PL194804B1

PL194804B1 - Zrekombinowany alergen, sposób przygotowywania zrekombinowanego alergenu, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie zrekombinowanego alergenu do przygotowywania leku do wywoływania odpowiedzi immunologicznej u osobnika i do przygotowywania leku do leczenia, zapobiegania lub osłabiania reakcji alergicznych

Info

Publication number: PL194804B1
Application number: PL343029A
Authority: PL
Inventors: Hans Henrik Ipsen; Michael Dho Spangfort; Joergen Nedergaard Larsen
Original assignee: Alk Abello As
Priority date: 1998-03-16
Filing date: 1999-03-16
Publication date: 2007-07-31
Also published as: IL138339A; IL138339A0; NO328354B1; NZ506665A; CA2323687C; NO20004614D0; JP2002506648A; ZA200004819B; US20040091500A1; DE69939584D1; EP1062341A1; WO1999047680A1; PT1062341E; AU2714799A; CN1293710A; CN1332029C; EP1062341B1; KR20010041918A; HUP0101464A2; NO20004614L

Abstract

1. Zrekombinowany alergen, znamienny tym, ze jest nienaturalnie wystepujacym mutantem pochodzacym z natural- nie wystepujacego alergenu, w którym co najmniej jedna powierzchniowo wyeksponowana, konserwowana reszta aminokwa- sowa co najmniej jednego obszaru konserwowanych reszt aminokwasowych spójnie zwiazanych na co najmniej 400Å 2 po- wierzchni trójwymiarowej struktury czasteczki alergenu jak okreslono na podstawie dostepnosci rozpuszczalnika co najmniej w 20%, a wymieniony obszar zawiera co najmniej jeden epitop komórki B, zastapiona jest przez inna reszte aminokwasowa, która nie wystepuje w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów zadnego znanego bialka homologicznego w obrebie rzedu taksonomicznego, z którego pochodzi wymieniony naturalnie wystepujacy alergen, wymieniony zmutowany alergen ma zasad- niczo te sama strukture trzeciorzedowa a-weglowego szkieletu, jak ten naturalnie wystepujacy alergen, a wiazanie swoistych IgE do zmutowanego alergenu zmniejszone jest w porównaniu z wiazaniem z wymienionymi naturalnie wystepujacym alergenem. 19. Zrekombinowany alergen, znamienny tym, ze uzyskuje sie go poprzez: a) okreslenie reszt aminokwasowych w naturalnie wystepujacym alergenie, które sa konserwowane w wiecej niz w 70% we wszystkich znanych bialkach homologicznych w rzedzie taksonomicznym, z którego pochodzi wymieniony naturalnie wyste- pujacy alergen, b) okreslenie co najmniej jednego obszaru konserwowanych reszt aminokwasów, który jest scisle zwiazany z obszarem o przynajmniej 400 Å 2 powierzchni trójwymiarowej struktury czastki alergenu, jak to zostalo okreslone na podstawie dostepnosci rozpuszczalnika co najmniej w 20%, przy czym co najmniej jeden wymieniony obszar zawiera co najmniej jeden epitop komórki B, i c) zastapienie co najmniej jednej reszty aminokwasowej w wymienionym co najmniej jednym obszarze przez inny ami- nokwas, który nie wystepuje w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów kazdego znanego bialka homologicznego w obrebie rzedu taksonomicznego, z którego pochodzi wymieniony naturalnie wystepujacy alergen, przy zasadniczo zachowanej calkowi- tej trzeciorzedowej strukturze a-weglowego szkieletu czasteczki alergenu dla uzyskania zmutowanego alergenu, w którym wiazanie swoistego IgE ze zmutowanym alergenem jest zmniejszone w porównaniu z naturalnie wystepujacym alergenem. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zrekombinowany alergen, sposób przygotowywania zrekombinowanego alergenu, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie zrekombinowanego alergenu do przygotowywania leku do wywoływania odpowiedzi immunologicznej u osobnika i do przygotowywania leku do leczenia, zapobiegania lub osłabiania reakcji alergicznych.

Wynalazek dotyczy nowych zrekombinowanych alergenów, które są nienaturalnie występującymi mutantami, pochodzącymi z naturalnie występujących alergenów.

Genetycznie predysponowane osobniki stają się uczulone (alergiczne) na antygeny pochodzące z wielu źródeł środowiskowych, oraz na alergeny, na działanie których są narażone. Reakcja alergiczna występuje, gdy wcześniej uczulony osobnik jest ponownie narażony na działanie takiego samego alergenu lub alergenu homologicznego. Reakcje alergiczne obejmują zarówno katar sienny, zaburzenia drożności nosa, nieżyt nosa i astmę, jak i anafilaksję układową i śmierć w odpowiedzi na użądlenie pszczoły lub osy, czy ukąszenie owada. Reakcja jest nagła i może być spowodowana przez wiele atopowych alergenów, takich jak składniki traw, drzew, chwastów, owadów, żywności, leków, środków chemicznych czy perfum.

Jednak, reakcje nie występują, gdy osobnik narażony jest na działanie alergenu po raz pierwszy. Wstępna odpowiedź adaptacyjna trwa jakiś czas i zazwyczaj nie powoduje żadnych symptomów. Ale kiedy wytwarzane są przeciwciała i komórki T zdolne do reakcji z alergenem, każde następne narażenie na szkodliwy wpływ alergenu może wywoływać symptomy. Tak więc, reakcje alergiczne pokazują, że odpowiedź odpornościowa sama w sobie może wywoływać istotne stany patologiczne, stanowiące zagrożenie dla życia.

Przeciwciała zaangażowane w alergię atopową należą przede wszystkim do immunoglobulin klasy IgE. IgE łączy się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek tucznych i zasadochłonnych (bazofili). Po utworzeniu kompleksu alergenu specyficznego z IgE związanym z komórką tuczną, następuje sieciowanie receptorów na powierzchni komórki, czego skutkiem jest dalsze przekazanie sygnału przez komórki tuczne i fizjologiczna odpowiedź komórek docelowych. Degranulacja przez komórki tuczne powoduje uwolnienie między innymi histaminy, heparyny, czynnika chemotaktycznego dla leukocytów kwasochłonnych, leukotrienów C4, D4 i E4, które powodują długotrwały skurcz mięśni gładkich komórek oskrzelowych. Wywołana reakcja może mieć charakter układowy lub lokalny.

Reakcje nadwrażliwości, w których pośredniczą przeciwciała można podzielić na cztery klasy, typu I, typu II, typu III i typu IV. Reakcje alergiczne typu I obejmują klasyczną nagłą reakcję nadwrażliwości, pojawiającą się w ciągu sekund lub minut po wystawieniu na działanie antygenu. W symptomach tych pośredniczą specyficzne alergiczne przeciwciała klasy IgE.

Zwykle, reakcje alergiczne obserwowane są w odpowiedzi na alergeny białkowe występujące w pyłkach, roztoczach kurzu domowego, sierści zwierzęcej i łupieżu, jadach i w produktach żywnościowych.

W celu zredukowania lub wyeliminowania reakcji alergicznych zwykle stosuje się uważnie kontrolowane i powtarzane podawanie szczepionek alergicznych. Szczepienie przeciw alergii tradycyjnie przeprowadza się w postaci podawania pozajelitowego, donosowego lub podjęzykowego zwiększających się dawek przez dłuższy okres czasu, czego skutkiem jest odczulenie pacjenta. Dokładny mechanizm immunologiczny takiej reakcji nie jest znany, ale uważa się, że różnice indukowane w fenotypie komórek T specyficznych dla alergenu są szczególnie ważne.

Epitopy wiążące przeciwciało (epitopy komórek B)

Analizy oparte na krystalografii rentgenograficznej kompleksów F_ab-antygen przyczyniły się do lepszego zrozumienia epitopów wiążących antygen. Według tego rodzaju analizy można określić epitopy wiążące przeciwciało jako fragment powierzchni antygenu zawierający atomy 15-25 reszt aminokwasowych, znajdujący się w takiej odległości od atomów przeciwciała, która umożliwia ich bezpośrednią interakcję. Nie można przewidzieć powinowactwa interakcji antygen-przeciwciało tylko na podstawie entalpii wywołanej przez oddziaływania van der Waals'a, wiązania wodorowe lub jonowe. Entropia związana z prawie całkowitym wyparciem cząsteczek wody spomiędzy ich granicy stanowi podobnej wielkości wkład energii. Oznacza to, że doskonałe dopasowanie powierzchni oddziaływujących ze sobą cząsteczek jest podstawowym czynnikiem leżącym u podstaw wysokiego powinowactwa interakcji antygen-przeciwciało.

Szczepienie alergiczne

Pomysł szczepienia oparty jest na dwóch fundamentalnych właściwościach układu immunologicznego, to jest jego specyficzności i pamięci. Szczepienie stymuluje układ immunologiczny biorcy

PL 194 804 B1 i przy powtarzającej się ekspozycji na podobne białka układ immunologiczny staje się zdolny do intensywniejszych odpowiedzi, przykładowo, na infekcje bakteryjną. Szczepionki są mieszaninami białek użytymi w celu wywołania takiej zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej u biorcy. Takie zabezpieczenie związane jest tylko ze składnikami występującymi w szczepionce i z antygenami homologicznymi.

W porównaniu z innymi rodzajami szczepień, szczepienie alergiczne jest skomplikowane z powodu istnienia ciągłej odpowiedzi immunologicznej u alergicznych pacjentów. Ta odpowiedź immunologiczna charakteryzuje się występowaniem alergenowo swoistych IgE pośredniczących w ujawnianiu symptomów alergicznych po ekspozycji na alergeny. Tak więc, szczepienia przeciw alergii wykorzystujące alergeny ze źródeł naturalnych niosą za sobą ryzyko skutków ubocznych, w najgorszym przypadku zagrażających życiu pacjenta.

Próby rozwiązania tego problemu można podzielić na trzy kategorie, chociaż w praktyce często łączy się ze sobą różne środki zaradcze. Pierwsza kategoria środków obejmuje podawanie wielu małych dawek przez dłuższy czas w celu osiągnięcia dawki zakumulowanej. Druga kategoria środków zawiera fizyczne modyfikacje alergenów poprzez wprowadzanie alergenów do substancji żelowych, takich jak wodorotlenek glinu. Preparat wodorotlenku glinu wywołuje efekt wspomagający i efekt magazynowania powolnie wydzielanego alergenu, co powoduje zmniejszenie stężenia składników aktywnych alergenu w tkance. Trzecia kategoria środków obejmuje chemiczne modyfikacje alergenów w celu zmniejszenia ich własności alergicznych, to jest wiązania IgE.

Szczegółowy mechanizm odpowiadający za efektywne szczepienie jest wciąż przedmiotem kontrowersji. Jednak podzielany jest pogląd, że komórki T odgrywają kluczową rolę w całkowitej regulacji odpowiedzi immunologicznych. Zgodnie z tym, relacja między dwoma skrajnymi fenotypami komórek T, Th1 i Th2, determinuje stan alergiczny osobnika. Przy stymulacji alergenem komórki Th1 wydzielają interleukiny, głównie interferon-γ, co prowadzi do odporności ochronnej i osobnik pozostaje zdrowy. Z drugiej strony, komórki Th2 wydzielają przede wszystkim interleukinę 4 i 5, co prowadzi do syntezy IgE i eozynofilii, i skutkiem tego osobnik staje się alergiczny. Badania in vitro wskazują na możliwość zmiany odpowiedzi specyficznych alergenowo komórek T poprzez kontakt z peptydami pochodzącymi z alergenu, zawierającymi odpowiednie ilości epitopów komórek T. Obecne podejścia do zagadnienia szczepionek alergicznych skierowane są w dużej mierze na komórki T i mają na celu wyeliminowanie ich wpływu lub przesunięcie ich odpowiedzi z fenotypu Th2 na fenotyp Th1.

W publikacji WO 97/30150 (publ. 1) określona jest populacja cząsteczek, które to cząsteczki białka mają rozkład specyficznych mutacji w sekwencji aminokwasów w porównaniu z białkiem macierzystym. Z opisu wynika, że wynalazek dotyczy produkcji analogów, które są zmodyfikowane w porównaniu z białkami macierzystymi, ale które zostały pobrane, strawione i zaprezentowane komórkom T w ten sam sposób, jak białka macierzyste (naturalnie występujące alergeny). Tym sposobem, uzyskuje się zmodyfikowaną odpowiedź komórek T. Biblioteki zmodyfikowanych białek zostały przygotowane przy zastosowaniu techniki określonej jako PM (Parsimonius Mutagenesis - Oszczędna Mutageneza).

W publikacji WO 92/02621 (publ. 2) opisane są cząsteczki zrekombinowanego DNA, które to cząsteczki zawierają DNA kodujący polipeptyd mający co najmniej jeden epitop alergenu drzew z rzędu Fagales, alergenu wyselekcjonowanego z Aln g 1, Cor a 1 i Bet v 1. Wszystkie opisane zrekombinowane cząsteczki mają sekwencję aminokwasów lub część sekwencji aminokwasów, która odpowiada sekwencji naturalnie występującego alergenu.

Przedmiotem publikacji WO 90/11293 (publ. 3) są między innymi izolowane alergenowe peptydy pyłku ambrozji i zmodyfikowane peptydy pyłku ambrozji. Opisane peptydy mają sekwencję aminokwasów odpowiadającą albo sekwencji naturalnie występującego alergenu lub jego naturalnych izoform.

Chemiczna modyfikacja alergenów

Podjęto wiele prób chemicznej modyfikacji alergenów. Próby z wczesnych lat siedemdziesiątych obejmują sprzężenie alergenów z polimerami i chemiczne sieciowanie alergenów przy użyciu formaldehydu, itd., i wytwarzanie tak zwanych „alergoidów”. Uzasadnieniem tych prób była przypadkowa destrukcja epitopów wiążących IgE poprzez przyłączenie chemicznego liganda, co redukowało wiązanie IgE zachowując jednocześnie immunogenność poprzez zwiększenie masy cząsteczkowej kompleksów. Wady wytwarzania „alergoidów” powiązane są z trudnościami w kontrolowaniu procesu chemicznego sieciowania i trudnościami w analizie i standaryzacji otrzymanych kompleksów o wysokiej masie cząsteczkowej. „Alergoidy” są obecnie w użyciu klinicznym i w związku z przypadkową destrukcją epitopów wiążących IgE mogą być podawane ich zwiększone dawki w porównaniu z kla4

PL 194 804 B1 sycznymi szczepionkami, ale parametry bezpieczeństwa i skuteczności nie są większe wobec zastosowania klasycznych szczepionek.

Ostatnie próby chemicznej modyfikacji alergenów mają na celu całkowite zniszczenie trzeciorzędowej struktury alergenu, a więc eliminacji wiązania IgE jako, że zasadniczym celem terapeutycznym jest specyficzna alergenowo komórka T. Takie szczepionki zawierają peptydy syntetyczne pochodzące z sekwencji alergenu, reprezentujące minimalną ilość epitopów komórek T, dłuższe peptydy reprezentujące epitopy związane z komórkami T, peptydy syntetyczne pochodzące z dłuższych sekwencji alergenu reprezentujące rejony immunodominujących epitopów komórek T, lub cząsteczki alergenu przecięte na dwie połowy techniką rekombinacji. Inne próby bazujące na takim uzasadnieniu opierają się na zastosowaniu zrekombinowanych izoform „o niskim poziomie wiązania IgE”. W ostatnich latach stało się jasne, że naturalne alergeny są heterogeniczne, zawierając izoalergeny i odmiany mając podstawionych do około 25% aminokwasów. Stwierdzono, że część zrekombinowanych izoalergenów jest mniej wydajna w wiązaniu IgE, prawdopodobnie z uwagi na nieodwracalną denaturację i wynikające stąd całkowite zniszczenie struktury trzeciorzędowej.

Mutageneza in vitro i szczepienie przeciw alergii

Próby mające na celu zmniejszenie alergiczności poprzez miejscowo ukierunkowane mutagenezy in vitro przeprowadzono przy zastosowaniu wielu alergenów zawierających Der f 2 (Takai i inni, publ. 4), Der p 2 (Smith i inni, publ. 5), alergen Dermatophagoides farinae 39 kDa (Aki i inni, publ. 6), fosfolipaza A2 jadu pszczelego (Forster i inni, publ. 7), Ara h 1 (Burks i inni, publ. 8), Ara h 2 (Stanley i inni, publ. 9) Bet v 1 (Ferreira i inni, publ. 10 i 11), profilinę brzozy (Wiedemann i inni, publ. 12), i Ory s 1 (Alvarez i inni, publ. 13).

Uzasadnienie leżące u podstaw tych prób ponownie odnosi się do alergenowo specyficznych komórek T i jednoczesnego zmniejszenia ryzyka skutków ubocznych, w których pośredniczą IgE, poprzez redukcję lub eliminację wiązania IgE w wyniku zniszczenia struktury trzeciorzędowej zrekombinowanego mutanta alergenu. Uzasadnienie leżące u podstaw tych prób nie zawiera koncepcji dominujących epitopów wiążących IgE i nie zawiera koncepcji inicjowania nowej zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej, która także obejmuje komórki B i tworzenie przeciwciał.

Publikacja autorstwa Ferreira i inni (publ. 11) opisuje zastosowanie ukierunkowanych miejscowo mutagenez w celu zredukowania wiązania IgE. Chociaż trzeciorzędowa struktura Bet v 1 jest wspomniana w podanej publikacji, autorzy nie wykorzystują tej struktury do określenia reszt aminokwasowych wyeksponowanych powierzchniowo dla mutacji, z których to reszt aminokwasowych połowa ma niski stopień ekspozycji na rozpuszczalnik. Stosują oni raczej metodę opracowaną do określania funkcjonalnych reszt w białkach, różną od koncepcji identyfikacji obszarów powierzchni konserwowanych opartej na strukturze opisywanej w niniejszym wynalazku. Chociaż autorzy omawiają zachowanie trzeciorzędowej struktury a-węglowego szkieletu, to koncepcja ta nie jest częścią strategii terapeutycznej, ale została użyta do oceny wiązania IgE in vitro. Co więcej, przedstawione dowody nie są adekwatne, gdyż normalizacja spektrów CD uniemożliwia oszacowanie stopnia denaturacji próbki, co stanowi powszechny problem. Opisana strategia terapeutyczna mająca na celu indukcję tolerancji w alergenowo specyficznych komórkach T, a inicjacja nowej odpowiedzi immunologicznej nie jest rozważana.

Publikacja autorstwa Wiedemann i inni. (publ. 12) opisuje zastosowanie miejscowo ukierunkowanej mutagenezy i syntezy peptydu w celu scharakteryzowania epitopu przeciwciała monoklonalnego. Autorzy znają strukturę trzeciorzędową antygenu, co wykorzystują do wyboru aminokwasów wyeksponowanych powierzchniowo do mutacji. Zastosowany algorytm można określić jako przeciwstawny algorytmowi opisywanemu w niniejszym wynalazku jako, że wybrano aminokwasy różne od tych według sekwencji homologicznej. Badania te pokazują, że substytucja aminokwasów eksponowanych powierzchniowo ma zdolność modyfikowania charakterystyki wiązania przeciwciała monoklonalnego, co nie stanowi zaskoczenia w świetle obecnej wiedzy. Opisywane doświadczenia nie zostały przeznaczone do oceny zmian w wiązaniu przeciwciał poliklonalnych, takich jak IgE z osocza pacjentów alergicznych. W jednym z doświadczeń stosuje się IgE z osocza i chociaż doświadczenie to nie jest odpowiednie do oznaczeń ilościowych, wiązanie IgE nie wydaje się zmienione przez zastosowane mutacje.

Publikacja autorstwa Smith i inni (publ. 5) opisuje zastosowanie miejscowo ukierunkowanej mutagenezy w celu zmapowania epitopów przeciwciał monoklonalnych i zmniejszenia wiązania IgE. Autorzy nie znają struktury trzeciorzędowej i nie próbują ocenić zakresu konserwowania struktury trzeciorzędowej a-węglowego szkieletu. Zastosowany algorytm nie zapewnia tego, że aminokwasy wyselekcjonowane do mutacji są aktualnie wyeksponowane na powierzchni cząsteczki. Tylko jeden

PL 194 804 B1 z opisanych mutantów zapewnia zasadniczą redukcję wiązania IgE. Mutant ten ma deficyt wiązania wszystkich testowanych przeciwciał, co wskazuje na uszkodzenie struktury trzeciorzędowej. Autorzy nie określają strategii terapeutycznej i nie rozważają też inicjowania nowej odpowiedzi immunologicznej.

Publikacja autorstwa Colombo i inni (publ. 14) opisuje badania epitopu wiążącego IgE przy zastosowaniu ukierunkowanej mutagenezy i syntezy peptydu. Autorzy stosują komputerowy, trójwymiarowy model struktury oparty na strukturze krystalicznej białka homologicznego w celu zilustrowania obecności epitopu na powierzchni cząsteczki. Dalsze występowanie epitopu na innym alergenie wykazującym homologię struktury pierwszorzędowej osiągnięte jest przy użyciu peptydów syntetycznych reprezentujących epitop. Strategia terapeutyczna oparta jest na leczeniu przy zastosowaniu tych syntetycznych peptydów, stanowiących jednowartościowy epitop wiążący IgE. Konserwowane obszary powierzchni pomiędzy alergenami homologicznymi jak również terapeutyczna koncepcja inicjowania nowej odpowiedzi terapeutycznej nie zostały omówione.

Publikacja autorstwa Spangfort i inni (publ. 15) opisuje trójwymiarową strukturę i konserwowane obszary eksponowane powierzchniowo u głównego alergenu brzozy. Publikacja ta nie rozważa ani głównych epitopów wiążących IgE, ani miejscowo ukierunkowanej mutagenezy, ani też zastosowań terapeutycznych.

W żadnej z powyższych publikacji nie rozwiązano problemu zmniejszenia wiązania IgE przez zastąpienie wyeksponowanych powierzchniowo aminokwasów, przy zachowaniu a-węglowego szkieletu struktury trzeciorzędowej. Uzasadnienie wyżej wymienionych prób nie obejmuje koncepcji dominujących epitopów wiążących IgE i nie obejmuje też terapeutycznej koncepcji inicjowania nowej ochronnej odpowiedzi immunologicznej.

Przedmiot wynalazku wyjaśniony zostanie w odniesieniu do rysunku, na którym fig. 1 przedstawia primery oligonukleotydowe specyficzne dla mutanta zastosowane w mutancie Bet v 1 numer 1, gdzie zmutowane nukleotydy są podkreślone, fig. 2 przedstawia dwa główne, możliwe do zastosowania primery (określane jako „całe-sensowne” i „całe nonsensowne”), które zostały zsyntetyzowane i zastosowane u wszystkich mutantów, fig. 3 przedstawia przegląd wszystkich mutacji Bet v 1, fig. 4 przedstawia zahamowanie wiązania biotynylowanego rekombinanta Bet v 1 z osoczem z IgE, pochodzącego od grupy pacjentów alergicznych przez nie-biotynylowanego Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 Glu45Ser, fig. 5 przedstawia zahamowanie wiązania biotynylowanego rekombinanta Bet v 1 z osoczem z IgE od grupy pacjentów alergicznych przez nie-biotynylowanego Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln, fig. 6 przedstawia zahamowanie wiązania biotynylowanego rekombinanta Bet v 1 z osoczem grupy pacjentów alergicznych przez nie-biotynylowanego Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 Pro108Gly, fig. 7 przedstawia zahamowanie wiązania biotynylowanego rekombinanta Bet v 1 z osoczem z IgE od grupy pacjentów alergicznych przez nie-biotynylowanego Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 Glu60Ser, fig. 8 przedstawia spektra rekombinanta i mutanta trój-obszarowego otrzymane przy prawie równych stężeniach, fig. 9 przedstawia zahamowanie wiązania biotynylowanego rekombinanta Bet v 1 z osoczem z IgE od grupy pacjentów alergicznych przez nie-bitoynylowanego Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 trój-obszarowego, fig. 10 przedstawia dostępność rozpuszczalnika indywidualnie uszeregowanych reszt antygenu 5 i ustawione w szeregu sekwencje antygenu 5 Vespula (lewy panel), przy czym w prawym panelu fig. 10 przedstawiono powierzchnię cząsteczki antygenu 5 z konserwowanymi obszarami pośród antygenu 5:s Vespula, fig. 11 przedstawia sekwencję primera odpowiadającą części terminalnej Ves v 5 pochodzącej z nici sensownej, przy czym sekwencja primera w części dolnej pochodzi z nici nonsensownej, fig. 12 przedstawia dwa możliwe do zastosowania primery (określane jako „cały sensowny” i „cały nonsensowny”), które zostały zsyntetyzowane i zastosowane u wszystkich mutantów, fig. 13 przedstawia przegląd wszystkich mutacji Ves v 5, fig. 14 przedstawia zahamowanie wiązania biotynylowanego rekombinanta Ves v 5 z osoczem z IgE od grupy pacjentów alergicznych przez niebiotynylowanego Ves v 5 i przez mutanta Ves v 5 Lys72Ala.

Niniejszy wynalazek opiera się na swoistym uzasadnieniu. Zgodnie z tym uzasadnieniem mechanizm efektywnego szczepienia przeciw alergii nie polega na zmianie istniejącej odpowiedzi immunologicznej typu Th2, ale raczej na zachodzącej równolegle inicjacji nowej odpowiedzi immunologicznej typu Th1, obejmującej rozpoznanie trzeciorzędowego epitopu przez komórki B i utworzenie przeciwciał. Model ten został potwierdzony przez obserwację potwierdzającą, że poziomy swoistych IgE pozostają niezmienione po efektywnym leczeniu za pomocą szczepień, i że temu efektywnemu leczeniu towarzyszy istotny wzrost alergenowo specyficznych IgG4. Dodatkowo, badania biopsji z nosa przed i po zadziałaniu alergenu nie wykazały redukcji komórek T o fenotypie podobnym do Th2, ale raczej wzrost komórek T o fenotypie podobnym do Th1. Gdy szczepionka (lub kompozycja farmaceutyczna) jest

PL 194 804 B1 podawana drogami innymi niż oddechowe, sugeruje się, że nowa odpowiedź immunologiczna typu

Th1 powstaje w miejscu fizycznie odseparowanym w stosunku do zachodzącej odpowiedzi Th2, umożliwiając tym samym równoległe zachodzenie dwóch odpowiedzi.

Innym ważnym aspektem uzasadnienia niniejszego wynalazku jest zapewnienie istnienia dominujących epitopów wiążących IgE. Proponuje się, że te dominujące epitopy wiążące IgE utworzone są przez spójne obszary powierzchni zależne od struktury trzeciorzędowej, wystarczająco duże, aby umożliwić wiązanie przeciwciał i konserwowanych wśród izoalergenów, odmian, i/lub homologicznych alergenów z różnych spokrewnionych gatunków. Istnienie reagujących krzyżowo IgE, zdolnych do wiązania podobnych epitopów na homologicznych alergenach zostało potwierdzone przez obserwacje kliniczne, gdzie pacjenci alergiczni często reagowali na wiele blisko spokrewnionych gatunków, np. olchy, brzozy i leszczyny, wiele gatunków traw, lub wiele gatunków roztoczy kurzu domowego rodzaju Dermatophagoides. Następnie potwierdzono za pomocą doświadczeń laboratoryjnych istnienie reakcji krzyżowych IgE między homologicznymi alergenami ze spokrewnionych gatunków oraz zdolność jednego alergenu do hamowania wiązania IgE z innymi alergenami homologicznymi (Ipsen i inni 1992, publ. 16). Jest wiadomym, że ekspozycja i odpowiedzi immunologiczne zależą od dawki. Opierając się na powyższych obserwacjach, postawiono hipotezę, że konserwowane obszary powierzchni są eksponowane do układu immunologicznego w większych dawkach niż nie konserwowane obszary powierzchni, czego efektem jest wytwarzanie przeciwciał IgE o większym powinowactwie, stąd termin „dominujące epitopy wiążące IgE”.

Zgodnie z tym uzasadnieniem, rzeczą zasadniczą jest to, że alergeny mają strukturę trzeciorzędową a-węglowego szkieletu, zasadniczo taką samą jak alergen naturalny, tym samym zapewniając konserwowanie topologii powierzchni obszarów otaczających konserwowane obszary, stanowiące cel mutagenezy, mającej na celu zmniejszenie wiązania IgE. Przy zachowaniu tych kryteriów alergen posiada potencjał do podawania we względnie dużych dawkach, co zwiększa skuteczność generowania ochronnej odpowiedzi immunologicznej, ale nie kosztem zmniejszania bezpieczeństwa.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest wprowadzenie substytucji aminokwasów w określone, krytyczne pozycje, z jednoczesnym zachowaniem struktury trzeciorzędowej a-węglowego szkieletu alergenu.

Wynalazek zapewnia zrekombinowany alergen, będący nienaturalnie występującym mutantem pochodzącym z naturalnie występującego alergenu, w którym co najmniej jedna powierzchniowo wyeksponowana, konserwowana reszta aminokwasowa epitopu komórki B zastąpiona jest przez inną resztę aminokwasową, która nie występuje w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów żadnego znanego białka homologicznego w obrębie rzędu taksonomicznego, z którego pochodzi wymieniony naturalnie występujący alergen, wymieniony zmutowany alergen mający zasadniczo tę sama strukturę trzeciorzędową a-węglowego szkieletu, jak ten naturalnie występujący alergen, i wiązanie swoistych IgE do zmutowanego alergenu zmniejszone w porównaniu z wiązaniem z wymienionymi naturalnie występującym alergenem.

Taki zrekombinowany alergen uzyskuje się poprzez:

a) określenie reszt aminokwasowych w naturalnie występującym alergenie, które są konserwowane w więcej niż w 70% we wszystkich znanych białkach homologicznych w rzędzie taksonomicznym, z którego pochodzi wymieniony naturalnie występujący alergen,

b) określenie co najmniej jednego obszarukonserwowanych reszt aminokwasów. który jest ściśle związany z obszarem o przynajmniej 400 A² powierzchni trójwymiarowej cząsteczki alergenu, jak to zostało określone na podstawie dostępności rozpuszczalnika co najmniej w 20%, przy czym co najmniej jeden wymieniony obszar zawiera co najmniej jeden epitop komórki B, i

c) zastąpienie co najmniej jednej reszty aminokwasowej w wymienionym co najmniej jednym obszarze przez inny aminokwas, który nie jest konserwowany w określonej pozycji, przy zasadniczym zachowaniu trzeciorzędowej struktury a-węglowego szkieletu cząsteczki alergenu.

Specyficzne wiązanie IgE jest korzystnie zmniejszone o co najmniej 5%, korzystnie co najmniej 10% w porównaniu z naturalnie występującymi izoalergenami lub podobnymi zrekombinowanymi białkami w testach z użyciem osocza pobranego od pacjentów alergicznych ze specyficznymi reaktywnymi IgE lub z naczynia zbiorczego.

Zrekombinowane alergeny według wynalazku mogą pochodzić odpowiednio z alergenów wziewnych (inhalacyjnych) pochodzących z drzew, traw, roślin zielnych, grzybów, roztoczy kurzu domowego, karaluchów oraz zwierzęcej sierści i łupieżu. Istotne alergeny pyłkowe z drzew, traw i roślin zielnych to alergeny pochodzące z rzędów taksonomicznych Fagales, Oleales i Pinales, włączając

PL 194 804 B1 w to brzozę (Betula), olchę (Alnus), leszczynę (Corylus), grab (Carpinus) i oliwkę (Olea), rząd Poales, w tym trawy rodzaju Lolium, Phelum, Poa, Cynodon, Dactylis i Secale, rzędy Asterales i Urticales obejmujące między innymi rośliny zielne rodzajów Ambrosia i Artemisia. Ważnymi alergenami inhalacyjnymi z grzybów są, między innymi, te pochodzące z rodzaju Alternaria i Cladosporium. Innymi ważnymi alergenami inhalacyjnymi są alergeny pochodzące z roztoczy kurzu domowego rodzaju Dermatophagoides, alergeny pochodzące od karaluchów i te od ssaków jak kot, pies i koń. Ponadto, zrekombinowane alergeny według wynalazku mogą pochodzić z alergenów jadu, włączając w to te pochodzące od żądlących lub gryzących owadów, takich jak te z rzędu taksonomicznego Hymenoptera obejmującego pszczoły (nadrodzina Apidae), osy (nadrodzina Vespidae) i mrówki (nadrodzina Formicoidae).

Specyficzne składniki alergenu zawierają, na przykład, Bet v 1 (B. verrucosa, brzoza) Aln g 1 (Alnus glutinosa, olcha), Cor a 1 (Corylus avelana, leszczyna), i Car b 1 (Carpinus betulus, grab) rzędu Fagales. Inne to Cry j 1 (Pinales), Amb a 1 i 2, Art v 1 (Asterales), Par j 1 (Urticales), Ole e 1 (Oleales), Ave e 1, Cyn d 1, Dac g 1, Fes p 1, Hol l 1, Lol p 1 i 5, Pas n 1, Phl p 1 i 5, Poa p 1,2 i 5, Sec c 1 i 5, i Sor h 1 (pyłki różnych traw), Alt a 1 i Cla h 1 (grzyby), Der f 1 i 2, Der p 1 i 2 (roztocza kurzu domowego, odpowiednio D. farinae i D. pteronyssinus,), Bla g 1 i 2, Per a 1 (karaluchy, odpowiednio Blatella germanica i Periplaneta americana,), Fel d 1 (kot), Can f 1 (pies), Equ c 1,2 i 3 (koń), Apis m 1 i 2 (pszczoła miodna), Ves g 1,2 i 5, Pol a 1,2 i 5 (wszystko osy) i Sol i 1,2, 3 i 4 (mrówka).

W jednym przykładzie wykonania, zrekombinowany alergen pochodzi z Bet v 1. Przykładami substytucji aminokwasów są Thr10Pro, Asp25Gly, (Asn28Thr + Lys32Gln), Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Thr77Ala, Pro108Gly i (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly). Jak widać, zrekombinowane alergeny mogą posiadać jedną lub więcej substytucji.

W innym przykładzie wykonania, zrekombinowany alergen pochodzi z alergenu jadu z rzędu taksonomicznego Vespidae, Apidae i Formicoidae,

W dalszym przykładzie wykonania, zrekombinowany alergen pochodzi z Ves v 5. Przykładami substytucji są Lys72Ala i Tyr96Ala. Jak widać, zrekombinowane alergeny mogą posiadać jedną lub więcej substytucji.

Niniejszy wynalazek zapewnia również sposób przygotowywania zrekombinowanego alergenu, jak to jest tu zdefiniowane, który obejmuje:

b) określenie co najmniej jednego konserwowanych reszz aminokwasów, który jess ściśle związany z obszarem o przynajmniej 400 A² powierzchni trójwymiarowej cząsteczki alergenu, jak to zostało określone na podstawie dostępności rozpuszczalnika co najmniej w 20%, przy czym co najmniej jeden wymieniony obszar zawiera co najmniej jeden epitop komórki B, i

c) zastąpienie co najmniej jednej reszty aminokwasowej w wymienionym co najmniej jednym obszarze przez inny aminokwas, który nie jest konserwowany w określonej pozycji, przy zasadniczym zachowaniu trzeciorzędowej struktury α-węglowego szkieletu cząsteczki alergenu.

W tym sposobie najlepsze rezultaty osiąga się poprzez uszeregowanie reszt aminokwasowych tego co najmniej jednego obszaru ze względu na dostępność rozpuszczalnika i zastąpienie jednego lub więcej aminokwasów spośród tych o większej dostępności rozpuszczalnika.

Zazwyczaj, w sposobie według wynalazku zastąpienie jednego lub więcej reszt aminokwasowych w wymienionych epitopie komórki B lub wymienionym co najmniej jednym obszarze przeprowadzane jest poprzez miejscowo ukierunkowaną mutagenezę.

Konserwatywność trzeciorzędowej struktury α-węglowego szkieletu można najlepiej określić poprzez uzyskanie identycznej struktury przez krystalografię rentgenograficzną lub NMR przed i po mutagenezie. Przy nieobecności danych strukturalnych opisujących nieodróżnialne CD-spektra mutanta, lub danych immunochemicznych, na przykład, reaktywności z przeciwciałem, można w przybliżeniu określić konserwatywność struktury trzeciorzędowej a-węglowego szkieletu, jeśli dokona się porównania z danymi uzyskanymi w wyniku analizy strukturalnie określonej cząsteczki.

Ponadto, niniejszy wynalazek zapewnia kompozycję farmaceutyczną zawierającą zrekombinowany alergen, jak to tu opisano, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub rozczynnikiem, i opcjonalnie adiuwant.

Taka kompozycja farmaceutyczna może być w formie szczepionki przeciw reakcjom alergicznym wywoływanym przez naturalnie występujący alergen u pacjentów cierpiących na alergię.

PL 194 804 B1

W dalszym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania zrekombinowanego alergenu według wynalazku przygotowywania leku do wywoływania odpowiedzi immunologicznej u osobnika alergen, tu określony.

Kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku może zostać przygotowany w procesie obejmującym zmieszanie co najmniej jednego zrekombinowanego alergenu, tu określonego z farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami i/lub rozczynnikami.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku otrzymywane są sposobem, który zdefiniowano powyżej.

W innym przykładzie wykonania, wynalazek dotyczy zastosowania zrekombinowanego alergenu, według wynalazku do przygotowywania leku do leczenia, zapobiegania lub osłabiania reakcji alergicznych.

Kryteria substytucji

Dla cząsteczek, u których ma zostać określona struktura trzeciorzędowa (na przykład, poprzez krystalografię rentgenograficzną lub mikroskopię elektronową NMR) mutant przenoszący aminokwas(y) do substytucji powinien korzystnie spełniać następujące kryteria:

1. Cała trzeciorzęd owa struktura cząsteczki z <a-węglowym szkieletem powinna być konserwowana, co definiuje się jako odchylenie standardowe porównywanych współrzędnych atomowych poniżej 2 A. Jest to ważne z dwóch powodów: a) Przewiduje się, że cała powierzchnia naturalnego alergenu stanowi nakładające się kontinuum potencjalnych epitopów wiążących przeciwciało. Na większą część powierzchni cząsteczki substytucja(e) nie ma(ją) wpływu, przez co zachowuje ona swe właściwości wiązania przeciwciała, co jest ważne dla wywołania nowych zabezpieczających swoistości skierowanych na epitopy występujące również na naturalnym alergenie. b) Stabilności, dotyczącej zarówno okresu trwałości, jak i stabilności po iniekcji do płynów ciała.

2. Aminokwasy, które mają ulec substytucji powinny być umiejscowione na powierzchni i tym sposobem być dostępne dla wiązania przeciwciał. Aminokwasy umiejscowione na powierzchni definiuje się jako aminokwasy, których trójwymiarowa struktura charakteryzuje się dostępnością rozpuszczalnika (wody) co najmniej w 20%, korzystniej w 20-80%, a najkorzystniej w zakresie 30-80%. Dostępność rozpuszczalnika definiowana jest jako obszar cząsteczki dostępny dla sfery o promieniu porównywalnym z cząsteczką rozpuszczalnika (woda, r = 1,4 A).

3. Zastępowane aminokwasy powinny być umiejscowione w konserwowanych obszarach większych niż 400 A². Konserwowane obszary definiuje się jako ściśle powiązane obszary powierzchniowo eksponowanych konserwowanych reszt aminokwasowych i łańcucha. Konserwowane reszty aminokwasowe definiuje się jako zestaw sekwencji wszystkich znanych (lub wnioskowanych) sekwencji aminokwasów białek homologicznych w obrębie rzędu taksonomicznego. Pozycje aminokwasów mających te same reszty aminokwasowe w więcej niż 90% sekwencji uważane są za konserwowane. Za konserwowane uważa się obszary zawierające epitopy, z którymi wiążą się IgE większości pacjentów.

4. W obrębie konserwowanych obszarów aminokwasy do mutagenezy powinny być korzystnie wyselekcjonowane spośród większości aminokwasów dostępnych dla rozpuszczalnika (wody), ulokowanych korzystnie blisko centrum konserwatywnego obszaru.

Korzystnie, reszty polarnych aminokwasów zastępowane są przez inne reszty polarne, natomiast reszty nie polarnych aminokwasów zastępowane są przez reszty nie polarnych aminokwasów.

Przygotowanie szczepionki jest zasadniczo dobrze znane. Szczepionki są zwykle przygotowywane, jako możliwe do iniekcji albo w postaci roztworów płynnych lub zawiesin. Takie szczepionki mogą także być emulgowane lub przygotowane tak, aby możliwie było podawanie ich do nosa. Omawiany składnik immunogenny (zrekombinowany alergen, tu opisany) może być odpowiednio zmieszany z rozczynnikami, które są dopuszczalne farmaceutycznie oraz kompatybilne ze składnikiem aktywnym. Przykładami odpowiednich rozczynników są woda, sól fizjologiczna, dekstroza, glicerol, etanol, i tym podobne, jak również kombinacje tych rozczynników. Szczepionka może dodatkowo zawierać inne substancje, takie jak środki zwilżające, środki emulgujące, środki buforujące lub adiuwanty zwiększające efektywność szczepionki.

Szczepionki najczęściej podawane są pozajelitowo przez zastrzyki podskórne lub domięśniowe. Preparaty, które są odpowiednie do podawania inną drogą, obejmują preparaty doustne i czopki. Szczepionki do podawania doustnego mogą być przygotowywane odpowiednio z rozczynników normalnie stosowanych w takich preparatach, na przykład, farmaceutyczne gatunki mannitolu, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharynian sodu, celuloza, węglan magnezu i podobne. Kompozycja

PL 194 804 B1 może być przygotowana w postaci roztworów, zawiesin, emulsji, tabletek, pigułek, kapsułek, preparatów o długotrwałym uwalnianiu, aerozoli, proszków lub granulatów.

Szczepionki podawane są w taki sposób, aby zachować kompatybilność z dawkowaniem preparatu i w takiej ilości, która będzie terapeutycznie efektywna i immunogenna. Ilość składnika aktywnego zawartego w szczepionce zależy od leczonego osobnika, to jest od zdolności układu odpornościowego osobnika do odpowiedzi na leczenie, sposobu podawania oraz wieku i wagi osobnika. Odpowiednie dawki mogą się różnić i zawierać w przedziale od 0,0001 mg do 1000 mg.

Jak nadmieniono powyżej, zwiększony efekt można uzyskać przez dodawanie do preparatu adiuwantów. Przykładami takich adiuwantów są wodorotlenek glinu i fosforan glinu w roztworach 0,05 do 0,1% w soli buforowanej fosforanami, syntetyczne polimery cukru używane w 0,25% roztworach. Jako substytuty może być też zastosowana mieszanka z komórek bakterii takich jak C. parvum, endotoksyny lub komponenty lipopolisacharydów bakterii gramujemnych, emulsje w fizjologicznie przystępnych nośnikach takich jak mannide monoaleate (Aracel A) lub emulsja z 20% roztworem fluoropochodnej węglowodoru (na przykład, Fluosol-DA). Mogą by ć też użyte inne adiuwanty, takie jak kompletne lub niekompletne adiuwanty Freund'a, jak również QuilA i RIBI.

Najczęściej niezbędne są wielokrotne podawania szczepionki, aby osiągnąć efekt. Często szczepionka jest podawana w postaci dawki inicjującej, po której następują kolejne szczepienia lub inne sposoby podania. Liczba szczepionek wynosić będzie zwykle od 1 do 50, zazwyczaj nie przekraczając 35 szczepionek. Szczepienie będzie normalnie stosowane dwa razy na tydzień, do dwóch razy na miesiąc przez okres od 3 miesięcy do 5 lat. Uważa się, że to zapewni właściwy poziom profilaktyki lub efektu terapeutycznego.

Zrekombinowany alergen może być zastosowany jako preparat farmaceutyczny, odpowiedni do zapewnienia pewnego zabezpieczenia przeciw odpowiedziom alergicznym przez okresu roku, gdy pojawiają się symptomy (profilaktyka). Zazwyczaj leczenie będzie musiało być powtarzane każdego roku w celu zachowania efektu ochronnego. Preparaty przygotowane do aplikacji do nosa są szczególnie odpowiednie dla tego celu. Niniejszy wynalazek zilustrowany jest poniżej przez następujące nie ograniczające przykłady.

P rzy kła d 1

Identyfikacja wspólnych epitopów pośród alergenów pyłku Fagales

Główny alergen pyłkowy brzozy Bet v 1 ma około 90% sekwencji identycznej z głównymi alergenami z pyłków taksonomicznie spokrewnionych drzew, to jest Fagales (na przykład, leszczyna lub grab), a pacjenci z alergią na pyłki brzozy często wykazują kliniczne symptomy alergiczne reaktywności krzyżowej na białka homologiczne Bet v 1.

Bet v 1 posiada również 50-60% sekwencji identycznej z białkami alergicznymi występującymi w pewnych owocach (na przykład, w jabłkach i wiśniach) oraz warzywach (na przykład, w selerze i marchwi), i są kliniczne dowody na alergiczną reaktywność krzyżową między Bet v 1 i wymienionymi białkami pożywienia.

Dodatkowo, Bet v 1 wykazuje istotne podobieństwo sekwencji z grupą białek roślinnych nazywanych białkami związanymi z patogenezą (PR-10), jednak nie ma doniesień o istnieniu krzyżowej reaktywności związanej z białkami PR-10.

Modelowanie cząsteczki sugeruje, że struktury alergenów Fagales, alergenów żywności i białek PR-10 są prawie identyczne ze strukturą Bet v 1.

Strukturalne podstawy reaktywności krzyżowej alergicznego Bet v 1 zostały opisane w publikacji autorstwa Gajhede i inni w 1996r. (publ. 17), w której trzy obszary powierzchni cząsteczki Bet v 1 można określić jako wspólne dla znanych, głównych alergenów pyłków drzew. Tak więc, każde IgE rozpoznające te obszary na Bet v 1 powinno reagować krzyżowo i wiązać się z innymi głównymi alergenami pyłków Fagales oraz powodować symptomy alergii. Identyfikacja tych wspólnych obszarów została przeprowadzona po ustaleniu wszystkich sekwencji aminokwasów głównych alergenów pyłków drzew w kombinacji z analizą powierzchni cząsteczki Bet v 1 przedstawionej dzięki strukturze trzeciorzędowej a-węglowego szkieletu według publ. 17. Dodatkowo obszary te określono jako mające szczególnie małe wymiary minimalne (> 400 A²) na podstawie obszaru zakrytego po związaniu przeciwciała.

Wybór reszt aminokwasowych do miejscowo ukierunkowanej mutagenezy

Reszty aminokwasowe do miejscowo ukierunkowanej mutagenezy wybrane zostały spomiędzy reszt występujących w specyficznych obszarach Bet v 1 i obszarach wspólnych jako, że ich modyfikacje powinny oddziałać na wiązanie IgE osocza od większości pacjentów, wykazujących kliniczne objawy reaktywności krzyżowej na pyłki drzew.

PL 194 804 B1

Względną orientację i proporcję ekspozycji na rozpuszczalnik każdej reszty aminokwasowej w odpowiednim obszarze obliczano na podstawie ich współrzędnych atomowych. Reszty mające niski stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (< 20%) nie uznawano za odpowiednie do mutagenezy w związku z możliwym uszkodzeniem struktury lub brakiem interakcji z przeciwciałem. Pozostałe reszty oceniane były zgodnie ze stopniem ich ekspozycji na rozpuszczalnik.

Uporządkowanie sekwencji

Sekwencje homologiczne do poszukiwanej sekwencji (Bet v 1 nr 2801, WHO IUIS Nomenclature Subcommittee on Allergens) pochodziły z GenBank i bazy danych sekwencji EMBL przez badanie BLAST (Altschul i inni, publ. 18). Wzięto pod uwagę wszystkie sekwencje o prawdopodobieństwie mniejszym niż 0,1 opisane przez BLAST, po czym ułożono listę zawierającą spis nie zawierający zbędnych homologicznych sekwencji. Zostały one opisane przez CLUSTAL W (Higgins i inni, publ. 19), a procent identyczności obliczano dla każdej pozycji w sekwencji, biorąc pod uwagę kompletną listę lub tylko gatunki taksonomicznie spokrewnione. W sumie 122 sekwencje były homologiczne z Bet v 1 nr 2801, z których 57 sekwencji pochodziło z taksonomicznie spokrewnionych gatunków.

Klonowanie genu kodującego Bet v 1

RNA otrzymano z pyłku Betula verrucosa (Allergon, Sweden) przez ekstrakcję fenolem i wytrącanie LiCl. Chromatografię powinowactwa na oligo (dT)-celulozie przeprowadzano periodycznie w probówkach Eppendorfa, a 2-niciowe cDNA zsyntetyzowano przy użyciu handlowo dostępnego zestawu (Amersham). DNA kodujące Bet v 1 amplifikowano przy zastosowaniu technologii PCR i klonowano. W skrócie, PCR przeprowadzono przy użyciu jako matrycy cDNA, a primery tak zaprojektowano, aby pasowały odpowiednio do sekwencji cDNA w pozycjach odpowiadających końcowi aminowemu Bet v 1 i rejonowi 3' nie podlegającemu translacji. Primery rozciągały się do końców 5', aby ułatwić kierunkowe klonowanie miejsc restrykcyjnych (NcoI i HindIII) do pKK233-2.

Subklonowanie do pMAL-c

Gen kodujący Bet v 1 był następnie subklonowany do wektora fuzyjnego pMAL-c (New England Biolabs) dla białka wiążącego maltozę. Gen został powielony technologią PCR i subklonowany do ramki odczytu z malE w celu utworzenia operonów fuzyjnych białka wiążącego maltozę (MBP) i białka Bet v 1, w których MBP i Bet v 1 były odseparowane przez miejsce rozszczepienia przez proteazę czynnika Xa, położonych tak, aby odtworzyć po rozszczepieniu autentyczną sekwencję aminoterminalną Bet v 1, jak to opisano w publ. 15. W skrócie, przeprowadzono PCR stosując pKK233-3 z Bet v 1 użytych odpowiednio jako matryca i primery odpowiadające końcowi aminowemu i karboksylowemu białek. Proksymalny primer promotora został przedłużony do końca 5', aby objąć 4 kodony kodujące w ramce odczytu miejsce rozszczepienia przez proteazę czynnika Xa. Oba primery były następnie przedłużone ku końcom 5', aby objąć miejsca restrykcyjne (Kpnl) do klonowania. Geny kodujące Bet v 1 były subklonowane przez 20 cykli PCR, aby zredukować częstość artefaktów PCR.

Mutageneza in vitro

Mutageneza in vitro przeprowadzona została przy zastosowaniu technologii PCR używając rekombinanta pMAL-c z Bet v 1 wprowadzonych jako matryca. Każdy mutant genu Bet v 1 utworzony został w 3 reakcjach PCR przy zastosowaniu 4 primerów.

Dwa primery oligonukleotydowe specyficzne dla mutacji zostały zsyntetyzowane, zawierając każdą mutację, jedną dla każdej nici DNA, patrz fig. 1 i 2. Stosując zmutowany(e) nukleotyd(y) jako punkty startu, oba primery zawierały 7 nukleotydów w końcu 5' i 15 nukleotydów w końcu 3'. Nukleotydy te miały identyczne sekwencje jak w genie Bet v 1 w danym rejonie.

Dwa możliwe do zastosowania primery (określane jako „całe sensowne” i „całe nonsensowne” na fig. 2) były dalej syntetyzowane i użyte u wszystkich mutantów. Primery te miały długość 15 nukleotydów i ich sekwencje odpowiadały rejonom 1kpz (1 kilobase) wektora pMAL-c zgodnie i niezgodnie z kierunkiem polimeryzacji od genu Bet v 1. Sekwencja primera leżącego zgodnie z kierunkiem polimeryzacji pochodziła od nici sensownej, a sekwencja primera leżącego niezgodnie z kierunkiem polimeryzacji pochodziła od nici nonsensownej, patrz fig. 2.

Zasadniczo przeprowadzono dwie niezależne reakcje PCR zgodnie z procedurą standardową (Saiki i inni, 1988, publ. 20) z takim wyjątkiem, że przeprowadzono tylko 20 cykli temperaturowych w celu zmniejszenia częstości błędów technologii PCR. W każdej reakcji PCR stosowano pMAL-c z Bet v 1, wprowadzonych jako matryca oraz jednego specyficznego dla mutacji i ogólnie możliwego do zastosowania primera w istotnych kombinacjach.

Wprowadzenie czterech substytucji aminokwasowych (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly) u mutantów trój-obszarowych przeprowadzono tak jak opisano to wyżej, kolejno krok po

PL 194 804 B1 kroku. Najpierw wprowadzono mutację Glu45Ser, następnie mutację Pro108Gly, Asn28Thr i Lys32Gln przy użyciu pMAL-c z wprowadzonym odpowiednio Bet v 1 nr 2801, Bet v 1 (Glu45Ser), Bet v 1 (Glu45Ser, Pro108Gly ) jako matryce.

Produkty reakcji PCR zostały oczyszczone poprzez elektroforezę na żelu agarozowym i elektroelucję, po których zastosowano wytrącanie w etanolu. Trzecią reakcję PCR przeprowadzono stosując łączone produkty PCR z dwóch pierwszych reakcji PCR jako matrycę i jako ogólnie możliwe do zastosowania primery. Znów, zastosowano 20 cykli standardowej techniki PCR. Produkt PCR został oczyszczony poprzez elektroforezę na żelu agarozowym i elektroelucję, po których nastąpiło wytrącanie w etanolu, cięcie enzymami restrykcyjnymi (BsiWI/EcoRI) i kierunkowa ligacja do pMAL-c z wprowadzonym Bet v 1, ciętym tymi samymi enzymami.

Figura 3 przedstawia przegląd wszystkich mutacji Bet v 1, które są jak podano poniżej:

Thr10Pro, Asp25Gly, Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Glu60Ser (bez obszaru), Thr77Ala i Pro108Gly. Dodatkowo przygotowano również cztery mutanty z czterema mutacjami (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly). Spośród nich, wybrano pięć do dalszego testowania: Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Glu60Ser, Pro108Gly i mutant trój-obszarowy Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly.

Sekwencjonowanie nukleotydów

Wyznaczenie sekwencji nukleotydowej genu kodującego Bet v 1 przeprowadzono odpowiednio przed i po subklonowaniu oraz po mutagenezach in vitro.

Plazmidowe DNA z 10 ml kultury bakteryjnej, która wzrastała do nasycenia przez całą noc w środowisku LB uzupełnionym 0,1 g/1 ampicyliny, zostało oczyszczone na kolumnach Qiagen-tip 20 i było sekwencjonowane przy użyciu zestawu do sekwencjonowania DNA (USB) według wersji Sequenase 2.0, zgodnie z zaleceniem dostawców.

Ekspresja i oczyszczanie zrekombinowanego Bet v 1 i mutantów

Zrekombinowane Bet v 1 (Bet v 1 nr 2801 i mutanty) poddane były wzmożonej ekspresji u Escherichia coli DH 5a połączonej (fuzja) z białkiem wiążącym maltozę i oczyszczone jak opisano w publ. 15. W skrócie, komórki zrekombinowanego E. coli wzrastały w 37°C do osiągnięcia gęstości optycznej 1,0 przy 436 nm, po czym indukowano ekspresję białka połączonego z Bet v 1 poprzez dodanie IPTG. Komórki były oddzielane przez wirowanie 3 godziny po indukcji, ponownie zawieszone w buforze lizującym i rozbite przez sonikację. Po sonikacji i dodatkowym wirowaniu, połączone zrekombinowane białko było izolowane poprzez chromatografię powinowactwa na amylozie i kolejno rozszczepiane podczas inkubacji z czynnikiem Xa (publ. 15). Po cięciu czynnikiem Xa, zrekombinowany Bet v 1 był izolowany przez filtrację na żelu i jeśli było to niezbędne, poddawany dodatkowej turze chromatografii powinowactwa na amylozie w celu usunięcia śladów białka wiążącego maltozę.

Oczyszczone zrekombinowane białko Bet v 1 było zagęszczane poprzez ultrafiltrację do około 5 mg/ml i przechowywane w temperaturze 4°C. Ostateczny stan preparatu oczyszczonego, zrekombinowanego Bet v 1 wynosił 2-5 mg na litr kultury komórek E. coli.

Preparaty oczyszczonego, zrekombinowanego Bet v 1 widoczne były jako pojedyncze paski po elektroforezie poliakrylamidowej SDS z barwieniem srebrem, o przybliżonej masie cząsteczkowej 17,5 kDa. Sekwencjonowanie N-terminalne wykazało, że spodziewane sekwencje pochodziły od sekwencji nukleotydowej cDNA, a ilościowa analiza aminokwasów wykazała oczekiwany skład aminokwasów.

Jak wykazano wcześniej (publ. 15), zrekombinowane Bet v 1 nr 2801 jest immunochemicznie nierozróżnialne od naturalnie pojawiającego się Bet v 1.

Immunoelektroforeza przy użyciu króliczych przeciwciał poliklonalnych

Siedem mutantów Bet v 1 utworzono jako zrekombinowane białka Bet v 1, oczyszczono jak to opisano powyżej i testowano na ich aktywność w stosunku do króliczych przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciw naturalnie występującemu Bet v 1 izolowanemu z pyłku brzozy. Kiedy analizowane w naturalnych warunkach przez immunoelektroforezę przeciwciała królicze były w stanie wytrącać wszystkie mutanty, wskazywało to, że mutanty te miały zakonserwowaną trzeciorzędowa strukturę a-węglowego szkieletu.

Wyniki te wskazują, że nienaturalnie pojawiające się substytucje wprowadzone na powierzchnie cząsteczki Bet v 1 mogą zmniejszyć odpowiedź przeciwciał poliklonalnych skierowaną przeciw naturalnie występującym Bet v 1 bez zniekształcenia całej struktury trzeciorzędowej alergenu z a-węglowym szkieletem. W celu analizy wpływu na odpowiedź ludzkich poliklonalnych IgE do dalszych analiz wyselekcjonowano mutanty Glu45Ser, Pro108Gly, Asn28Thr + Lys32Gln i Glu60Ser.

PL 194 804 B1

Mutant Bet v 1 Glu45Ser

Kwas glutaminowy w pozycji 45 wykazuje wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (40%) i jest umiejscowiony w obszarze na powierzchni cząsteczki wspólnej dla alergenów Fagales (obszar I). Stwierdzono, że reszta serynowa zajmuje pozycję 45 w niektórych białkach PR-10 homologicznych z Bet v 1, wskazując, że kwas glutaminowy może być zastąpiony przez serynę bez zniekształcania trzeciorzędowej struktury a-węglowego szkieletu. Dodatkowo, ponieważ żadna ze znanych sekwencji alergenów Fagales nie ma seryny w pozycji 45, substytucja kwasu glutaminowego seryną jest źródłem nienaturalnie pojawiającej się cząsteczki Bet v 1.

Test proliferacji komórek T przy zastosowaniu mutanta Glu45Ser zrekombinowanego Bet v 1

Analizę przeprowadzono w sposób, jaki opisano w publikacji autorstwa Spangorf i inni, 1996a. Stwierdzono, że mutant Glu45Ser zrekombinowanego Bet v 1 był zdolny do indukowania proliferacji linii komórkowych T od trzech różnych pacjentów alergicznych w stosunku do pyłku brzozy, ze współczynnikami stymulacji podobnymi jak w przypadku rekombinanta i naturalnie występujących mutacji.

Krystalizacja i określenie struktury zrekombinowanego Glu45Ser Bet v 1

Wzrost kryształów zrekombinowanego Glu45Ser Bet v 1 otrzymywano przez dyfuzję gazową w 25°C, zasadniczo jak to opisano w publ. 21 (Spangfort i inni 1996b). Glu45Ser Bet v 1, o stężeniu 5 mg/ml było zmieszane z równą objętością 2,0 M siarczanu amonu, 0,1 M cytrynianu sodu, 1% (v/v) dioksanu, pH 6,0. Po 24 godzinach równoważenia, wzrost kryształów indukowano poprzez stosowanie techniki zaszczepiania opisanej w publ. 21, używając kryształów zrekombinowanego Bet v 1 dzikiego typu, jako źródła zarodków krystalizacji.

Po około 2 miesiącach, kryształy zbierano i analizowano przy użyciu promieni X wytwarzanych przez wirującą anodę Rigaku, jak to opisano w publ. 21, a strukturę określano stosując podstawienie cząsteczkowe.

Struktura mutanta Glu45Ser Bet v 1

Wpływ mutacji na strukturę wyjaśniono analizując trójwymiarowe kryształy białka Bet v 1 Glu45Ser poddane dyfrakcji przy rozdzielczości 3 A podczas analizy promieniami X, wytwarzanymi przez wirującą anodę. Zastąpienie kwasu glutaminowego seryną w pozycji 45 zostało zweryfikowane przez zmapowanie gęstości elektronowej struktury Bet v 1 Glu45Ser. co wykazało, że cała struktura trzeciorzędowa a-węglowego szkieletu została zachowana.

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Glu45Ser Bet v 1

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Glu45Ser Bet v 1 porównano z właściwościami zrekombinowanego Bet v 1 w teście inhibicji IgE w płynnej fazie przy użyciu zestawu osocza pochodzącego od pacjentów z alergią na pyłki brzozy.

Zrekombinowane Bet v 1 nr 2801 było biotynylowane w stosunku 1:5 (Bet v 1 nr 2801:biotyny). Test inhibicji przeprowadzono jak następuje: próbka osocza była inkubowana w stałej fazie anty IgE, przemywana, ponownie zawieszana i dalej inkubowana z mieszanką biotynylowanego Bet v 1 nr 2801 (3,4 nM) i danego mutanta (0-28,6 nM). Ilość biotynylowanego Bet v 1 nr 2801 związanego ze stałą fazą szacowano na podstawie mierzonego RLU po inkubacji z estrem akrydynowym znakowanym streptawidyną. Stopień inhibicji obliczano jako stosunek pomiędzy RLU uzyskanym przy zastosowaniu buforu i przy zastosowaniu mutanta jako inhibitora.

Figura 4 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego rekombinanta Bet v 1 z osoczem z IgE od grupy alergicznych pacjentów przez nie-biotynylowane Bet v 1 i przez mutanta Glu45Ser Bet v 1.

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek niezbędnych do osiągnięcia 50% inhibicji wiązania IgE z osocza występujących w zbiorczym osoczu. Zrekombinowany Bet v 1 osiąga 50% inhibicji przy około 6,5 ng, podczas gdy odpowiednie stężenie dla mutanta Glu45Ser Bet v 1 wynosi około 12 ng. Pokazuje to, że mutacja punktowa wprowadzona do mutanta Glu45Ser Bet v 1 zmniejsza dwukrotnie powinowactwo do specyficznych IgE osocza. Maksymalny poziom inhibicji osiągnięty przez mutanta Glu45Ser Bet v 1 jest wyraźnie niższy w porównaniu ze zrekombinowanym Bet v 1. Może to wskazywać, że po substytucji Glu45Ser, część specyficznych IgE występujących w osoczu nie jest zdolna do rozpoznania mutanta Glu45Ser Bet v 1.

Mutant Asn28Thr + Lys32Gln Bet v 1

Asparaginian i lizyna odpowiednio w pozycjach 28 i 32, wykazują wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (odpowiednio 35% i 50%) i są umiejscowione w obszarze na powierzchni cząsteczki wspólnej dla alergenów Fagales (obszar II). W strukturze swej, asparaginian 28 i lizyna 32 umiejscowione są blisko siebie na powierzchni cząsteczki i najprawdopodobniej oddziaływają poprzez wiązania wodorowe. Stwierdzono, że reszty treoniny i glutaminianu zajmują odpowiednio pozycje 28 i 32,

PL 194 804 B1 u części białek PR-10 homologicznych z Bet v 1, wskazując, że asparaginian i lizyna mogą być zastąpione odpowiednio treoniną i glutaminianem, bez zniekształcania struktury trzeciorzędowej a-węglowego szkieletu. Dodatkowo, ponieważ żadna z naturalnie występujących sekwencji izoalergenu nie posiada treoniny i glutaminianu odpowiednio w pozycjach 28 i 32, substytucje są źródłem nienaturalnie występującej cząsteczki Bet v 1.

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Asn28Thr + Lys32Gln

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Asn28Thr + Lys32Gln porównano ze zrekombinowanym Bet v 1 w oznaczeniu inhibicji IgE w fazie płynnej przy użyciu IgE zbiorczego osocza pochodzącego od pacjentów z alergią na pyłki brzozy, jak opisano powyżej.

Figura 5 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 z IgE osocza pochodzącego od grupy alergicznych pacjentów przez nie-biotynylowane Bet v 1 i przez mutanta Asn28Thr + Lys32Gln Bet v 1.

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek niezbędnych do osiągnięcia 50% inhibicji wiązania IgE osocza obecnych w zbiorczym osoczu. Zrekombinowane Bet v 1 osiąga 50% inhibicji przy około 6,5 ng, podczas gdy odpowiadające stężenie dla mutanta Asn28Thr + Lys32Gln Bet v 1 wynosi około 12 ng. Pokazuje to, że punktowe mutacje wprowadzone do mutanta Asn28Thr + + Lys32Gln Bet v 1 obniżają powinowactwo do specyficznych IgE osocza ze współczynnikiem wynoszącym około 2.

Maksymalny poziom inhibicji osiągany przez mutanta Asn28Thr + Lys32Gln Bet v 1 jest wyraźnie niższy w porównaniu z rekombinantem Bet v 1. Może to wskazywać, że po substytucji Asn28Thr + Lys32Gln, część specyficznych IgE obecnych w osoczu nie jest zdolna do rozpoznania mutanta Asn28Thr + Lys32Gln Bet v 1.

Mutant Pro108Gly Bet v 1

Prolina w pozycji 108 wykazuje duży stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (60%) i jest umiejscowiona w obszarze na powierzchni cząsteczki, wspólnej dla alergenów Fagales (obszar III). Stwierdzono, że glicyna zajmuje pozycję 108 u pewnych białek PR-10 homologicznych w stosunku do Bet v 1, co sugerowało, że prolina może być zastąpiona przez glicynę bez zniekształcenia trzeciorzędowej struktury a-węglowego szkieletu. Dodatkowo, ponieważ żadna z naturalnie występujących sekwencji izoalergenu nie posiada glicyny w pozycji 108, substytucja proliny przez glicynę jest źródłem nienaturalnie występującej cząsteczki Bet v 1.

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Pro108Gly Bet v 1

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Pro108Gly Bet v 1 porównano z rekombinantem Bet v 1 w oznaczeniu w fazie płynnej inhibicji IgE przy użyciu IgE ze zbiorczego osocza pochodzącego od pacjentów z alergią na pyłek brzozy opisanych powyżej.

Figura 6 przestawia inhibicję wiązania biotynylowanego rekombinanta Bet v 1 z IgE z osocza od grupy alergicznych pacjentów przez nie biotynylowane Bet v 1 i przez mutanta Pro108Gly Bet v 1.

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek niezbędnych do osiągnięcia 50% inhibicji wiązania IgE osocza występujących w osoczu zbiorczym. Zrekombinowane Bet v 1 osiąga 50% inhibicji przy około 6,5 ng, podczas gdy odpowiadające stężenie dla mutanta Pro108Gly Bet v 1 wynosi około 15 ng. Pokazuje to, że punktowa mutacja wprowadzona do mutanta Pro108Gly Bet v 1 obniża powinowactwo do swoistych IgE osocza około 2-krotnie.

Maksymalny poziom inhibicji osiągany przez mutanta Pro108Gly Bet v 1 jest wyraźnie niższy w porównaniu z rekombinantem Bet v 1. Może to wskazywać, że po substytucji Pro108Gly, część swoistych IgE występujących w osoczu nie jest zdolna do rozpoznania mutanta Pro108Gly Bet v 1.

Mutant Glu60Ser Bet v 1 (mutant bez obszaru)

Kwas glutaminowy w pozycji 60 wykazuje wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (60%), jakkolwiek nie jest umiejscowiony w obszarze na powierzchni cząsteczki wspólnej dla alergenów Fagales. Stwierdzono, że reszta serynowa zajmuje pozycje 60 u części białek PR-10 homologicznych z Bet v 1, co wskazuje, ze kwas glutaminowy może być zastąpiony przez serynę bez zniekształcenia trzeciorzędowej struktury a-węglowego szkieletu. Dodatkowo, ponieważ żadna z naturalnie występujących sekwencji izolaregenu nie posiada seryny w pozycji 60, substytucja kwasu glutaminowego przez serynę jest źródłem nienaturalnie występującej cząsteczki Bet v 1.

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Glu60Ser Bet v 1

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Glu60Ser Bet v 1 porównano z rekombinantem Bet v 1 w oznaczeniu w fazie płynnej inhibicji IgE przy użyciu IgE ze zbiorczego osocza pochodzącego od pacjentów z alergią na pyłek brzozy, opisanych powyżej.

PL 194 804 B1

Figura 7 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego rekombinanta Bet v 1 do IgE z osocza od grupy alergicznych pacjentów przez nie biotynylowane Bet v 1 i przez mutanta Glu60Ser Bet v 1. W przeciwieństwie do mutantów Glu60Ser, Pro108Gly i Asn28Thr + Lys32Gln, substytucja kwasu glutaminowego w pozycji 60 na serynę nie wywoływała żadnych znaczących zmian we właściwościach wiązania IgE. Wskazuje to, że substytucja poza zdefiniowanymi obszarami wspólnymi dla Fagales wywiera tylko marginalny wpływ na wiązanie swoistych IgE z osocza, co potwierdza koncepcję, że konserwowane powierzchnie cząsteczki alergenu zawierają dominujące epitopy wiążące IgE.

Mutant trój-obszarowy Bet v 1

U mutanta trój-obszarowego punktowe mutacje (Glu45Ser, Asn28Thr + Lys32Gln i Pro108Gly) wprowadzone do trzech różnych obszarów wspólnych u Fagales, opisanych powyżej, zostały jednocześnie wprowadzone w celu utworzenia sztucznego mutanta przenoszącego cztery substytucje aminokwasów.

Strukturalna analiza mutanta trój-obszarowego Bet v 1

Strukturalną integralność oczyszczonego mutanta trój-obszarowego analizowano przy pomocy spektroskopii dichroizmu kołowego (CD). Fig. 8 przedstawia spektra CD rekombinanta i mutanta trój-obszarowego, mierzone przy prawie równych stężeniach. Nakładanie się szczytów amplitud i pozycji w spektrach CD z dwóch zrekombinowanych białek pokazuje, że dwa preparaty zawierają prawie równe ilości struktur drugorzędowych, co silnie sugeruje, że wprowadzone substytucje aminokwasów nie wpływają na trzeciorzędowa strukturę a-węglowego szkieletu.

Własności wiązania IgE przez mutanta trój-obszarowego Bet v 1

Własności wiązania IgE przez mutanta trój-obszarowego Bet v 1 porównano z rekombinantem Bet v 1 w oznaczeniu w fazie płynnej inhibicji IgE przy użyciu IgE ze zbiorczego osocza pochodzącego od pacjentów z alergią na pyłek brzozy, opisanych powyżej.

Figura 9 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 z IgE osocza od grupy alergicznych pacjentów przez nie biotynylowane Bet v 1 i przez mutanta trój-obszarowego Bet v 1. W przeciwieństwie do pojedynczego mutanta opisanego wyżej, krzywa inhibicji mutanta trój-obszarowego nie jest równoległa w stosunku do krzywej rekombinanta. Pokazuje to, że substytucje wprowadzone u mutanta trój-obszarowego zmieniły własności wiązania IgE i profil epitopu w porównaniu z rekombinantem. Brak równoległego przebiegu utrudnia ilościową ocenę spadku powinowactwa mutanta trój-obszarowego w stosunku do specyficznych IgE osocza.

Zrekombinowany Bet v 1 osiąga 50% inhibicji przy około 6 ng, podczas gdy odpowiadające stężenie dla mutanta trój-obszarowego Bet v 1 wynosi 30 ng, to znaczy zmniejsza powinowactwo 5-krotnie. Jednak, w celu osiągnięcia 80% inhibicji odpowiednie ilości wynoszą odpowiednio 20 ng i 400 ng, co oznacza spadek 20-krotny.

Oznaczenie proliferacji komórek T przy użyciu mutanta trój-obszarowego Bet v 1

Analizę przeprowadzono tak, jak to opisano w publ. 15. Stwierdzono, że mutant trój-obszarowy Bet v 1 miał zdolność indukowania proliferacji linii komórek T od trzech różnych pacjentów z alergią na pyłek brzozy, ze stymulacją o wskaźnikach podobnych jak u rekombinanta i naturalnie pojawiającego się mutanta. Sugeruje to, że mutant trój-obszarowy może inicjować komórkową odpowiedź immunologiczną niezbędną do produkcji przeciwciał.

P r z y k ł a d 2

Identyfikacja wspólnych epitopów antygenu 5 głównego alergenu jadu Vespula vulgaris

Antygen 5 jest jednym z trzech białek jadu osy, które są znane jako alergeny ludzkie. Osowate obejmują szerszenie, pszczoły i osy. Dwa inne, znane alergeny jadu osowatych to fosfolipaza A1 i hialuronidaza. Antygen 5 osy zwyczajnej został sklonowany i wykazywał ekspresję jako zrekombinowane białko w układzie drożdży (Monsalve i inni 1999, publ. 22). Trójwymiarowa struktura krystaliczna zrekombinowanego Ves v 5 została ostatnio określona z rozdzielczością 1,8 A (w preparacie). Głównymi właściwościami struktury są cztery nici β i cztery a-helisy ułożone w trzy nakładające się warstwy tworzące „a-b-a sandwicz”. Identyczność sekwencji między antygenem 5 homologicznych alergenów od różnych gatunków osy wynosi około 90%, co sugeruje obecność konserwowanych obszarów powierzchni cząsteczki i epitopów komórek B.

Obecność i identyfikacja wspólnych obszarów została przeprowadzona po uszeregowaniu wszystkich znanych sekwencji aminokwasów, jak to uprzednio opisano dla trzech alergenów pyłkowych, antygenu 5 alergenów Vespula w połączeniu z analizą powierzchni cząsteczki antygenu 5, ujawnionej przez trójwymiarową strukturę Ves v 5.

PL 194 804 B1

Figura 10 przedstawia dostępność do rozpuszczalnika indywidualnie uszeregowanych reszt antygenu 5 i uszeregowanie sekwencji antygenu 5 (lewy panel). Prawy panel pokazany na fig. 10 przedstawia powierzchnię cząsteczki antygenu 5 z konserwowanymi obszarami antygenu 5:s Vespula, które zabarwiono.

Selekcja reszt aminokwasowych do miejscowej ukierunkowanej mutagenezy

Reszty aminokwasowe do miejscowo ukierunkowanej mutagenezy zostały wybrane spośród reszt umiejscowionych w obszarach wspólnych dla Vespula, jako że spodziewano się, że ich modyfikacja wpłynie na wiązanie IgE osocza większości pacjentów wykazujących kliniczną, alergiczną reaktywność krzyżową w stosunku do Vespula.

Względna orientacja i procent ekspozycji każdego aminokwasu w odpowiednim obszarze obliczano na podstawie ich współrzędnych atomowych. Reszty mające niski stopień ekspozycji na rozpuszczalnik nie były uznane za odpowiednie do mutagenezy, w związku z możliwym zniekształceniem struktury lub brakiem interakcji z przeciwciałem. Pozostałe reszty były oceniane zgodnie ze stopniem ich ekspozycji na rozpuszczalnik.

Klonowanie genu kodującego Ves v 5

Całkowite RNA izolowano z jadu kwaśnych gruczołów osy Vespula vulgaris zgodnie z opisem w publ. 23 (Fang i inni 1988).

Synteza pierwszej nici DNA, amplifikacja technika PCR i klonowanie genu Ves v 5 przeprowadzono zgodnie z opisem w publ. 24 (Lu i inni 1993).

Subklonowanie do pPICZaA

Gen kodujący Ves v 5 był następnie subklonowany do wektora pPICZaA (Invitrogen) w celu sekrecyjnej ekspresji Ves v 5 u Pichia pastoris. Gen był amplifikowany techniką PCR i subklonowany do ramki zawierającej sekwencje kodujące sygnał sekrecji czynnika a Saccharomyces cerevisiae. W konstrukcie tym czynnik a jest rozszczepiany, in vivo, przez system proteaz Kex2 Pichia pastoris podczas sekrecji białka.

W skrócie, reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu Ves v 5 jako matrycy i primerów odpowiadających odpowiednio końcowi aminowemu i karboksylowemu białka. Primery rozciągały się w końcu 5' w celu objęcia miejsc restrykcyjnych dla klonowania, EcoRl i XbaI, odpowiednio. Nukleotydy kodujące miejsca rozszczepień Kex2 znajdowały się w tym konstrukcie w odległości 18 nukleotydów, zgodnie z kierunkiem, w stosunku do końca aminowego białka, czego efektem była ekspresja Ves v 5 z sześcioma dodatkowymi aminokwasami, Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe, w końcu aminowym.

Wprowadzenie pPICZaA- Ves v 5 do P. pastoris

Wektory pPICZaA z wprowadzonym genem Ves v 5 były linearyzowane poprzez restrykcję i insercję do miejsca AOX1 w genomie Pichia pastoris. Insercję przeprowadzono poprzez homologiczną rekombinację na komórkach KM71 Pichia pastoris zgodnie z zaleceniami firmy Invitrogen.

Mutageneza in vitro

Mutageneza in vitro została przeprowadzona przy zastosowaniu technologii PCR używając rekombinanta pPICZaA- Ves v 5 wprowadzonego jako matryca. Każdy mutant genu Ves v 5 utworzony został w 3 reakcjach PCR przy zastosowaniu 4 primerów.

Dwa primery oligonukleotydowe specyficzne dla mutacji zostały zsyntetyzowane zawierając każdą mutację, jedną dla każdej nici DNA., patrz fig. 11 i 12. Stosując zmutowany(e) nukleotyd(y) jako punkty startu, oba primery zawierały 6-7 nukleotydów w końcu 5' i 12-13 nukleotydów w końcu 3'. Nukleotydy te miały identyczne sekwencje, jak w genie Ves v 5 w danym rejonie.

Dwa możliwe do zastosowania primery (określane jako „całe sensowne” i „całe nonsensowne” na fig. 12) były dalej syntetyzowane i użyte u wszystkich mutantów. Aby zapewnić ekspresję mutantów Ves v 5 z autentycznym końcem aminowym, jeden primer odpowiadający końcowi aminowemu białka rozciągał się w końcu 5' z miejscem Xho I. Po insercji genów mutanta Ves v 5 do wektora pPICZaA, miejsce rozszczepienia przez proteazę Kex2 było odtwarzane bezpośrednio, zgodnie z kierunkiem końca aminowego Ves v 5. Sekwencja drugiego primera odpowiadała sekwencji rejonu wektora pPICZaA usytuowanego w przybliżeniu 300 pz (par zasad), niezgodnie z kierunkiem polimeryzacji od genu Ves v 5. Sekwencja primera odpowiadającego końcowi aminowemu Ves v 5 pochodziła od nici sensownej, a sekwencja primera niezgodnego z kierunkiem polimeryzacji pochodziła od nici nonsensownej, patrz fig. 11.

Zasadniczo przeprowadzono dwie niezależne reakcje PCR zgodnie z procedurą standardową (Saiki i inni 1988, publ. 20) z takim wyjątkiem, że przeprowadzono tylko 20 cykli temperaturowych w celu zmniejszenia częstości błędów technologii PCR. W każdej reakcji PCR stosowano pPICZaA- Ves v 5,

PL 194 804 B1 wprowadzonych jako matryca oraz jednego specyficznego dla mutacji i ogólnie możliwego do zastosowania primera w istotnych kombinacjach.

Produkty reakcji PCR oczyszczone zostały przy użyciu „Concert, Rapid PCR Purification System” (Life Technologies). Trzecią reakcję PCR przeprowadzono stosując łączone produkty PCR z dwóch pierwszych reakcji PCR jako matrycę i oba ogólnie możliwe do zastosowania primery. Znów, zastosowano 20 cykli standardowej techniki PCR. Produkt PCR został oczyszczony technologią „Concert, Rapid PCR Purification System” (Life Technologies), po którym nastąpiło cięcie enzymami restrykcyjnymi (XhoI/XbaI)) i kierunkowa ligacja do wektora pPICZaA ciętego tymi samymi enzymami. Figura 13 przedstawia przegląd wszystkich mutacji Ves v 5.

Wprowadzenie mutantów pPICZaA- Ves v 5 do P. pastoris

Wektory pPICZaA z wprowadzonymi zmutowanymi genami Ves v 5 były linearyzowane przez restrykcję Sac I i wprowadzone w miejsce AOXI w genomie Pichia pastoris. Insercje przeprowadzono przez homologiczną rekombinację w komórkach KM71 Pichia pastoris, zgodnie z zaleceniem firmy Invitrogen.

Sekwencjonowanie nukleotydów

Wyznaczenie sekwencji nukleotydowej genu kodującego Ves v 5 przeprowadzono odpowiednio przed i po subklonowaniu oraz po mutagenezach in vitro.

Plazmidowe DNA z 10 ml kultury bakteryjnej, która wzrastała do nasycenia przez całą noc w środowisku LB uzupełnionym 0,1 g/1 ampicyliny, zostało oczyszczone na kolumnach Qiagen-tip 20 i było sekwencjonowane przy użyciu zestawu do sekwencjonowania DNA (USB), zgodnie z zaleceniem dostawców.

Ekspresja i oczyszczenie zrekombinowanego Ves v 5

Zrekombinowane komórki drożdży szczepu KM71 Pichia pastoris wzrastały w 500 ml butelkach zawierających 10 ml buforu fosforanowego o pH 6,0, który zawierał podłoże azotowe dla drożdży, biotynę, glicerol i histydynę, i były wstrząsane w 30°C przy ruchu kolistym 225 obr/min do A₅00 nm z 4-6. Komórki zbierano przez wirowanie i ponowne zawieszenie w 10 ml podobnego buforowanego środowiska, zawierającego metanol zamiast glicerol. Inkubację kontynuowano w 30°C przez 7 dni, dodając codziennie 0,05 ml metanolu.

Komórki były oddzielane poprzez wirowanie, a zebrany z kultury płyn był zagęszczany poprzez ultrafiltrację. Po dializie przeciw 50 mM buforowi octanu amonowego, pH 4,6, próbkę umieszczono w kationowej kolumnie SE-53 FPLC (Pharmacia), zrównoważoną w tym samym buforze. Kolumna była eluowana przez 0-1,0 M NaCl w liniowym gradiencie 50 mM octanu amonowego. Szczyty elucyjne zrekombinowanego Ves v 5 w ok. 0,4 M NaCl były zbierane i dializowane przeciwko 0,02 N kwasowi octowemu. Po zagęszczeniu to około 10 mg/ml, oczyszczony Ves v 5 był przechowywany w temperaturze 4°C.

Krystalizacja zrekombinowanego Ves v 5

Kryształy Ves v 5 wzrastały dzięki technice dyfuzji gazowej w 25°C. W celu krystalizacji, 5 ml 5mg/ml Ves v 5 mieszano z 5 ml 18% PEG 6000, 0,1 M cytrynianu sodu, pH 6,0 i równoważono przeciw 1 ml 18% PEG 6000, 0,1 M cytrynianowi sodu, pH 6,0.

Dane dyfrakcji promieni X były zbierane przy 100K od natywnych kryształów Ves v 5 i po inkorporacji pochodnych ciężkiego atomu, i zostały użyte do wyjaśnienia trójwymiarowej struktury Ves v 5, patrz fig. 10 (manuskrypt w przygotowaniu).

Immunoelektroforeza przy zastosowaniu króliczych przeciwciał poliklonalnych

Dwa mutanty Ves v 5 utworzono jako zrekombinowane białka Ves v 5 i dalej testowano na ich reaktywność w stosunku do króliczych przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciwko zrekombinowanemu Ves v 5. Podczas analizy przy zastosowaniu immunoelektroforezy („rocket”) w natywnych warunkach, przeciwciała królicze były zdolne do wytrącania zrekombinowanego Ves v 5 jak również do dwóch mutantów co wskazuje, że mutanty posiadają zakonserwowaną trzeciorzędowa strukturę a-węglowego szkieletu.

Inhibicja specyficznych IgE osocza

Własności wiązania IgE przez mutanty Ves v 5 zostały porównane z własnościami zrekombinowanego Ves v 5 w oznaczeniu inhibicji IgE w płynnej fazie przy użyciu IgE ze zbiorczego osocza pochodzącego od pacjentów z alergią na jad os.

Oznaczenie inhibicji przeprowadzono jak to opisano wyżej, używając biotynylowanego rekombinanta Ves v 5 zamiast Bet v 1.

PL 194 804 B1

Mutant Lys72Ala Ves v 5

Lizyna w pozycji 72 wykazuje wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (70%) i jest umiejscowiona w obszarze na powierzchni cząsteczki, wspólnej dla antygenu 5 Vespula. Względna orientacja i wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik przemawiają za tym, że lizyna 72 może być zastąpiona resztą alaniny bez zniekształcania trzeciorzędowej struktury a-węglowego szkieletu. Dodatkowo, ponieważ żadna z naturalnie występujących sekwencji izoalergenu nie posiada alaniny w pozycji 72, substytucja lizyny alaniną jest źródłem nienaturalnie występującej cząsteczki Ves v 5.

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Lys72Ala Ves v 5

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Lys72Ala Ves v 5 porównano ze zrekombinowanym Ves v 5 w oznaczeniu inhibicji IgE w fazie płynnej przy użyciu IgE zbiorczego osocza pochodzącego od pacjentów z alergią na jad osy, jak opisano powyżej.

Figura 14 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Ves v 5 z IgE osocza pochodzącego od grupy alergicznych pacjentów przez nie-biotynylowane Ves v 5 i przez mutanta Lys72Ala Ves v 5.

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek niezbędnych do osiągnięcia 50% inhibicji wiązania IgE osocza obecnych w zbiorczym osoczu. Zrekombinowane Ves v 5 osiąga 50% inhibicji przy około 6 ng, podczas gdy odpowiadające stężenie dla mutanta Lys72Ala Ves v 5 wynosi około 40 ng.

Pokazuje to, że punktowe mutacje wprowadzone do mutanta Lys72Ala Ves v 5 obniżają powinowactwo do specyficznych IgE osocza około 6-krotnie. Maksymalny poziom inhibicji osiągany przez mutanta Lys72Ala Ves v 5 jest wyraźnie niższy w porównaniu z rekombinantem Ves v 5. Może to wskazywać, że po substytucji Lys72Ala, część specyficznych IgE występujących w osoczu nie jest zdolna do rozpoznania mutanta Lys72Ala Ves v 5.

Mutant Tyr96Ala Ves v 5

Tyrozyna w pozycji 96 wykazuje wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (65%) i jest umiejscowiona w obszarze na powierzchni cząsteczki, wspólnej dla antygenu 5 Vespula. Względna orientacja i wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik przemawiają za tym, że tyrozyna 96 może być zastąpiona resztą alaniny bez zniekształcania trzeciorzędowej struktury a-węglowego szkieletu. Dodatkowo, ponieważ żadna z naturalnie występujących sekwencji izoalergenu nie posiada alaniny w pozycji 96, substytucja tyrozyny alaniną jest źródłem nienaturalnie występującej cząsteczki Ves v 5.

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Tyr96Ala Ves v 5

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Tyr96Ala Ves v 5 porównano ze zrekombinowanym Ves v 5 w oznaczeniu inhibicji IgE w fazie płynnej przy użyciu IgE zbiorczego osocza pochodzącego od pacjentów z alergią na jad osy, jak opisano powyżej.

Figura 14 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Ves v 5 z IgE osocza pochodzącego od grupy alergicznych pacjentów przez nie-biotynylowane Ves v 5 i przez mutanta Tyr96Ala Ves v 5.

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek niezbędnych do osiągnięcia 50% inhibicji wiązania IgE osocza występujących w zbiorczym osoczu. Zrekombinowane Ves v 5 osiąga 50% inhibicji przy około 6 ng, podczas gdy odpowiadające stężenie dla mutanta Tyr96Ala Ves v 5 wynosi około 40 ng. Pokazuje to, że punktowe mutacje wprowadzone do mutanta Tyr96Ala Ves v 5 obniżają powinowactwo do specyficznych IgE osocza około 6-krotnie. Maksymalny poziom inhibicji osiągany przez mutanta Tyr96Ala Ves v 5 jest wyraźnie niższy w porównaniu z rekombinantem Ves v 5. Może to wskazywać, że po substytucji Tyr96Ala, część specyficznych IgE występujących w osoczu nie jest zdolna do rozpoznania mutanta Tyr96Ala Ves v 5.

Publikacje

1. WO 97/30150 (Pangenetics B.V., Molecules for the induction of immunological tolerance).

2. WO 92/02621 (Biomay Biotechnik Produktions - und Handelsgesellschaft mbH, Allergens of Alder pollen and applications thereof).

3. WO 90/11293 (ΐΓΠΓηυηο^ίβΡίΊθΠΌθοβυΙίοθΙ Cotpotation. The University of North Carollna at Chapel Hill, Allergenic proteins from ragweed and uses thereof).

4. Takai T, Yokooa T, Yasue M, Nishiyama C, Yuuki T, Mori A, Okudaira H, Okumura Y: „Engineering of the major house dust mite allergen Der f 2 for allergen-specific immunotherapy”. Nat Biotechnol 15, 754-758 (1997).

5. Smith AM, Chapman MD: „Locallzation of antigenic sites on Der p 2 using oligonucleotide-directed mutagenesis targeted to predicted surface residues”. Clin Exp Allergy 27, 593-599 (1997).

PL 194 804 B1

6. Aki T, Ono K, HidakaY, ShimonishiY, Jyo T, Wada T, YamashitaM, Shigeta S, Murooka Y, Oka S: „Strrctrre of IgE epitopes oo s oew 39-kD sllergeo molecrle from the horse drst mite, Dermatophagoides farinae. lot Arch Allergo Immrool 103, 357-364 (1994).

7. Forster E, Drdler T, Gmschl M, Aberer W, Urbsoek R, Srter M: „Nstrrsl sod recombiosot eozomsticsllo sctive or iosctive bee veoom phohpholipshe A2 hss the ssme poteocy to relesse histsmioe from bshophilh io pstieoth with Homeoopters sllergo. J Allergo Clio Immrool 95, 1229-1235 (1995).

8. Brrks AW, Shio D, Cockrell G, Stsoleo JS, Helm RM, Bsoooo GA: „Msppiog sod mrtstioosl soslosis of the IgE-biodiog epitopes oo Ars h 1, s legrme vicilio proteio sod s msjor sllergeo io pesort hoperseositivito. Err J Biochem 245, 334-339 (1997).

9. Stsoleo JS, Kiog N, Brrks AW, Hrsog SK, Ssmpsoo H, Cockrell G, Helm RM, West CM, Bsoooo GA: „Ideotificstioo sod mrtstioosl soslosis of the immrooaomiosot IgE biodiog epitopes of the msjor pesort sllergeo Ars h 2. Arch Biochem Biophos 342, 244-253 (1997).

10. Ferreirs F, Rohlfs A, Hoffmsoo-Sommererrber K, Scheok S, Eboer C, Brizs P, Jilek A, Krsft D, Breiteobsch M, Scheioer O: „Moarlstioo of IgE-biodiog properties of tree polleo sllergeos bo site-directea mrtseeoesis. Adv Exp Med Biol 409,127-135(1996).

11. Ferreirs F, Eboer C, Krsmer B, Csssri G, Brizs P, Krogi AJ, Grimm R, ysh-Schmia B, Breiteoeder H, Krsft D, Breiteobsch M, Rheioberger H-J, Scheioer O, „Moarlstioo of IgE resctivito of sllergeos bo site-directea mrtsgeoesis: Poteotisl rse of hopesllergeoic vsrisots for immrootherspo, FASEB Jorrosl for Experimeotsl Biologo Vol. 12, No. 2, Febrrsro 1998, 231-242 (1998).

12. Wiedemsoo P, Giehl K, Almo SC, Feaorov AA, Girvio M, Steioberger P, Rrdiger M, Ortoer M, Sippl M, Dolecek C, Krsft D, Jockrsch B, Vsleots R: „Molecrlsr sod strrctrrsl soslosis of s cootiorors birch profilio epitope defioed bo s mooocloosl sotiboao. J Biol Chem 271,29915-29921 (1996).

13. Alvsrez AM, Frkrhsrs E, Nsksse M, Adschi T, Aoki N, Nsksmrrs R, Mstsras T: „Forr rice seed cDNA clooes beloogiog to the slphs-smolsse/trypsio iohibitor geoe fsmilo eocode poteotisl rice sllergeos. Biosci Biotechool Biochem 59,1304-1308(1995).

14. Colombo P, Keooedo D, Rsmsasle T, Costs MA, Djro G, Izzo V, Sslvsaori S, Grerrioi R, Cocchisrs R, Mirisols MG, Wood S, Gersci D, Jorrosl of Immroologo Vol. 160, No. 6,15 Msrch 1998, 2780-2875.

15. Spsogfort MD, Ipseo H, Spsrholt SH, Assmrl-Olseo S, Lsrseo MR, M0rtz E, Roepstorff P, Lsrseo JN: „Chsrscterizstioo of Prrified Recombiosot Bet v 1 with Artheotic N-termiors, Clooed io Frsioo with Msltose-Biodiog Proteio. Prot Exp Prrificstioo 8, 365-373 (1996s).

16. Ipseo H, Wihl J-A, Peterseo BN, L0weosteio H: „Specificito msppiog of pstieots IgE respoose towsras the tree polleo msjor sllergeos Alo g I, Bet v I sod Cor s I Clio. Exp. Allergo 22, 391-9, (1992).

17. Gsjhede M, Osmsrk P, Porlseo FM, Ipseo H, Lsrseo JN, Joost vso Neerveo RJ, Schor C, L0wosteio H, sod Spsogfort MD: „X-rso sod NMR strrctrre of Bet v 1, the origio of birch polleo sllergo. Nstrre strrctrrsl biologo 3, 1040-1045 (1996).

18. Altschrl SF, Gish W, Miller W, Moers EW, sod Lipmso DJ: „Bssic locsl sligomeot sesrch tool. ,J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990).

19. Higgios D, Thompsoo J, Gibsoo T, Thompsoo JD, Higgios DG, sod Gibsoo TJ: „CLUSTAL W: improviog the seositivito of progressive mrltiple seqreoce sligomeot throrgh seqreoce weightiog, positioo-specific gsp peoslties sod weight mstrix choice. Nrcleic Acids Res. 22, 4673-4680 (1994).

20. Ssiki RK, Gelfsod DH, Stoffel S, Schsrf SJ, Higrchi R, Horo GT, Mrllis KB, Eriich HA: „Primer-directed eozomstic smplificstioo of DNA with s thermostsble DNA polomersse. Scieoce 239,487-491 (1988).

21. Spsogfort MD, Lsrseo JN, Gsjhede M: „Crostsllizstioo sod Prelimiosro X-rso Iovestigstioo st 2.0 A Resolrtioo of Bet v 1, s Birch Polleo Proteio Csrsiog IgE-Medisted Allergo. PROTEINS, Strrc Froc Geoet 26, 358-360 (1996b).

22. Moosslve RI, Lr G, sod Kiog TP: „Recombiosot veoom sllergeo, sotigeo 5 of oellowjscket (Vesprls vrlgsris) sod psper wssp (Polistes soorlsris) bo expressioo io bscteris or oesst (1999) Srbmitted.

23. Fsog KSF, Vitsle M, Fehloer P sod Kiog TP: „cDNA clooiog sod primsro strrctrre of s white-fsce horoet veoom sllergeo, sotigeo 5. Proc. Nstl. Acsd. Sci. USA 85, 895 (1988).

PL 194 804 B1

24. LuG, VillalbaM,CosciaMR, HoffmanDR and KingTP: SequenceAnalysisandAntigenic

Cross-reactivity sf n Vncsm Allnrgnc, Actlenc 5, frsm Osrantc, Wncpc, nad Ynllsw Jnekntc”. Jsercnl sf

Immeaslses 150, 2823-2830 (1993).

Claims

1. Zrenomainawana aleegen, zznmieenn tym, że j ent nienaturalnie występpjąccra raatantena pschsdzącym z gateralgiq wyctępejcenes alqreqge, w którym es gajmgiqj jqdga powiqrzehgiowo wyqkcpogowaga, kogcqrwowaga rqczta amigokwacowa cs gajmgiqj endanes sacznre kogcqrwowagyeh rnczt amigokwacowych cpójaln związagych an cs gajmgiqj 400A² powiqrzchgi trójwymiarowqj ctrektery czcctnczki alqreqge jnk skrnślsas an podctawiq doctępgośei rozpeczezalgika cs gajmgiqj w 20%, n wymiqgiogy sacznr zawiqra cs gajmgiqj jndna npitsp ksmórki B, zactąpioga jnct prznz Iaac recztę amigokwacową, która ain wyctępejn w tnj camqj pszycji w cqkwqgcji amigokwaców endanes zananes aiałka homoloeiczgqeo w saręain rzęde takcogomiczgqeo, z którees pschsdzi wymiqgiogy gateralgiq wyctępejący nlnrena, wymiqgiogy zmetowagy nlnrena mn zacadgiczo tę cama ctrekterę trznclorzędową a-węelowqeo czkinlnte, jnk tna gateralgiq wyctępejący nln^na, n wiązagiq cwsictych IeE ds zmetowagqeo alqreqge zmgiqjczogq jnct w porówgagie z wiązagiqm z wymiqgiogymi gateralgiq wyctępejącym alqreqgqm.

2. Zrqkomaigowagy alqreqg wndłee znctrz. 1, znamienny tym, en pschsdzi sd alqreqge ighalacyjgqeo.

3. Zrqkomaigowagy alqreqg wndłee znctrz. 2, znamienny tym, en pschsdzi sd alqreqge pyłkswnes.

4. Zrqkomaigowagy alqreqg wndłee znctrz. 3, znamienny tym, en pschsdzi sd alqreqge pyłkswnes pochodzącqeo z rzęde takcogomiczgqeo Fagales, Oleales lea Pinales.

5. Zrqkomaigowagy alqreqg wndłee znctrz. 4, znamienny tym, en pschsdzi sd Bet v 1.

6. Zrqkomaigowagy alqreqg wndłee znctrz. 5, znamienny tym, en ceactytecją jnct/ceactytecjami cą Acp25Gly, (Aca28Thr + Usc32GIc), Gle45enr, Acg47eqr, Usc55Acc, Thr77Aln, Prs108Gly lea (Aca28Thr, Usc32GIc, Gle45enr, Prs108Gly ).

7. Zrqkomaigowagy alqreqg wndłee znctrz. 3, znamienny tym, en pschsdzi sd alqreqge pyłkswnes pochodzącqeo z rzęde tnkcogomiczgqeo Poales.

8. Zrqkomaigowngy nlnrena wndłee znctrz. 3, znamienny tym, en pschsdzi sd nlnrenae pyłkswnes pochodzącqeo z rzęde tnkcogomiczgqeo Asterales lea Urticales.

9. Zrqkomaigowngy nlnrena wndłee znctrz. 2, znamienny tym, en pschsdzi sd nlnrenae roztoczy kerze dsmswnes.

10. Zrqkomaigowngy nlnrena wndłee znctrz. 9, znamienny tym, en pschsdzi sd nlqreqge roztoczy pochodzącqeo z Dermatophagoides.

11. Zrqkomaigowngy nlqrgqg wndłee znctrz. 2, znamienny tym, en pschsdzi sd nlnrgnae knrnlechn.

12. Zrqkomaigowngy nlnrena wndłee znctrz. 2, znamienny tym, en pschsdzi sd nlqreqge zwiqrzęcqeo.

13. Zrqkomaigowngy nlnrena wndłee znctrz. 12, znamienny tym, en pschsdzi sd nlqreqge zwiqrzęcqeo pochodzącqeo sd kstn, pcn lea ksain.

14. Zrqkomaiaownay nlnrena wndłee znctrz. 2, znamienny tym, en pschsdzi sd nlnrenae jnde.

15. Zrnkomaiaownay nlnrena wndłee znctrz. 14, znamienny tym, en pschsdzi sd nlnrenae jnde pochodzącneo z rzęde tnkcoaomiczaneo Hymenoptera.

16. Zrnkomaiaownay nlnrena wndłee znctrz. 15, znamienny tym, en pschsdzi sd nlnrenae jnde z rzęde tnkcoaomiczaneo Vespidae, Apidae i Formicoidae.

17. Zrnkomaiaownay nlnrena wndłee znctrz. 16, znamienny tym, en pschsdzi sd Ves v 5.

18. Zrnkomaiaownay nlnrena wndłee znctrz. 17, znamienny tym, en ceactytecją jnct Uyc72Aln lea Tyr96Aln.

19. Zrnkomaiaownay nlnrena, znamienny tym, en ezyckejn cię es psprznz:

n) skrnślnain rnczt nmiaokwncowych w anternlain wyctępejącym nlnrenain, którn cą ksacnrwswnan w więcnj aie w 70% wn wczyctkich zanaych ainłknch hsmslseiczaych w rzędzin tnkcsasmiczaym, z którnes pschsdzi wyminaisay anternlain wyctępejący nlnrena,

a) skrnślnain cs anjmainj jndanes sacznre ksacnrwswnaych rnczt nmiaskwnców, który jnct ściśln związnay z sacznrnm s przyanjmainj 400 A2 pswinrzchai trójwyminrswnj ctrektery cząctki nlnren20

PL 194 804 B1 nu, jak to zostało określone na podstawie dostępności rozpuszczalnika co najmniej w 20%, przy czym co najmniej jeden wymieniony obszar zawiera co najmniej jeden epitop komórki B, i

c) zastąpienie co najmniej jednej reszty aminokwasowej w wymienionym co najmniej jednym obszarze przez inny aminokwas, który nie występuje w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów każdego znanego białka homologicznego w obrębie rzędu taksonomicznego, z którego pochodzi wymieniony naturalnie występujący alergen, przy zasadniczo zachowanej całkowitej trzeciorzędowej strukturze a-węglowego szkieletu cząsteczki alergenu dla uzyskania zmutowanego alergenu, w którym wiązanie swoistego IgE ze zmutowanym alergenem jest zmniejszone w porównaniu z naturalnie występującym alergenem.

20. ZreSombinywasy aleegge weeług zzstyz. j9,znamienny tym, żż wiązzaie swoistyyh I gE do zmutowanego alergenu jest zmniejszone co najmniej o 5%, a korzystnie co najmniej 9 0%.

29. Zrekombinowany alergen według zastrz. 99, albo 20, naaminaay tym, że gdy porównuje się trzeciorzędową strukturę a-węglowego szkieletu mutanta z naturalnie występującą cząsteczką alergenu, to odchylenie standardowe współrzędnych atomowych wynosi poniżej 2A.

22. Zrekombinowany alergen według zastrz. 99, naaminaay tym, że co najmniej jeden wymieniony obszar zawiera atomy 95-25 reszt aminokwasowych.

23. Zrekombinowany alergen według zastrz. 99, albo 20, albo 29, albo 22, naaminaay tym, że reszty aminokwasowe co najmniej jednego wymienionego obszaru uszeregowano ze względu na dostępność rozpuszczalnika, i jeden lub więcej aminokwasów o największej dostępności rozpuszczalnika uległy substytucji.

24. Zrekombinowany alergen według zastrz. 23, naaminaay tym, że jedna lub więcej reszt aminokwasowych co najmniej jednego wymienionego obszaru mających dostępność do rozpuszczalnika 20-80% ulega substytucji.

25. Zrekombinowany alergen według zastrz. 99, albo 20, albo 29, albo 22, albo 23, albo 24, naaminaay tym, że 9-5 reszt aminokwasowych na obszarze 400 A²w co najmniej jednym wymienionym obszarze ulega substytucji.

26. Zrekombinowany alergen według zastrz. 99, albo 20, albo 29, albo 22, albo 23, albo 24, albo 25, naaminaay tym, że substytucja jednej lub więcej reszt aminokwasowych w wymienionym epitopie komórki B lub co najmniej jednym wymienionym obszarze przeprowadzana jest poprzez miejscowo ukierunkowaną mutagenezę.

27. Zrekombinowany alergen według zastrz. 99, albo 20, albo 29, albo 22, albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, naaminaay tym, że pochodzi od alergenów inhalacyjnych.

28. Zrekombinowany alergen według zastrz. 27, naaminaay tym, że pochodzi od alergenu pyłkowego.

29. Zrekombinowany alergen według zastrz. 28, naaminaay tym, że pochodzi od alergenu pyłkowego pochodzącego z rzędu taksonomicznego Fagales, Oleales lub Pinales.

30. Zrekombinowany alergen według zastrz. 29, naaminaay tym, że pochodzi od Bet v 9.

39. Zrekombinowany alergen według zastrz. 30, naaminaay tym, że co najmniej jedna reszta aminokwasowa wymienionego epitopu komórki B lub co najmniej jednego wymienionego obszaru ulega substytucji.

32. Zrekombinowany alergen według zastrz. 30, naaminaay tym, że substytucji ulegają Asp25Gly, (Asn28Thr + Lys32Gln), Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Thr77Ala, Pro908Glyl lub (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro908Gly ).

33. Zrekombinowany alergen według zastrz. 28, naaminaay tym, że pochodzi od alergenu pyłkowego pochodzącego z rzędu taksonomicznego Poales.

34. Zrekombinowany alergen według zastrz. 28, naaminaay tym, że pochodzi od alergenu pyłkowego pochodzącego z rzędu taksonomicznego Asterales lub Urticales.

35. Zrekombinowany alergen według zastrz. 27, naaminaay tym, że pochodzi od alergenu roztoczy kurzu domowego.

36. Zrekombinowany alergen według zastrz. 35, naaminaay tym, że pochodzi od alergenu roztoczy pochodzących z Dermatophagoides.

37. Zrekombinowany alergen według zastrz. 27, naaminaay tym, że pochodzi od alergenu karalucha.

38. Zrekombinowany alergen według zastrz. 27, naaminaay tym, że pochodzi od alergenu zwierzęcego.

39. Zrekombinowany alergen według zastrz. 38, naaminaay tym, że pochodzi od alergenu zwierzęcego pochodzącego od kota, psa lub konia.

PL 194 804 B1

40. Zrekombinowany alergen według zastrz. 27, znamienny tym, że pochodzi od alergenu jadu.

41. Zrekkmbinowanyalerggn weeługzzattz. 44, zznmieenn tym, Zż ppoChddi od alerggnu jaau pochodzącego z rzędu taksonomicznego Hymenoptera.

42. Zrgnc>mbinowano zle^ge weełuu zć^^tt^. 01, zznmieenn tym, Zż ΟΡε^ΜοσΙ^ od ζΙθ^πο ućrn^u z rzędu taksonomicznego Vespidae, Apidae i Formicoidae.

43. Zrekombinowany alergen według zastrz. 42, znamienny tym, że pochodzi od Ves v 5.

44. Zrekombinoweno ale^en według zza^r. 40, albo 44, albo 44, albo 43, znamienny tym, że co najmniej jeden aminokwas ulega substytucji.

45. Zrekombinowany alergen według zastrz. 43, znamienny tym, że tą substytucją jest Lys72Ala lub Tyr96Ala.

46. Sppdóborgzygtowewenia zr^d^c^r^t^k^u^v^^r^^e^o alergenu w^n^^^ęj Οtórgegk.olwien o zalta. 0,45. znamienny tym, że obejmuje

a) okcenlenin oedzz aminokwanowech w naruęaleie weytępująccm al<^rc^^ni<^, które są ^ηί5βί^οwane w więcej niż w 70% we wszystkich znanych białkach homologicznych w rzędzie taksonomicznym, z którego pochodzi wymieniony naturalnie występujący alergen,

b) okcenlenin co n^jr^ni¢^rjaerιueo obszaru konuerwowenu^,ch zeesz aminokwaitów, który j Zciśle związany z obszarem o przynajmniej 400 A² powierzchni trójwymiarowej struktury cząstki alergenu, jak to zostało określone na podstawie dostępności rozpuszczalnika co najmniej w 20%, przy czym co najmniej jeden wymieniony obszar zawiera co najmniej jeden epitop komórki B, i

c) zastąpienie co nańmniej jednej reszty aminokwasower w wymienionym co nańmniej jednym obszarze przez inny aminokwas, który nie występuje w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów każdego znanego białka homologicznego w obrębie rzędu taksonomicznego, z którego pochodzi wymieniony naturalnie występujący alergen, przy zasadniczo zachowanej całkowitej trzeciorzędowej strukturze α-węglowego szkieletu cząsteczki alergenu dla uzyskania zmutowanego alergenu, w którym wiązanie swoistego IgE ze zmutowanym alergenem jest zmniejszone w porównaniu z naturalnie występującym alergenem.

47. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że uszeregowano reszty aminokwasowe co najmniej jednego wymienionego obszaru ze względu na dostępność rozpuszczalnika i możliwość substytucji jednego lub więcej aminokwasów spośród tych o największym stopniu dostępności.

48. Sposób według zastrz. 46, albo 47, znamienny tym, że substytucja jednego lub kilku aminokwasów w wymienionym epitopie komórki B lub co najmniej jednym wymienionym obszarze przeprowadzana jest przez miejscowo ukierunkowana mutagenezę.

49. Zrekombinowany alergen według któregokolwiek z zastrz. 1-48, znamienny tym, że ma zastosowanie farmaceutyczne.

50. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera zrekombinowany alergen, według któregokolwiek z zastrz. 1-48, opcjonalnie w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub rozczynnikiem, i opcjonalnie z adiuwantem.

51. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że jest w postaci szczepionki przeciw reakcjom alergicznym wywoływanym przez naturalnie występujący alergen u pacjentów cierpiących na alergię.

52. Zastosowanie zrekombinowanego alergenu według któregokolwiek z zastrz. 1-45, do przygotowywania leku do wywoływania odpowiedzi immunologicznej u osobnika.

53. Sposób otrzymywania kompozycji farmaceutycznej według zastrz. 50, albo 51, znamienny tym, że miesza się co najmniej jeden zrekombinowany alergen według któregokolwiek z zastrz. 1-45 z farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami i/lub rozczynnikami.

54. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że otrzymana jest sposobem według zastrz. 53.

55. Zastosowanie zrekombinowanego alergenu według któregokolwiek z zastrz. 1-45, do przygotowywania leku do leczenia, zapobiegania lub osłabiania reakcji alergicznych.