Ｔ スレオニン Ｔｒｐ＝Ｗ トリプトファン Ｔｙｒ＝Ｙ チロシン Ｖａｌ＝Ｖ バリン 加えて、下記の略号は以下の意味を有する。即ち、 Ａｃ アセチル ＢＯＣ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル ＣＢＺ又はＺ ベンジルオキシカルボニル ＤＣＣＩ ジシクロヘキシルカルボジイミド ＤＭＦ ジメチルフォルムアミド ＥＤＣＩ Ｎ−エチル−Ｎ，Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カル ボジイミド Ｅｔ エチル ＦＣＡ フルオレセインカルボン酸 ＦＩＴＣ フルオレセインイソチオシアナート Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール Ｍｅ メチル ＭＢＨＡ ４−メチルベンズヒドリルアミン Ｍｔｒ ４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニルスルホ ニル ＨＯＮＳｕ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ＯＢｕｔ ｔｅｒｔ−ブチルエステル Ｏｃｔ オクタノイル ＯＭｅ メチルエステル ＯＥｔ エチルエステル ＰＯＡ フェノキシアセチル Ｓａｌ サリシロイル ＴＦＡ トリフルオロ酢酸 Ｔｒｔ トリチル（トリフェニルメチル） 上記アミノ酸がいくつかの鏡像異性体型でおこるかぎり、これらすべての型お よびまたそれらの混合物(例えばDL体)を本明細書中において含む。さらに、アミ ノ酸は、例えば化合物の成分として、それ自体公知の適当な保護基を付けること ができる。 所謂プロドラッグ誘導体、即ち例えば、アルキル基またはアシル基、糖または オリゴペプチドで修飾され、器官内で活性な新規化合物を生成するように速やか に分割される化合物がまた、新規化合物に含まれる。 これらのプロドラッグはまた、例えばＩｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１５，６１ −６７（１９９５）に記載されるような新規化合物の生物分解性のポリマー誘導 体を含む。 新規アレルゲンは、１または２以上のカイラル中心を有してもよく、従って異 なる立体異性体型になってもよい。本発明は、これらすべての型を含む。 Ｐｈｌ ｐ ５ｂから誘導されるポリペプチドの以下のグループから誘導され る修飾された組換えアレルゲンが特に好適である。即ち、 ＰＭ１（Ｎ³²→Ｄ，Ｄ⁴⁹→Ｌ，Ｋ⁵⁰→Ａ） ＰＭ２（Ｄ⁴⁹→Ｌ，Ｋ⁵⁰→Ａ） ＰＭ３（Ａ¹³→Ｃ） ＤＭ１（ΔＫ⁵⁰→Ｐ^・132，Ｄ⁴⁹→Ｌ） ＤＭ２（ΔＦ⁵¹−Ｇ¹⁷⁸，Ｄ⁴⁹→Ｌ，Ｋ⁵⁰→Ａ） ＤＭ２^*（ΔＦ⁵¹−Ｇ¹⁷⁸，１７９−２１７変更配列） ＤＭ３（ΔＡ¹⁵⁴−Ｔ¹⁷⁷，Ａ²²⁰→Ｔ） 上記の配列において、修飾されるアミノ酸またはアミノ酸配列が各々の場合で 示されている。 これに関連して、ＰＭ１はポイント変異１を示し、以下の配列を有する(Ｐｈ ｌ ｐ ５ｂと比較して置き換えられているアミノ酸が太字で印刷されている) 。即ち、 他の特に好ましいペプチドは、以下の配列を有する。即ち、 ＰＭ２（Ｄ⁴⁹→Ｌ，Ｋ⁵⁰→Ａ）: ＰＭ３（Ａ¹³→Ｃ）: ＤＭ１（ΔＫ⁵⁰→Ｐ^・132，Ｄ⁴⁹→Ｌ）: ＤＭ２（ΔＦ⁵¹−Ｇ¹⁷⁸，Ｄ⁴⁹→Ｌ，Ｋ⁵⁰−Ａ）: ＤＭ２^*（ΔＦ⁵¹−Ｇ¹⁷⁸，１７９−２１７変更配列）: この配列は、ＤＭ２のそれに対応するが、原料ペプチドＰｈｌ ｐ ５ｂの位 置１７９−２１７のアミノ酸がさらに変更された配列を示し、続く全てのアミノ 酸が無い。 ＤＭ３（ΔＡ¹⁵⁴−Ｔ¹⁷⁷，Ａ²²⁰→Ｔ）: 本発明はさらに、ポリメラーゼ連鎖反応および／またはその変法を使用するこ とによって修飾された組換えアレルゲンを製造する方法に関する。ペプチド配列 が知られると、アレルゲンはまた、それ自体公知のペプチド合成法、例えば、文 献（例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ，Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ ｏｒｇａｎ ｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｌｅ(Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ)，Ｇｅｏｒｇ−Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒ ｔ；のような標準的学術書）に記載されているような改変Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ 法により、該反応に知られていて且つ適当な反応条件下に製造できる。これに関 連して、それ自体公知であるが、ここでは詳しく述べられていない変法も使用で きる。さらに、それらの官能基誘導体のひとつから、それを加溶媒分解剤または 水素化分解剤で処理することによってペプチドを遊離し、および／または塩基性 または酸性のペプチドをそれと酸または塩基で処理してその塩または溶媒和物の ひとつに変換することができる。 加溶媒分解または水素化分解のための好ましい原料は、１または２以上の遊離 アミノ基および／または遊離ヒドロキシル基の代りに対応する保護されたアミノ 基および／または保護されたヒドロキシル基を含むものであり、好ましくはＮ原 子に結合しているＨ原子の代りに、例えば、ＮＨ₂基の代りにＮＨＲ’基 （Ｒ’はアミノ保護基、例えばＢＯＣまたはＣＢＺである）を含むアミノ保護基 をもつものである。 ヒドロキシル基のＨ原子の代りに、例えばヒドロキシフェニル基の代りにＲ” Ｏ−フェニル基（Ｒ”はヒドロキシル保護基である）を含むヒドロキシル保護基 をもつ出発化合物がまた、好ましい。 いくつかの、同一または異なる保護アミノ基および／または保護ヒドロキシル 基が、出発化合物の分子中に存在してもよい。存在する保護基が互いに異なるな らば、それらは多くの場合、選択的に除去できる。 “アミノ保護基”という表現は、一般的に知られており、アミノ基を化学反応 から保護する（ブロックする）ために適しているが、所望の化学反応が分子の他 の位置で行われた後容易に除くことができる基を言う。この種の典型的な基は、 特に、非置換または置換アシル基、アリール基、アルアルコキシメチル基または アルアルキル基である。アミノ保護基は、所望の反応（または一連の反応）が起 った後、取り除かれるので、それらの性質およびサイズは、別に重大ではない； しかし、１−２０個のＣ原子、とくに１−８個のＣ原子を有するそれらのアミノ 保護基が好ましい。本方法に関連して、“アシル基”という表現は、最も広い可 能な意味で解釈されるべきである。それは、脂肪族、芳香族脂式、芳香族または 複素環式のカルボン酸またはスルホン酸から誘導されるアシル基、そして特にア ルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基および、特にアルアルコキ シカルボニル基を含む。この種のアシル基の例は、アセチル、プロピオニルまた はブチリル等のアルカノイル；フェニルアセチル等のアルアルカノイル；ベンゾ イルまたはトルイル等のアロイル；ＰＯＡ等のアリールオキシアルカノイル；メ トキシカルボニル、エトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカル ボニル、ＢＯＣ又は２−ヨードエトキシカルボニル等のアルコキシカルボニル； ＣＢＺ(“カルボベンゾキシ”)、４−メトキシベンジルオキシカルボニルまたは ＦＭＯＣ等のアルアルコキシカルボニル；Ｍｔｒ等のアリールスルホニルである 。好ましいアミノ保護基は、ＢＯＣおよびＭｔｒ、そしてまたＣＢＺ、Ｆｍｏｃ 、ベンジルおよびアセチルである。 “ヒドロキシル保護基”という表現は、同様にして一般的に知られており、 ヒドロキシル基を化学反応から保護するために適するが、所望の化学反応が分子 の他の位置で行われた後、容易に除去される基を言う。この種の典型的な基は、 上記の非置換または置換アリール基、アルアルキル基またはアシル基、そしてま たアルキル基である。ヒドロキシル保護基の性質およびサイズは、それらが所望 の反応または一連の反応が起きた後再び取り除かれるので、重大でない；１−２ ０個のＣ原子、とくに１−１０個のＣ原子を有する基が好ましい。 ヒドロキシル保護基の例は、就中ベンジル、ｐ−ニトロベンゾイル、ｐ−トルエ ンスルホニル、ｔｅｒｔ−ブチルおよびアセチルであり、ベンジルおよびｔｅｒ ｔ−ブチルが特に好ましい。アスパラギン酸およびグルタミン酸のＣＯＯＨ基は 、ｔｅｒｔ−ブチルエステル（例えば、Ａｓｐ(ＯＢｕｔ)）の形で好ましく保護 される。 用いられる保護基によって、例えば強酸、適宜ＴＦＡまたは過塩素酸、のみな らず塩酸または硫酸等の他の強酸、トリクロロ酢酸等の強有機カルボン酸、また はベンゼンスルホン酸またはｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸を使用して 、化合物を官能基誘導体から遊離する。加えられる不活性溶媒の存在は可能であ るが、必ずしも必要ではない。好ましい適当な不活性溶媒は、例えば、酢酸等の カルボン酸、テトラヒドロフランまたはジオキサン等のエーテル、ＤＭＦ等のア ミド、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素、そしてさらにメタノール、エタ ノールまたはイソプロパノール等のアルコール、および水であある。上記溶媒の 混合物も適当である。ＴＦＡは、好ましくは他の溶媒を加えること無く過剰に用 いられ、過塩素酸は、酢酸と７０％過塩素酸が９：１の比率からなる混合物の形 で使用される。解裂の反応温度は、好適には約０−５０°であり、反応は好まし くは１５−３０°または室温で行われる。 ＢＯＣ、ＯＢｕｔおよびＭｔｒ基は例えば、１５−３０°でジクロロメタン中 のＴＦＡまたはジオキサン中約３−５Ｎ塩酸を使用して好ましく取り除くことが できる；ＦＭＯＣ基は、１５−３０°でＤＭＦ中のジメチルアミン、ジエチルア ミンまたはピペリジンの約５−５０％溶液を使用して取り除くことができる。 トリチル基を、アミノ酸、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミンおよびシ ステインを保護するために用いる。所望の最終製造物によって、ＴＦＡ／１０％ チオフェノールを使用して、述べたすべてのアミノ酸からトリチル基が除かれ、 ＴＦＡ／アニソールまたはＴＦＡ／チオアニソールを使用して、この場合、トリ チル基は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、およびＧｌｎからだけ除かれ、Ｃｙｓ側鎖に残る。 水素化分解で除去される保護基（例えば、ＣＢＺまたはベンジル）は、例えば 、触媒（例えば、好適には炭素のような支持体上のパラジュウム等の貴金属触媒 ）の存在下、水素と処理して除去できる。この場合の適当な溶媒は、上記の溶媒 であり、例えば、メタノールまたはエタノール等のアルコール、またはＤＭＦ等 のアミドである。原則として、水素化分解は、約０−１００°の温度で、そして 約１−２００気圧の圧力下、好ましくは２０−３０°および１−１０気圧で行わ れる。ＣＢＺ基の水素化分解は、例えば、メタノール中２０−３０°、５−１０ ％Ｐｄ／Ｃ、またはメタノール／ＤＭＦ中２０−３０°で蟻酸アンモニウム（水 素の代り）を使用して満足に行われる。 例えば、エタノール等の不活性溶媒中当量の塩基と酸を反応させ、次いで蒸発 により濃縮して、酸は塩基をその関連酸付加塩に変換するために使用できる。生 理学的に有害で無い塩を生じる酸が、特にこの反応に適する。従って、例えば、 硫酸、硝酸、塩酸または臭化水素酸等のハロゲン化水素酸、オルトリン酸等のリ ン酸、またはスルファミン酸等の無機酸、そしてまた有機酸、特に脂肪族、脂環 式、芳香族脂式、芳香族または複素環モノ塩基性または多塩基性カルボン酸、ス ルホン酸またはスルフリル酸、例えば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジ エチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマール酸、マレイン酸、乳酸 、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、イ ソニコチン酸、メタンスルホン酸またはエタンスルホン酸、エタンジスルホン酸 、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホ ン酸、ナフタレンモノ−およびジスルホン酸およびラウリルスルホン酸を使用す ることができる。生理学的に有害で無いことのない酸との塩、例えばピクリン酸 塩は、式Ｉの化合物を単離したり、および／または精製したりするために使用し てもよい。 他方、式Ｉの酸を塩基と反応させることにより生理学的に有害で無い金属塩ま たはアンモニウム塩に変換できる。この場合、適当な塩は、特にナトリウム塩、 カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩およびアンモニウム塩、そしてまた 、例えばジメチル−、モノエチル−、ジエチル−またはジイソプロピル−アンモ ニウム塩、シクロヘキシル−またはジシクロヘキシル−アンモニウム塩のような 置換されているアンモニア塩、またはジベンジルエチレンジアンモニウム塩、そ してさらに、例えば、アルギニンまたはリジンとの塩である。 以下の工程は、ＤＮＡまたはアミノ酸配列を確かめるために必要である。 通常の方法によって製造された抽出物のアレルゲン性構成成分が、同定され、 それらの重要な物理化学的パラメターが特定されている。構成成分が、アレルギ ー患者のＩｇＥ抗体に結合するそれらの能力を示すことによってアレルゲンでと 同定される。原則として、これはアレルギー患者の血清でＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等 電集中法(isoelectrofocusing)次いでウエスタンブロティングし、ＩｇＥイソタ イプの結合抗体のみが展開されるそれ自体公知の方法を使用して行われる。この 場合、適切な大きさの数のタイプの臨床的に証明されたアレルギー患者（２０と いう値は最低の数として設定すべきである）が使われることを確実にするように 注意すべきである。ＣＩＥまたはＣＲＩＥ等の他の方法をまた、代りに使用でき る。 このようにして同定および特定されたこれらのイネ科花粉アレルゲンを、Ｎ末 端アミノ酸決定を行うことができるように分析的に製造できる。さらに、アレル ゲンをまた、生化学的に精製し、モノクローナル抗体を製造するために使用でき る。これらのモノクローナル抗体を、天然原料からのアレルゲンまたは組換え技 術によって製造される分子の免疫学的同定および特定のために使用できる。 アレルゲンに関するこの情報およびそれらを同定するための方法に基づいて、 公知の遺伝子操作方法を使用してクローンしたり、それらを組換えアレルゲンと して発現させることができる。通常の方法を使用して単離され、特定された組換 えアレルゲンのＤＮＡクローンが、遺伝子操作によって行われ且つ新規な修飾さ れ組換えられて製造されたアレルゲン分子を生じる修飾の基盤であ る。 新規な修飾された組換えアレルゲンの反応性を確保するために、Ｔ細胞エピト ープを同定することも必要である。 このための基礎は、問題のアレルゲンのアミノ酸配列または対応する基礎にな るＤＮＡ配列の知識である。通常、アミノ酸配列は組換えアレルゲンのＤＮＡ配 列から推定される。従って、本発明の範囲内で、挙げられる全てのペプチド配列 の関連ＤＮＡ配列が、これらのＤＮＡ配列が明確に開示されていなくても含まれ るのは、それらが公知且つ簡単な方法でペプチド配列から誘導できるからである 。 アミノ酸配列に基づいて、一連の重なるオリゴペプチドを、改変Ｍｅｒｒｉｆ ｉｅｌｄ法を使用する固相合成等の通常の方法によって製造し、アレルゲンの全 体配列がカバーされる。各場合６−２０個、好ましくは９−１５個のアミノ酸残 基を有するオリゴペプチドが、これに関連して適切に製造される。各々の場合３ つのアミノ酸によりオフセットされ、対象アレルゲンの全配列をオーバーラップ してカバーするドデカペプチドが特に適する。 Ｔ細胞エピトープを同定するために、イネ科花粉にアレルギーの患者からのＴ 細胞クローンを、通常の方法（文献）を使用して問題の精製した天然または組換 え的に製造されたアレルゲンで繰り返し刺激によって樹立する。このため、十分 な数のドナーから由来する相当数のＴ細胞クローンを樹立する必要がある。 これらのＴ細胞クローンを上記オーバーラップペプチドと培養し、Ｔ細胞が増 殖することを刺激する後者の能力を試験する。増殖は、それ自体通常の方法によ って［³Ｈ］−チミジンを取り込むことによって決定される。Ｔ細胞クローンの 適当な増殖を誘導するそれらのオリゴペプチドが、Ｔ細胞エピトープに対応する ペプチドリガンドと見なされる。このようにして決定されたＴ細胞エピトープが 、その部分で、新規な修飾組換えアレルゲンを構築する基盤を構成するアレルゲ ンのＴ細胞反応性領域を決めるために使用される。 修飾組換えアレルゲンがアレルギー患者で見い出されるＴリンパ球と反応する ことを確実にするため、免疫優性Ｔ細胞エピトープを含むＴ細胞反応性領域 の１次構造は、部分的または完全に変更から除かれる。 遺伝子操作は、変更された１次構造を得るためにポリペプチド（アレルゲン） の残りの領域にあるＤＮＡ配列に変異を起すために使用される。この変更された １次構造は、ＩｇＥ抗体に結合する配列依存連続Ｂ細胞エピトープの能力を破壊 するか、または限定し、そして１次修飾の結果として修飾された３次構造のため 、それらの抗体と反応する立体配座依存の、おそらく非連続的エピトープの力を 完全または部分的になくす。 変異は、Ｔ細胞反応性領域以外の１つまたは数個のアミノ酸の置換であること ができる。そのような点変異が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する位 置特異的変異により、例えば、ｒＰｈｌ ｐ ５ｂをコードするＤＮＡに誘導さ れる。ｒＰｈｌ ｐ ５ｂのｃＤＮＡを含む発現ベクター（ｐＭａ Ｉｃ）であ るプラスミドｐＧＳ１３を、この場合テンプレートとして使用できる。適当な塩 基置換そしてまた新しい制限部位（Ｎｈｅ ＩまたはＳｐｈ Ｉ）を含む遺伝子 特異的プライマーをＰＣＲに使用する。ＰＣＲで増幅され、変異をおこすフラグ メントをクローニングベクターに次々結合し、完成物を次いでｐＭａｌｃ発現ベ クターへ再クローンする。 さらに、変異を特異的に設定した欠失によって行うことができる。欠失変異体 を製造するために、ｒＰｈｌ ｐ ５ｂのｃＤＮＡの切断３’−末端フラグメン トを、遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲで製造する。比較的大きな３’ −末端フラグメントを、内部切断部位で制限によって出発ベクター（ｐＧＳ１２ またはｐＧＳ１３）から除き、そしてＰＣＲで増幅し、各ケースでより小さいフ ラグメントを、それらを置換するため結合する。 同様の方法で、１又は２以上のアミノ酸の付加を含む変異は、付加的ＤＮＡフ ラグメントを挿入することにより製造できる。 遺伝子操作によって変異され、修飾された組換えアレルゲンをコードするＤＮ Ａクローンを、適当な発現ベクターに再クローンし、適当なホスト生物体で発現 させる。融合タンパク質を、これらホスト生物体の上清または破壊物から通常の 方法で精製し、そして融合部分を取り除いた後、修飾された組換えアレルゲンを 通常の生化学的方法を使用して純粋状態で製造する。修飾された組換 えアレルゲンが、天然アレルゲンに対応する純粋成分としてさらなる試験に使用 されることが重要である。 修飾された組換えアレルゲンのアレルゲン性、即ちアレルギー患者のＩｇＥ抗 体に結合する力、に関する誘導された変異の効果は、ＥＡＳＴ阻害試験によって 定性的および定量的に決定される。この検定は、試験される物質（修飾された組 換えアレルゲン）が天然アレルゲンおよび／または組換え野性型に等しいか、ま たは異なるかを示す。免疫化学的関連性（交差反応性）の程度はまた、定量でき る。このＥＡＳＴ阻害試験は、ＩｇＥ抗体との反応だけを計る。 ５０％阻害でＰ_relと測定される阻害効果を示し、天然アレルゲンおよび／ま たは組換え野性型と比較して少なくとも１０²のファクターで減少するそれらの 修飾された組換えアレルゲン変種が、適当なものとして選択される。 このようにして選択された修飾された組換えアレルゲン変種を、それらのＴ細 胞反応性が実際に残っているかどうかを見るためにチェックする。このために、 Ｔ細胞反応性領域のエピトープと反応する一組のＴ細胞クローンを、第１相の試 験のために取る。 選択されたクローンが増殖するように刺激するそれら選択された修飾された組 換えアレルゲンだけが考慮される。 第２相において、相当するアレルゲンで繰り返し刺激して樹立されたオリゴク ローンＴ細胞系を試験のために用いる。再び、野性型の刺激インデックス（ＳＩ ）の５０％のＳＩを少なくとも与えるそれら選択され修飾された組換えアレルゲ ンだけが考慮される。 第３相において、アレルギー患者の末梢血からのポリクローンの短時間Ｔ細胞 培養を試験のために用いる。 特異的ＩｇＥへのアレルゲンの結合とは別に、アレルギー作用または細胞によ るヒスタミンのアレルゲン誘起のＩｇＥによる遊離が、アレルギー反応（副作用 ）に対して病理生理学的に重要である。エフェクター細胞（好塩基球および肥満 細胞）の反応性およびＦｃεＲＩによって結合されるＩｇＥ抗体のエピトープ特 異性もこの場合重要である。この理由で、修飾された組換えアレルゲン変種は、 アレルギー患者の血液から単離されるＩｇＥを担う好塩基球の脱顆粒 によるヒスタミン遊離を誘起するそれらの力の試験をする。この機能試験におい て、上記選択方式によって選ばれた修飾された組換えアレルゲン変種は、著しく 減じられたヒスタミン遊離力を示さなければならない。 これら要求に合う修飾された組換えアレルゲンは、制御作用を有するＴＨ細胞 の大部分との反応性を確かめ、それらの減じられたＩｇＥ反応性により、イネ科 花粉にアレルギーの患者のアレルゲン特異的免疫療法（減感作）の治療剤として 用いられるための必要な性質を有する。 本発明はさらに、ＩｇＥ仲介アレルギーを治療するための、本発明による１又 は２以上の修飾された組換えアレルゲン、および／またはその生理学的に無害な 塩または溶媒和物、および／または適宜付加的活性化合物、および／または補助 物質を含む医薬製剤に関する。 本発明はさらに、少なくとも１つの修飾された組換えアレルゲンおよび／また はその生理学的に無害な塩または溶媒和物が、少なくとも１つの固体、液体また は半液体の担体または補助物質と一緒に適当な剤形にされる医薬製剤を製造する ための方法に関する。 本発明はさらに、特に非化学的ルートによって医薬製剤を製造するための修飾 された組換えアレルゲンおよび／またはその生理学的に無害な塩または溶媒和物 の使用に関する。これに関連して、それらは、少なくとも１つの固体、液体また は半液体の担体または補助物質と一緒に、そして適宜、１又は２以上の付加的活 性物質と組み合わせて適当な剤形にすることができる。医薬品は、免疫特異的治 療、即ちアレルギーと関連して減感作に使用される。アレルギーの免疫特異的治 療（減感作）用に修飾された組換えアレルゲンを直接使用することを考えること は同様にして可能である。 これらの製剤を、医薬品としてヒトまたは動物の医療において使用できる。適 当な担体は、経腸(例えば経口)、非経腸または局所投与又は吸入スプレー形態で の投与に適し、新規化合物と反応しない有機または無機物質であり、例えば水、 植物油、ベンジルアルコール、アルキレングリコール、ポリエチレングリコール 、グリセロールトリアセテート、ゼラチン、乳糖またはデンプンのような炭水化 物、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたは黄色ソフトパラフィ ンである。錠剤、ピル剤、被覆錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、シロップ剤、 ジュース剤またはドロップ剤は特に、経口用途に用いられ、一方座剤は経腸用途 に用いられ、溶液剤、好ましくは油性または水性溶液剤、さらに懸濁剤、乳剤ま たは埋め込み剤は非経腸用途に用いられ、そして軟膏剤、クリーム剤または粉剤 は局所用途に用いられる。本新規化合物はまた、凍結乾燥でき、そして得られた 凍結乾燥体は、例えば注射用の製剤を製造するために使用できる。上述の製剤は 、滅菌することができ、および／または潤滑剤、保存料、安定剤および／または 湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色料、矯味剤および／または いくつかの付加的活性化合物、例えば、１または２以上のビタミン、等の補助的 物質を含んでいてもよい。吸入スプレーとしての投与には、噴射ガスまたは噴射 ガス混合物（例えばＣＯ₂またはフルオロクロロ炭化水素）中に溶解または懸濁 されている活性成分を含むスプレー剤が使用される。この場合、活性化合物は好 適には微粒子化されて使用され、１または２以上の付加的な生理学的に許容され る溶媒、例えばエタノールが存在していてもよい。吸入液は、通常の吸入器を使 用して投与できる。 本化合物およびその生理学的に無害な塩を、アレルギー疾患、特に草類および 草の花粉によって引き起こされるアレルギーをコントロールすることに関連して アレルギー患者を減感作するために使用できる。 この場合、新規物質は、通常、他の知られている市販ペプチドと同様にして、 特にＵＳ−Ａ−４ ４７２ ３０５に記載されている化合物と同様にして投与さ れ、そして好ましくは用量単位当たり０．０５−５００ｍｇ、特に０．５−１０ ０ｍｇの用量で投与される。１日用量は、好ましくは約０．０１−２ｍｇ／ｋｇ 体重である。しかし、個々の患者に対する特定の用量は、非常に広い種類の因子 、例えば、使用される特定の化合物の効力、年齢、体重、一般健康状態そして患 者の性、食事、投与の時間および経路、排泄速度、薬剤の組み合わせおよび治療 の対象である特定の疾患の重症度による。非経腸投与が好ましい。 本明細書中、全ての温度は℃である。製造物を単離するために、必要なら水を 加え、そして必要なら、混合物を最終製造物の構成によって、２−１０の ｐＨ値に調整し、酢酸エチルまたはジクロロメタンで抽出する；相を分離し、有 機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして蒸発によって濃縮する；残渣を次いで、 シリカゲルのクロマトグラフィーおよび／または結晶化によって精製する。実施例１ 主草花粉アレルゲンＰｈｌ ｐ５のＴ細胞反応性領域を決定するためのＴ細胞エ ピトープの同定 草花粉アレルギー（鼻炎）の典型的な徴候の病歴を有し、そして陽性皮膚試験 （プリック試験）を与えた患者を、オオアワガエリ草（Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔ ｅｎｓｅ）Ｐｈｌ ｐ５の主グループ５花粉アレルゲンと反応するＴ細胞系（Ｔ ＣＬ）およびＴ細胞クローン（ＴＣＣ）を樹立するために選択した。これらの患 者は、ＲＡＳＴクラス３以上の循環する特異的ＩｇＥ抗体を有していた。 ヘパリン血４０ｍｌを各患者から得た。末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を次いで、 密度勾配遠心分離を使用する通常の方法によって、この血液サンプルから単離し た。同様の細胞分離を、さらにＴＣＬおよびＴＣＣを特定するために照射された 自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を得ることが必要な後の段階で行った。ＰＢＭＣを 数えた後、インヴィトロでグループ５アレルゲンに反応するＴＣＬを、以下のよ うにそして他（文献１）に既に詳しく記載されているように樹立した：２４穴マ イクロカルチャープレートの各ウヱルに培養培地（Ｕｌｔｒａ Ｃｕｌｔｕｒｅ ）１ｍｌ中１．５−２．０×１０⁶ＰＢＭＣを、免疫親和性クロマトグラフィー により精製された天然Ｐｈｌ ｐ５アレルゲン（各場合、１０μｇ／ウェル）を 加えて７日刺激した。これら培養の全部で８から１０が設定された。免疫親和性 クロマトグラフィーによるＰｈｌ ｐ５の単離は、詳しく記載されている(文献 ２)。培養の７日の終わりに、ＩＬ−２（１０−２０ＩＵ／ウェル）を、さらに ５−７日の培養に対して細胞培養物に加えた。次いで個々の培養物すべてを集め 、そしてＴ幼若細胞を密度勾配遠心分離によって集めた，次いで得られたＴＣＬ を、特異的リンパ球増殖試験（同様に文献１を参照）で試験した。このため、２ ×１０⁴／ｍｌのＴＣＬ幼若細胞を、各場合５× １０⁴／ｍｌの照射された自己ＡＰＣと９６穴マイクロカルチャープレート中の ３重のサンプルで培養した。Ｐｈｌ ｐ５アレルゲン１０−２０μｇを特異的抗 原刺激として加えた。５６時間培養後、³Ｈラベル化チミジン（１μＣｉ／ウェ ル）をマイクロカルチャーへピペットで入れた。さらに１６時間後、増殖Ｔ幼若 細胞へとりこまれた放射活性を、ベーターカウンター（Ｍａｔｒｉｘ ９６）で 測定した。結果は、１分当たりのカウント（ｃｐｍ）で多重サンプルの算術平均 として計算された。ＴＣＬの品質の基準は、Ｐｈｌ ｐ５添加のｃｐｍ値をＰｈ ｌ ｐ５を加えないものと関連して得られた刺激指数であった。 それらを選んだ後、ＴＣＬをクローン化した(文献１参照)。このため、０．３ ［ラクナ(ｌａｃｕｎａ)］のＴＣＬ幼若細胞／ウェルを、照射同種ＰＢＭＣ（５ ×１０⁴／ウェル）、ＰＨＡ（１．５ｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（２５ＩＵ／ｍ ｌ）を加えて、９６穴マイクロカルチャープレート（丸底）中、最終容量０．２ ｍｌで培養した。１２−１４日後、培養物に、新鮮な照射ＰＢＭＣ、ＰＨＡおよ びＩＬ−２を加えた。さらに、ＩＬ−２（２５ＩＵ／ｍｌ）を加えて培地交換を ４−５日毎に行った。照射同種ＰＢＭＣを加えずに約１０日が、Ｐｈｌ ｐ５特 異的増殖試験を行う前に過ぎた。選択されたＴＣＣを、ＰＨＡ、照射同種ＰＢＭ ＣおよびＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ）で繰り返し刺激することによって２４穴マ イクロカルチャープレート中で増殖した。 ＴＣＬをクローン化した（下記参照）後、単離ＴＣＣの特異性を述べたように して決定した。少なくとも５の刺激指数を、ＴＣＣ陽性であると評価した。グル ープ５アレルゲン上のＴ細胞反応性領域を定めるためのＴ細胞エピトープの決定 がまた、特異的増殖試験を使用して行われ、合成ドデカペプチド１−２μｇ／ｍ ｌがこの目的のため各々の場合で使用された(下記参照)。 Ｂｕｆｅら（文献３）によって決定されたＰｈｌ ｐ ５ｂアレルゲンの公知 １次構造に基づいて製造された全部で８６個の重なる合成ドデカペプチドを、Ｔ 細胞エピトープの決定のために使用した。これらペプチドは、ＣＨＩＲＯＮ Ｍ ｉｍｏｔｏｐｅｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ／Ｃｌａｙｔｏｎ，Ａｕｓ ｔｒａｌｉａによって供給される市販の合成キットを使用して製造される。これ らのペプチドのアミノ酸配列は９個のアミノ酸の重なり程度であ った(表１)。特異的増殖試験で使用されるペプチドの１つに対するＴＣＣの反応 を、計算した刺激指数が少なくとも５であると陽性であるとして評価した。 草花粉にアレルギーであった１８名の患者が研究に含められた。これらから、 Ｐｈｌ ｐ ５ｂ配列に基づくドデカペプチドと特異的に反応した５４のＴ細胞 クローンを単離することに成功した。これらのＴＣＣの分析は、ペプチドリガン ドの認識は、３つの免疫優性Ｔ細胞反応性領域に明らかに集中していることを示 す。５４個のＴ細胞クローンのうち、８５％に相当する４６個は、Ｐｈｌ ｐ ５ｂの３つの免疫優性Ｔ細胞反応性領域Ａ、ＢおよびＣのペプチドと反応する( 表１ａ)。８個のＴ細胞クローンだけが、５つの異なるペプチドリガンドと反応 し、各場合３個のペプチドが２つの異なるクローンによって認識された。免疫優 性Ｔ細胞反応性領域Ａは、位置１８１−２０７に対応し、アミノ酸１８１−１９ ５からなるコア領域を有するペプチド（２７ｍｅｒ）を包含する。５１％に相当 する５４Ｐｈｌ ｐ ５ｂ反応性ＴＣＣの２８個だけが、この免疫優性Ｔ細胞反 応性領域Ａと反応する。 Ｔ細胞クローンの９個（１７％）と９個（１７％）とが、Ｔ細胞反応性領域Ｃ （位置１６−４８；３３ｍｅｒ）およびＴ細胞反応性領域Ｂ（位置１３３−１５ ０）それぞれと反応する。主アレルゲンＰｈｌ ｐ ５ｂの３つの免疫優性Ｔ細 胞反応性領域の認識についての研究された枠の濃度のＴＨ細胞は、これらの領域 が点変異、欠失変異または付加変異によって影響されないＰｈｌ ｐ ５ｂ変異 体を構築することを可能にする。このことが、アレルギー患者に存在するアレル ゲン反応性ＴＨ細胞と反応し、そしてこれらの細胞に治療的影響を与えるこれら アレルゲン変異体の必要条件をつくる。 表１：Ｐｈｌ ｐ ５ｂ配列に基づき且つＴ細胞反応性領域を決定するために使 用されるドデカペプチド表１ａ：主草花粉アレルゲンＰｈｌ ｐ ５のＴ細胞反応性領域をマッピング 実施例２ ｒＰｈｌ ｐ ５ｂの変異体ＰＭ１、ＰＭ２（Ｄ⁴⁹→Ｌ，Ｋ⁵⁰→Ａ）およびＰＭ ３（Ａ¹³→Ｃ）の製造ＰＭ２： プラスミドｐＧＳ１３を出発ベクターとして使用した。これは、Ｂａｍ ＨＩ 位とＨｉｎｄ ＩＩＩ位間にクローン化されるｗｔ ｒＰｈｌ ｐ ５ｂに対す るｃＤＮＡを含むｐＭａｌｃベクター（Ｂｉｏｌａｂｓ）である。ｒＰｈ ｐ ５ｂに対するｃＤＮＡのフラグメント１（ｂｐ：１−１５３）および２（ｂｐ： １４１−１３７４）をＰＣＲ反応によって増幅した。以下のプライマー（制限部 位をアンダーラインする）がこの反応に使用された。フラグメント１： Ｐｈｌ ｐ ５ｂ センス： ＭＰ１ アンチセンス： フラグメント２： ＭＰ１ センス： Ｐｈｌ ｐ ５ｂ アンチセンス： ｗｔ配列と比較して、２つの変異プライマーＭＰ１センスおよびＭＰ１アンチ センスが、酵素Ｎｈｅ Ｉの新しい制限切断部位をさらに与える６塩基置換を含 む。 増幅されたフラグメント１をＢａｍ ＨＩおよびＮｈｅ Ｉで消化し、ベクタ ーｐＵＨ８９（Ｊｅｋｅｌ ｅｔ ａｌ.，Ｇｅｎｅ：１５４，５５−５９；１ ９９５）にクローン化した。得られるプラスミドｐＧＳ１０を再度Ｎｈｅ Ｉ／ Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、フラグメント２（Ｎｈｅ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ） をこれらの切断部位へ入れた。このプラスミドｐＧＳ１１は、ｒＰｈｌ ｐ ５ｂをコードするが、所望の塩基置換を含有する完全なｃＤＮＡを含む。点変異 体ｒＰｈｌ ｐ ５ｂ ＰＭ２を発現するために、変異ｃＤＮＡを、発現ベクタ ーｐＭａｌｃのＢａｍ ＨＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ切断部位間で再クローン化 した。得られたプラスミドはｐＧＳ２１と命名された。 点変異体ｒＰｈｌ ｐ ５ｂ ＰＭ１をＰＭ２と同様にして製造した。それは 、ＰＣＲエラーの結果として、さらなる点変異、即ちＮ³²→Ｄを含む。 この点変異体をクローン化するために、ベクターｐＧＳ１３中のｒＰｈｌ ｐ ５ｂに対する全ｃＤＮＡを以下のプライマーを使用するＰＣＲで増幅した。 ＰＣｙｓＭ１： Ｐｈｌ ｐ ５ｂ アンチセンス：上記参照。 ｗｔ配列と比較して、変異プライマーＰＣｙｓＭ１は、アラニン残基がシステ イン残基で置き換えられ、そして同時に酵素Ｓｐｈ Ｉに対する新しい制限 切断部位を与える３塩基置換を含む。ＰＣＲ製造物は、ｐＭａｌｃ発現ベクター （Ｂａｍ ＨＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ）へ直接クローン化された。得られるベクタ ーを、ｐＣｙｓＭ１と命名した。変異の成功は、Ｓｐｈ Ｉを使用する切断分析 でチェックされた。実施例３ 欠失変異体ＤＭ１(ΔＫ⁵⁰→Ｐ¹³²，Ｄ⁴⁹→Ｌ)、ＤＭ２（ΔＦ⁵¹−Ｇ¹⁷⁸，Ｄ⁴⁹→ Ｌ，Ｋ⁵⁰→Ａ）およびＤＭ３（ΔＡ¹⁵⁴−Ｔ¹⁷⁷，Ａ²²⁰→）の製造 プラスミドｐＧＳ２１（上記参照）を欠失変異体ＤＭ１をクローン化するため の出発ベクターとして使用した。ｒＰｈｌ ｐ ５ｂに対するｃＤＮＡのｂｐ３ ９９−１３７４フラグメントを、以下のプライマーを使用するＰＣＲで増幅した 。 ＭＰ２ センス： Ｐｈ ｐ ５ｂ アンチセンス：上を参照。 ベクターｐＧＳ２１をＢａｍ ＨＩおよびＮｈｅ Ｉで切断し、切り出された フラグメントから分離した。またＮｈｅ ＩおよびＢａｍ ＨＩで切断されたＰ ＣＲ製造物を次いで、残りのベクターに結合した。これ、即ちｐＤＭ１から得ら れるベクターは、２５２ｂｐの欠失を有し且つ欠失変異体ｒＰｈｌ ｐ ５ｂＤ Ｍ１をコードするｒＰｈｌ ｐ ５ｂ ｃＤＮＡを含有する。欠失変異体ＤＭ２ およびＤＭ３を同様の方法で製造した。実施例４ 組換えＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体の減じられたアレルゲン性（ＩｇＥ反応性）を示 すためのＥＡＳＴ阻害試験の使用 ＩｇＥ抗体によるアレルゲンの結合は、タイプＩアレルギーにおけるエフェク ター細胞（肥満細胞、就中好塩基球）のアレルゲン特異的活性化の基本的な必要 条件である。酵素／アレルゲン吸収試験（ＥＡＳＴ）のアレルゲン特異的阻害が 、ＩｇＥ抗体へのアレルゲンの結合を定性的および定量的に記録するた めの最良の手段である。ＥＡＳＴ阻害試験を以下のように行う。ミクロタイター プレートをアレルゲン（天然または組換えＰｈｌ ｐ ５またはＰｈｌ ｐ ５ ｂ）(１μｇ／ｍｌ)で覆う。非結合アレルゲン分子を洗浄によって除いた後、非 特異的プラスチック結合部位を、牛血清アルブミン（０．５％）でブロックする 。１０−３０ドナーの代表的なプールとして、または個々の血清としてアレルギ ー患者からの抗ＩｇＥを、アレルゲン被覆ミクロタイタープレートで適当に希釈 して培養する。結合アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を、酵素結合抗ＩｇＥ抗体（例 えば、アルカリホスファターゼ−ａ−ＩｇＥ抗体）を使用して定量する。この結 合は、溶解性アレルゲンまたは試験される物質（アレルゲン変異体）によって、 濃度に依存して阻害される。精製天然アレルゲンＰｈｌ ｐ ５ｂで得られる阻 害カーブを対照として使用する。 図１に表わされている阻害カーブは、代表的なアレルギー患者血清プールＢｏ ｒ １８／１００（２０ドナー）で得られる。 ｒＰｈｌ ｐ ５ｂ（野性タイプ）およびＰＭ３は、アフィニティークロマト グラフィーで得られたものに似た結合カーブを示す。低い範囲でよりよい阻害効 果そして高い濃度でより不十分な阻害による少しばかりの差異が見られる。この 理由は分からぬが、少しばかり程度が異なる立体的なエピトープによって説明さ れるかもしれない。 点変異体ＰＭ１は、この効果を高い範囲でいくらかより大きな程度まで効果を 示す。欠失変異体ＤＭ１およびＤＭ３は、著しく減じられた阻害効果を示す。こ のことは、これらのアレルゲン変異体の強く減じられたアレルゲン性を立証して いて、その結果、化学的に修飾されたアレルゲン（アレルゴイド）と同程度であ る。 欠失変異体ＤＭ２およびＤＭ２^*は、アレルゲン−ＩｇＥ反応に極めて低い阻 害効果を示す。このことは、これらの変異体のアレルゲン性が大部分除去されて いることを示す。アレルギー患者（Ｗｅ ６／９７）からの異なる血清そしてま たアレルギー患者ＩＩ３、ＩＩ１２およびＩＩ１７からの各血清は、変異体とそ の阻害カーブにおいて少し変化を示すが、それにもかかわらずそれらは、欠失変 異体ＤＭ１およびＤＭ３が大きく減じられたアレルゲン性（図２−５） を示すことを確かめている。低い残存活性は別にして、欠失変異体ＤＭ２および ＤＭ２^*の阻害効果は除去されている。点変異体ＰＭ１およびＰＭ３は、全く減 少を示さないか、またはアレルゲン性（例えば、プールＷｅ ６／９７および各 血清ＩＩ １７についてのＰＭ１）において，大部分わずかな減少を示す。修飾 アレルゲンの阻害能を、２５％または５０％阻害でのＰｒｅｌ値を計算して定量 できる(１)。対応阻害値そしてまた２５％または５０％阻害で測定されたアレル ゲン性力価（Ｐｒｅｌ）を、表２−６に血清プールおよび各血清に対して示す。 欠失変異体ＤＭ２およびＤＭ２^*は、極めて低いかまたは意味ある方法で決定 できないそれらのＰｒｅｌ値によってアレルゲン性の失活を示す。点変異体ＰＭ １およびＰＭ３は、アレルゲン性の部分的な失活を示すが、この失活は実際の使 用にとって適当でない。欠失変異体ＤＭ１およびＤＭ３は、アレルゲン性の著し い減少を示す。ＩｇＥ反応性の減少は、以前に知られている化学的に修飾された アレルゲンのそれよりも優れているかまたは同程度であり、それによってこれら の変異体を免疫療法に対して特に適する候補にするものである。 図１ アレルギー患者血清プールＢｏｒ １８／１００を使用するＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体のＥＡＳＴ阻害カーブ 阻害剤： 図２ アレルギー患者血清プールＷｅ ６／９７を使用するＰｈｌ ｐ ５ｂ変 異体のＥＡＳＴ阻害カーブ 阻害剤： 図３ 各アレルギー患者血清ＩＩ／３を使用するＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体のＥＡ ＳＴ阻害カーブ 阻害剤： 図４ 各アレルギー患者血清ＩＩ／１２を使用するＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体のＥ ＡＳＴ阻害カーブ 阻害剤： 図５ 各アレルギー患者血清ＩＩ／１７を使用するＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体のＥ ＡＳＴ阻害カーブ 阻害剤： 表２： アレルギー患者血清プールＢｏｒ １８／１００を使用する組換えＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体のアレルゲン性力価（Ｐ_rel）を組換えおよび天然Ｐｈｌ ｐ ５ｂ のそれと比較 ¹ 阻害値：それぞれ２５％および５０％阻害での阻害剤の濃度² アレルゲン性力価：それぞれ２５％および５０％阻害での天然Ｐｈｌｐ５ｂ に対する比 表３： アレルギー患者血清プールＷｅ ６／９７を使用する組換えＰｈｌ ｐ ５ｂ変 異体のアレルゲン性力価（Ｐ_rel）を組換えおよび天然Ｐｈｌ ｐ ５ｂのそれ と比較 ¹ 阻害値：それぞれ２５％および５０％阻害での阻害剤の濃度² アレルゲン性力価：それぞれ２５％および５０％阻害での天然Ｐｈｌｐ５ｂ に対する比 表４： 各アレルギー患者血清ＩＩ／３を使用する組換えＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体のアレ ルゲン性力価（Ｐ_rel.）を組換えおよび天然Ｐｈｌ ｐ ５ｂのそれと比較 ¹ 阻害値：それぞれ２５％および５０％阻害での阻害剤の濃度² アレルゲン性力価：それぞれ２５％および５０％阻害での生Ｐｈｌｐ５ｂに 対する比 表５： 各アレルギー患者血清ＩＩ／１２を使用する組換えＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体のア レルゲン性力価（Ｐ_rel）を組換えおよび天然Ｐｈｌ ｐ ５ｂのそれと比較 ¹ 阻害値：それぞれ２５％および５０％阻害での阻害剤の濃度² アレルゲン性力価：それぞれ２５％および５０％阻害での天然Ｐｈｌｐ５ｂ に対する比 表６： 各アレルギー患者血清ＩＩ／１７を使用する組換えＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体のア レルゲン性力価（Ｐ_rel）を組換えおよび天然Ｐｈｌ ｐ ５ｂのそれと比較 ¹ 阻害値：それぞれ２５％および５０％阻害での阻害剤の濃度² アレルゲン性力価：それぞれ２５％および５０％阻害での天然Ｐｈｌｐ５ｂ に対する比実施例５ ｒＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体による好塩基球からの減少したヒスタミン遊離 製造された点変異体ＰＭ３および欠失変異体ＤＭ１、ＤＭ２、ＤＭ２^*および ＤＭ３の好塩基球からのヒスタミン遊離能を試験し、野性タイプｒＰｈｌ ｐ ５ｂのそれと比較した。 ヒスタミン遊離試験を行う前に、アレルギー患者（ＰＳ−Ｗ）のＥＤＴＡ血 から好塩基性白血球を、先ずデキストラン沈降によって濃縮し、次いで最終濃度 １００，０００好塩基球／ｍｌに調整した。好塩基球からヒスタミンを遊離する ために、２００μｌの細胞懸濁液を、各々の場合５０μｌの抗原溶液と３７℃で ４０分培養した。このために、ｒＰｈｌ ｐ ５ｂおよび変異体をいろいろの濃 度（１０^-5−１０^-12 Ｍ）で用いた。遊離したヒスタミンを、Ｐｈａｒｍａｃ ｉａのメチルヒスタミンＲＩＡを使用し、製造者の指示に従って各上清で決定し た。 ヒスタミン遊離試験において、検討されたすべての組換えタンパク質は、濃度 が増すごとに典型的なベル形カーブを描いた(図６)。点変異体は、ヒスタミンを 遊離能において野性タイプのｒＰｈｌ ｐ ５ｂと比較してなんら有意な差を示 さなかった。３０％ヒスタミン遊離をもたらすために必要とされる欠失変異体Ｄ Ｍ３、ＤＭ１およびＤＭ２のの濃度は、それぞれ３倍、２０倍そして５００倍で あった。従って、欠失変異体は明白に好塩基球からヒスタミンを遊離能の減少を 示した。 図６：アレルゲンおよびアレルゲン変異体との反応後のヒト好塩基球からのヒス タミン遊離 実施例６ 草花粉にアレルギーである患者のＴ細胞クローンとの組換えＰｈｌ ｐ ５ｂ変 異体の反応性の証明 組換えＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体の反応性を、知られている特異性の樹立Ｔ細胞 クローン（ＴＣＣｓ）で試験した。ＴＣＣｓは、草花粉にアレルギーである患者 から得（実施例１参照）そしてＴ細胞反応性領域Ａ(図７)、Ｂ（図８）およびＣ （図９）に対して向けられた。Ｔ細胞反応性を、クローンを増殖するように刺激 することによって測定した。結果は明らかに、ＴＣＣｓが対応エピトープを変え なければＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体と特異的に反応し、期待通り、このエピトープ が欠如したり、点変異によって変更されていればなんらの反応も示さないことを 明確に示している。 図７：アレルギーで患者のＰｈｌ ｐ ５ｂ反応性Ｔ細胞クローン（ＴＣＣｓ） のｒＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体との増殖反応 特異性：免疫優性Ｔ細胞反応性領域Ａ ¹ 最終濃度０．３μＭ² 刺激指数 ＳＩ：＜１(−)、１−２(＋)、２−５(＋)、５−１０(＋＋)、＞ １０（＋＋＋）³ ｎ．ｔ.：試験せず 図８：アレルギーで患者のＰｈｌ ｐ ５ｂ反応性Ｔ細胞クローン（ＴＣＣｓ） のｒＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体との増殖反応 特異性：免疫優性Ｔ細胞反応性領域Ｂ ¹ 最終濃度０．３μＭ² 刺激指数 ＳＩ：＜１(−)、１−２(＋)、２−５(＋)、５−１０(＋＋)、＞ １０（＋＋＋）³ ｎ．ｔ.：試験せず 図９：アレルギーで患者のＰｈｌ ｐ ５ｂ反応性Ｔ細胞クローン（ＴＣＣｓ） のｒＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体との増殖反応 特異性：免疫優性Ｔ細胞反応性領域Ｃ ¹ 最終濃度０．３μＭ² 刺激指数 ＳＩ：＜１(−)、１−２(＋)、２−５(＋)、５−１０(＋＋)、＞ １０（＋＋＋）³ ｎ．ｔ.：試験せず実施例７ 草花粉にアレルギーである患者のＴ細胞系との組換えＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体の 反応性試験 草花粉にアレルギーである８名の患者からのオリゴクローナルＴ細胞系（ＴＣ Ｌｓ）(実施例１参照)を、天然Ｐｈｌ ｐ ５ｂ(ａ＋ｂ)、または組換えｒＰｈ ｌ ｐ ５ｂ、または５ａ＋５ｂで繰り返し活性化して樹立した。 これらのＴＣＬｓの増殖反応を、ｒＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体を使用して試験し た(図１０)。これは、すべての変異体がＴＣＬｓを活性化するが、定量的な差が あることを示している。欠失変異体ＤＭ３は、ほとんどのＴＣＬｓとの強い特異 的刺激を示している。 図１０：アレルギーである患者のＰｈｌ ｐ ５ｂ反応性Ｔ細胞系（ＴＣＬｓ） のｒＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体との増殖反応 ¹ 最終濃度０．３μＭ² 刺激指数 ＳＩ：＜１(−)、１−２(＋)、２−５(＋)、５−１０(＋＋)、＞ １０（＋＋＋）³ ｎ．ｔ.：試験せず 実施例１−７に記載された結果の概括的評価 草花粉にアレルギーである患者からのＴヘルパー細胞によって認識される主ア レルゲンＰｈｌ ｐ ５ｂのエピトープのマッピングは、個々のＴ細胞系（ＴＣ Ｌｓ）がＰｈｌ ｐ ５ｂの全配列に分布していることを示した。しかし、８５ ％のＴＣＬｓによって認識される３つの免疫優性Ｔ細胞反応性領域を困難なく明 らかにできる(実施例１)。点変異（実施例２）および欠失変異（実施例３）によ って組換えＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体を製造しることができた。ＥＡＳＴ阻害試験 で測定された点変異体（ＰＭ１およびＰＭ３）のＩｇＥ反応性（実施例４）は、 野性タイプのＰｈｌ ｐ ５ｂのそれと有意には変わらない。欠失変異ＤＭ１お よびＤＭ３のＩｇＥ反応性は大きく減少するが、依然として検出可能である。対 照的に、変異体ＤＭ２およびＤＭ２^*のＩｇＥ結合は非常に大きく減少する。ｒ Ｐｈｌ ｐ ５ｂ変異体のアレルゲン性のこの漸進的な減少はまた、アレルギー 患者の血液からの特異的ＩｇＥ結合好塩基球を使用するヒスタミン遊離試験によ って確認される(実施例５)。エピトープ地図化Ｔ細胞クローンでのｒＰｈｌ ｐ ５ｂ変異体の試験は、点変異および欠失変異が期待するようにＴＣＣｓと反応 したり、または刺激をできないことを確かめている(実施例６)。草花粉にアレル ギーである患者の血液からＰｈｌ ｐ ５での刺激により樹立されたオリゴクロ ーナルＴ細胞系を使用して、変異体はこの種のオリゴクローナルＴＣＬｓを刺激 できることを示すことができた(実施例７)。アレルゲン性の減少の結果とＴ細胞 刺激の保持を一緒にすると、特に欠失変異体が、特異的免疫治療に適しそうな組 換えアレルゲン変種を構成する。 次の実施例は医薬製剤に関するものである。実施例Ａ ：注射バイアル剤 ２回蒸留水３リットル中の修飾された組換えアレルゲンに基づく活性化合物ま たは活性化合物混合物１００ｇおよび重リン酸ソーダ５ｇの溶液を、２Ｎ塩 酸によりｐＨ６．５に調節し、ろ過滅菌し、注射用バイアルに分注し、無菌条件 下に凍結乾燥し、バイアルを次いで無菌的に封をする。各注射用バイアルは５ｍ ｇの活性化合物を含有する。実施例Ｂ ：座剤 修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物２０ｇ、大豆レシチン１００ｇ およびココアバター１４００ｇを混合したものを溶かし、型にながし、冷やす。 各座剤は２０ｍｇの活性化合物を含有する。実施例Ｃ ：溶液剤 修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物１ｇ、ＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ９．３８ｇ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ ２８．４８ｇおよび塩化ベンザルコ ニウム０．１ｇを２回蒸留水９４０ｍｌに溶かす。溶液はｐＨ６．８に調節され 且つ１リットルとされ、照射によって滅菌される。この溶液は点眼剤の形で使用 できる。実施例Ｄ ：軟膏剤 修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物５００ｍｇを無菌条件下に黄色 ソフトパラフィン９９．５ｇと混合する。実施例Ｅ ：錠剤 修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物１ｋｇ、ラクトース４ｋｇ、ポ テト澱粉１．２ｋｇ、タルク０．２ｋｇ、およびステアリン酸マグネシウム０． １ｋｇの混合物を、通常の方法で圧縮し、各錠剤が１０ｍｇの活性化合物を含有 するように錠剤とする。実施例Ｆ ：被覆錠剤 実施例Ｅで述べた様にして、錠剤は圧縮され、次いでショ糖、ポテト澱粉、タ ルク、トラガントガムおよび着色料からなるコーティング剤で通常の方法で被覆 される。実施例Ｇ ：カプセル剤 修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物２ｋｇを、各カプセルが活性化 合物２０ｍｇを含有するように、硬質ゼラチンカプセルへ通常の方法で分注する 。実施例Ｈ ：アンプル剤 ２回蒸留水６０リットル中の修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物１ ｋｇの溶液を、ろ過滅菌し、アンプルに分注し、無菌条件下に凍結乾燥し；アン プルを次いで滅菌的に封をする。各アンプルは１０ｍｇの活性化合物を含有する 。実施例Ｉ ：吸入スプレー剤 修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物１４ｇを等張ＮａＣｌ溶液１０ リットルに溶解し、そして溶液を、商業的に入手できるポンプ機能を有するスプ レー容器に分注する。溶液は、口または鼻にスプレーすることができる。１回の スプレー噴射（約０．１ｍｌ）は、約０．１４ｍｇの用量に相当する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 フィービッヒ，ヘルムート ドイツ連邦共和国 デー―21493 シュヴ ァルツェンベーク、ベッカーヴェーク 10 (72)発明者 クロムウェル，オリバー ドイツ連邦共和国 デー―21465 ヴェン トオルフ、レンスヘーエ ２ (72)発明者 ベッカー，ヴォルフ−マインハルト ドイツ連邦共和国 デー―23975 メーツ ェン、ドルフシュトラーセ 53 (72)発明者 ブーフェ，アルブレヒト ドイツ連邦共和国 デー―20255 ハンブ ルク、オッテルスベックアレー 21 (72)発明者 シュラム，ガブリエレ ドイツ連邦共和国 デー―23867 ジュル フェルト、アホルンヴェーク 10 (72)発明者 イェーガー，ローター ドイツ連邦共和国 デー―07743 イエナ、 エル．―ルクセンブルク―シュトラーセ 34 (72)発明者 ミューラー，ヴォルフ−ディーター ドイツ連邦共和国 デー―07749 イエナ、 ブラントシュトレームシュトラーセ 17

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 天然の原料から抽出によって得ることのできるアレルゲンから誘導される 修飾された組換えアレルゲン(ｍｒａ)、及び／又はそれらの生理学的に無害な塩 又は溶媒和物。 ２． これらのアレルゲンが、グループ１−６の主アレルゲンから誘導されるこ とを特徴とする、請求項１に記載の修飾された組換えアレルゲン。 ３． 草花粉にアレルギーである患者からのＩｇＥ抗体との反応性が取り除かれ ているか、又は減少されていて、なおＴリンパ球との反応性は残されていること を特徴とする、請求項１及び２に記載の修飾された組換えアレルゲン。 ４． アレルゲンの遺伝子が、それらがコードするポリペプチドが、野性タイプ と比較して１個又は数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を示すように、 遺伝子操作によって修飾されることを特徴とする、請求項の１−３のいずれかに 記載の修飾された組換えアレルゲン。 ５． アレルゲンの優性Ｔ細胞反応性領域（Ｔ細胞エピトープ）が、遺伝子操作 によって変えられていないことを特徴とする、請求項１−４のいずれかに記載の 修飾された組換えアレルゲン。 ６． アレルゲンが、グループ５の主アレルゲンから誘導されることを特徴とす る、請求項２に記載の修飾された組換えアレルゲン。 ７． アレルゲンが、主Ｐｈｌ ｐ ５ｂアレルゲンから由来することを特徴と する、請求項６に記載の修飾された組換えアレルゲン。 ８． 全２６５アミノ酸からなるＰｈｌ ｐ ５ｂポリペプチドの領域１６−４ ２、１３５−１４９及び１８０−２０６の少なくとも１つ又は組み合わせを変え ないことを特徴とする、請求項５に記載の修飾された組換えアレルゲン。 ９． 以下のグループのポリペプチド、 ＰＭ１（Ｎ³²→Ｄ，Ｄ⁴⁹→Ｌ，Ｋ⁵⁰→Ａ） ＰＭ２（Ｄ⁴⁹→Ｌ，Ｋ⁵⁰→Ａ） ＰＭ３（Ａ¹³→Ｃ） ＤＭ１（Δ Ｋ⁵⁰→Ｐ^Δ32，Ｄ⁴⁹→Ｌ） ＤＭ２（Δ Ｆ⁵¹−Ｇ¹⁷⁸，Ｄ⁴⁹−Ｌ，Ｋ⁵⁰−Ａ） ＤＭ２^*（Δ Ｆ⁵¹−Ｇ¹⁷⁸，１７９−２１７変更配列） ＤＭ３（Δ Ａ¹⁵⁴−Ｔ¹⁷⁷，Ａ²²⁰→Ｔ） から選択される、請求項８に記載の修飾された組換えアレルゲン。 １０． 種々の異なるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用されることを特徴 とする、請求項１−９のいずれかに記載の修飾された組換えアレルゲン、及び／ 又はそれらの生理学的に無害な塩又は溶媒和物を製造する方法。 １１． ＩｇＥ仲介アレルギーを治療するために、請求項１−９のいずれかに記 載の１又は２以上の修飾された組換えアレルゲン、及び／又はそれらの生理学的 に無害な塩又は溶媒和物の１つを含み、そして適宜、付加的活性化合物及び／又 は補助物質を含んでもよい医薬製剤。 １２． 請求項１−９のいずれかに記載の少なくとも１つの修飾された組換えア レルゲン、及び／又はそれらの生理学的に無害な塩又は溶媒和物の１つが、少な くとも１つの固体、液体又は半液体の担体物質又は補助物質と一緒に適当な剤形 にされることを特徴とする、医薬製剤を製造するための方法。 １３． アレルギーの免疫特異的治療（減感作）用に医薬品を製造するための、 請求項１−９のいずれかに記載の修飾された組換えアレルゲン、及び／又はそれ らの生理学的に無害な塩又は溶媒和物の１つの使用。 １４． アレルギーの免疫特異的治療（減感作）ための、請求項１−９のいずれ かに記載の修飾された組換えアレルゲンの使用。