PL196830B1 - Modyfikowane alergeny rekombinacyjne pyłku Graminae, sposób ich otrzymywania, zawierające je preparaty farmaceutyczne i sposób ich otrzymywania oraz ich zastosowanie do immunospecyficznej terapii alergii i wytwarzania leków do immunospecyficznej terapii alergii - Google Patents

Abstract

1. Modyfikowane alergeny rekombinacyjne py lku Graminae, znamienne tym, ze co najmniej jeden lub kombinacja re- gionów 16-42, 135-149 oraz 180-206 polipeptydu Phl p 5b sk ladaj acego si e z ca lkowitej liczby 265 aminokwasów pozostaje niezmieniona i wykazuj a one obni zon a reaktywnosc wobec przeciwcia l IgE, zachowuj ac reaktywnosc wobec limfocytów T i s a korzystnie wybrane z nast epuj acej grupy polipeptydów: PM1 (N 32 ? D, D 49 ? L, K 50 ? A), PM2 (D 49 ? L, K 50 ? A), PM3 (A 13 ? C), DM1 ( ? K 50 - p ?132 , D 49 ? L), DM2 ( ? F 51 - G 178 , D 49 - L, K 50 - A), DM2* ( ? F 51 - G 178 , 179-217 zmieniona sekwencja), oraz DM3 ( ? A 154 - T 177 , A 220 ? T). 8. Sposób otrzymywania modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych py lku Graminae pochodz acych z g lównej grupy 1 lub 5, których reaktywno sc wobec przeciwcia l IgE pacjentów, którzy s a alergiczni na te alergeny jest zmniejszona lub wyeliminowana, przy zachowaniu reaktywno sci wobec limfocytów T, znamienny tym, ze w oparciu o sekwencj e aminokwasow a naturalnego alergenu, - wytwarza si e szeregi nak ladaj acych si e oligopeptydów, pochodz acych od sekwencji tego alergenu, - uzyskuje si e klony limfocytów T od pacjentów, którzy s a alergiczni wobec tego alergenu, - przeprowadza si e badanie rzeczonych oligopeptydów dla okre slenia ich zdolno sci do reagowania z rzeczonymi klo- nami limfocytów T i ich stymulowania, - wytwarza si e mutanty tego alergenu, przy czym co najmniej jeden lub wi ecej regionów sekwencji reaktywnej limfocytu T (epitopów limfocytu T) pozostawia si e niezmienionymi, oraz - identyfikuje si e i wybiera te mutanty, które wykazuj a poszukiwane w lasciwo sci. 10. Preparat farmaceutyczny do leczenia alergii po sredniczonych przez IgE, znamienny tym, ze zawieraj acy jeden lub wi eksz a liczb e modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych zdefiniowanych w zastrz. 1 i/lub jedn a z ich fizjologicznie tolero- wanych soli lub solwatów, a tak ze, je sli jest to odpowiednie, dodatkowe zwi azki aktywne i/lub dodatkowe substancje. 12. Zastosowanie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli lub solwatów zdefiniowanych w zastrz. 1 do wytwarzania preparatów farmaceutycznych do immunospecyficznej terapii alergii (odczulania). PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 335981	(11) 196830 (13) B1
tlfil	(22) Data zgłoszenia: 16.03.1998	(51) Int.Cl. C07K 14/415 (2006.01)
	(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:	A61K 39/35 (2006.01)
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej	16.03.1998, PCT/EP98/01507 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:	A61P 37/08 (2006.01)
08.10.1998, WO98/43657 PCT Gazette nr 40/98

Modyfikowane alergeny rekombinacyjne pyłku Graminae, sposób ich otrzymywania, zawierające je preparaty farmaceutyczne i sposób ich otrzymywania oraz ich zastosowanie do immunospecyficznej terapii alergii i wytwarzania leków do immunospecyficznej terapii alergii

	(73) Uprawniony z patentu: MERCK PATENT GMBH,Darmstadt,DE
(30) Pierwszeństwo:	(72) Twórca(y) wynalazku:
27.03.1997,DE,19713001.1	Helga Kahlert,Hamburg,DE
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	Hans-Thomas SWwe,Stelle,DE Helmut Fiebig,Schwarzenbek,DE Oliver Cromwell,Wentorf,DE
05.06.2000 BUP 12/00	Wolf-Meinhard Becker,Mozen,DE Albrecht Bufe,Hamburg,DE
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	Gabriele Schramm,S^lfeld,DE Lothar Jager,Jena,DE Wolf-Dieter M^ler,Jena,DE
29.02.2008 WUP 02/08	(74) Pełnomocnik: Szymon Łukaszyk, Kancelaria Patentowa Łukaszyk

⁽⁵⁷⁾ 1. Modyfikowane alergeny rekombinacyjne pyłku Graminae, znamienne tym, że co najmniej jeden lub kombinacja regionów 16-42, 135-149 oraz 180-206 polipeptydu Phl p 5b składającego się z całkowitej liczby 265 aminokwasów pozostaje niezmieniona i wykazują one obniżoną reaktywność wobec przeciwciał IgE, zachowując reaktywność wobec limfocytów T i są korzystnie wybrane z następującej grupy polipeptydów:

PM1 (N³² D, D⁴⁹ L, K⁵⁰ A),

PM2 (D⁴⁹ L, K⁵⁰ A),

PM3 (A¹³ C),

DM1 (Δ K⁵⁰ - p''³². D⁴⁹ L),

DM2 (Δ F⁵¹ - G¹⁷⁸, D⁴⁹ - L, K⁵⁰ - A),

DM2* (Δ F⁵¹ - G¹⁷⁸, 179-217 zmieniona sekwencja), oraz

DM3 (Δ A¹⁵⁴ - T¹⁷⁷, A²²⁰ T).

8. Sposób otrzymywania modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych pyłku Graminae pochodzących z głównej grupy 1 lub 5, których reaktywność wobec przeciwciał IgE pacjentów, którzy są alergiczni na te alergeny jest zmniejszona lub wyeliminowana, przy zachowaniu reaktywności wobec limfocytów T, znamienny tym, że w oparciu o sekwencję aminokwasową naturalnego alergenu,

- wytwarza się szeregi nakładających się oligopeptydów, pochodzących od sekwencji tego alergenu,

- uzyskuje się klony limfocytów T od pacjentów, którzy są alergiczni wobec tego alergenu,

- przeprowadza się badanie rzeczonych oligopeptydów dla określenia ich zdolności do reagowania z rzeczonymi klonami limfocytów T i ich stymulowania,

- wytwarza się mutanty tego alergenu, przy czym co najmniej jeden lub więcej regionów sekwencji reaktywnej limfocytu T (epitopów limfocytu T) pozostawia się niezmienionymi, oraz

- identyfikuje się i wybiera te mutanty, które wykazują poszukiwane właściwości.

10. Preparat farmaceutyczny do leczenia alergii pośredniczonych przez IgE, znamienny tym, że zawierający jeden lub większą liczbę modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych zdefiniowanych w zastrz. 1 i/lub jedną z ich fizjologicznie tolerowanych soli lub solwatów, a także, jeśli jest to odpowiednie, dodatkowe związki aktywne i/lub dodatkowe substancje.

12. Zastosowanie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli lub solwatów zdefiniowanych w zastrz. 1 do wytwarzania preparatów farmaceutycznych do immunospecyficznej terapii alergii (odczulania).

PL 196 830 B1

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zmodyfikowanych rekombinacyjnych alergenów (mra), które są pochodnymi alergenów, jakie można otrzymać z naturalnych surowców metodą ekstrakcji. Między innymi jako naturalnych surowców używa się ziaren pyłku z Graminae takich jak Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylus glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon i Holcus lanatus.

Ekstrakty pyłków Graminae, w postaci stosowanej w diagnostyce i terapii składają się z heterogenicznych mieszanin protein i glikoprotein, z których niektóre reagują z przeciwciałami IgE alergicznych pacjentów i z definicji nazywane są alergenami. Własności molekularne tych alergenów dają podstawy do ich podziału na 6 grup, w związku z czym wzajemna reaktywność omawianych gatunków

Graminae jest stosunkowo wysoka. Dominującymi grupami alergenów (główne alergeny) są grupy 5 i 1, według typowej klasyfikacji alergenów (Liebers et al., Clin. Exper. Alergy, 26, 494-516 (1996)). N-terminalne sekwencje aminokwasów i/lub częściowo lub całkowicie oznaczone sekwencje aminokwasów grup 5 i 1 głównych alergenów są znane (Vrtala et al., J Immunology 151, 4773-4781 (1993) i Bufe et al. FEBS. Lett. 263, 6-12 (1995)). Ponadto metody klonowania tych głównych alergenów opisano (Scheiner et al. Int. Arch Allergy Immunol. 98, 93-96 (1992)).

Alergeny grupy 5 tymotki łąkowej opisano też w publikacji International archives of allergy and immunology, vol 109, 196 r. (str. 352-355).

Obecnie ciekłe ekstrakty pyłku Graminae używane są do diagnozy in vitro alergii typu 1. Ekstrakty te są także podstawą diagnozy in vitro a następnie immunoterapii (Fiebig h., Allergo Journal 7, 377-382 1995)). Zastosowanie naturalnych ekstraktów alergenów do specyficznej immunoterapii jest ograniczone przez zależne od IgE reakcje alergiczne (reakcje uboczne), które indukowane są w takich warunkach.

Zgłoszenia patentowe WO 91/06571 i WO 94/04564 opisują odpowiednio peptydy alergenu kota TRFP i alergenu Lol p 5 trawy Lolium perenne, odpowiednie do zastosowań terapeutycznych.

Ze względu na to ekstrakty naturalnych alergenów mogą być podawane jedynie w takich dawkach, które nie przekraczają progu efektów ubocznych. Celem osiągnięcia wysokich stężeń alergenu, które konieczne są dla osiągnięcia efektu terapeutycznego, ekstrakty podawane są w postaci kilku kolejnych zastrzyków o stężeniach rosnących aż do dawki podtrzymującej. Absorpcja na żelach umożliwia zastosowanie ekstraktów alergenów do odczulania w sposób bardziej efektywny i mniej podatny na efekty uboczne.

Dodatkowym udoskonaleniem jest chemiczna modyfikacja alergenów prowadząca do alergoidów, które charakteryzując się niższą reaktywnością z IgE w dużej mierze wykazują przy tym nadal zdolność wzbudzania odpowiedzi immunologicznej. (Fiebig H., Allergo Journal 7, 377-382 (1995) i Maasch et al. Clin. Ref. allergy 5, 89-106 (1987).

Początkowo badając alergeny roztoczy kurzu domowego stwierdzono, że obniżenie reaktywności względem IgE można uzyskać metodą kierowanej wymiany aminokwasów (Smith et al. Mol. Immuol. 33, 339-405 (1996) i Nishiyama et al. Mol. lmmuol. 32, 1021-1021 (1995)).

Obecnie odczulanie pacjentów, którzy uczuleni są na pyłki Graminae przeprowadza się używając naturalnych ekstraktów, które zawierają wszystkie znane alergeny jak również dodatkowe niealergogenne komponenty o działaniu immunogennym. Komponenty te stosuje się w wysokich stężeniach pomimo tego, że do alergeno-specyficznej terapii potrzebne są tylko cząsteczki alergenów, na które uczulony jest konkretny pacjent. Oznacza to, że konieczne jest podawanie alergikowi komponentów, które nie działają na niego odczulająco i które mogą wywołać efekty uboczne.

W efekcie dostępności modyfikowanych alergenów rekomendowanych jako farmaceutyki stosowane mogą być pojedyncze alergeny lub ściśle określone mieszaniny. Środki takie działają odczulająco zgodnie z indywidualnym spektrum uczulenia.

Umożliwia to każdorazowe dobranie odpowiedniej, indywidualnie dopasowanej terapii.

Celem obecnego wynalazku jest opracowanie nowych związków, w szczególności związków, posiadających odpowiednie właściwości, a w szczególności związków, które mogą być użyte do otrzymywania farmaceutyków.

Stwierdzono, że przedstawione w niniejszym opisie związki, w postaci modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych i ich soli i solwatów charakteryzują się korzystnymi właściwościami farmakologicznymi, przy czym są one także dobrze tolerowane. W szczególności wykazują działanie odczulające.

PL 196 830 B1

Związki te mogą być używane w medycynie i weterynarii jako związki farmaceutycznie aktywne, w szczególnoś ci w terapii chorób alergicznych i do odczulania pacjentów alergicznych.

W kontekście obecnego wynalazku niespodziewanym sukcesem okazało się zastosowanie alergenów rekombinacyjnych, których sekwencje aminokwasów są identyczne z cząsteczkami alergenów występujących w ekstraktach naturalnych, do konstruowania mutantów metodami manipulacji genetycznej, które są znane per se. Reagują one specyficznie z limfocytami T pacjentów, którzy są uczuleni na pyłek trawy, tzn. stymulują wzrost limfocytów T oraz syntezę przez nie cytokin lub indukują w limfocytach T anergię, lecz wykazują wyraźnie obniżoną zdolność wiązania z przeciwciałami IgE, które obecne są w surowicy donorów limfocytów T oraz alergeno-specyficznym IgE pyłku trawy z surowic innych pacjentów uczulonych na pyłek trawy.

Efekt ten, którego nie obserwuje się ani w przypadku alergenów występujących naturalnie ani alergenów rekombinacyjnych, jest korzystny ponieważ:

• unika się kontrolowanych przez IgE efektów ubocznych, które w innych przypadkach występują podczas odczulania, lub co najmniej są one w znacznym stopniu ograniczone, • zapewnia się rozpoznawanie modyfikowanych alergenów rekombinowanych przez limfocyty pamięciowe TH pacjentów alergicznych, • tworzy się warunki normalizacji równowagi różnych subpopulacji TH, równowaga ta jest zakłócona u pacjentów alergicznych • umoż liwia się dział anie terapeutyczne poprzez anergizację i/lub eliminację alergenoreaktywnych komórek T i funkcjonalną reorientację specyficznej populacji komórek T, która zdominowana jest przez TH2 do takiej, która dopasowana jest do TH0/TH1, • synteza immunologlobuliny moż e być przestawiona z tworzenia specyficznych przeciwciał IgE (kontrolowanej przez TH2), co jest typowe dla pacjentów alergicznych, na korzystniejszą syntezę przeciwciał IgG (kontrolowaną przez TH1), • w efekcie moż na się spodziewać , ż e stan pacjentów, leczonych nowymi modyfikowanymi alergenami rekombinacyjnymi ulegnie znacznej poprawie.

Wynalazek dotyczy modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych, które pochodzą z alergenów, które otrzymywane są z materiałów naturalnych metodą ekstrakcji. Jako surowce naturalne stosowane są między innymi ziarna pyłku z Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylus glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon i Holcus lanatus. W szczególności wynalazek dotyczy modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych, które pochodzą z głównych alergenów grupy 1-6 i których reaktywność z przeciwciałami IgE alergicznych pacjentów, którzy uczuleni są na pyłek trawy, eliminuje się lub co najmniej redukuje się, podczas gdy pozostawia się reaktywność względem limfocytów T. Modyfikowane alergeny rekombinacyjne różnią się od szczepów pierwotnych tym, że geny tych alergenów modyfikowane są metodami manipulacji genetycznej w taki sposób, że polipeptydy, które są przez nie kodowane wykazują w porównaniu do szczepów pierwotnych substytucje, delecje i/lub addycje pojedynczych lub kilku aminokwasów. Równocześnie regiony modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych dominujące ze względu na reaktywność wobec komórki T nie podlegają manipulacji genetycznej.

Modyfikacje alergenów rekombinacyjnych otrzymuję się z głównych alergenów grupy 5 lub innych grupy 1. W szczególności nowe alergeny otrzymuje się z głównego alergenu Phl p 5b.

Używając jednoliterowego kodu aminokwasowego sekwencję Phl p 5b przedstawić można następująco:

PL 196 830 B1

ADAGYAPATPAACGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADK

10 20 30 40 50

FKTFEAAFTSSSKAAAAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFV 51 60 70 80 90 100

ASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAA 101 110 120 130 140 150

TAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAA 151 160 170 180 190 200

TVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAG 201 210 220 230 240 250

AASGAATVAAGGYKV

251 260 265

Istotą wynalazku są modyfikowane alergeny rekombinacyjne pyłku Graminae, charakteryzujące się tym, że co najmniej jeden lub kombinacja regionów 16-42, 135-149 oraz 180-206 polipeptydu Phl p 5b składającego się z całkowitej liczby 265 aminokwasów pozostaje niezmieniona i wykazują one obniżoną reaktywność wobec przeciwciał IgE, zachowując reaktywność wobec limfocytów T i są korzystnie wybrane z następującej grupy polipeptydów:

PM1 (N³² D, D⁴⁹ L, K⁵⁰ A),

PM2 (D⁴⁹ L, K⁵⁰ A),

PM3 (A¹³ C),

DM1 (Δ K⁵⁰ - ρ^Δ132, DM2 (Δ F⁵¹ - G¹⁷⁸, DM2* (Δ F⁵¹ - G¹⁷⁸, DM3 (Δ A¹⁵⁴ - T¹⁷⁷,

D⁴⁹ L),

D⁴⁹ - L, K⁵⁰ - A),

179-217 zmieniona sekwencja), oraz

A²²⁰ T).

Zachowane segmenty są regionami determinanty antygenowej komórki T.

W powyższych sekwencjach aminokwasy lub sekwencje aminokwasów, które podlegają modyfikacji są w każdym przypadku wskazane. W tym kontekście PM1 oznacza mutację punktową 1 charakteryzującą się następującą sekwencją (aminokwasy które zostały wymienione w porównaniu do

Ph1 p 5b wydrukowane są wytłuszczoną czcionką):

ADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAALA 1 10 20 30 40 50

PL 196 830 B1

FKTFEAAFTSSSKAAAAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFD SFV 51 60 70 80 90 100

ASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAA 101 110 120 130 140 150

TAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAA 151 160 170 180 190 200

TVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAG 201 210 220 230 240 250

AASGAATVAAGGYKV

251 260 265

Inne szczególnie korzystne peptydy mają następujące sekwencje:

PM2 (D⁴⁹ L, K⁵⁰ A):

ADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAALA 1 10 20 30 40 50

FKTFEAAFTS S SKAAAAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFD SFV 51 60 70 80 90 100

ASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAA 101 110 120 130 140 150

TAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAA 151 160 170 180 190 200

TVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAG 201 210 220 230 240 150

AASGAATVAAGGYKV

251 260 265

AASGAATVAAGGYKV 251 260 265

PM3 (A¹³ C):

PL 196 830 B1

ADAGYAPATPAACGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADK

10 20 30 40 50

FKTFEAAFTSSSKAAAAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFV 51 60 70 80 90 100

ASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAA 101 110 120 130 140 150

TAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAA 151 160 170 180 190 200

TVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAG 201 210 220 230 240 250

AASGAATVAAGGYKV 251 260 265

DM1 (Δ K⁵⁰ - ρ^Δ132, D⁴⁹ L)

ADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAALA 1 10 20 30 40 50

GELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYK 51 60 70 80 90 100

CIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATG 103 110 120 130 140 150

AATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV

154 160 170 180

DM2 (Δ F⁵¹ - G¹⁷⁸, D⁴⁹ - L, K⁵⁰ - A)

PL 196 830 B1

ADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAALA

10 20 30 40 50

GAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQ 51 60 70 80 90 100

VSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV 102 110 120 130 137

DM2* (Δ F⁵¹ - G^178, 179 - 217 zmieniona sekwencja):

Sekwencja ta odpowiada sekwencji DM2, w której jednak aminokwasy w pozycjach 179-217 startującego peptydu Phl p5b dodatkowo wykazują zmienioną sekwencję, a ponadto brak wszystkich następnych aminokwasów,

DM3 (Δ A¹⁵⁴ - T¹⁷⁷, A²²⁰ T)

ADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADK 1 10 20 30 40 50

FKTFEAAFTSSSKAAAAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFV

60 70 80 90 100

ASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAA 101 110 120 130 140 150

TAAGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKTITAMS 151 160 170 180 190 200

EVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV 202 210 220 230 240

Skróty reszt aminokwasów występujące w niniejszym spisie oznaczają następujące aminokwasy:

Ala = A alaninę

Asn = N asparaginę

Asp = D kwas asparaginowy

Arg = R argininę

Cys = C cysteinę

Gin = Q glutaminę

Glu = E kwas glutaminowy

Gly = G glicynę

His = H histydynę

Ile = l izolencynę

Leu = L leucynę

Lys = K lizynę

PL 196 830 B1

Met = M metioninę

Phe = F fenyloalaninę

Pro = P prolinę

Ser = S serynę

Thr = T treoninę

Trp = W tryptofan

Tyr = Y tyrozynę

Val = V walinę.

Znaczenie innych stosowanych skrótów podano poniżej:

Ac

BOC

CBZ lub Z

DCCI

DMF

EDCI

Et

FCA

FITC

Fmoc

HOBt

Me

MBHA

Mtr

HONSu

OBut

Oct

OMe

OEt

POA

Sal

TFA

Trt acetyl tert-butoksykarbonyl benzyloksykarbonyl dicykloheksylokarbodiimid dimetyloformamid

N-etylo-N,N'-(dimetyloaminopropylo)karbodiimid etyl kwas fluoresceinokarboksylowy izotiocyjanian fluoresceiny

9-fluorenylometoksykarbonyl

1-hydroksybenzotriazol metyl

4-metylobenzhydryloamina

4-metoksy-2,3,6-trimetylofenylosulfonyl

N-hydroksysukcynimid ester t-butylowy oktanoil ester metylowy ester etylowy fenoksyacetyl salicyloil kwas trifluorooctowy trityl (trifenylometyl)

W wypadku kiedy wcześ niej wymienione aminokwasy mogą wystę pować w wię kszej liczbie form enancjomerycznych, to w tekście powyżej i poniżej uwzględnia się np. wszystkie te formy a także ich mieszaniny (np. formy DL). Ponadto aminokwasy mogą np. jako część składową związków zawierać odpowiednie znane grupy ochronne (zabezpieczające), które per se są znane.

Związki według wynalazku zawierają także pochodne związków derywatyzowane tzw. prolekami, tzn. np. grupami alkilowymi lub acylowymi, cukrami lub oligopeptydami, które w organizmie rozpadają się szybko do aktywnych związków według wynalazku.

Proleki zawierają także biodegradowalne polimeryczne pochodne nowych związków, jak np.

opisane w Int. J. Pharm 115. 61-67 (1995).

Nowe alergeny mogą posiadać jedno lub większą liczbę centrów chiralnych i stąd mogą występować w różnych formach stereoizomerycznych. Obecny wynalazek obejmuje wszystkie te formy.

Wymienione reszty aminokwasów mogą być również przekształcone w pochodne. W tym kontekście szczególnie korzystne są modyfikacje bocznych łańcuchów.

Istotą wynalazku jest ponadto sposób otrzymywania modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych pyłku Graminae pochodzących z głównej grupy 1 lub 5, których reaktywność wobec przeciwciał IgE pacjentów, którzy są alergiczni na te alergeny jest zmniejszona lub wyeliminowana, przy zachowaniu reaktywności wobec limfocytów T, charakteryzujący się tym, że w oparciu o sekwencję aminokwasową naturalnego alergenu,

- wytwarza się szeregi nakładających się oligopeptydów, pochodzących od sekwencji tego alergenu,

- uzyskuje się klony limfocytów T od pacjentów, którzy są alergiczni wobec tego alergenu,

PL 196 830 B1

- przeprowadza się badanie rzeczonych oligopeptydów dla określenia ich zdolności do reagowania z rzeczonymi klonami limfocytów T i ich stymulowania,

- wytwarza się mutanty tego alergenu, przy czym co najmniej jeden lub więcej regionów sekwencji reaktywnej limfocytu T (epitopów limfocytu T) pozostawia się niezmienionymi, oraz

- identyfikuje się i wybiera te mutanty, które wykazują poszukiwane właściwości.

Korzystne jest aby do realizacji sposobu według wynalazku wykorzystać polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) i/lub jej warianty.

W przypadku kiedy sekwencja peptydu jest znana alergeny mogą także być otrzymywane metodami syntezy peptydów które są znane per se np. zmodyfikowaną techniką Merrifielda, jak opisano w literaturze (np. w typowych monografiach takich jak Houben - Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart), w warunkach reakcyjnych, które są znane i odpowiednie dla wymienionych reakcji. W tym kontekście można także wykorzystać warianty, które są per se znane, lecz które nie zostały tutaj wymienione. Możliwe jest ponadto uwalnianie peptydów z jednej z ich pochodnych funkcyjnych przez poddanie takich pochodnych działaniu środka solwolitycznego lub wodorolitycznego i/lub przeprowadzenie zasadowego lub kwasowego peptydu w jedną z jego soli lub solwatów przez poddanie go działaniu kwasu lub zasady.

Korzystnymi surowcami wyjściowymi do solwolizy względnie wodorolizy są takie związki, które w miejscu jednej lub kilku wolnych grup aminowych i/lub hydroksylowych posiadają odpowiednie zabezpieczone grupy aminowe i/lub hydroksylowe, korzystnie takie, które w miejscu atomu H, który jest związany z atomem N, mają grupę zabezpieczającą funkcję aminową, np. takie które w miejscu grupy aminowej NH2 zawierają grupę NHR' (gdzie R' oznacza grupę zabezpieczającą funkcję aminową, np. BOC lub CBZ).

Ponadto korzystnymi surowcami wyjściowymi są te, które w miejscu atomu H grupy hydroksylowej mają grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową, np. takie, które w miejscu grupy hydroksyfenylowej mają grupę RO-fenylową (gdzie R oznacza grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową).

W cząsteczkach surowców wyjściowych może występować większa liczba - takich samych lub różnych - grup zabezpieczających funkcję aminową i/lub hydroksylową. W wypadku kiedy grupy ochronne są różne od siebie mogą być w wielu przypadkach usunięte selektywnie.

Termin „grupa zabezpieczająca funkcję aminową jest ogólnie znany i odnosi się do grup, które są odpowiednie do zabezpieczania (blokowania) grupy aminowej przed reakcją chemiczną, które jednak są łatwe do usunięcia po przeprowadzeniu żądanej reakcji w innych miejscach cząsteczki. Typowymi takimi grupami są w szczególności niepodstawione lub podstawione grupy acylowe, arylowe, aryloalkoksymetylowe lub aryloalkilowe. Ponieważ grupy zabezpieczające po planowanej reakcji (lub szeregu reakcji) są usuwane, z reguły ich rodzaj i wielkość nie stanowią dla procesu parametru krytycznego; korzystnymi są jednak takie o 1-20 atomach C, w szczególności 1-8 atomach C. Termin grupa acylowa w kontekście omawianego procesu powinien być interpretowany w najszerszym znaczeniu. Obejmuje on grupy acylowe tworzone przez alifatyczne, aryloalifatyczne, aromatyczne lub heterocykliczne kwasy karboksylowe lub sulfonowe jak również w szczególności grupy alkoksykarbonylowe, aryloksykarbonylowe a szczególnie aryloalkoksykarbonylowe. Przykładami takich grup acylowych są grupy alkanoilowe jak acetylowa, propionylowa, butyrylowa; aryloalkanoilowe jak fenyloacetylowa; aryloilowe jak benzoilowa lub toluilowa; aryloksyalkanoilowe jak POA; alkoksykarbonylowe jak metoksykarbonylowa, etoksykarbonylowa, 2,2,2-trichloroetoksykarbonylowa, BOC lub 2-jodoetoksykarbonylowa, aryloalkiloksykarbonylowe jak CBZ („karbobenzoksy), 4-metyloksybenzyloksykarbonylowa lub FMOC; arylosulfonylowe jak Mtr. Korzystnymi grupami zabezpieczającymi funkcję aminową są BOC i Mtr, ponadto CBZ, Fmoc, grupa benzylowa i acetylowa.

Termin „grupa zabezpieczająca funkcję hydroksylową jest podobnie ogólnie znany i odnosi się do takich grup, które są odpowiednie do zabezpieczenia grupy hydroksylowej przed wstąpieniem w reakcję chemiczną, a jednocześnie są łatwe do usunięcia po przeprowadzeniu planowanej reakcji w innych miejscach cząsteczki. Typowymi takim grupami są w szczególności wymienione powyżej niepodstawione lub podstawione grupy arylowe, aryloalkilowe lub acylowe, ponadto także alkilowe. Ponieważ grupy zabezpieczające po planowanej reakcji lub szeregu reakcji są usuwane, z reguły ich rodzaj i wielkość nie stanowią dla procesu parametru krytycznego; korzystnymi są jednak grupy o 1-20 atomach C, w szczególności 1-10 atomach C. Przykładami grup zabezpieczających funkcję hydroksylową są między innymi grupa benzylowa, p-nitrobenzoilowa, p-toluenosulfonylowa, tert-butylowa i acetylowa, przy czym grupy benzylowa i tert-butylowa są szczególnie korzystne. Grupy COOH

PL 196 830 B1 w kwasie asparaginowym i glutaminowym są zabezpieczane korzystnie w formie ich estrów tert-butylowych (np. Asp(OBut)).

Usuwanie grup zabezpieczających z pochodnych związków o wzorze l następuje - w zależności od użytej grupy ochronnej - np. pod działaniem mocnych kwasów, korzystnie TFA lub nadchlorowego, ale także pod wpływem innych mocnych kwasów nieorganicznych jak kwas solny lub siarkowy, silnych organicznych kwasów karboksylowych jak kwas trichloroctowy lub kwasy sulfonowe, jak kwas benzeno- i p-toluenosulfonowy. Obecność dodatkowych niereaktywnych rozpuszczalników jest możliwa, ale nie zawsze konieczne. Odpowiednimi niereaktywnymi rozpuszczalnikami są na przykład kwasy karboksylowe jak kwas octowy, etery jak tetrahydrofuran lub dioksan, amidy jak DMF, halogenowane węglowodory jak dichlorometan, ponadto także alkohole jak metanol, etanol lub izopropanol a także woda. Odpowiednie są także mieszaniny wymienionych rozpuszczalników. TFA stosowany jest korzystnie w nadmiarze bez dodatku dodatkowego rozpuszczalnika, kwas nadchlorowy w formie mieszaniny kwasu octowego i 70% kwasu nadchlorowego w stosunku 9:1. Temperatury reakcji usuwania grup zabezpieczających zwierają się w granicach 0 i 50°C, korzystnie między 15 i 30° (temperatura pokojowa).

Grupy BOC, OBut i Mtr mogą np. być usunięte przy użyciu TFA w dichlorometanie lub ok. 3 do 5 N HCI w dioksanie przy temperaturze 15-30°, grupa FMOC może być usunięta od 5% do 50% roztworem dimetyloaminy, dietyloaminy lub piperydyny w DMF w temp. 15-30°.

Grupa tritylowa stosowana jest do zabezpieczania aminokwasowej histydyny, asparaginy, glutaminy i cysteiny. Usunięcie grupy zabezpieczającej, w zależności od żądanego produktu końcowego, przeprowadza się odczynnikiem TFA/10% tiofenol, wobec którego grupa tritylowa odszczepia się od wszystkich wymienionych aminokwasów, lub TFA/anizol lub TFA/tioanizol, które odszczepiają grupę tritylową tylko od His, Asn i Gly, pozostawiając ją na łańcuchach bocznych Cys.

Wodorolitycznie odszczepiane grupy ochronne (np. CBZ lub benzylowa) mogą np. być usunięte przez działanie wodorem w obecności katalizatorów (np. katalitycznych metali szlachetnych jak pallad, korzystnie na nośnikach jak węgiel). Jako rozpuszczalniki nadają się obok wyżej wymienionych, w szczególnoś ci np. alkohole jak metanol lub etanol lub amidy jak DMF. Wodorolizę przeprowadza się z reguły w temperaturach między 0 i 100° i ciś nieniach między 1 i 200 bar, korzystnie 20-30° i 1-10 bar. Wodoroliza grupy CBZ daje dobry wynik np. na 5 do 10% Pd/C w metanolu lub mrówczanem amonu (zamiast wodoru) na Pd/C w mieszanine metanol/DMF w temperaturze 20-30°.

Zasada pod działaniem kwasu może być przeprowadzona do odpowiedniej kwasowej soli addycyjnej, na przykład przez reakcję ekwiwalentnych ilości zasady i kwasu w inertnym rozpuszczalniku jak etanol a w końcu oddestylowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem. W reakcji takiej brane są pod uwagę szczególnie takie kwasy, które prowadzą do soli tolerowanych fizjologicznie, l tak stosowane mogą być kwasy nieorganiczne, np. kwas siarkowy, azotowy, kwasy halogenowodorowe jak kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwasy fosforowe jak ortofosforowy, kwas sulfaminowy, ponadto kwasy organiczne, w szczególności alifatyczne, alicykliczne, arylowoalifatyczne, aromatyczne lub heterocykliczne jedno lub wielozasadowe kwasy węglowe, sulfonowe lub siarkowe, na przykład kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas propionowy, kwas piwalonowy, kwas dietylooctowy, kwas malonowy, kwas bursztynowy, kwas pimelinowy, kwas fumarowy, kwas maleinowy, kwas mlekowy, kwas winowy, kwas jabłkowy, kwas cytrynowy, kwas glukonowy, kwas askorbinowy, kwas nikotynowy, kwas izonikotynowy, kwasy metano- i etanosulfonowe, kwas etanodisulfonowy, kwas 2-hydroksyetanosulfonowy, kwas benzenosulfonowy, kwas p-toluenosulfonowy, kwasy naftaleno- mono i di -sulfonowe, kwas laurylosiarkowy. Sole z kwasami nietolerowanymi fizjologicznie np. pikryniany mogą być używane do izolowania i/lub oczyszczania związków o wzorze l.

Z drugiej strony kwas o wzorze l pod działaniem zasady moż e utworzyć fizjologicznie tolerowaną sól metalu lub sól amonową. Jako sole wchodzą przy tym w rachubę szczególnie sól sodowa, potasowa, magnezowa, wapniowa lub sole amoniowa, np. sole dimetylo-, monoetylo- dietylo- lub diizopropylo-amoniowe, sole cykle heksylowa-, lub dicykloheksylo-amoniowa lub sole dibenzyloetylenodiamoniowe, ponadto np. sole z argininą lub lizyną.

Celem zapewnienia odpowiedniej sekwencji DNA lub aminokwasu konieczne są następujące etapy:

Składniki alergogenne ekstraktów, które otrzymano tradycyjnymi metodami identyfikuje się i oznacza ich istotne parametry fizykochemiczne. Składniki określa się jako alergeny przez wykazanie ich zdolności do wiązania się z przeciwciałami IgE pacjentów z alergią. Z reguły oznaczenia wykonuje się metodami, które same w sobie są znane, takie jak SDS-PAGE, izoelektroogniskowanie (isoelectroPL 196 830 B1 focusing) a następnie Western blotting. Stosuje się surowice pacjentów alergicznych, rozwijając jedynie przeciwciała wiążące izotypu IgE. W tym kontekście należy zwrócić uwagę na zapewnienie odpowiednio dużej liczby klinicznie zweryfikowanych pacjentów alergicznych (dwudziestu uważa się za najmniejszą liczbę jaką można użyć). Alternatywnie stosowane mogą być także inne metody takie jak

CIE lub CRIE.

Te alergeny pyłku Graminae, które zidentyfikowano i scharakteryzowano tą metodą mogą być otrzymane analitycznie w taki sposób, że można przeprowadzić oznaczenie N-terminalnego aminokwasu. Ponadto alergeny można oczyszczać biochemicznie i używać ich do otrzymywania przeciwciał monoklonalnych. Przeciwciała monoklonalne podobnie jak przeciwciała IgE w surowicy pacjentów alergicznych mogą być używane do identyfikacji immunologicznej i charakteryzacji alergenów pochodzenia naturalnego lub molekuł, które otrzymuje się techniką rekombinacyjną.

Na podstawie takich informacji o alergenach i środków ich identyfikacji możliwe jest klonowanie alergenów przy użyciu metod manipulacji genetycznej i ich ekspresja jako alergenów rekombinacyjnych. Klony DNA, które zostały wyizolowane i scharakteryzowane z zastosowaniem typowych metod stanowią podstawę modyfikacji metodami manipulacji genetycznej i dają początek nowym molekułom modyfikowanych alergenów otrzymywanych rekombinacyjnie.

Celem zapewnienia reaktywności nowych modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych konieczna jest także identyfikacja determinant antygenowych komórki T.

W tym przypadku podstawą jest znajomość sekwencji aminokwasów konkretnego alergenu lub odpowiedniej sekwencji DNA. Z reguły sekwencję aminokwasu określa się na podstawie sekwencji DNA alergenu rekombinacyjnego. W konsekwencji, w kontekście tego wynalazku, sekwencje DNA związane z każdą wymienioną sekwencją peptydową są także ujęte niniejszym wynalazkiem, nawet, jeżeli takie sekwencje DNA nie zostały wyraźnie wymienione, ponieważ sekwencje takie mogą być otrzymane z sekwencji peptydowych prostym i znanym sposobem.

Na podstawie sekwencji aminokwasów otrzymano szereg nakładających się oligopeptytdów, stosując typowe metody także takie jak synteza na fazie stałej z zastosowaniem zmodyfikowanej techniki Merrifielda, przy czym pokrywa się całą sekwencję alergenu. W tym kontekście mogą być otrzymywane korzystnie oligopeptydy posiadające w każdym przypadku 6-20, korzystnie 9-15 reszt aminokwasowych. Szczególnie korzystne są dodekapeptydy, w których offsecie są w każdym przypadku 3 aminokwasy i które pokrywają w sposób nakładający się całą sekwencję odpowiedniego alergenu.

Celem identyfikacji determinant antygenowych komórki T, zakłada się klony komórki T od pacjentów, którzy są alergiczni wobec pyłku Graminae, poddając je wielokrotnej stymulacji odpowiednim oczyszczonym naturalnym lub otrzymanym rekombincyjnie alergenem. Stosuje się przy tym typowe metody (Lit.). Konieczne jest w tym wypadku użycie reprezentatywnej liczby klonów komórki T, które pochodzą od wystarczająco dużej liczby donorów.

Omawiane klony komórek T inkubowane są z wyżej opisanymi nakładającymi się peptydami celem określenia ich zdolności stymulowania wzrostu komórek T. Rozrost oznacza się przez inkorporację [³H] - tymidyny metodami, które same w sobie są znane. Te oligopeptydy, które indukują odpowiedni rozrost klonów komórek T uznawane są za ligandy peptydu, który odpowiada determinantom antygenowym komórki T. Determinanty antygenowe komórki T, które ustalono tą metodą używane są do zdefiniowania regionów alergenu reaktywnych wobec komórki T. Alergen ze swej strony tworzy podstawę konstruowania nowych modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych.

Celem zapewnienia, że modyfikowane alergeny rekombinacyjne będą reagowały z limfocytami T, których obecność stwierdzono u pacjentów alergicznych, pierwszorzędowa struktura regionów reaktywnych wobec komórek T, obejmująca immunodominatywne determinanty antygenowe komórki T jest częściowo lub całkowicie wykluczana z modyfikacji.

Celem zmutowania sekwencji DNA kodujących odpowiadające pozostałe regiony polipeptydów (alergenów) której wynikiem jest otrzymanie zmodyfikowanej struktury pierwszorzędowej, stosuje się manipulację genetyczną. Ta zmodyfikowana struktura pierwszorzędowa niszczy lub ogranicza zdolność ciągłych, zależnych od sekwencji determinant antygenowych komórek B do wiązania się z przeciwciałami IgE i, ze względu na tworzenie zmodyfikowanej struktury trzeciorzędowej, całkowicie lub częściowo niszczy zdolność konformacyjnie-zależnej reakcji możliwych nieciągłych determinant antygenowych ze swoimi przeciwciałami.

Mutacjami mogą być wymiany pojedynczych lub kilku aminokwasów poza regionami reaktywnymi wobec komórki T. Takie mutacje punktowe wprowadza się do DNA, które np. koduje rPhl p 5b,

PL 196 830 B1 motodą miejscowo-specyficznej mutagenezy przy użyciu polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR). W tym kontekście jako wzorzec zastosowany może być plazmid pGS13, wektor ekspresji (pMalc), który zawiera cDNA dla rPhl p 5b. Do PCR używa się genowo - specyficznych primerów, które zawierają odpowiednie zmienione zasady a także nowe miejsce restrykcyjne (Nhe l lub Sph l). Fragmenty, które są amplifikowane metodą PCR i które zawierają mutacje wiąże się jeden za drugim tworząc wektor klonujący. Gotowy produkt reklonuje się następnie do wektora ekspresji pMalc.

Mutacje mogą być ponadto przeprowadzane metodą różnie uporządkowanych delecji. Celem otrzymania mutacji delecyjnych odcięte 3'terminalne fragmenty cDNA rPhl p 5b otrzymuje się metodą PCR z zastosowaniem primerów genowo-specyficznych. Stosunkowo duże fragmenty 3'terminalne usuwane są z wektorów startowych (pGS12 lub pGS13) metodą restrykcji na wewnętrznych miejscach cięcia. Zastępują je włączane fragmenty, które były amplifikowane metodą PCR, i które są w każdym wypadku krótsze.

W analogiczny sposób przez insercję dodatkowych fragmentów DNA można otrzymać mutacje zawierające addycje jednego lub kilku aminokwasów.

Klony DNA, które zostały zmutowane metodą manipulacji genetycznej, które kodują modyfikowane alergeny rekombinacyjne klonowane są do odpowiednich wektorów ekspresji i poddawane są ekspresji w odpowiednich organizmach gospodarzy. Białka łączące oczyszczane są typowymi metodami z supernatantów lub po zniszczeniu organizmów gospodarzy, po eliminacji łączącego fragmentu; modyfikowany alergen rekombinacyjny otrzymuje się w stanie czystym typowymi metodami biochemicznymi. Ważne jest, żeby modyfikowane alergeny rekombinacyjne były używane do dalszych testów jako czyste komponenty, które odpowiadają naturalnym alergenom.

Wpływy wprowadzonych mutacji na alergiczność, tzn. zdolność do wiązania się do przeciwciał IgE pacjentów alergicznych, oznacza się (jakościowo i ilościowo) dla modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych metodą testu inhibicyjnego EAST. Oznaczenie to wykazuje, czy substancja badana (modyfikowany alergen rekombinacyjny jest identyczna, czy różna, od naturalnego alergenu i/lub rekombinantów szczepu pierwotnego. Można także oznaczyć ilościowo rozmiar pokrewieństwa immunochemicznego (cross reaktywności). Test inhibicyjny EAST uwzględnia jedynie reakcję z przeciwciałami IgE.

Te warianty modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych, które wykazują efekt hamujący, mierzony Prel na poziomie 50% hamowania, który obniża się co najmniej o rząd 10² w porównaniu z naturalnym alergenem i/lub rekombinantem szczepu pierwotnego wybierane są jako odpowiednie.

Warianty modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych, które zostały wybrane w ten sposób badane są pod kątem zachowania reaktywności z komórką T. Badanie takie polega na tym, że w pierwszym etapie testuje się zbiór klonów komórki T, który reaguje z determinantą antygenową w regionach reaktywnych wobec komórki T.

Pod uwagę bierze się tylko te modyfikowane alergeny rekombinacyjne, które stymulują rozrost wybranych klonów.

W drugim etapie do badań stosuje się oligoklonalne linie komórkowe T, które określono przez powtarzaną stymulację odpowiadającymi im alergenami. Ponownie bierze się pod uwagę jedynie te modyfikowane alergeny rekombinacyjne, które dają wzrost indeksu stymulacji (Sl) na poziomie 50% Sl szczepu pierwotnego.

W trzecim etapie do badań używa się poliklonalnych krótkoterminowyh hodowli komórek T z krwi obwodowej pacjentów alergicznych.

Obok wiązania alergenu do specyficznego IgE znaczenie patofizjologiczne dla reakcji alergicznej posiada indukowane alergenem uwalnianie histaminy przez efekt alergiczny lub przez komórkę (efekt uboczny). W uwalnianiu tym pośredniczy IgE. W tym kontekście ważna jest także reaktywność komórek efektora (leukocytów zasadochłonnych i komórek tucznych) i specyficzność przeciwciał IgE, które wiązane są przez FcεRI. Z tego względu warianty modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych badane są pod kątem ich zdolności indukowania uwalniania histaminy przez degranulację zasadochłonnych leukocytów wypełnionych IgE, które izolowane są z krwi pacjentów alergicznych. W takim teście funkcjonalnym warianty modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych, które zostały wybrane zgodnie z powyżej omówionym schematem wyboru muszą wykazywać znacznie obniżoną zdolność uwalniania histaminy.

Modyfikowane alergeny rekombinacyjne, które odpowiadają tym wymaganiom wykazują reaktywność z większością komórek TH, które wykazują efekt regulatorowy i ze względu na swoją obniżoną reaktywność IgE mają odpowiednie właściwości aby być stosowane jako środki terapeutyczne do

PL 196 830 B1 alergeno-specyficznej immunoterapii (odczulania) pacjentów wykazujących alergię w stosunku do pyłku Graminae.

Istotą wynalazku jest zatem także preparat farmaceutyczny do leczenia alergii pośredniczonych przez IgE, charakteryzujący się tym, że zawiera jeden lub większą liczbę modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych według wynalazku i/lub jedną z ich fizjologicznie tolerowanych soli lub solwatów, a takż e, jeś li jest to odpowiednie, dodatkowe zwią zki aktywne i/lub dodatkowe substancje.

Istotą wynalazku jest również sposób otrzymywania preparatów farmaceutycznych, charakteryzujący się tym, że co najmniej jeden modyfikowany alergen rekombinacyjny według wynalazku i/lub jedna z jego fizjologicznie tolerowanych soli lub solwatów jest doprowadzany do odpowiedniej formy dozowania wraz z co najmniej jednym stałym, płynnym lub półpłynnym nośnikiem lub substancją pomocniczą.

Istotą wynalazku jest ponadto zastosowanie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych według wynalazku i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli lub solwatów zdefiniowanych w zastrz. 1 do wytwarzania preparatów farmaceutycznych do immunospecyficznej terapii alergii (odczulania). Szczególnie korzystne jest tu zastosowanie metod nie-chemicznych. W tym kontekście mogą być one doprowadzone do odpowiedniej formy dozowania razem z co najmniej jednym stałym, płynnym i/lub półpłynnym nośnikiem lub środkiem pomocniczym i ewentualnie jako kombinacja z jednym lub kilku innymi związkiem/związkami aktywnymi. Farmaceutyki takie używane w terapii immunospecyficznej, tzn., do odczulania związanego z alergiami.

Istotą wynalazku jest ponadto bezpośrednie zastosowanie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych według wynalazku do immunospecyficznej terapii alergii (odczulania).

Preparaty te mogą być stosowane jako leki medyczne i weterynaryjne. Jako nośniki bierze się pod uwagę substancje organiczne i nieorganiczne, które nadają się do zastosowań wewnętrznych (np. doustnych), pozajelitowych, miejscowych lub do aplikacji w formie aerozolu i nie reagują z nowymi związkami, przykładowo woda, olej roślinny, alkohole benzylowe, glikole alkilenowe, glikole polietylenowe, trójoctan gliceryny, żelatyna, węglowodany jak laktoza lub skrobia, stearynian magnezu, talk, wazelina. Do aplikacji doustnych stosuje się szczególnie tabletki, drażetki, kapsułki, proszki, granulaty, syropy, soki lub krople, do aplikacji doodbytniczych - czopki, do aplikacji pozajelitowych - roztwory, korzystnie roztwory olejowe lub wodne a także zawiesiny, emulsje lub implanty, do zastosowań miejscowych -maści, kremy lub pudry. Nowe związki mogą być również liofilizowane, a otrzymane liofilizaty, mogą być np. używane do wytwarzania preparatów injekcyjnych. Omawiane preparaty mogą być sterylizowane i/lub mogą zawierać środki pomocnicze jak substancje smarujące, konserwujące, stabilizujące i/lub zwilżacze, emulgatory, sole wpływające na ciśnienie osmotyczne, substancje buforujące, barwniki, środki smakowe i aromatyczne i/lub dalsze substancje aktywne, np. jedną lub kilka witamin.

Do aplikacji w postaci aerozoli do inhalacji mogą być wykorzystane aerozole, które zawierają środek aktywny rozpuszczony lub w formie zawiesiny w gazie roboczym lub mieszaninie gazów roboczych (np. CO2 lub fluorochlorowęglowodory). Środek aktywny stosuje się przy tym w formie mikrokrystalicznej, przy czym może być wprowadzonych kilka dodatkowych fizjologicznie tolerowanych rozpuszczalników, np. etanol. Roztwory inhalacyjne mogą być aplikowane przy pomocy typowych inhalatorów.

Związki te i ich fizjologicznie tolerowane sole mogą być używane do odczulania pacjentów alergicznych, w kontekście leczenia chorób alergicznych, w szczególności alergii wywoływanych trawami i pył kiem trawy.

Substancje według wynalazku mogą być przy tym z reguły stosowane analogicznie do innych znanych dostępnych handlowo peptydów, w szczególności jednak analogicznie do związków opisanych w patencie USA 4 472 305, korzystnie w dawkach pomiędzy 0,05 i 500 mg, w szczególności pomiędzy 0,5 i 100 mg na jednostkę dawki. Dzienna dawka korzystnie zawiera się pomiędzy 0,01 i 2 mg/kg wagi ciała. Dozy określane są specyficznie dla każdego pacjenta i zależą od różnych czynników, przykładowo od aktywności konkretnie używanego związku, od wieku, masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety, czasu i sposobu podania, szybkości wydalania, kombinacji środków aktywnych, zaawansowania choroby, która podlega terapii. Korzystna jest aplikacja pozajelitowa.

Wszystkie temperatury powyżej i poniżej podane są w °C. Celem wyizolowania produktów dodaje się, jeżeli jest to konieczne, wodę i jeżeli jest to konieczne, w zależności od struktury produktu końcowego ustawia się wartość pH mieszaniny pomiędzy 2 i 10; mieszaninę ekstrahuje się octanem etylu lub dichlorometanem, warstwy rozdziela się, a warstwę organiczną suszy się nad siarczanem

PL 196 830 B1 sodu, następnie odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszcza chromatograficznie na żelu krzemionkowym i/lub przez krystalizację.

P r z y k ł a d 1

Identyfikacja determinant antygenowych dla oznaczania regionów reaktywnych komórek T głównych alergenów Ph1 p5 pyłku trawy.

Pacjenci, których wywiad choroby wskazywał na typowe symptomy alergii na pyłek trawy (rhinitis) i którzy mieli pozytywny wynik testu skóry (test ukłuciowy) zostali wybrani do założenia linii komórkowych (TCL) i klonów komórek T (TCC), które reagują z główną grupą 5 alergenów pyłku trawy „timothy (Phleum pratense) Phl p5. Pacjenci ci posiadali krążące specyficzne przeciwciała IgE o klasie

RAST > 3.

Przez pobranie od pacjentów otrzymano 40 ml heparyzowanej krwi. Następnie typową metodą z zastosowaniem odwirowania z gradientem gęstości izolowano z tak otrzymanych próbek krwi jednojądrowe komórki krwi obwodowej (PBMC). Analogiczne izolowanie komórek przeprowadzono w późnym stadium, kiedy celem scharakteryzowania TCL i TCC konieczne było otrzymanie napromieniowanych autologicznych komórek prezentujących antygen (APC). Po zliczeniu PBMC ustalono TCL, które reagowały In vitro z alergenami grupy 5 wg. następującej procedury opisanej wcześniej w odnośniku (Lit.1): W każdej celce 24-celkowej płytki do mikrohodowli poddano stymulacji od 1,5 do 2,0 x 10⁶ PBMC w 1 ml pożywki hodowlanej (UltraCulture) przez 7 dni w obecności naturalnych alergenów Phl p5 (każdorazowo 10 μg/celkę), które oczyszczano metodą chromatografii immunospecyficznej (immunoafinity chromatography) liczba ustawianych hodowli wynosiła od 8 do 10. Izolowanie Phl p5 metodą chromatografii immunospecyficznej opisano szczegółowo w (Lit. 2). Po 7 dniach hodowli do celek dodawano IL-2 (od 10 do 20 μ/celkę) i przez dalsze 5-7 dni. Następnie wszystkie pojedyncze hodowle zlewa się razem i blastyczne komórki T wzbogaca się metodą odwirowania z gradientem gęstości; TCL, które otrzymano badano następnie w teście wzrostu specyficznego limfocytu (por. Lit. 1). W tym celu 2 x 10⁴/ml blastycznych TCL hodowano każdorazowo z 5 x 10⁴/ml napromieniowanych autologicznych APC w 96-celkowych płytkach mikrohodowlanych, każdy test wykonywano na trzech próbkach. jako specyficznego stymulatora antygenu dodawano 10 - 20 mg alergenu Phl p5. Po 56 godzinach inkubowania do mikrohodowli pipetowano tymidynę znaczoną ³H (1 μθί/oeikę). Po dalszych 16 godzinach licznikiem cząstek beta (Matrix 96) zmierzono radioaktywność nabytą przez wzrastające blasty komórki T. Wyniki przeliczono na średnie arytmetyczne badanych próbek i podano jako liczbę zliczeń na minutę (cpm). Kryterium jakości TCL był indeks stymulacji, który otrzymano przez porównanie wartości cpm dla próbek do których dodawano Phl p5 z próbkami bez dodatku Phl p5.

Po wyborze, TCL poddano klonowaniu (por Lit. 1). W tym celu 0,3 [jamki] blastycznych TCL/celkę hodowano w końcowej objętości 0,2 ml w 96-celkowej płytce mikrohodowlanej (okrągłodennej) w obecności dodawanego napromieniowanych alogenicznych PBMC (5 x 10⁴/celkę), PHA (1,5 g/ml) i IL-2 (25 lU/ml). Po 12 do 14 dniach hodowlę zasilono świeżymi napromieniowanymi PBMC, PHA i IL-2. Ponadto co 4 do 5 dni wymieniano pożywkę i dodawano IL-2 (25 IU/ml). Po około 10 dniowym okresie bez dodawania napromieniowanych alogenicznych PBMC przeprowadzono test specyficznego rozrostu Phl p5. Wybrane TCC rozmnożono następnie na 24 celkowych płytkach mikrohodowlanych przez powtarzane stymulowanie PHA oraz napromieniowanymi alogenicznymi PBMC i IL-2 (50 lU/ml).

Po sklonowaniu TCL (patrz niżej) specyficzność izolowanych TCC sprawdzano opisaną metodę. Indeksy stymulacji wynoszące co najmniej 5 uznawano jako dodatni wynik testu TCC. Oznaczenie determinant antygenowych komórki T, definiujące na alergenach grupy 5 regiony reaktywne wobec komórki T, przeprowadzano także metodą testów specyficznego rozrostu. Każdorazowo stosowano 1-2 μg syntezowanego dodekapeptydu/ml (patrz poniżej).

Do oznaczenia determinant antygenowych komórki T użyto 86 nakładających się syntetycznych dodekapeptydów, które otrzymano na podstawie znanej struktury pierwszorzędowej alergenu Phl p 5b oznaczonej przez Bufe et al. (Lit. 3). Peptydy te otrzymywano używając handlowych zestawów syntetycznych dostarczonych przez CHIRON Mimotopes Peptide Systems/Cleyron, Australia. Sekwencje aminokwasów tych peptydów charakteryzuje nałożenie 9 aminokwasów (Tab 1). Reakcję TCC z jednym z peptydów użytych w teście specyficznego rozrostu uważano za dodatnią, kiedy indeks stymulacji wynosił co najmniej 5.

W badaniach wykorzystano TCC 18 pacjentów, którzy byli uczuleni na pyłek trawy. Wśród nich osiągnięto sukces, izolując 54 klonów komórek T, które reagowały specyficznie z dodekapeptydami, które bazowały na sekwencji Phl p 5b. Analiza tych TCC wykazuje, że rozpoznawanie ligandów pepPL 196 830 B1 tydów w oczywisty sposób koncentruje się w 3 immunodominujących regionach reaktywnych wobec komórki T. Wśród 54 klonów komórki T, 46 (co odpowiada 85%) reaguje z peptydami 3 immunodominujących regionów A, B i C Phl p 5b reaktywnych wobec komórki T. (Tab. 1a). Jedynie 8 klonów komórki T reagowało z 5 różnymi ligandami peptydowymi, przy czym każdorazowo 3 peptydy były rozpoznawane przez 2 różne klony. Immunodominujący region A reaktywny wobec komórki T obejmuje peptyd (27-mer), który odpowiada położeniem 181-207 i który posiada główny region składający się z aminokwasów 181-195. Jedynie 28 z 54 TCC reaktywnych względem Phl p 5b, co odpowiada 51%, reaguje z tym immunodominującym regionem A.

Odpowiednio 9 (17%) i 9 (17%) klonów komórki T reaguje z reaktywnymi wobec komórki T regionami C (pozycja 16-48; 33-mer) i B (pozycja 133-150). Ta koncentracja komórek TH badanego zespołu pacjentów alergicznych na rozpoznawaniu 3 immunodominujących regionów reaktywnych komórki T głównego alergenu umożliwia skonstruowanie mutantów, w których na regiony te nie mają wpływu mutacje punktowe, mutacje delecyjne lub mutacje addycyjne, Tak więc podstawowym wymogiem wobec mutantów alergenów jest specyficzna reakcja z alergeno-reaktywnymi komórkami TH, które obecne są u pacjentów alergicznych oraz wykazywanie efektu terapeutycznego wobec tych komórek.

T a b e l a 1

Dodekaptydy, które bazują na sekwencji Phl p 5b i które używane są do oznaczania regionów reaktywnych wobec komórki T.

1	ADAGYAPATPAA	27	AYSVAYKAAVGA
2	GYAPATPAAAGA	28	VAYKAAVGATPE
3	PATPAAAGAAAG	29	KAAVGATPEAKF
4	PAAAGAAAGKAT	30	VGATPEAKFDSF
5	AGAAAGKATTEE	31	TPEAKFDSFVAS
6	AAGKATTEEQKL	32	AKFDSFVASLTE
7	KATTEEQKLIED	33	DSFVASLTEALR
8	TEEQKLIEDINV	34	VASLTEALRVIA
9	QKLIEDINVGFK	35	LTEALRVIAGAL
10	IEDINVGFKAAV	36	ALRVIAGALEVH
11	INVGFKAAVAAAA	37	VIAGALEVHAVK
12	GFKAAVAAAASV	38	GALEVHAVKPVT
13	AAVAAAASVPAA	39	EVHAVKPVTEEP
14	AAAASVPAADKF	40	AVKPVTEEPGMA
15	ASVPAADKFKTF	41	PTVEEPGMAKIP
16	PAADKFKTFEAA	42	EEPGMAKIPAGE
17	DKFKTFEAAFTS	43	GMAKIPAGELOI
18	KTFEAAFTSSSK	44	KIPAGELQIIDK
19	EAAFTSSSKAAA	45	AGELQIIDKIDA
20	FTSSSKAAAAKA	46	LQIIDKIDAAFK
21	SSKAAAAKAPGL	47	IDKIDAAFKVAA
22	AAAAKAPGLVPK	48	IDAAFKVAATAA
23	AKAPGLVPKLDA	49	AFKVAATAAATA
24	PGLVPKLDAAYS	50	VAATAAATAPAD
25	VPKLDAAYSVAY	51	TAAATAPADDKF
26	LDAAYSVAYKAA	52	ATAPADDKFTYF

PL 196 830 B1 cd. tabeli 1

53	PADDKFTVFEAA	70	VKYAVFEAALTK
54	DKFTVFEAAFNK	71	AVFEAALTKAIT
55	TVFEAAFNKAIK	72	EAALTKAITAMS
56	EAAFNKAIKEST	73	LTKAITAMSEVQ
57	FNKAIKESTGGA	74	AITAMSEVQKVS
58	AIKESTGGAYDT	75	AMSEVQKVSQPA
59	ESTGGAYDTYKC	76	EVQKVSQPATGA
60	GGAYDTYKCIPS	77	KVSQPATGAATV
61	YDTYKCIPSLEA	78	QPATGAATVAAG
62	YKCIPSLEAAVK	79	TGAATVAGAAT
63	IPSLEAAVKQAY	80	ATVAAGAATTAA
64	LEAAVKQAYAAT	81	AAGAATTAAGAA
65	AVKQAYAATVAA	82	AATTAAGAASGA
66	QAYAATVAAAPQ	83	TAAGAASGATV
67	AATVAAAPQVKY	84	GAASGAATVAAG
68	VAAAPQVKYAVF	85	SGAATVAAGGYK
69	APQVKYAVFEAA	86	GAATVAAGGYKV

T a b e l a 1a

Mapowanie regionów reaktywnych komórki T głównego alergenu pyłku trawy Phl p5

TCC	Stymulujące ligandy peptydowe (12-mery)	Immunodominujący region reaktywny wobec komórki T	Uboczna determinanta antygenowa
		A	B	C
1	2	3	4	5	6
DW 8	139-150		+
DW 14	196-207	+
DW 16	181-192, 184-195	+
DW 23	181-192	+
DW 25	181-192, 184-195	+
DW 28	184-195	+
CBH 1	211-22, 214-225				+
CBH 10	211-222				+
JR 6a	22-33, 25-36			+
JR 6b	136-147, 139-150		+
JR 7a	28-39, 31-42			+
JR 7b	136-147, 139-150		+
JR 9	181-192, 184-195	+
JR 10	19-30			+
JR 11	49-60				+

PL 196 830 B1 cd. tabeli 1a

JR 13	181-192, 184-195	+
JR 15	181-192, 184-195	+
JR 19a	31-42			+
JR 19b	136-147		+
JR 24	97-108, 100-111				+
JR 25	181-192, 184-195	+
JR 27	184-195	+
KS 1	181-192, 194-195	+
KS 2	181-192, 194-195	+
KS 3	181-192, 194, 195	+
KS 4	181-192, 194-195	+
KS 5	181-192, 194, 195	+
KSE 18	43-54				+
UD 6	112-123				+
GE 4	136-147, 139-150		+
GE 7	136-147		+
GE 12	37-48			+
AS 4	181-192, 184-195	+
AS 5	181-192, 184-195	+
UZH 2	136-147, 139-15		+
UZ 25	97-108				+
CB 1	190-201, 193-204	+
CB 2	181-192, 184-195	+
CB 7	25-36			+
CB 10	181-192, 184-195	+
CB 14	181-192	+
MF 11	184-195	+
AH 19	16-27			+
AH 26	139-150		+
JMD	133-144		+
45		A22	9B	7C	7
II 3.2A 12	31-42			+
II 12.7F11	196-207	+
II 12.5C10	187-198	+
II 17.9E5	184-195	+
II 17.1D8	184-195	+
II 17.C2	184-195	+
II 17.19A1	193-204	+
II 17.12F5	25-36			+
II 17.3C10	49-60, 52-63				+
54		28	0	9	8

PL 196 830 B1

Literatura:

1. M^ler WD, Karamfilov T, Fahibusch B, Vogelsang H, Jager L:

„Analyzes of human T cell clones reactive with group V grass pollen allergens. Int. Arch. Allergy immunol. 1994, 105:391-396.

2. Jung K, Fahibusch B, M^ler WD, Hermann D, Diener C, Jager L:

„Isolation of timothy (Phleum pratense) allergens using affinity chromatography with monoclonal antibodies. Allergy Immunol (Leipzig) 1989, 35:287-294.

3. Bufe A, Schramm G, Keown MB, Schlaak M, Becker WM:

Major allergen Phl p 5b in timothy grass is a novel pollen Rnase. FEBS Letters 1995,263:6-12.

P r z y k ł a d 2

Otrzymywanie mutantów punktowych rPhl p 5b PM1, PM2 (D ⁴⁸ > L, K⁵⁰ > A) i PM3 (A¹³ > C).

PM2:

Jako wektora startującego użyto plazmidu pGS13. Wektor pMalc (Biolabs), zawiera c-DNA dla wt rPhl p 5b, który klonowany jest między miejscami Bam Hl i Hind III. W reakcji PCR amplifikowano Fragmenty 1 (bp: 1-153) i 2 (bp: 141-1374) cDNA dla rPhl p 5b. W reakcji tej używano następujących primerów (miejsca restrykcyjne zostały podkreślone):

Fragment 1:

Sensowy Phl p 5b:

5'-ATATGGATCCATCGAGGGAAGGGCCGATGCCGGCTACGCC-3'

Antysensowy MP1:

5'-GAACGCTAGCGCCGCAGGGACGCTGGC-3'

Fragment 2:

Sensowy MP1

5'-GCGCTAGCGTTCAAGACGACCTTCGAG-3'

Antysensowy Phl p 5p

5'-ATATAAGCTTTCCTCTGAAGGAAGGCAACCC-3'

W porównaniu z sekwencją wt dwa primery mutagenezy sensowy MP1 i antysensowy MP2 zawierają 6 zmienionych zasad, które dają początek nowemu miejscu restrykcyjnemu enzymu Nhe l.

Amplifikowany fragment 1 poddano trawieniu Bam Hl i Nhe l i klonowano do wektora pUH89 (Jakel et al., Gene: 154, 55-59; 1995). Otrzymany w wyniku tego plazmid pGS10 poddano ponownie restrykcji Nhe l/Hind III, a fragment 2 (Nhel/Hind III) dołączono do miejsc cięcia. Plazmid pGS11 zawiera kompletne cDNA kodujące rPhl p 5b, posiada jednak pożądane zmienione zasady. Celem ekspresji mutantu punktowego PM2 rPhl p 5b, zmutowane cDNA poddano reklonowaniu między miejscami cięcia Bam Hl i Hind III wektora ekspresji pMalc. Otrzymanemu w wyniku tego plazmidowi nadano nazwę pGS21.

Mutant punktowy PM1 rPhl p 5b otrzymano analogicznie do PM2. Zawiera on dodatkową mutacje punktową: N³² > D, która jest wynikiem błędu PCR.

Celem sklonowania tego mutanta punktowego, cały cDNA dla rPhl p 5b w wektorze pGS13 amplifikowano techniką PCR, używając następujących primerów.

PCysM1:

5' ATATGGATCCATCGAGGGTAGGGCCGATGCCGGCTACGCCCCGGC

CACCCCGGCTGCATGCGGAGCG-3'

Antysensowy Phl p 5b: patrz powyżej.

W porównaniu z sekwencją wt, primer mutagenezy PCysM1 zawiera 3 zmienione zasady, co prowadzi do zastępowania reszt alaniny resztami cysteiny i co równocześnie daje początek nowym miejscom cięcia restrykcyjnego dla enzymu Sph I. Produkt PCR klonowano bezpośrednio do wektora ekspresji pMalc (Bam HI/Hind III). Otrzymanemu w wyniku tego wektorowi nadano nazwę pCysM1. Wyniki mutagenezy sprawdzano techniką analizy restrykcyjnej, używając Sph I.

P r z y k ł a d 3

Otrzymywanie mutantów delecyjnych DM1 (ΔΚ⁵⁰ - p¹³², D⁴⁹ > L) DM2 ^F⁵¹ - 4 G¹⁷⁸, D⁴⁹ > L, K⁵⁰ > A) i DM3 ^A¹⁵⁴ - T¹⁷⁷, A²²⁰ > T).

PL 196 830 B1

Jako wektor startowy do klonowania mutanta delecyjnego DM1 użyty został plazmid pGS21 (patrz powyżej). Fragment cDNA bp 399 - 1374 dla rPhl p 5b amplifikowano techniką PCR, stosując następujące primery:

Sensowy MP2:

5' -GCTAGCCGGCGAGCTGCAGATCATCG-3'

Antysensowy Phl p 5b: patrz powyżej.

Wektor pGS21 poddano restrykcji Nhe l i Bam Hl i wydzielono z wyciętych fragmentów. Produkt PCR, który również poddano restrykcji Nhe l i Bam Hl, podwiązano następnie do pozostałego wektora. Otrzymany w ten sposób wektor, tzn. pDM1, zawiera cDNA rPhl p 5b, które posiada delecję 252 bp i które koduje delecyjnego mutanta 5bDM1 rPhl p 5b. Mutanty delecyjne DM2 i DM3 otrzymywano w sposób analogiczny.

P r z y k ł a d 4

Zastosowanie testu hamowania EAST celem wykazania obniżonej alergogenności (reaktywności wobec IgE) mutantów rekombinacyjnych Phl p 5b

Wiązanie alergenów przez przeciwciała IgE stanowi podstawowy wymóg dla alergenospecyficznej aktywacji komórek efektora (między innymi mastoblastów, komórek zasadochłonnych) w alergii typu l. Sorbentowy test hamowania alergeno-specyficznego alergenu/enzymu (EAST) jest najlepszą metodą jakościowego i ilościowego wiązania do przeciwciał IgE. Test hamowania EAST przeprowadza się w następujący sposób. Płytki mikrotitracyjne pokrywa się alergenem (naturalnym lub rekombinacyjnym Phl p 5 lub Phl p 5b) (1 μg/ml). Po usunięciu przez odmycie niezwiązanych cząsteczek alergenu niespecyficzne plastyczne miejsca wiązania blokuje się albuminą surowicy wołowej (0.5%). Anty-lgE pacjentów alergicznych - w postaci reprezentatywnej puli od 10-30 donorów (pacjentów) lub pojedynczej surowicy - poddaje się inkubowaniu w odpowiednim rozcieńczeniu, stosując płytki mikrotitracyjne pokryte alergenem. Związane alergeno-specyficzne przeciwciała IgE są określane przy użyciu sparowanych enzymatycznie przeciwciał anty-lgE (np. przeciwciała zasadowej fosfatazy a-lgE). W zależności od stężenia wiązanie to jest hamowane przez rozpuszczalne alergeny lub substancje badane (mutanty alergenów) Krzywą hamowania otrzymaną dla oczyszczonego naturalnego alergenu Phl p 5b używa się jako krzywą wzorcową.

Na rysunku pokazano krzywe hamowania EAST dla mutantów Phl p 5b, przy czym fig. 1 dla puli surowicy pacjentów alergicznych Bor 18/100, fig. 2 dla puli surowicy pacjentów alergicznych We 6/97, fig. 3 dla surowicy pojedynczego pacjenta alergicznego II/3, fig. 4 dla surowicy pojedynczego pacjenta alergicznego II/12, a fig. 5 dla surowicy pojedynczego pacjenta alergicznego II/17.

Krzywe hamowania pokazane na rysunku fig. 1 otrzymano dla reprezentatywnej puli surowic pacjentów alergicznych Bor 18/100 (20 donorów).

rPhl p 5b (szczepu pierwotnego) i PM3 wykazują krzywe wiązania podobne do tych, które otrzymuje się dla naturalnego Phl p 5b, który oczyszczono metodą chromatografii specyficznego powinowactwa (affinity chromatography). Widoczne są niewielkie różnice efektu hamowania w dolnym zakresie i zbyt słabe hamowanie przy wysokich stężeniach. Chociaż przyczyna tego faktu nie jest znana, można ją przypisać konformacyjnym determinantom antygenowym, które różnią się w niewielkim stopniu.

Mutanty punktowe PM1 wykazują podobny efekt w wyższym zakresie. Efekt ten jest przy tym nieco silniejszy. Mutanty delecyjne DM1 i DM3 wykazują wyraźnie obniżony efekt hamowania. Daje to podstawę silnie obniżonej alergeniczności tych mutantów alergenów, które w konsekwencji porównywalne są z alergenami modyfikowanymi chemicznie (alergoidy).

Mutanty delecyjne DM2 i DM2* wykazują bardzo niski efekt hamujący w stosunku do reakcji alergen-lgE. Dowodzi to, że alergeniczność tych mutantów została w dużym stopniu wyeliminowana. Różne pule surowic pacjentów alergicznych (We 6/97) a także pojedyncze surowice pacjentów alergicznych II3, II12 i II17 wykazują lekkie zróżnicowanie względem krzywych hamowania mutantów; pomimo tego jednak potwierdzają one, że mutanty delecyjne DM1 i DM3 wykazują silnie obniżoną allergenność (fig. 2-fig. 5). Poza niską resztkową aktywnością efekt hamowania mutantów delecyjnych DM2 i DM2* został wyeliminowany. Punktowe mutacje PM1 i PM3 nie wykazują obniżenia alergenności, lub jedynie obniżanie, które jest w większej części niewielkie (np. PM1 o puli We 6/97 i pojedyncza surowica II 17). Potencjał hamowania modyfikowanych alergenów może zostać opisany w kategoriach ilościowych przez obliczenie wartości Prel przy 25% lub 50% hamowania (1). Odpowiednie wartości hamowania a także potencjału alergenności (Prel) mierzone przy 25% lub 50% hamowania dla puli surowic i pojedynczych surowic pokazano w tabelach 2-6.

PL 196 830 B1

Mutanty delecyjne DM2 i DM2* wykazują spadek alergenności mierzony wartościami Prel, które są bardzo małe lub nie dają się mierzyć rozsądnym sposobem. Chociaż mutacje punktowe PM1 i PM3 wykazują częściowy spadek alergenności, spadek ten nie jest odpowiedni dla zastosowań praktycznych. Mutacje delecyjne DM1 i DM3 wykazują znaczne obniżenie alergenności. Obniżenie reaktywności IgE jest także większe lub porównywalne z wartościami dla poprzednio znanych chemicznie modyfikowanych alergenów i dlatego mutanty te są szczególnie korzystnymi kandydatami dla immunoterapii.

Literatura:

Anderson MC i Baer H: Methodology for RAST inhibition. Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland, USA (1986).

T a b e l a 2

Alergenność (Prel) rekombinacyjnych mutantów Phl p 5b w porównaniu z alergennością rekombinacyjnego i natywnego Phl p 5b z puli surowicy pacjentów alergicznych Bor 18/100

Inhibitor	Wartość hamowania1 [mol/l]	Alergenność (Prel)2
	25%	50%	25%	50%
n Phl p 5b	3,3x1010	4,2x10-9	1,000	1,0000
r Phl p 5b	2,0x1010	5,0x10-9	1,709	0,8410
PM1	4,5x1010	1,2x108	0,739	0,3490
PM3	2,0x1010	4,8x10-9	1,641	0,8640
DM1	8,6x109	2,8x108	0,039	0,0015
DM2	8,3x1013	2,3x1038	4,0x10-23	1,8x10-45
DM3	1,2x108	4,1x10-5	0,028	0,0001
DM2*	5,0x1023	2,3x1066	6,7x10-34	2,0x10-75

1/Wartości hamowania: stężenia inhibitorów odpowiednio przy 25% i 50% 2/Alergenność: względem natywnego Phlp5b odpowiednio przy 25% i 50%

T a b e l a 3

Alergenność (Prel) rekombinacyjnych mutantów Phl p 5b w porównaniu z alergennością rekombinacyjnego i natywnego Phl p 5b z puli surowicy pacjentów alergicznych We 6/97

Inhibitor	Wartość hamowania1 [mol/l]	Alergenność (Prel)2
	25%	50%	25%	50%
n Phl p 5b	5,1x1010	6,1x10-9	1,000	1,0000
r Phl p 5b	3,0x1010	1,4x10-8	1,697	0,4400
PM1	1,2x10-9	1,2x10-7	0,415	0,0510
PM3	8,3x1010	3,0x10-8	0,611	0,2030
DM1	2,3x10-8	1,7x105	0,022	0,0004
DM2	1,9x108	2,7x1021	2,6x1015	2,3x1030
DM3	5,1x10-9	2,9x10-8	0,099	0,0020
DM2	4,6x10-7	1,5x10-3	0,001	4,0x10-8

1/Wartości hamowania: stężenia inhibitorów odpowiednio przy 25% i 50% 2/Alergenność: względem natywnego Phlp5b odpowiednio przy 25% i 50%

PL 196 830 B1

T a b e l a 4

Alergenność (Prel) rekombinacyjnych mutantów Phl p 5b w porównaniu z alergennością rekombinacyjnego i natywnego Phl p 5b z puli surowicy pojedynczego pacjenta alergicznego II/3

Inhibitor	Wartość hamowania1 [mol/l]	Alergenność (Prel)2
	25%	50%	25%	50%
n Phl p 5b	5,1x10-10	5,9x10-9	1,0000	1,0000
r Phl p 5b	5,6x10-10	1,4x10-8	0,9030	0,4190
PM1	8,6x10-10	1,9x10-8	0,5950	0,3140
PM3	5,5x10-10	1,5x10-8	0,9220	0,3990
DM1	1,2x10-8	1,7x10-8	0,0420	0,0035
DM2	6,6x1010	5,5x1027	7,7x10-20	1,1x1038
DM3	1,1x10-6	0,032	0,0004	1,8x10-7
DM2	2,1x10-6	0,010	0,0002	5,9x10-7

1/Wartości hamowania: stężenia inhibitorów odpowiednio przy 25% i 50% 2/Alergenność: względem natywnego Phlp5b odpowiednio przy 25% i 50%

T a b e l a 5

Alergenność (Prel) rekombinacyjnych mutantów Phl p 5b w porównaniu z alergennością rekombinacyjnego i natywnego Phl p 5b z puli surowicy pojedynczego pacjenta alergicznego II/12

Inhibitor	Wartość hamowania1 [mol/l]	Alergenność (Prel)2
	25%	50%	25%	50%
n Phl p 5b	5,2x10-10	6,8x10-9	1,000	1,000
r Phl p 5b	8,7x10-10	7,3x10-8	0,597	0,093
PM1	1,3x10-9	8,3x10-8	0,391	0,082
PM3	1,3x10-5	9,1x10-8	0,389	0,075
DM1	1,5x10-5	68,0	3,4x10-5	1,0x10-10
DM2	3,8x1010	4,4x1030	1,4x1019	1,6x10-39
DM3	4,5x10-8	0,0001	0,012	5,7x10-5
DM2	196,0	7,4x1014	2,6x10-12	9,2x10-25

1/Wartości hamowania: stężenia inhibitorów odpowiednio przy 25% i 50% 2/Alergenność: względem natywnego Phlp5b odpowiednio przy 25% i 50%

PL 196 830 B1

T a b e l a 6

Alergenność (Prel) rekombinacyjnych mutantów Phl p 5b w porównaniu z alergennością rekombinacyjnego i natywnego Phl p 5b z puli surowicy pojedynczego pacjenta alergicznego II/17

Inhibitor	Wartość hamowania1 [mol/l]	Alergenność (Prel)2
	25%	50%	25%	50%
n Phl p 5b	2,2x10-10	2,6x10 9	1,000	1,0000
r Phl p 5b	2,1x10-10	1,7x10 9	1,045	0,5450
PM1	6,4x10	2,2x10 8	0,336	0,1190
PM3	2,5x10	5,5x10 9	0,855	0,4680
DM1	6,5x10 9	2,0x10 8	0,033	0,0010
DM2	73,9	6,4x1019	2,9x10 12	4,1x10 29
DM3	5,6x10 9	5,0x10 8	0,038	0,0005
DM2	0,0004	11675,0	5,3x10 '	2,2x10 13

1/Wartości hamowania: stężenia inhibitorów odpowiednio przy 25% i 50% 2/Alergenność: względem natywnego Phlp5b odpowiednio przy 25% i 50%

P r z y k ł a d 5

Uwalnianie histaminy z komórek zasadochłonnych obniżone ze względu na mutanty rPhl p 5b

Zdolność uwalniania histaminy z komórek zasadochłonnych przez otrzymane mutanty punktowe PM3 i mutantów delecyjnych DM1, DM2, DM2* i DM3 były testowane i porównywane z wartościami dla szczepu pierwotnego rPhl p 5b.

Przed przeprowadzeniem testu uwalniania histaminy leukocyty zasadochłonne z krwi EDTA alergicznego pacjenta (PS-W) były na samym początku wzbogacane przez sedymentację dekstranową a następnie zbilansowane do końcowego stężenia 100 000 komórek zasadochłonnych/ml. Celem uwalniania histaminy z komórek zasadochłonnych każdorazowo inkubowano 200 μl zawiesiny komórek z 50 μl roztworu antygenu w 37°C przez 40 min. Stosowano zmienne stężenia rPhl p 5b i mutan-5 -12 tów (10^-5 - 10^-12 M). Histamina, która ulegała uwolnieniu oznaczana była w odpowiednich supernatantach przy użyciu metylohistaminy RIA Pharmacia, zgodnie z instrukcją producenta.

W teście uwalniania histaminy wszystkie rekombinacyjne proteiny, które badano w miarę wzrostu stężenia opisuje typowa krzywa w kształcie dzwonu pokazano na rysunku fig. 6. Punktowe mutanty porównywane ze szczepami pierwotnymi rPhl p 5b, nie wykazują żadnej istotnej różnicy pod względem zdolności uwalniania histaminy. Stężenie mutantów delecyjnych DM3, DM1 i DM2 konieczne do spowodowania 30% wzrostu uwalniania histaminy było odpowiednio 3-krotnie, 20-krotnie i 500-krotnie wyższe. Dlatego mutanty punktowe wykazują jednoznacznie obniżoną zdolność uwalniania histaminy z komórek zasadochłonnych.

Na rysunku fig. 6 pokazano uwalnianie histaminy z ludzkich komórek zasadochłonnych po reakcji z alergenami i mutantami alergenów.

P r z y k ł a d 6

Demonstracja reaktywności rekombinacyjnych mutantów Phl p 5b z klonami komórki T od pacjentów którzy są uczuleni na pyłek trawy

Reaktywność rekombinacyjnych mutantów Phl p 5b badano na ustalonych klonach komórki T (TCC) o znanej specyficzności. TCC pochodzą od pacjentów, którzy są alergiczni na pyłek trawy (patrz przykład 1) i jest kierowane przeciw regionom reaktywnym A komórki T (Rys. 7), B (Rys. 8) i C (Rys. 9). Reaktywność wobec komórki T mierzono przez stymulowanie klonów do rozrostu. Wyniki pokazują jasno, że TCC reagują specyficznie z mutantami Phl p 5b, kiedy odpowiednia determinanta antygenowa jest nie zmieniona i Jak można się tego było spodziewać, nie wykazują reakcji, kiedy brakuje determinanty antygenowej lub jest ona zmieniona przez mutację punktową.

PL 196 830 B1

T a b e l a 7

Reakcja rozrostowa klonów reaktywnych wobec Phl p 5b komórki T (TCC) od pacjentów alergicznych z mutantami rPhl p 5b

Specyficzność: Immunodominujacy region A reaktywny wobec komórki T

Stymulator¹

Obecna

Wbudowywanie [³H] tymidyny do TCC²

	antygenowa	JR 15	JR 13	CB 14	CB 2
Pożywka	-	-	-	-	-
n Phl p5	+	+++	+++	+++	+++
r Phl p5a	(±)	-	-	+	+
r Phl p5b	+	+++	+++	+++	+++
PM1	+	++	+++	+++	+++
PM3	+	+++	+++	+++	+++
DM1	+	+++	+++	+++	+++
DM2	+	+++	+++	nt3)	nt
DM2*	-	-	-	-	-
DM3	+	+++	+++	nt	nt
PL(12mer)	+	+++	+++	+++	+++

¹ Stężenie koń cowe 0.3 μ M ² Indeks stymulacji Sl: < 1 (-), 1-2 (+), 2-5 (+), 5-10 (++), > 10 (+++) ³ n.t: nie badano

T a b e l a 8

Reakcja rozrostowa klonów reaktywnych wobec Phl p 5b komórki T (TCC) od pacjentów alergicznych z mutantami rPhl p 5b

Specyficzność: immunodominujący region B reaktywny względem komórki T.

Stymulator1)	Obecna determinanta antygeniczna	Wbudowywanie [3H] tymidyny do TCC2)
UZH2	DW8
Pożywka	-	-	-
n Phl p5	+	+++	+++
r Phl p5a	(±)	±	+++
r Phl p5b	+	+++	+
PM1	+	+++	+
PM3	+	+++	+
DM1	+	+++	+
DM2	-	-	-
DM2*	-	-	-
DM3	+	+++	+
PL(12mer)	+	+++	+++

Stężenie końcowe 0.3 μM

Indeks stymulacji Sl: < 1 (-), 1-2 (+), 2-5 (+), 5-10 (++), > 10 (+++)

n.t: nie badano

PL 196 830 B1

T a b e l a 9

Reakcja rozrostowa klonów reaktywnych wobec Phl p 5b komórki T (TCC) od pacjentów alergicznych z mutantami rPhl p 5b

Specyficzność: immunodominujący region C reaktywny względem komórki T.

Stymulator1)	Obecna determinanta antygenowa bez zmian	Wbudowywanie [3H] tymidyny do TCC2)
eksperyment 1	eksperyment 2	eksperyment 3
Pożywka	-	1	1	1	-
n Phl p5	+	11,2	8,2	4,5	+ +
r Phl p5a	-	nt	<1	<1	-
r Phl p5b	+	11,0	7,0	5,5	+ +
PM1	-	<1	<1	1,1	-
PM3	+	7,4	5,9	4,5	+ +
DM1	+	8,6	6,2	4,4	+ +
DM2	-	14,4	9,1	7,1	+++
DM2*	+	12,8	12,1	11,7	+++
DM3	+	9,8	6,9	4,4	+ +
PL (12mer)	+	20,9	16,7	nt3)	+++

¹ Stężenie koń cowe 0.3 μ M ² Indeks stymulacji Sl: < 1 (-), 1-2 (+), 2-5 (+), 5-10 (++), > 10 (+++) ³ n.t.: nie badano

P r z y k ł a d 7

Badanie reaktywności rekombinacyjnych mutantów Phl p 5b względem linii komórek T od pacjentów, którzy są uczuleni na pyłek trawy.

Przez powtarzaną aktywację naturalnym Phl p 5b (a + b) lub rekombinacyjnym rPhl p 5b lub 5a + 5b założono oligoklonalne linie komórek T (TCL) od 8 pacjentów, którzy byli uczuleni na pyłek trawy (patrz eksperyment 1).

Reakcję rozrostu TCL badano, używając mutantów rPhl p 5b (Tabela 10). Wyniki wskazują, że wszystkie mutanty aktywują TCL, chociaż istnieją różnice ilościowe. Mutanty delecyjne DM3 wykazują specyficzną stymulację względem większości TCL.

T a b e l a 10

Reakcja rozrostu linii komórkowych T reaktywnych względem Phl p 5b (pacjenci alergiczni z naturalnymi rPhl p 5b)

TCL	Wbudowywanie [3H] tymidyny do TCL 2)
1 Wol	2 Eic	3 Fre	4 Mer	6 Mah	5 17.4	7 19.2	8 20.1
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Pierwotny	n Phl p 5	n Phl p 5	n Phl p 5	n Phl p 5	r Phl p 5a	r Phl p 5	r Phl p 5b	r Phl p 5
stymulator					r Phl p 5b
Aktywator wtórny 1)
n Phl p 5	+++	+++	++	+++	+++	+	+++	+
r Phl p 5a	-	+	+	+	++	nt3)	nt	nt
n Phl p 5b	+	+	+	+	+++	+	+++	+++
PM1	+	±	+	±	++	+	+++	+++

PL 196 830 B1 cd. tabeli 10

1	2	3	4	5	6	7	8	9
PM3	±	±	+	+	±	+	+++	+
DM1	±	+	+	+	++	+	+++	+++
DM2	±	+	+++	+++	++	+	++	+++
DM2*	±	+	+	+ +	++	+	+	±
DM3	±	+	++++	+ +	+++	++	+++	+++

¹ Stężenie koń cowe 0.3 μ M ² Indeks stymulacji Sl: < 1 (-), 1-2 (+), 2-5 (+), 5-10 (++), > 10 (+++) ³n.t: nie badano

Podsumowanie wyników opisanych w przykładach 1-7

Mapowanie determinant głównego alergenu Phl p 5b, który rozpoznawany jest przez komórki wspomagające od pacjentów, którzy uczuleni są na pyłek traw dowodzi, ze determinanty antygenowe poszczególnych klonów komórek (TCL) rozkładają się wzdłuż całej sekwencji Phl p 5b. Jednakże można bez trudu zdefiniować 3 immunodominujące regiony reaktywne względem komórki T; rozpoznawane są one przez 85% TCC (Przykład 1). Możliwe było otrzymywanie rekombinacyjnych mutantów Phl p 5b przez mutacje punktową (Przykład 2) i przez mutacje delecyjne (Przykład 3). Reaktywność mutacji punktowych (PM1 i PM3) względem IgE, mierzoną testem klonowania EAST (Przykład 4) nie różni się znacznie od reaktywności Phl p 5b szczepu pierwotnego. Chociaż reaktywność mutantów delecyjnych DM1 i DM3 względem IgE jest znacznie obniżona, jej poziom jest ciągle wykrywalny. Przeciwnie do tego, wiązanie mutantów DM2 i DM2* do IgE jest obniżone w bardzo znacznym stopniu. To stopniowe obniżanie alergenności mutantów r Phl p 5b potwierdzane jest także przez test uwalnianie histaminy, stosujący specyficzne wypełnione IgE komórki zasadochłonne z krwi pacjentów alergicznych (Przykład 5). Badanie mutantów r Phl p 5b klonów komórek T o zmapowanych determinantach antygenowych potwierdza, że mutacje punktowe i delecyjne reagują z TCC, lub nie mogą stymulować w oczekiwany sposób TCC (Przykład 6). Używając oligoklonalnych linii komórkowych T, które zakładane są z krwi pacjentów uczulonych na pyłek trawy przez stymulację Phl p5 można udowodnić, że mutacje mogą stymulować oligoklonalne TCL o takim charakterze (Przykład 7). Łącząc razem wyniki obniżania alergenności i utrzymywania stymulacji komórki T, mutanty, w szczególności mutanty delecyjne stanowią warianty alergenów rekombinacyjnych, które są potencjalnie korzystne dla specyficznej immunoterapii.

Podane poniżej przykłady dotyczą preparatów farmaceutycznych.

P r z y k ł a d A: Ampułki iniekcyjne

Odczyn roztworu 100 g związku aktywnego lub mieszaniny związku aktywnego sporządzonej w oparciu o modyfikowane alergeny rekombinacyjne i 5 g kwaśnego fosforanu dwusodowego w 3 l dwukrotnie destylowanej wody ustawiono przy pomocy 2 n kwasu solnego na pH 6,5, odsączono sterylnie, umieszczono w ampułkach, liofilizowano w sterylnych warunkach i sterylnie zamknięto. Każda ampułka zawiera 5 mg środka aktywnego.

P r z y k ł a d B: Czopki

Mieszaninę 20 g związku aktywnego w formie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych razem ze 100 g lecytyny sojowej i 1400 g masła kakaowego topi się, odlewa do form i ochładza. Każdy czopek zawiera 20 mg środka aktywnego.

P r z y k ł a d C: Roztwór

Przygotowuje się roztwór 1 g związku aktywnego w formie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych, 9,38 g NaH2PO4 x 2 H2O, 28,48 g Na2HPO4 x 12 H2O i 0,1 g chlorku alkilo-benzylodimetyloamoniowego w 940 ml dwukrotnie destylowanej wody. Ustawia się pH na 6,8, dopełnia do 1 l i sterylizuje przez napromieniowanie. Roztwór ten może być stosowany w formie kropli do oczu.

P r z y k ł a d D: Maść

Miesza się 500 mg związku aktywnego w formie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych z 99,5 g wazeliny w warunkach aseptycznych.

P r z y k ł a d E: Tabletki

Mieszaninę 1 kg związku aktywnego w formie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych, 4 kg laktozy, 1,2 kg mąki ziemniaczanej, 0,2 kg talku i 0,1 kg stearynianu magnezu sprasowano w typowy sposób na tabletki tak, że każda tabletka zawiera 10 mg środka aktywnego.

PL 196 830 B1

P r z y k ł a d F: Drażetki

Analogicznie do przykładu E prasowano tabletki, które następnie typowym sposobem pokrywano powłoką z sacharozy, mąki ziemniaczanej, talku, tragakantu i barwnika.

P r z y k ł a d G: Kapsułki kg związku aktywnego w formie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych użyto do napełnienia powszechnie stosowanym sposobem kapsułek żelatynowych, tak by każda kapsułka zawierała 20 mg środka aktywnego.

P r z y k ł a d H: Ampuły

Roztwór 1 kg związku aktywnego w formie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych w 60 l dwukrotnie destylowanej wody przesączono w sterylnych warunkach, napełniono ampuły, liofilizowano w warunkach aseptycznych i zamykano sterylnie. Każda ampuła zawiera 10 mg środka aktywnego.

P r z y k ł a d l: Aerozol do inhalacji

Rozpuszcza się 14 g związku aktywnego w formie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych w 10 l izotonicznego roztworu NaCI i roztworem napełnia się zwykłe dostępne handlowo aerozole z pompką. Roztwór może być rozpylany do ust lub nosa. Jednorazowo rozpylona porcja (ok. 0,1 ml) odpowiada dawce ok. 0.14 mg.

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Modyfikowane alergeny rekombinacyjne pyłku Graminae, znamienne tym, że co najmniej jeden lub kombinacja regionów 16-42, 135-149 oraz 180-206 polipeptydu Phl p 5b składającego się z całkowitej liczby 265 aminokwasów pozostaje niezmieniona i wykazują one obniżoną reaktywność wobec przeciwciał IgE, zachowując reaktywność wobec limfocytów T i są korzystnie wybrane z następującej grupy polipeptydów:

   D, D⁴⁹ L, K⁵⁰ A),

   PM1 (N PM2 (D⁴⁹ L, K⁵ A),

   PM3 (A¹³ C),

   DM1 (Δ K⁵⁰ - p''¹³², DM2 (Δ F⁵¹ - G¹⁷⁸, DM2* (Δ F⁵¹ - G¹⁷⁸ DM3 (Δ A¹⁵⁴ - T¹⁷⁷,

   D⁴⁹ L),

   D⁴⁹ - L, K⁵⁰ - A),

   179-217 zmieniona sekwencja), oraz

   A²²⁰ T).
2. 2. Modyfikowane alergeny rekombinacyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że wywodzą się z głównych alergenów grup 1-6.
3. 3. Modyfikowane alergeny rekombinacyjne według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że ich reaktywność wobec przeciwciał IgE pochodzących od pacjentów uczulonych na pyłek traw jest wyeliminowana lub zredukowana, zaś reaktywność wobec limfocytów T zachowana.
4. 4. Modyfikowane alergeny rekombinacyjne według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że ich geny modyfikowane są metodami manipulacji genetycznej tak, że polipeptydy, które są przez nie kodowane wykazują wymiany, delecje, i/lub addycje pojedynczych aminokwasów lub kilku aminokwasów w porównaniu ze szczepem pierwotnym.
5. 5. Modyfikowane alergeny rekombinacyjne według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że ich dominujące regiony, reaktywne wobec komórki T (dominanta antygenowa komórki T) nie ulegają zmianie podczas manipulacji genetycznej.
6. 6. Modyfikowane alergeny rekombinacyjne według zastrz. 2, znamienne tym, że wywodzą się z głównych alergenów grupy 5.
7. 7. Modyfikowane alergeny rekombinacyjne według zastrz. 6, znamienne tym, że wywodzą się z głównego alergenu Phl p 5b.
8. 8. Sposób otrzymywania modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych pyłku Graminae pochodzących z głównej grupy 1 lub 5, których reaktywność wobec przeciwciał IgE pacjentów, którzy są alergiczni na te alergeny jest zmniejszona lub wyeliminowana, przy zachowaniu reaktywności wobec limfocytów T, znamienny tym, że w oparciu o sekwencję aminokwasową naturalnego alergenu,

   - wytwarza się szeregi nakładających się oligopeptydów, pochodzących od sekwencji tego alergenu,

   - uzyskuje się klony limfocytów T od pacjentów, którzy są alergiczni wobec tego alergenu,

   - przeprowadza się badanie rzeczonych oligopeptydów dla określenia ich zdolności do reagowania z rzeczonymi klonami limfocytów T i ich stymulowania,

   PL 196 830 B1

   - wytwarza się mutanty tego alergenu, przy czym co najmniej jeden lub więcej regionów sekwencji reaktywnej limfocytu T (epitopów limfocytu T) pozostawia się niezmienionymi, oraz

   - identyfikuje się i wybiera te mutanty, które wykazuj ą poszukiwane właściwości.
9. 9. Sposób otrzymywania modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych zdefiniowanych w zastrz. 1 i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli lub solwatów, znamienny tym, że wykorzystuje się w nim róż ne warianty polimerazowej reakcji ł a ń cuchowej (PCR).
10. 10. Preparat farmaceutyczny do leczenia alergii pośredniczonych przez IgE, znamienny tym, że zawierający jeden lub większą liczbę modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych zdefiniowanych w zastrz. 1 i/lub jedną z ich fizjologicznie tolerowanych soli lub solwatów, a także, jeśli jest to odpowiednie, dodatkowe związki aktywne i/lub dodatkowe substancje.
11. 11. Sposób otrzymywania preparatów farmaceutycznych, znamienny tym, że co najmniej jeden modyfikowany alergen rekombinacyjny zdefiniowany w zastrz. 1 i/lub jedna z jego fizjologicznie tolerowanych soli lub solwatów jest doprowadzany do odpowiedniej formy dozowania wraz z co najmniej jednym stałym, płynnym lub półpłynnym nośnikiem lub substancją pomocniczą.
12. 12. Zastosowanie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli lub solwatów zdefiniowanych w zastrz. 1 do wytwarzania preparatów farmaceutycznych do immunospecyficznej terapii alergii (odczulania).
13. 13. Zastosowanie modyfikowanych alergenów rekombinacyjnych zdefiniowanych w zastrz. 1 do immunospecyficznej terapii alergii (odczulania).