CN1332029C - 突变的重组过敏原 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新的重组过敏原。该过敏原是来自天然存在的过敏原的非天然突变体。其基本上保留了总体α-碳骨架的三级结构。还公开了制备该重组过敏原的方法及其用途。

Description

突变的重组过敏原
发明领域
本发明涉及新型重组过敏原，它是来自天然存在的过敏原的非天然存在的突变体。另外，本发明涉及制备该重组过敏原的方法，还涉及含有该重组过敏原的药用组合物，包括疫苗。在另一实施方案中，本发明涉及在受试者中产生免疫应答，接种或治疗受试者的方法以及制备本发明的组合物的方法。
发明背景
遗传上易感的个体可被个体所接触的各种环境来源产生的抗原或过敏原致敏(过敏反应)。当以前致敏的个体再接触相同或同源的过敏原时发生过敏反应。过敏反应的范围从枯草热，鼻传导疾病，鼻炎和哮喘到全身性过敏病和由于，例如，蜜蜂或大黄蜂螯伤或昆虫咬伤引起的死亡。该反应是即时的且可由各种特异反应性过敏原引起，例如，由草类，树木，杂草，昆虫，食物，药品，化学试剂和香水产生的化合物。
然而，当个体首次接触过敏原时不出现这类反应。开始的适应性应答需要时间且通常不引起任何症状。但当已产生能与过敏原反应的抗体和T细胞时，任何随后的接触可能激发症状。因此，过敏反应表明免疫应答本身可引起威胁生命的重大病理学状态。
特异反应性过敏反应涉及的抗体主要属于IgE型免疫球蛋白。IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的特异性受体结合。特定的过敏原与结合于肥大细胞上的IgE形成复合物后，受体在细胞表面交联，导致通过该受体产生信号传导和靶细胞的生理反应。脱粒导致释放组胺，肝素，嗜酸性白细胞趋化因子，白三烯C4，D4和E4，它们引起支气管平滑肌细胞持续收缩。在自然情况下产生的效应可以是全身性的或是局部的。
抗体介导的过敏性反应可分成4类，即I型，II型，III型和IV型。I型过敏反应是典型的即时过敏反应，在接触抗原后几秒或几分钟内发生。这些症状由过敏原特异性IgE介导。
通常，观察到的过敏反应是对存在于诸如花粉，室内粉尘螨，动物毛发和头皮屑，毒液和食品中的蛋白质过敏原发生的反应。
为了减小或消除过敏反应，通常使用仔细控制和重复地施用过敏反应疫苗。传统上经过肠胃外，鼻内或舌下用药进行过敏反应疫苗接种，在相当长的时间期间内不断增加剂量，导致病人脱敏。尚未知道精确的免疫学机制，但据认为在过敏原特异性T细胞表型方面诱导的差异特别重要。
结合抗体的表位(B-细胞表位)
Fab-抗原复合物的X-射线晶体学分析增进了对结合抗体的表位的了解。根据这类分析，结合抗体的表位可定义为含有15-25个氨基酸残基的原子的抗原表面部分，它们在与能直接相互作用的抗体原子保持在一定的距离内。抗原-抗体相互作用的亲和性不能单独从范德华相互作用，氢键或离子键产生的焓来推测。其能量贡献的大小相似于水分子从界面几乎完全脱去所需的熵。这意味着相互作用的分子外形之间的完全匹配是进行抗原-抗体高亲和性相互作用的主要因素。
过敏反应的疫苗接种
疫苗接种的概念以免疫系统的两个基础特征，即特异性和记忆性为基础。疫苗接种引发受体的免疫系统，当重复接触相似蛋白时，免疫系统将诸如微生物感染之类的攻击发生更强烈的应答。疫苗是用于接种以在受体中产生这种保护性免疫反应的蛋白混合物。保护仅包括存在于疫苗中的成份和同源抗原。
与其它类型的疫苗接种相比，过敏反应接种由于在过敏反应病人中存在正进行的免疫反应而复杂化。这种免疫反应的特征在于存在过敏原特异性IgE，当接触过敏原时介导过敏反应症状出现。因此，使用来自天然来源的过敏原进行过敏反应接种具有内在的危险，其副作用的最坏后果可能会威胁患者的生命。
围绕该问题的研究方法可分成3类。在实际中常结合使用多类方法。第一类方法包括在较长的时间内施用一些小剂量以达到较大的累积剂量。第二类方法包括将过敏原掺入诸如氢氧化铝的胶体物质中对过敏原进行物理修饰。氢氧化铝制剂具有佐剂效应和延缓过敏原释放以降低活性过敏原成份的组织浓度的贮藏效应。第三类方法包括化学修饰过敏原以降低过敏原性，即IgE结合。
成功的过敏反应接种的详细机制还存在争议。然而，已认可T细胞在免疫反应的总体调节中起关键作用。根据目前的共识，T细胞的两种极端表型，Th1和Th2之间的关系决定了个体的过敏反应状态。当用过敏原刺激时，Th1细胞分泌白细胞介素，主要是干扰素-γ，导致保护性免疫，且该个体是健康的。另一方面，Th2细胞主要分泌白细胞介素4和5，导致IgE合成和嗜曙红细胞增多，且该个体是过敏性的。体外研究表明，用含相关T细胞表位的肽衍生的过敏原攻击有可能改变过敏原特异性T细胞的反应。因此目前对新的过敏反应疫苗的研究主要以针对T细胞为基础，目的在于使T细胞(过敏反应诱导)沉默或使反应从Th2表型转换为Th1表型。
在WO 97/30150(参考文献1)中要求保护一群蛋白质分子，该蛋白质分子与亲本蛋白质相比在氨基酸序列中分布着特定的突变。根据其说明书，似乎该发明涉及产生与亲本蛋白质相比修饰过的类似物，但它们与亲本蛋白质(天然存在的过敏原)以相同的方式被吸收，消化并呈递给T细胞。因此，得到有所改变的T细胞反应。修饰的蛋白质文库使用称为PM(简约原则的诱变)的技术制备。
在WO 92/02621(参考文献2)中描述了重组的DNA分子，该分子包含编码具有山毛榉目中树的过敏原至少一个表位的多肽的DNA，该过敏原选自Aln g 1，Cor a1和Bet v 1。文中描述的重组分子确实都具有相应于天然存在的过敏原的序列的氨基酸序列或部分氨基酸序列。
WO 90/11293(参考文献3)涉及分离的豚草花粉过敏原多肽和修饰的豚草花粉肽。其中公开的多肽具有相应于天然存在的过敏原或其天然存在的同种型的序列的氨基酸序列。
过敏原的化学修饰
对过敏原的化学修饰已进行了一些研究。七十年代早期的科学研究包括将过敏原化学偶联到多聚体上和使用甲醛等化学交联过敏原产生所谓的“过敏原类似物(allergoids)”。这些研究的基本原理是经过附着化学配体随机破坏IgE结合表位从而降低IgE结合，同时因增加复合物的分子量而保持其免疫原性。与“过敏原类似物”生产的内在缺陷相关联的是难以控制化学交联过程和难以分析及标准化所得的高分子量复合物。“过敏原类似物”目前用于临床，且由于随机破坏了IgE结合表位，故与常规疫苗相比可施用更高的剂量，但相对于使用常规疫苗没有提高安全性和效力参数。
化学修饰过敏原的更近期的研究集中于总体破坏过敏原的三级结构，从而消除Ig结合，其中假定的基本治疗靶是过敏原特异性T细胞。该疫苗含有来自过敏原序列的代表最小T细胞表位的合成肽，代表连接的T细胞表位的较长肽，代表免疫显性T细胞表位区域的来自较长过敏原序列的合成肽，或以重组技术切成两半的过敏原分子。根据这一基本原理的另一方案是建议使用“低IgE结合”的重组同种型。在最近几年中，已清楚天然的过敏原是异源性的，其中含有同种过敏原(isoallergen)和具有多达大约25％氨基酸被取代的变体。已发现一些重组的同种过敏原在IgE结合中效率较低，这很可能是由于不可逆的变性且因此总体上破坏了三级结构。
体外诱变和过敏反应接种
使用一些过敏原经过体外定点诱变进行了降低过敏反应性的尝试，这些过敏原包括Der f 2(Takai等，文献4)，Der p 2(Smith等，文献5)，39KDa美洲家刺皮螨过敏原(Aki等，文献6)，蜜蜂毒液磷脂酶A2(Frster等，文献7)，Ara h 1(Burks等，文献8)，Ara h2(Stanley等，文献9)，Bet v 1(Ferreira等，文献10和11)，桦木抑制蛋白(Wiedemann等，文献12)，和Ory s 1(Alvarez等，文献13)。
同样，这些方案的基本原理也是针对过敏原特异性T细胞，同时经过破坏重组突变体过敏原的三级结构以减少或消除IgE结合来降低IgE介导的副作用的风险。这些方案的基本原理不包括显性IgE结合表位的概念，也不包括起动还涉及B-细胞和抗体产生的新保护性免疫应答的概念。
Ferreira等(文献11)的文章描述了使用定点诱变以减少IgE结合。尽管在该文章中提到了Bet v 1的三维结构，但作者没有使用该结构预测暴露于表面、可用于突变的氨基酸残基，其中一半具有较低的溶剂暴露程度。而且他们使用的用于预测蛋白质中功能性残基的方法不同于本文描述的基于结构鉴定保守的表面区域的概念。尽管作者确实讨论了α-碳原子骨架三级结构的保守性，但该概念不是治疗策略的一部分，而仅仅用于体外评价IgE结合。而且，提供的证据也不充分，因为CD-色谱的标准化防碍对样品变性部分的评价，这是一个共同的问题。所述的治疗策略旨在在过敏原特异性T细胞中诱导耐受性，且未提及起动新的免疫应答。
Wiedemann等(文献12)的文章描述了使用定点诱变和肽合成来进行单克隆抗体表位的鉴定。作者具有抗原三级结构的知识，且他们使用这一知识选择暴露于表面的氨基酸用于突变。可以说他们使用的原则与本发明人描述的相反，因为选择的是与同源序列不同的氨基酸。该研究表明取代表面暴露的氨基酸具有修饰单克隆抗体结合特征的能力，但这并不令人惊奇，据认为是一种常识。所描述的实验没有设计成评价对诸如过敏反应患者血清IgE之类多克隆抗体的结合的调节。其中所包含的一个实验确实应用了血清IgE，尽管该实验不适合于定量评价，但IgE结合似乎不受所进行的突变的影响。
Smith等(文献5)的文章描述了使用定点诱变以实现单克隆抗体表位定位和减少IgE结合。作者不了解三级结构且没有尝试评价α-碳原子骨架三级结构的保守性。所用的算法不能保证选择用于突变的氨基酸确实暴露于分子表面。所述的突变体只有一个导致IgE结合明显减小。该突变体不能结合所试验的全部抗体，表明其三级结构被破坏。作者没有限定治疗策略、也没有提及起动新的免疫应答。
Colombo等(文献14)的文章描述了使用定点诱变和肽合成研究IgE结合表位。作者根据同源蛋白质的晶体结构使用了一个三维计算机模型结构以阐明分子表面的表位存在。使用代表表位的合成肽证实了显示一级结构同源性的不同过敏原上也存在一个表位。治疗策略以使用代表单价IgE结合表位的合成肽进行的治疗为基础。没有提及同源过敏原之间保守的表面区及起动新的保护性免疫应答的治疗概念。
Spangfort等(文献15)的文章描述了主要桦木过敏原的三维结构和保守的表面暴露部分。该文章没有提及主要的IgE结合表位和定点诱变，也没有阐述治疗应用。
在上述研究中没有一个是经过取代表面暴露的氨基酸而保持α-碳骨架的三级结构来减小IgE结合。上述研究的基本原理不包括显性IgE结合表位的概念，也不包括起动一个新的保护性免疫应答的治疗理念。
附图的简要描述
图1显示了用于Bet v 1突变体1号的突变体特异性寡聚核苷酸引物。突变的核苷酸下划线。
图2显示了为所有突变体而合成和使用的2个普遍适用的引物(称为“全有义”(all-sense)和“全无义”(all non-sense))。
图3显示了所有Bet v 1突变的概述。
图4显示了用非生物素标记的Bet v 1和用Bet v 1 Glu 45 Ser突变体抑制生物素标记的重组Bet v 1与来自过敏反应患者的血清IgE的结合。
图5显示了用非生物素标记的Bet v 1和用Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln抑制生物素标记的重组Bet v 1与过敏反应病人血清IgE的结合。
图6显示了用非生物素标记的Bet v 1和用Bet v 1 Pro108Gly突变体抑制生物素标记的重组Bet v 1与过敏反应患者血清IgE的结合。
图7显示了用非生物素标记的Bet v 1和用Bet v 1 Glu60Ser突变体抑制生物素标记的重组Bet v 1与过敏反应患者血清IgE的结合。
图8显示了重组的和3区段(Triple-patch)突变体的CD色谱，接近等浓度下记录。
图9显示了用非生物素标记的Bet v 1和用Bet v 1三区段突变体抑制生物素标记的重组Bet v 1与过敏反应患者血清IgE的结合。
图10显示了各个比对的抗原5残基的溶剂可接近性和黄胡蜂属抗原5序列的序列对比(左侧)。图10的右侧显示了在黄胡蜂属抗原5：s间具有保守区域的抗原5的分子表面。
图11显示了来自有义链的相应于Ves v 5氨基端的引物序列。下游引物的序列来自无义链。
图12显示了为所有突变体合成和使用的两个普遍适用的引物(表示为“全有义”和“全无义”)。
图13显示了所有Ves v 5突变的概述。
图14显示了用无生物素标记的Ves v 5和用Ves v 5 Lys72Ala突变体抑制生物素标记的重组Ves v 5与过敏反应患者血清IgE的结合。
本发明的目的
本发明的基本原理
本发明以独特的原理为基础。根据该基本原理，成功的过敏反应接种的机制不是改变正在进行的Th2-型免疫应答，而是同时起动涉及B-细胞识别三级结构表位和抗体形成的一种新的Th1-型免疫应答。观察到特异性IgE水平不受成功接种治疗的影响，并且成功的治疗常常伴随着过敏原特异性IgG4的大量升高，这些结果可支持这一模型。另外，过敏原攻击前和之后的鼻活体解剖研究表明具有Th2样表型的T细胞不减少，而且还观察到Th1样T细胞增加。当疫苗(或药用组合物)通过非呼吸道的其它途径用药时，假定新的Th1样免疫应答在身体上不同于正在进行Th2应答的部位发生，从而使得两种应答同时存在。
本发明的基本原理的另一重要方面是推测存在显性IgE结合表位。推测这些显性IgE结合表位由大小足以容纳抗体结合，且在同种过敏原、变体和/或来自有亲缘关系的物种的同源过敏原之间保守的三级结构依赖型连贯的表面区构成。存在能结合同源过敏原上相似表位的交叉反应IgE由以下临床观察结果所支持，该观察结果是过敏反应患者常与一些亲缘关系较近的物种，如桤木，桦木和榛木，多种草类，或一些种类的表皮螨属室内粉尘螨产生反应。它还被实验室的实验所支持，该实验证实来自有亲缘关系的物种的同源过敏原之间存在IgE交叉反应性，且一种过敏原具有抑制IgE结合其同源过敏原的能力(Ipsen等，1992，文献16)。已知接触和免疫应答以剂量依赖性方式相关。结合这些观察结果，推测保守的表面区比非保守的表面区程度更高地接触免疫系统，导致产生具有更高亲和力的IgE抗体，因此产生了术语“显性IgE结合表位”。
根据这一基本原理，过敏原具有α-碳骨架三级结构是必需的，该结构基本上相似于天然过敏原，从而保证保守片段周围区域的表面拓扑学保守，这些保守片段代表了用于诱变以减小IgE结合的靶。满足这些标准时，过敏原能够以相当高剂量用药以提高其在产生保护性免疫应答中的效力而不损失其安全性。
本发明简述
本发明涉及将人工氨基酸取代导入确定的关键位置而保留过敏原的α-碳骨架三级结构。
本发明提供了一种重组过敏原，它是一种来自天然存在的过敏原的非天然突变体，其中B细胞表位中至少一个暴露于表面的保守氨基酸残基被在所述天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知同源性蛋白质的氨基酸序列中相同位置上都不出现的另一残基取代，所述的突变过敏原具有与所说的天然存在的过敏原基本上相同的α-碳骨架三级结构，且突变过敏原的特异性IgE结合与所说的天然存在的过敏原的结合相比减小。
该重组过敏原可经过如下方法获得：
a)鉴定天然存在的过敏原中，在所述天然存在的过敏原来源的分类学目内所有已知同源蛋白区中且具有超过70％相同性的保守氨基酸残基；
b)以具有至少20％的溶剂可接近性，确定在过敏原分子三维结构表面至少4002的范围内连贯连接的至少一个保守氨基酸残基区段，所说的至少一个区段包含至少一个B细胞表位；
c)所说的至少一区段中的至少一个氨基酸残基被在该特定位置不保守的另一氨基酸取代，而基本上保留过敏原分子的总体α-碳骨架三级结构。
在用来自特异性IgE反应性过敏反应患者或其群体来源的血清进行的免疫测定中，与天然存在的同种过敏原或相似的重组蛋白相比，突变过敏原的特异性IgE结合优选降低至少5％，更优选至少10％。
根据本发明的重组过敏原可以是以下来源的吸入性过敏原：树木，草类，草本，真菌，室内粉尘螨，蟑螂和动物毛发和皮屑。来自树木，草类和草本的重要花粉过敏原是由分类学上的山毛榉目，木犀目和松目产生的过敏原，包括桦木(桦木属)，桤木(赤杨属)，榛(榛属)，鹅耳枥属树(鹅耳枥属)和橄榄(木犀榄属)，Poales目，包括百合属，Phelum，早熟禾属，狗牙根属，鸭茅属和黑麦属的草类，菊目和荨麻目，包括豚草属和蒿属的草本。来自真菌的重要吸入性过敏原是由交链孢霉属和芽枝霉属产生的过敏原。其它重要的吸入性过敏原是来自表皮螨属室内粉尘螨的过敏原，来自蟑螂的过敏原，和来自诸如猫、狗和马的哺乳动物的过敏原。而且，根据本发明的重组过敏原可来自毒液过敏原，包括螯伤或咬伤性昆虫产生的过敏原，如来自分类学上的膜翅目，包括蜜蜂(蜜蜂总科)，黄蜂(胡蜂总科)，和蚂蚁(蚁总科)。
特异性过敏原成份包括，例如，山毛榉目的Bet v 1(B.verrucosa，桦木)，Aln g 1(Alnus glutinosa，桤木)，Cor a 1(Corylus avelana，榛木)和Car b 1(Carpinus betulus，鹅耳枥)。其它有Cry j 1(松目)，Amb a 1和2，Art v 1(菊目)，Par j 1(荨麻目)，Ole e 1(木犀目)，Ave e 1，Cyn d 1，Dac g 1，Fes p 1，Hol l 1，Lol p 1和5，Pas n 1，Ph1 p 1和5，Poa p 1，2和5，Sec c 1和5，和Sor h 1(各种草类花粉)，Alta 1和Cla h 1(真菌)，Der f 1和2，Der p 1和2(分别来自室内粉尘螨，D.farinae和D.pteronyssinus)，Bla g 1和2，Per a 1(分别来自蟑螂，Blatella germanica和Periplaneta americana)，Fel d 1(猫)，Can f 1(狗)，Equ c 1，2和3(马)，Apis m 1和2(蜜蜂)，Ves g 1，2和5，Pol a 1，2和5(均来自黄蜂)和Sol i 1，2，3和4(火蚁)。
在一个实施方案中，重组过敏原来自Bet v 1。取代的例子有Thr10Pro，Asp25Gly，(Asn28Thr+Lys32Gln)，Glu45Ser，Asn47Ser，Lys55Asn，Thr77Ala，Pro108Gly和(Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108Gly)。很明显，该重组过敏原可具有一个或多个取代。
在另一实施方案中，该重组过敏原来自胡蜂科，蜜蜂科和蚁总科分类学水平上的毒液过敏原。
在还有一个实施方案中，重组过敏原来自Ves v 5。取代的例子是Lys72Ala和Tyr96Ala。很明显，该重组过敏原可具有一个或多个取代。
本发明还提供了制备本文限定的重组过敏原的方法，包括：
a)鉴定天然存在的过敏原中，在所说天然存在的过敏原来源的分类学目内所有已知同源蛋白质中均保守且具有超过70％相同性的氨基酸残基；
b)以具有至少20％的溶剂可接近性，确定在过敏原分子三维结构的表面至少4002的范围内连贯连接的至少一个保守氨基酸残基区段，所说的至少一个区段包含至少一个B细胞表位，和
c)所说的至少一区段中的至少一个氨基酸残基以在该特定位置上非保守的另一氨基酸取代，而基本上保留过敏原分子的总体α-碳骨架三级结构。
在该方法中，根据溶剂可接近性将所述的至少一区段的氨基酸残基分级并取代溶剂可接近性更大的氨基酸中的一个或多个氨基酸。
一般来说，在根据本发明的方法中，经过定点诱变实现在所说的B细胞表位或所说的至少一区段中取代一个或多个氨基酸残基。
以诱变前和后由X-射线晶体学或NMR获得相同结构来最佳确定α-碳骨架三维结构保守。在缺乏描述突变体的结构数据时，不能辨别的CD-色谱或诸如抗体反应活性的免疫化学数据如果与分析结构确定的分子获得的数据相比可产生保守α-碳骨架的三级结构。
另外，本发明提供了一种药用组合物，包括本文限定的重组过敏原与药用上可接受的载体和/或赋形剂和任选的佐剂组合。
该药用组合物可以是针对天然存在的过敏原在患有过敏反应的患者中诱发的过敏反应的疫苗形式。
在另一方面，本发明涉及在受试者中产生免疫反应的方法，该方法包括给受试者施用至少一种本文所限定的重组过敏原，或含有至少一种本文所限定的重组过敏原的药用组合物。
本发明的药用组合物可用包括混合至少一种本文所限定的重组过敏原与药用上可接受的物质和/或赋形剂的方法来制备。
在一个具体实施方案中，本发明涉及接种或治疗受试者，所说的接种或治疗包括给受试者施用至少一种本文限定的重组过敏原或本文限定的药用组合物。
本发明的药用组合物可用上文限定的方法获得。
在另一实施方案中，本发明的重组过敏原适用于治疗，阻止或减轻过敏反应的方法，该方法包括给受试者施用本文限定的重组过敏原或本文限定的药用组合物。
本发明的详细描述
取代的标准
对于已确定(例如，由X-射线晶体学，或NMR电子显微镜)三级结构的分子，带有取代氨基酸的突变体优选应满足下列标准：
1.分子的总体α-碳骨架三级结构应保守。保守定义为比较结构时原子坐标平均均方根偏差在2以下。其重要性有2个原因：a)预期该天然过敏原的整个表面组成潜在抗体结合表位的重叠连续体。该分子表面的大部分不受取代的影响，从而保留了其抗体结合特性，这对于产生针对也存在于天然过敏原上的表位的新保护性抗体特异性是重要的。b)稳定性，涉及保存期和注射进体液两方面的稳定性。
2.待取代的氨基酸应位于表面，因此对于抗体结合是可接近的。位于表面的氨基酸限定为三维结构中具有至少20％的溶剂(水)可接近性，合适的是20-80％，更合适的是30-80％的溶剂可接近性的氨基酸。溶剂可接近性定义为半径与溶剂分子(水，r＝1.4)相当的球体可接近的分子区域。
3.取代的氨基酸应位于大于4002的保守区段内。保守的区段定义为暴露于表面的保守氨基酸残基和骨架的连贯连接区域。保守氨基酸残基是经过对分类学上的目内同源蛋白质的所有已知(推断)氨基酸序列进行序列对比确定的。在90％以上的序列中具有相同氨基酸残基的氨基酸位置被认为是保守的。预期保守的区段含有大部分患者的IgE所针对的表位。
4.保守区段内，进行诱变的氨基酸优选选自具有最大溶剂(水)可接近性的氨基酸，优选位于靠近保守区段中心的氨基酸。
优选的是，极性氨基酸残基被另一极性残基所取代，非极性的氨基酸残基被另一非极性残基所取代。
疫苗的制备是本领域中普遍熟知的。疫苗一般制备成可注射剂，如液体溶液或悬液。该疫苗也可乳化或配制成能够经鼻用药。所述的免疫原性成份(本文所定义的重组过敏原)可与药用上可接受的且与活性成份可配伍的赋形剂适当地混合。合适的赋形剂的例子是水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等及其组合。疫苗还可含有其它物质，如润湿剂，乳化剂，缓冲剂或增强疫苗效力的佐剂。
疫苗最常见的是通过皮下或肌肉内注射经肠胃外用药。适合于以其它途径用药的制剂包括口服制剂和栓剂。口服用药的疫苗可用正常用于这种制剂的赋形剂适当配制，例如，药用级的甘露糖，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。该组合物可配制成溶液，悬液，乳剂，片剂，丸剂，胶囊，缓释制剂，气溶胶，粉末或颗粒。
疫苗以与剂型配方相配伍的方式和以治疗上有效的和具免疫原性的量用药。疫苗内包含的活性成份的量取决于待治疗的受试者，即受试者免疫系统对治疗的反应能力，用药途径和受试者的年龄和体重。合适的剂量范围可在大约0.0001μg到1000μg内变动。
如上所述，经过向制剂中添加佐剂可获得增强的效力。该佐剂的例子是在磷酸缓冲盐溶液中以0.05％至0.1％溶液存在的氢氧化铝和磷酸盐(明矾)，以0.25％的溶液使用的合成糖类聚合物。也可采用具有诸如C.parvum的细菌细胞，内毒素或革兰氏阴性细菌的脂多糖成份的混合物，在诸如mannide monoaleate(Aracel A)的生理学上可接受的油类载体中的乳剂，或含有20％全氟化碳(例如，Fluosol-DA)的溶液的乳剂用作封闭取代物。也可使用其它佐剂，如弗氏完全和不完全佐剂以及QuilA和RIBI。
最常见的是，为保证有效，有必要多次施用疫苗。通常，疫苗的施用以起始用药，随后接种或其它次的用药进行。接种的次数通常在1至50次的范围内，通常不超过35次接种。接种一般在3个月到5年的期限内每2周到每2月进行一次。这样预期可产生所需水平的预防或治疗效果。
重组过敏原可用作药用制品，它适合于在发生症状的季节期间提供针对过敏反应的一定程度的保护(预防)。通常，该治疗必须每年重复进行以维持保护效果。配制成鼻应用的制品特别适于该目的。
本发明用下面的非限制性实施例进一步说明。
实施例
实施例1
山毛榉目花粉过敏原内的共有表位的鉴定
主要桦木花粉过敏原Bet v 1与分类学上有亲缘关系的树木，即山毛榉目(例如榛木和鹅耳枥属树)的花粉来源的主要过敏原显示出大约90％的氨基酸序列相同性，且桦木花粉过敏原患者对这些Bet v 1同源蛋白质常显示出过敏交叉反应的临床症状。
Bet v 1与某些水果(例如苹果和樱桃)和蔬菜(如芥菜和胡萝卜)中存在的过敏反应蛋白质显示出大约50-60％的序列相同性，在Bet v 1和这些食物相关蛋白之间存在过敏交叉反应的临床证据。
另外，Bet v 1与称为病理相关蛋白质(PR-10)的一组植物蛋白具有明显的序列相同性(20-40％)，然而对这些PR-10蛋白还没有过敏交叉反应性的报道。
分子模拟表明山毛榉目和食品过敏原及PR-10蛋白质的结构近似于与Bet v 1的结构相同。
过敏反应Bet v 1交叉反应的结构基础在(Gajhede等，1996，文献17)中报道，其中鉴定了Bet v 1分子表面上的3个区段在已知的主要树木花粉过敏原中是共有的。因此，识别Bet v 1上这些区段的任何IgE可与其它山毛榉目主要花粉过敏原发生交叉反应并与其结合，产生过敏反应症状。在将所有已知的主要树木花粉过敏原的氨基酸序列进行序列对比后，结合对文献17中报道的α-碳骨架三级结构揭示的Bet v1分子表面的分析，进行这些共有区段的鉴定。此外，根据结合时抗体覆盖的面积将该区段限定为具有某一最小的大小(＞4002)。
选择氨基酸残基用于定点诱变
在存在于Bet v 1特异性区域和共有片段上的残基中选择进行定点诱变的氨基酸残基，因为这些修饰预期会影响来自显示临床树木花粉过敏原交叉反应性的大多数患者的血清IgE的结合。
根据它们的原子坐标计算各区段内各氨基酸残基的相对定位和溶剂暴露百分数。具有较低溶剂暴露程度(＜20％)的残基由于可能会破坏结构或缺乏抗体相互作用而被视为与诱变无关。剩下的残基根据其溶剂暴露程度进行分级。
序列对比
与查询序列(Bet v 1 No.2801，WHO IUIS过敏原命名小组)同源的序列通过BLAST检索得自GenBank和EMBL序列数据库(Altschul等，文献18)。考虑BLAST报道的概率小于0.1的所有序列，将含无冗余序列的同源序列制成一览表。以CLUSTAL W(Higgins等，文献19)进行序列对比，针对全部序列或仅分类学上有亲缘关系的种类计算序列中各位置的相同百分数。总共有122个序列与Bet v 1 No.2801同源，其中57个序列来自分类学上有亲缘关系的种类。
克隆编码Bet v 1的基因
以酚提取和LiCl沉淀从Betula verrucosa花粉(Allergon，Sweden)制备RNA。在Eppendorph管中逐批进行寡聚(dT)-纤维素亲和色谱，使用可商购的试剂盒(Amersham)合成双链cDNA。编码Bet v 1的DNA经PCR扩增和克隆。简单地说，使用cDNA作模板，和设计成在分别相应于Bet v 1氨基端和3’-非翻译区的位置匹配cDNA序列的引物进行PCR。引物在5’端延伸以提供限制性位点(NcoI和Hind III)用于定向克隆进pKK233-2。
亚克隆进pMAL-c
编码Bet v 1的基因随后被亚克隆进麦芽糖结合蛋白融合载体pMAL-c(New England Biolabs)中。经过PCR扩增基因并与malE读框一致地亚克隆，以产生麦芽糖结合蛋白(MBP)-Bet v 1蛋白融合操纵子，其中MBP和Bet v 1被因子Xa蛋白酶裂解位点分开，该裂解位点所处位置使得在裂解时恢复Bet v 1真正的氨基端序列，如文献15所述。简单地说，使用插入了Bet v 1的pKK233-3作模板，分别相应于蛋白质氨基和羧基端的引物进行PCR。启动子近端引物在5’端延伸以提供编码符合读框的因子Xa蛋白酶裂解位点的4个密码子。两个引物均在5’端进一步延伸以提供限制性位点(KpnI)用于克隆。使用20个循环的PCR亚克隆编码Bet v 1的基因以降低PCR假象的频率。
体外诱变
使用带有Bet v 1插入片段的重组pMAL-c作模板经PCR进行体外诱变。各突变的Bet v 1基因使用4个引物经3个PCR反应产生。
合成2个突变特异性寡核苷酸引物用于各突变，每条引物针对一条DNA链，见图1和2。以突变的核苷酸作起点，两条引物均在5’-端延伸7个核苷酸，在3’-端延伸15个核苷酸。延伸的核苷酸在序列上与Bet v 1基因实际区域相同。
还合成了两个普遍适用的引物(在图2中称为“全有义”和“全无义”)并用于所有突变体。这些引物长15个核苷酸，在序列上相应于距离Bet v 1上游和下游大约1千碱基的pMAL-c载体区域。上游引物的序列来自有义链，下游引物的序列来自无义链，见图2。
除了只进行20个温度循环以减小PCR假像的频率外，基本上按照标准方法(Saiki等，1988，文献20)进行2个独立的PCR反应。各PCR反应使用插入了Bet v 1的pMAL-c作模板，以及以有意义组合的一个突变特异性引物和一个普遍适用的引物。
按照上面所述的逐步方法在3区段突变体中导入4个氨基酸取代(Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108Gly)。分别使用插入了Bet v1 No.2801，Bet v 1(Glu45Ser)，Bet v 1(Glu45Ser，Pro108Gly)的pMAL-c作模板，首先导入Glu45Ser突变，然后导入Pro108Gly突变，最后导入Asn28Thr，Lys32Gln突变。
经过琼脂糖凝胶电泳并电洗脱，随后乙醇沉淀来纯化PCR产物。使用来自开始2个PCR反应的混合PCR产物作模板和2个通用引物进行第3次PCR反应。同样，使用20个循环的标准PCR。经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱，随后进行乙醇沉淀纯化PCR产物，用限制性酶(BsiWI/EcoRI)切割并定向连接进用相同的限制性酶消化的插入了Betv 1的pMAL-c中。
图3显示了所有9个Bet v 1突变的概述，这9个突变如下：
Thr10Pro，Asp25Gly，Asn28Thr+Lys32Gln，Glu45Ser，Asn47Ser，Lys55Asn，Glu60Ser(非区段的)，Thr77Ala和Pro108Gly。还制备了具有4处突变的另外4个突变体(Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108Gly)。其中，选择5个用于进一步的试验：Asn28Thr+Lys32Gln，Glu45Ser，Glu60Ser，Pro108Gly和三区段突变体Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108Gly。
核苷酸测序
亚克隆之前、之后和体外诱变之后分别对Bet v 1编码基因的核苷酸序列进行了测定。
在Qiagen-tip 20柱上从生长于补充了0.1g/l氨苄青霉素的LB培养基中的饱和过夜10ml细菌培养物中纯化质粒DNA，并按照厂商的建议使用Sequenase version 2.0 DNA测序试剂盒(USB)测序。
重组Bet v 1和突变体的表达和纯化
融合到麦芽糖结合蛋白上的重组Bet v 1(Bet v 1 N0.2801和突变体)在大肠杆菌DH 5 α中过表达并按文献15所述纯化。简单地说，重组大肠杆菌细胞在37℃下生长至436nm处的光密度为1.0，此时经过加入IPTG诱导Bet v 1融合蛋白表达。诱导后3小时经离心收获细胞，重悬于裂解缓冲液中并经超声处理破碎。超声处理和再次离心后，经淀粉亲和色谱分离重组融合蛋白并随后经过与因子Xa温育裂解(文献15)。因子Xa裂解后，经凝胶过滤分离重组Bet v 1，且如果有必要，进行另一轮淀粉亲和色谱以去掉痕量的麦芽糖结合蛋白。
经超滤浓缩纯化的重组Bet v 1至大约5mg/ml并贮存于4℃。纯化的重组Bet v 1制品的最终产率为每升大肠杆菌细胞培养物2-5mg。
纯化的重组Bet v 1制品在SDS-聚丙烯酰胺电泳银染后出现单一带，具有17.5KDa的表观分子量。N-端测序显示出来自cDNA核苷酸序列的预期序列，定量氨基酸分析显示出预期的氨基酸组成。
我们以前已表明(文献15)重组Bet v 1 No.2801与天然存在的Betv 1在免疫化学上不可辨别。
使用兔多克降抗体的免疫电泳
以重组Bet v 1蛋白的形式产生了7种突变体Bet v 1并按上文所述纯化，试验其与针对从桦木花粉分离的Bet v 1产生的多克隆兔抗体的反应性。当在非变性条件下免疫电泳(火箭免疫电泳)分析时，兔抗体能沉淀所有的突变体，表明诸突变体具有保守的α-碳骨架三级结构。
这些结果表明，在Bet v 1分子表面导入的非天然存在的取代可降低针对天然存在的Bet v 1的多克隆抗体反应，且不会破坏总体α-碳骨架的三级过敏原结构。为了分析对人多克隆IgE-反应的影响，选择突变体Glu45Ser，Pro108Gly，Asn28Thr+Lys32Gln和Glu60Ser进行进一步的分析。
Ret v 1 Glu45Ser突变体
在45位的谷氨酸显示高度溶剂暴露性(40％)，位于山毛榉目过敏原共有的分子表面区段(区段I)中。发现在一些Bet v 1同源性PR-10蛋白质中丝氨酸残基占据位置45，表明谷氨酸可被丝氨酸取代而不会破坏α-碳骨架三级结构。此外，由于没有一个已知的山毛榉目过敏原序列在位置45具有丝氨酸，因此用丝氨酸取代谷氨酸产生非天然存在的Bet v 1分子。
使用重组Glu45Ser Bet v 1突变体进行T细胞增殖试验
按Spangfort等，1996a所述进行分析。发现重组Bet v 1 Glu45Ser突变体能诱导来自3个不同桦木花粉过敏患者的T细胞系增殖，其刺激指数相似于重组的和天然存在的过敏原。
重组Glu45Ser Bet v 1的结晶和结构测定
基本上按(Spangfort等1996b，文献21)所述在25℃经蒸气扩散生长出重组Glu45Ser Bet v 1晶体。5mg/ml浓度的Glu45Ser Bet v 1与等体积的2.0M硫酸铵，0.1M柠檬酸钠，1％(v/v)二氧六环，pH6.0混合并用100倍体积的2.0M硫酸铵，0.1柠檬酸钠，1％(v/v)二氧六环，pH6.0平衡。平衡24小时后，使用重组野生型Bet v 1晶体作晶种，应用文献21所述的接种技术诱导晶体生长。
大约2个月后，收获晶体并使用Rigakn旋转正极产生的X-射线按文献21所述进行分析，使用分子取代解析结构。
Bet v 1 Glu45Ser突变体的结构
经过生长3维Bet v 1 Glu45Ser蛋白晶体解析突变对结构的影响，该晶体当用旋转正极产生的X-射线衍射分析时分辨率为3.0。以Bet v1 Glu45Ser结构电子密度图证实在45位的谷氨酸取代成丝氨酸，该电子密度图也显示总体α-碳骨架三级结构是保守的。
Bet v 1 Glu45Ser突变体的IgE结合特性
使用来自桦木过敏反应患者血清IgE库进行液相IgE-抑制试验，比较Bet v 1 Glu45Ser突变体与重组Bet v 1的IgE结合特性。
以1∶5的摩尔比(Bet v 1 No.2801：生物素)用生物素标记重组Bet v1 No.2801。抑制试验按下述方法进行：血清样品(25μl)与固相抗IgE保温，洗涤，重悬并进一步与生物素标记的Bet v 1 No.2801(3.4nM)和给定突变体(0-28.6nM)的混合物保温。根据与吖啶酯标记的链霉抗生素蛋白保温后测定的RLU评价结合到固相上的生物素标记的Bet v1 No.2801的量。以使用缓冲液和突变体作抑制剂获得的RLU之间的比率计算抑制的程度。
图4显示了无生物素标记的Bet v 1和Bet v 1 Glu45Ser突变体对生物素标记的重组Bet v 1与过敏反应患者血清IgE的结合的抑制。
对血清库中存在的血清IgE的结合达到50％抑制所需的各重组蛋白的量有明显的区别。重组Bet v 1在大约6.5ng达到50％的抑制，而Bet v 1 Glu45Ser突变体的相应浓度是大约12ng。这说明导入Bet v 1Glu45Ser突变体中的点突变降低了对特异性血清IgE的亲和性大约2倍。用Bet v 1 Glu45Ser突变体达到的最大抑制水平比重组Bet v 1明显更低。这表明Glu45Ser取代后，存在于血清库中的一些特异性IgE不能识别Bet v 1 Glu45Ser突变体。
Bet v 1突变体Asn28Thr+Lvs32Gln
28位和32位的天冬氨酸和赖氨酸分别显示出高度的溶剂暴露性(分别为35％和50％)，它们位于山毛榉目过敏原共有的分子表面区段(区段II)中。在结构上，天冬氨酸28和赖氨酸32在分子表面上互相靠近，且最有可能通过氢键相互作用。在一些Bet v 1同源性PR-10蛋白质中发现苏氨酸和谷氨酸残基分别占据位置28和32，表明天冬氨酸和赖氨酸可分别被苏氨酸和谷氨酸所取代而不破坏α-碳骨架三级结构。另外，由于没有一个天然存在的同种过敏原序列分别在28和32位具有苏氨酸和谷氨酸，因此这种取代产生了天然不存在的Bet v 1分子。
Bet v 1突变体Asn28Thr+Lvs32Gln的IgE结合特性
使用上文所述来自桦木过敏反应患者血清IgE库在液相IgE抑制试验中比较突变体Asn28Thr+Lys32Gln与重组Bet v 1的IgE结合特性。
图5显示了非生物素标记的Bet v 1和Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln对生物素标记的重组Bet v 1与过敏反应患者血清IgE的结合的抑制作用。
对血清库中存在的血清IgE的结合达到50％抑制作用所需的各重组蛋白质的量有明显的区别。重组Bet v 1在大约6.5ng时达到50％的抑制，而Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln的相应浓度是大约12ng。这表明Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln中导入的点突变降低了对特异性血清IgE的亲和力大约2倍。
用Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln突变体达到的最大抑制水平与重组Bet v 1相比明显更低。这可能表明Asn28Thr+Lyr32Gln取代后，一些存在于血清库中的特异性IgE不能识别Bet v 1突变体Asn28Thr+Lys32Gln。
Bet v 1突变体Pro108Gly
位置108的脯氨酸显示出高度的溶剂暴露性(60％)且位于山毛榉目过敏原共有的分子表面区段(区段III)内。在一些Bet v 1同源的PR-10蛋白中发现甘氨酸残基占据108位，这表明脯氨酸可被甘氨酸取代而不破坏α-碳骨架三级结构。另外，由于没有一个天然存在的同种过敏原序列在108位具有甘氨酸，因此用甘氨酸取代脯氨酸产生非天然存在的Bet v 1分子。
Bet v 1 Pro108Gly突变体的IgE-结合特性
使用上述来自桦木过敏反应患者的血清IgE库在液相IgE-抑制试验中比较Bet v 1 Pr0108Gly突变体与重组Bet v 1的IgE-结合特性。
图6显示了非生物素标记的Bet v 1和Bet v 1 Pro108Gly突变体对生物素标记的重组Bet v 1与过敏反应患者血清IgE的结合的抑制作用。
对血清库中存在的血清IgE的结合达到50％抑制所需的各重组蛋白的量有明显的区别。重组Bet v 1在大约6.5ng时达到50％的抑制，而Bet v 1 Pro108Gly的相应浓度为15ng。这表明导入Bet v 1 Pro108Gly的单个点突变降低了对特异性血清IgE的亲和性大约2倍。
与重组Bet v 1相比，Bet v 1 Pro108Gly突变体达到的最大抑制水平有一定程度的降低。这可能表明，Pro108Gly取代后，血清库中存在的一些特异性IgE不能识别Bet v 1 Pro108Gly突变体。
Retv 1突变体Glu60Ser(非区段的突变体)
位置60的谷氨酸显示出高度的溶剂暴露性(60％)，然而它不位于山毛榉目过敏原共有的分子表面区段内。在一些Bet v 1同源的PR-10蛋白中发现丝氨酸残基占据60位，这表明谷氨酸可被丝氨酸取代而不破坏α-碳骨架三级结构。另外，由于没有一个天然存在的同种过敏原序列在60位具有丝氨酸，因此用丝氨酸取代谷氨酸产生非天然存在的Bet v 1分子。
Bet v 1 Glu60Ser突变体的IgE-结合特性
使用上述来自桦木过敏反应患者的血清IgE库在液相IgE-抑制试验中比较Bet v 1 Glu60Ser突变体与重组Bet v 1的IgE-结合特性。
图7显示了非生物素标记的Bet v 1和Bet v 1 Glu60Ser突变体对生物素标记的重组Bet v 1与过敏反应患者血清IgE的结合的抑制作用。与Glu45Ser，Pro108Gly和Asn28Thr+Lys32Gln突变体相反，谷氨酸60取代成丝氨酸对其IgE结合特性没有显示任何明显的影响。这表明在定义的山毛榉目共有区段外进行的取代对特异性血清IgE的结合仅具有边缘效应，这支持了这样的理念，即，保守的过敏原分子表面区域含有显性IgE结合表位。
Bet v 1三区段的突变体
在三区段突变体中，在上述3个不同的共有山毛榉目区段中同时导入点突变(Glu45Ser，Asn28Thr+Lys32Gln和Pro108Gly)，以产生携带4个氨基酸取代的人工突变体。
Bet v 1三区段突变体的结构分析
以圆二色性(CD)光谱学分析纯化的三区段突变体的结构完整性。图8显示了在接近等浓度时记录的重组和三区段突变体的CD光谱。两个重组蛋白CD光谱的峰振幅和位置重叠，表明两制品含有等量的二级结构，这有力地表明α-碳骨架三级结构不受导入的氨基酸取代的影响。
Bet v 1三区段突变体的IgE结合特性
使用上文所述来自桦木过敏反应患者的血清IgE库在液相IgE抑制试验中比较Bet v 1三区段突变体与重组Bet v 1的IgE结合特性。
图9显示了非生物素标记的Bet v 1和Bet v 1三区段突变体对生物素标记的重组Bet v 1与过敏反应患者血清IgE的结合的抑制作用。与本文所述的单一突变体相反，三区段突变体的抑制曲线不再与重组体相似。这表明，与重组体相比，三区段突变体中导入的取代改变了IgE结合特性和表位情况。缺乏相似性使得难以定量评估三区段突变体与特异性血清IgE亲和性的降低。
重组Bet v 1在大约6ng达到50％抑制，Bet v 1三区段突变体的相应浓度是30ng，即亲和性降低5倍。然而，为了达到80％抑制，相应的值分别是20ng和400ng，即降低20倍。
使用重组Bet v 1三区段突变体的T细胞增殖试验
按文献15所述进行分析。发现重组Bet v 1三区段突变体能以与重组和天然存在的Bet v 1相似的刺激指数诱导来自三个不同桦木花粉过敏反应患者的T细胞系增殖。这表明三区段突变体可起动抗体产生所必需的细胞免疫应答。
实施例2
鉴定常见黄胡蜂(Vespula vulgaris)毒液主要过敏原抗原5内的共 有表位
抗原5是三种胡蜂毒液蛋白中的一种，它是人类已知的过敏原。胡蜂包括大黄蜂，鲜黄色胡蜂和黄蜂。胡蜂毒液的其它2种已知过敏原是磷脂酶A1和透明质酸酶。已克隆了来自常见黄胡蜂的抗原5(Ves v 5)并在酵母系统中表达成重组蛋白(Monsalve等，1999，文献22)。最近以1.8的分辨率测定了重组Ves v 5的3维晶体结构(在制品中)。该结构的主要特征是由4个β链和4个α螺旋组成，它们以3叠层排列成“α-β-α夹心”结构。来自不同黄胡蜂属种类的抗原5同源过敏原之间的序列相同性是大约90％，表明存在保守的分子表面区和B细胞表位。
按前面对树木花粉过敏原所述，对黄胡蜂属抗原5过敏原的所有已知氨基酸序列进行序列对比，结合对由Ves v 5三维结构揭示的抗原5分子表面的分析，进行共有区段的有无确定和鉴定。图10显示了逐个排列的抗原5残基的溶剂可接近性和黄胡蜂属抗原5序列的序列对比(左侧)。图10的右侧显示了抗原5的分子表面，其中黄胡蜂属抗原5之间的保守区域着色表示。
选择氨基酸残基用于定点诱变
在存在于黄胡蜂属共有片段上的残基中选择定点诱变的氨基酸残基，因为这些修饰预期会影响对来自显示临床黄胡蜂属过敏性交叉反应性的大多数患者的血清IgE的结合。
根据它们的原子坐标计算各区段内各氨基酸残基的相对定位和溶剂暴露百分数。具有较低的溶剂暴露程度的残基由于可能破坏结构或缺乏抗体相互作用而被认为不适合于诱变。剩下的残基根据其溶剂暴露程度进行分级。
克隆编码Ves v 5的基因
按(Fang等1988，文献23)所述从常见黄胡蜂的胡蜂毒液酸性腺体分离总RNA。
按(Lu等，1993，文献24)所述进行Ves v 5基因的第一链cDNA合成，PCR扩增和克隆。
亚克隆进pPICZαA
编码Ves v 5的基因随后亚克隆进pPICZαA载体(Invitrogen)，用于在巴斯德毕赤酵母中分泌表达Ves v 5。以PCR扩增该基因并与酿酒酵母α-因子分泌信号编码序列读框一致地亚克隆。在该构建体中，α因子在蛋白质分泌期间经巴斯德毕赤氏酵母Kex2蛋白酶系统体内裂解掉。
简单地说，使用Ves v 5作模板和分别相应于该蛋白质氨基-和羧基端的引物进行PCR。各引物分别在5’端延伸以提供用于克隆的限制性位点EcoRI和XbaI。编码Kex2裂解位点的核苷酸在该构建体中位于该蛋白质氨基端上游18个核苷酸处，导致表达的Ves v 5在氨基端具有6个额外的氨基酸，Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe。
pPICZαA-Ves v 5插入巴斯德毕赤氏酵母中
经Sac I限制性酶裂解线性化插入了Ves v 5基因的pPICZαA载体并插入巴斯德毕赤氏酵母基因组的AOX1基因座。按Invitrogen的建议经巴斯德毕赤氏酵母KM71细胞中的同源重组进行插入。
体外诱变
使用带有Ves v 5插入片段的重组pPICZαA作模板，经PCR进行体外诱变。各突变的Ves v 5基因使用4个引物经3个PCR反应产生。
合成2个突变特异性寡核苷酸引物用于各突变，每条引物针对一条DNA链，见图11和12。以突变的核苷酸作起点，两条引物均在5’-端延伸6-7个核苷酸，在3’-端延伸12-13个核苷酸。延伸的核苷酸在序列上与Ves v 5基因实际区域相同。
还合成了两个通用引物(在图12中称为“全有义”和“全无义”)并用于所有突变体。为了保证表达的Ves v 5突变体具有真正的氨基端，相应于该蛋白质氨基端的引物在5’端延伸具有Xho I位点。当Ves v 5突变体基因插入pPICZαA载体中时，Ves v 5氨基端上游紧接处重新产生Kex2蛋白酶裂解位点。第二引物在序列上相应于pPICZαA载体中位于Ves v 5基因下游大约300bp的区域。相应于Ves v 5氨基端的引物序列来自有义链，下游引物的序列来自无义链，见图11。
除了只进行20个温度循环以减小PCR假像的频率外，基本上按照标准方法(Saiki等，1988)进行2个独立的PCR反应。各PCR反应使用插入了Ves v 5的pPICZαA作模板和以有意义组合的一个突变特异性引物和一个通用的引物。
经过使用“Concert，Rapid PCR纯化系统”(Life Technologies)来纯化PCR产物。使用来自前2个PCR反应的混合PCR产物作模板和2个通用引物进行第3次PCR反应。同样，使用20个循环的标准PCR。用“Concert，Rapid PCR纯化系统”(Life Technologies)纯化PCR产物，用限制性酶(XhoI/XbaI)切割并定向连接进用相同的限制性酶消化的pPICZαA载体中。
图13显示了所有ves v 5突变体的概述。
将pPICZαA-Ves v 5突变体插入巴斯德毕赤氏酵母
插入了Ves v 5突变体基因的pPICZαA载体经过SacI限制性酶消化线性化，并插入巴斯德毕赤氏酵母基因组的AOX1，基因座。按Invitrogen的建议经巴斯德毕赤氏酵母KM71细胞的同源重组进行插入。
核苷酸测序
亚克隆之前、之后和体外诱变之后分别对Ves v 5编码基因的核苷酸序列进行测定。
在Qiagen-tip 20柱上，从生长于补充了0.1g/l氨苄青霉素的LB培养基中饱和过夜的10ml细菌培养物中纯化质粒DNA并按照厂商的建议使用Sequenase version 2.0 DNA测序试剂盒(USB)测序。
重组Ves v 5的表达和纯化
巴斯德毕赤氏酵母菌株KM71的重组酵母细胞在装有含酵母氮源，生物素，甘油和组氨酸的100ml pH6.0磷酸盐缓冲液的500ml瓶中30℃以225rpm有轨摇动生长至A600nm为4-6。经离心收集细胞并重悬于10ml含甲醇代替甘油的相似缓冲培养基中。在30℃下每天加入0.05ml甲醇持续培养7天。
离心收获细胞并经超滤浓缩收集的培养液。在50mM乙酸铵缓冲液，pH4.6中透析后，将样品上样到以相同缓冲液平衡的FPLC(Pharmacia)SE-53阳离子交换柱上。用0-1.0M NaCl，50mM乙酸铵线性梯度洗脱柱。收集在大约0.4M NaCl处洗脱的重组Ves v 5峰并在0.02N乙酸中透析。浓缩至大约10mg/ml，纯化的Ves v 5贮存于4℃。
重组Ves v 5的结晶
经过蒸气扩散技术在25℃生长Ves v 5的晶体。为了结晶，将5μl5mg/ml Ves v 5与5μl 18％PEG6000，0.1M柠檬酸钠，pH6.0混合，并用1ml 18％PEG 6000，0.1M柠檬酸钠，pH6.0平衡。
从天然Ves v 5晶体在100K下收集X-射线衍射数据，在掺入重原子衍生物后用于分析Ves v 5的3维结构，见图10(制品原稿)。
使用兔多克隆抗体的免疫电泳
以重组Ves v 5蛋白形式生产2个Ves v 5突变体并试验其与针对重组Ves v 5产生的多克隆兔抗体的反应性。当在天然条件下经火箭免疫电泳分析时，兔抗体可沉淀重组Ves v 5及两种突变体，表明该突变体保留了α-碳骨架三级结构。
特异性血清IgE的抑制
使用来自胡蜂毒液过敏病人的血清IgE库在液相IgE-抑制试验中比较Ves v 5突变体与重组Ves v 5的IgE结合特性。
使用生物素标记的重组Ves v 5代替Bet v 1，按上文所述进行抑制试验。
Ves v 5 Lvs72Ala突变体
位置72的赖氨酸显示出高度的溶剂暴露性(70％)且位于黄胡蜂属抗原5共有的分子表面区段上。其相对定位和高度的溶剂暴露性表明赖氨酸72可被丙氨酸残基取代而不破坏α-碳骨架的三级结构。此外，由于没有一个天然存在的同种过敏原序列在位置72具有丙氨酸，因此用丙氨酸取代赖氨酸产生了非天然存在的Ves v 5分子。
Ves v 5 Lvs72Ala突变体的IgE结合特性
使用来自上文所述的桦木过敏反应病人的血清IgE库在液相IgE抑制试验中比较Ves v 5 Lys72Ala突变体与重组Ves v 5的IgE结合特性。
图14显示了用非生物素标记的Ves v 5和Ves v 5 Lys72Ala突变体对生物素标记的重组Ves v 5与过敏反应患者血清IgE结合的抑制作用。
对与血清库中存在的血清IgE的结合达到50％抑制所需的各重组蛋白的量有明显的区别。重组Ves v 5在大约6ng达到50％的抑制，而Ves v 5 Lys72Ala突变体的相应浓度是40ng。这显示导入Ves v 5Lys72Ala突变体中的单个点突变降低了对特异性血清IgE的亲和性大约6倍。用Ves v 5 Lys72Ala突变体达到的最大抑制水平比重组Ves v 5明显更低。这可能表明，Lys72Ala取代后，存在于血清库中的一些特异性IgE不能识别Ves v 5 Lys72Ala突变体。
Ves v 5 Tvr96Ala突变体
96位的酪氨酸显示出高度的溶剂暴露性(65％)且位于黄胡蜂属抗原5共有的分子表面区段上。其相对定位和高度溶剂暴露性表明酪氨酸96可被丙氨酸残基取代而不破坏三维结构。此外，由于没有一个天然存在的同种过敏原序列在96位具有丙氨酸，因此用丙氨酸取代酪氨酸产生了非天然存在的Ves v 5分子。
Ves v 5 Tyr96Ala突变体的IgE结合特性
使用来自上述桦木过敏反应病人的血清IgE库在液相IgE-抑制试验中比较Ves v 5 Tyr96Ala突变体与重组Ves v 5的IgE-结合特性。
图14显示了用非生物素标记的Ves v 5和Ves v 5 Tyr96Ala突变体对生物素标记的重组Ves v 5与过敏反应患者血清IgE结合的抑制作用。
对与血清库中存在的血清IgE的结合达到50％抑制所需的各重组蛋白的量有明显的区别。重组Ves v 5在大约6ng达到50％抑制，而Vesv 5 Tyr96Ala突变体相应的浓度为40ng。
这表明在Ves v 5 Tyr96Ala突变体中导入的单个点突变降低了对特异性血清IgE的亲和性大约6倍。
Ves v 5 Tyr96Ala突变体达到的最大抑制水平与重组Ves v 5相比明显更低。这表明Tyr96Ala取代后，在血清库中存在的一些特异性IgE不能识别Ves v 5 Tyr96Ala突变体。
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Claims (55)

1.一种来自天然存在的过敏原之非天然存在的重组突变过敏原，其中天然存在的过敏原包含过敏原分子三维结构表面至少4002连贯相连的至少一个区段的氨基酸残基，其具有至少20％的溶剂可接近性，其与天然存在的过敏原来源的同一分类学目内的同源序列具有超过70％的序列相同性，所述的区段包含至少一个B细胞表位，其中：
1)所述突变包含在位于所述至少一个区段中的保守性氨基酸残基的取代，所述保守性氨基酸残基具有至少20％的溶剂可接近性，所述取代是被在任何已知同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置上不出现的氨基酸残基取代，所述同源蛋白质与天然存在的过敏原来源在同一分类学目内；
2)所述的突变过敏原具有与所述天然存在的过敏原基本上相同的α-碳骨架三级结构，并且
3)突变过敏原的特异性IgE结合与对所述天然存在的过敏原的结合相比有所减少。
2.根据权利要求1的重组过敏原，其特征在于它来自吸入性过敏原。
3.根据权利要求2的重组过敏原，其特征在于它来自花粉过敏原。
4.根据权利要求3的重组过敏原，其特征在于它来自分类学上的山毛榉目、木犀目或松目产生的花粉过敏原。
5.根据权利要求4的重组过敏原，其特征在于它来自Bet v 1。
6.根据权利要求5的重组过敏原，其特征在于所述取代是Asp25Gly，Asn28Thr+Lys32Gln，Glu45Ser，Asn47Ser，Lys55Asn，Thr77Ala，Pro108Gly或Asn28Thr+Lys32Gln+Glu45Ser+Pro108Gly。
7.根据权利要求3的重组过敏原，其特征在于它来自分类学上的Poales目产生的花粉过敏原。
8.根据权利要求3的重组过敏原，其特征在于它来自分类学上的菊目或荨麻目产生的花粉过敏原。
9.根据权利要求2的重组过敏原，其特征在于它来自室内粉尘螨过敏原。
10.根据权利要求9的重组过敏原，其特征在于它来自表皮螨属产生的螨虫过敏原。
11.根据权利要求2的重组过敏原，其特征在于它来自蟑螂过敏原。
12.根据权利要求2的重组过敏原，其特征在于它来自动物过敏原。
13.根据权利要求12的重组过敏原，其特征在于它来自猫、狗或马产生的动物过敏原。
14.根据权利要求2的重组过敏原，其特征在于它来自毒液过敏原。
15.根据权利要求14的重组过敏原，其特征在于它来自分类学上的膜翅目产生的毒液过敏原。
16.根据权利要求15的重组过敏原，其特征在于它来自分类学上的胡蜂科、蜜蜂科和蚁总科的目产生的毒液过敏原。
17.根据权利要求16的重组过敏原，其特征在于它来自Ves v 5。
18.根据权利要求17的重组过敏原，其特征在于所述取代是Lys72Ala或Tyr96Ala。
19.重组过敏原，其特征在于它由如下步骤获得：
a)鉴定天然存在的过敏原中，在所述天然存在的过敏原来源的分类学目内所有已知同源蛋白质中具有超过70％相同性的保守氨基酸残基；
b)以具有至少20％的溶剂可接近性，确定过敏原分子三维结构表面至少4002连贯相连的至少一个区段的保守氨基酸残基，所述的至少一个区段包含至少一个B细胞表位；和
c)所述至少一个区段中的至少一个氨基酸残基被在所述天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知同源蛋白质的相同位置不出现的另一氨基酸取代，而基本上保留过敏原分子的总体α-碳骨架三级结构，以获得一个突变的过敏原，其中突变过敏原的特异性IgE结合相比于所述天然存在的过敏原的结合减少。
20.根据权利要求19的重组过敏原，其特征在于突变过敏原的特异性IgE结合减少至少5％。
21.根据权利要求19的重组过敏原，其特征在于突变过敏原的特异性IgE结合减少至少10％。
22.根据权利要求19的重组过敏原，其特征在于当比较突变体和天然存在的过敏原分子的α-碳骨架三级结构时，原子坐标的平均均方根差低于2。
23.根据权利要求19的重组过敏原，其特征在于所述的至少一个区段包含15-25个氨基酸残基的原子。
24.根据权利要求19-21中任意一项的重组过敏原，其特征在于根据溶剂可接近性对所述的至少一个区段中的氨基酸残基进行分级，并且溶剂可接近性更大的残基中的一个或多个氨基酸被取代。
25.根据权利要求24的重组过敏原，其特征在于所述至少一个区段中具有20-80％溶剂可接近性的一个或多个氨基酸残基被取代。
26.根据权利要求19-21中任意一项的重组过敏原，其特征在于在所述至少一个区段中每4002有1-5个氨基酸残基被取代。
27.根据权利要求19-21中任意一项的重组过敏原，其特征在于所述B细胞表位或所述至少一个区段中的一个或多个氨基酸残基的取代以定点诱变进行。
28.根据权利要求19-21中任意一项的重组过敏原，其特征在于它来自吸入性过敏原。
29.根据权利要求28的重组过敏原，其特征在于它来自花粉过敏原。
30.根据权利要求29的重组过敏原，其特征在于它来自分类学上的山毛榉目、木犀目或松目产生的花粉过敏原。
31.根据权利要求30的重组过敏原，其特征在于它来自Bet v 1。
32.根据权利要求31的重组过敏原，其特征在于所述B细胞表位或所述至少一个区段中的至少一个氨基酸残基被取代。
33.根据权利要求31的重组过敏原，其特征在于所述取代是Asp25Gly，Asn28Thr+Lys32Gln，Glu45Ser，Asn47Ser，Lys55Asn，Thr77Ala，Pro108Gly或Asn28Thr+Lys32Gln+Glu45Ser+Pro108Gly。
34.根据权利要求29的重组过敏原，其特征在于它来自分类学上的Poales目产生的花粉过敏原。
35.根据权利要求29的重组过敏原，其特征在于它来自分类学上的菊目或荨麻目产生的花粉过敏原。
36.根据权利要求28的重组过敏原，其特征在于它来自室内粉尘螨过敏原。
37.根据权利要求36的重组过敏原，其特征在于它来自表皮螨属产生的螨虫过敏原。
38.根据权利要求28的重组过敏原，其特征在于它来自蟑螂过敏原。
39.根据权利要求28的重组过敏原，其特征在于它来自动物过敏原。
40.根据权利要求39的重组过敏原，其特征在于它来自猫、狗或马产生的动物过敏原。
41.根据权利要求28的重组过敏原，其特征在于它来自毒液过敏原。
42.根据权利要求41的重组过敏原，其特征在于它来自分类学上的膜翅目产生的毒液过敏原。
43.根据权利要求42的重组过敏原，其特征在于它来自分类学上的胡蜂科、蜜蜂科和蚁总科的目产生的毒液过敏原。
44.根据权利要求43的重组过敏原，其特征在于它来自Ves v 5。
45.根据权利要求41的重组过敏原，其特征在于至少一个氨基酸残基被取代。
46.根据权利要求44的重组过敏原，其特征在于所述取代是Lys72Ala或Tyr96Ala。
47.制备根据权利要求1-46中任意一项的重组过敏原的方法，其特征在于：
a)鉴定天然存在的过敏原中，在所述天然存在的过敏原来源的分类学目内所有已知同源蛋白质中具有超过70％相同性的保守氨基酸残基；
b)以具有至少20％的溶剂可接近性，确定过敏原分子三维结构表面至少4002连贯相连的至少一个区段的保守氨基酸残基，所述的至少一个区段包含至少一个B细胞表位；和
c)所述至少一个区段中的至少一个氨基酸残基被在所述天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的另一氨基酸取代，而基本上保留过敏原分子的总体α-碳骨架三级结构，以获得突变的过敏原，其中突变过敏原的特异性IgE结合相比于所述天然存在的过敏原的结合减少。
48.根据权利要求47的方法，其特征在于根据溶剂可接近性对所述至少一个区段中的氨基酸残基进行分级，并且取代溶剂可接近性更大的残基中的一个或多个氨基酸。
49.根据权利要求47或48的方法，其特征在于所述B细胞表位或所述至少一个区段中的一个或多个氨基酸残基的取代经定点诱变进行。
50.药用组合物，其特征在于它包含根据权利要求1-46中任意一项的重组过敏原，任选与药用上可接受的载体和/或赋形剂，和任选佐剂组合。
51.根据权利要求50的药用组合物，其特征在于它是针对在患有过敏反应的病人中天然存在的过敏原诱发的过敏反应的疫苗形式。
52.根据权利要求1-46中任意一项的重组过敏原或根据权利要求50-51中任意一项的药用组合物在制备用于在受试者中产生免疫应答的药物中的用途。
53.制备根据权利要求50-51中任意一项的药用组合物的方法，包括将至少一种根据权利要求1-46中任意一项的重组过敏原与药用上可接受的物质和/或赋形剂混合。
54.根据权利要求1-46中任意一项的重组过敏原或根据权利要求50-51中任意一项的药用组合物在制备用于对受试者进行接种或治疗的药物中的用途。
55.根据权利要求1-46中任意一项的重组过敏原或者根据权利要求50-51中任意一项的药用组合物在制备用于治疗、预防或减轻过敏反应的药物中的用途。
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