NO328354B1

NO328354B1 - Mutante rekombinante allergener, fremgangsmate for fremstilling, farmasoytisk sammensetning og anvendelse.

Info

Publication number: NO328354B1
Application number: NO20004614A
Authority: NO
Inventors: Hans Henrik Ipsen; Michael Dho Spangfort; Jorgen Nedergaard Larsen
Original assignee: Alk Abello As
Priority date: 1998-03-16
Filing date: 2000-09-15
Publication date: 2010-02-01
Also published as: IL138339A; HUP0101464A2; PL343029A1; DE69939584D1; AU2714799A; HUP0101464A3; NO20004614L; CN1332029C; WO1999047680A1; ES2313776T3; CA2323687A1; KR20010041918A; IL138339A0; US20040091500A1; CA2323687C; AU749749B2; PL194804B1; EP1062341B1; HK1033591A1; JP2002506648A

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse gjelder nye rekombinante allergener som er ikke-naturlig forekommende mutanter avledet fra naturlig forekommende allergener. Videre gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av slike rekombinante allergener såvel som farmasøytiske sammensetninger, innbefattet vaksiner som omfatter de rekombinante allergener. I videre utførelsesformer gjelder foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for fremstilling av de farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen, og anvendelse av rekombinante allergener for fremstilling av medikamenter.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Genetisk predisponerte individer blir sensibiliserte (allergiske) mot antigener, som har opphav fra en rekke kilder i omgivelsene, til hvilke allergener individene utsettes. Den allergiske reaksjon skjer når et på forhånd sensibilisert individ reeksponeres overfor det samme eller et homologt allergen. Allergiske responser varierer fra høysnue, rinokon-duktivitet, rinitt og astma til systemisk anafylakse og død som respons på for eksempel bistikk eller vepsestikk eller insektbitt. Reaksjonen er umiddelbar og kan forårsakes av en rekke atopiske allergener, for eksempel forbindelser med opphav i gress, trær, ugress, insekter, matvarer, medikamenter, kjemikalier og parfymer.

Responsene utløses imidlertid ikke når et individ eksponeres overfor et allergen for første gang. Den innledende adaptive respons tar tid, og gir vanligvis ingen symptomer. Men, når antistoffer og T-celler som kan reagere med allergenet er dannet, kan enhver påfølgende eksponering frembringe symptomer. Allergiske responser demonstrerer således at immunresponsen i seg selv kan forårsake signifikante patologiske tilstander som kan være livstruende.

Antistoffene som deltar i atopisk allergi, tilhører hovedsakelig immunglobuliner av IgE-klassen. IgE binder til spesifikke reseptorer på overflaten av mastceller og basofile celler. Etter kompleksdannelse mellom et spesifikt allergen og IgE bundet til mastceller, fører reseptorkryssbinding på celleoverflaten til signaldannelse via reseptorene og mål-cellenes fysiologiske respons. Degranulering fører til frigivelse av bla. histamin, heparin, en kjemotaktisk faktor for eosinofile leukocytter, leukotrienene C4, D4 og E4, som gir langvarig konstriksjon av bronkiale glatte muskelceller. De resulterende virkninger kan være systemiske eller lokale.

Antistoff-formidlede hypersensitivitetsreaksjonene kan inndeles i fire klasser, nemlig type I, type II, type III og type IV. Allergiske reaksjoner av type I er den klassiske, umiddelbare hypersensitivitetsreaksjonen som opptrer i løpet av sekunder eller minutter etter antigeneksponering. Disse symptomer formidles av allergenspesifikt IgE.

Allergene reaksjoner observeres vanligvis som en respons på proteinallergener som foreligger i f.eks. pollen, husstøvmidd, dyrehår og flass, gifter og matprodukter.

For å redusere eller eliminere allergiske reaksjoner benyttes ofte nøye kontrollerte og gjentatte tilførsler av allergivaksiner. Allergi vaksinasjon utføres tradisjonelt ved parenteral, intranasal eller sublingual tilførsel i økende doser over et temmelig langt tidsrom, og fører til desensibilisering av pasienten. Den nøyaktige immunologiske mekanisme er ikke kjent, men induserte forskjeller i fenotypen til allergenspesifikke T-celler antas å være av spesiell betydning.

Antistoffbindende epitoper ( B- celle- epitoper)

Røntgen-krystallografiske analyser av Fab-antigen-komplekser har gitt økt forståelse av antistoffbindende epitoper. Ut fra denne type analyser kan antistoffbindende epitoper defineres som et område på overflaten av antigenet som omfatter atomene fra 15-25 aminosyrerester, som ligger i en avstand fra atomene i antistoffet som tillater direkte interaksjon. Affiniteten av antigen-antistoff-interaksjonen kan ikke forutsies ut i fra entalpien med bidrag fra van der Waals-interaksjoner, hydrogenbindinger eller ione-bindinger bidrar med alene. Entropien som er forbundet med den nærmest fullstendige frastøtning av vannmolekyler fra grenseflaten, representerer et energibidrag som er av tilsvarende størrelse. Dette betyr at perfekt tilpasning mellom konturene av de interager-ende molekyler er en hovedfaktor som ligger til grunn for høy-affinitetsinteraksjoner mellom antigen og antistoff.

Aller gi- vaksinasion

Vaksinasjonsbegrepet er basert på to fundamentale egenskaper ved immunsystemet, nemlig spesifisitet og hukommelse. Vaksinasjon vil forhåndspåvirke mottakerens immunsystem, og ved gjentatt eksponering overfor tilsvarende proteiner vil immunsystemet være i stand til å respondere mer rigorøst på utfordringen forbundet med for eksempel en mikrobiell infeksjon. Vaksiner er blandinger av proteiner som er ment å benyttes ved vaksinering med det formål å frembringe en slik beskyttende immunrespons hos mottakeren. Beskyttelsen vil kun omfatte bestanddeler som foreligger i vaksinen og homologe antigener.

Sammenlignet med andre former for vaksinasjon kompliseres allergivaksinasjon ved forekomsten av en pågående immunrespons hos allergiske pasienter. Denne immunrespons særpreges av nærvær av allergenspesifikt IgE som formidler utløsning av allergiske symptomer ved eksponering overfor allergener. Således har allergivaksinasjon som benytter allergener fra naturlige kilder en iboende risiko for bivirkninger som i sin ytterste konsekvens kan være livstruende for pasienten.

Tilnærminger for å omgå dette problem, kan inndeles i tre kategorier. I praksis kombineres ofte tiltak fra mer enn én kategori. Den første kategori av tiltak, omfatter tilførsel av flere små doser over et forlenget tidsrom for å nå en omfattende akkumulert dose. Den andre kategori av tiltak omfatter fysisk modifisering av allergenene ved innføring av disse i gelsubstanser som aluminiumhydroksid. Utforming med aluminiumhydroksid har en adjuvansvirkning og en deponeringsvirkning med langsom allergenfirgivelse, noe som reduserer vevskonsentrasjonen av aktive allergenbestanddeler. Den tredje kategori av tiltak omfatter kjemisk modifisering av allergenene med det formål å redusere allergenisitet, dvs. IgE-binding.

Den detaljerte mekanisme som ligger bak vellykket allergivaksinasjon forblir kontro-versiell. Det er imidlertid enighet om at T-celler spiller en nøkkelrolle i totalreguler-ingen av immunresponsene. Ifølge hva som er vanlig akseptert i dag, bestemmer forholdet mellom to ekstreme T-celle-fenotyper, Thl og Th2, individets allergiske status. Ved stimulering med allergen utskiller Thl-celler interleukiner som domineres av interferon-y, noe som fører til beskyttende immunitet og et friskt individ. Th2-celler skiller på den annen side hovedsakelig ut interleukin 4 og 5, noe som fører til IgE-syntese og eosinofili, og individet er allergisk. In v/Vro-undersøkelser har antydet muligheten for å endre responsene til allergenspesifikke T-celler ved tilførsel av allergenavledede peptider som inneholder relevante T-celle-epitoper. Dagens tilnærminger til nye allergivaksiner er derfor hovedsakelig basert på å påvirke T-cellene, hvor målet er å gjøre dem tause (anergi-induksjon) eller å forskyve responsen fra Th2-fenotypen til Th 1 -fenotypen.

WO 97/30150 (ref. 1) angår en populasjon av proteinmolekyler som har en fordeling av spesifikke mutasjoner av aminosyresekvensen sammenlignet med et utgangsprotein. Fra beskrivelsen fremgår det at oppfinnelsen gjelder fremstilling av analoger som er modifisert sammenlignet med utgangsproteinet, men som tas opp, fordøyes og presenteres for T-celler på samme måte som utgangsproteinet (naturlig forekommende allergener). På denne måten oppnås en modifisert T-cellerespons. Biblioteker av modifiserte proteiner fremstilles ved benyttelse av en teknikk betegnet PM ("Parsimonious Mutagenesis" eller "sparsom mutagenese").

IWO 92/02621 (ref. 2) beskrives rekombinante DNA-molekyler som omfatter et DNA som koder for et polypeptid med minst én epitop fra et allergen fra trær fra ordenen Fagales, hvor allergenet er utvalgt blant Aln g 1, Cor a 1 og Bet v 1. De rekombinante molekylene som beskrives heri har alle en aminosyresekvens eller en del av en aminosyresekvens som tilsvarer sekvensen til et naturlig forekommende allergen.

WO 90/11293 (ref. 3) gjelder bl.a. isolerte allergene peptider fra androsiapollen og modifiserte ambrosiapollenpeptider. Peptidene som beskrives i denne referansen har en aminosyresekvens som tilsvarer enten sekvensen til det naturlig forekommende allergen eller til naturlig forekommende isoformer av dette.

Kjemisk modifisering av allergener

Flere tilnærminger til kjemisk modifisering av allergener har blitt utført. Tilnærminger fra det tidlige syttitall omfatter kjemisk kobling av allergener til polymerer og kjemisk kryssbinding av allergener ved benyttelse av formaldehyd etc, hvorved de såkalte

"allergoider" fremstilles. Tankegangen bak disse tilnærminger var tilfeldig ødeleggelse av IgE-bindende epitoper ved tilkobling av den kjemiske ligand og derved redusere IgE-bindingen samtidig som immunogenisiteten ble bibeholdt ved kompleksenes forhøyede molekylvekt. Iboende ulemper ved "allergoid"-fremstilling er koblet til vanskeligheter når det gjelder å kontrollere den kjemiske kryssbindingsprosess og vanskeligheter ved analyse og standardisering av de resulterende høymolekylære komplekser. "Allergoider" er for tiden i klinisk anvendelse, og grunnet den tilfeldige ødeleggelse av IgE-bindende epitoper kan høyere doser tilføres enn for konvensjonelle vaksiner, men parametere vedrørende sikkerhet og effektivitet er ikke forbedret sammenlignet med konvensjonelle vaksiner.

Nyere tilnærminger til kjemisk modifisering av allergener er rettet mot en fullstendig ødeleggelse av allergenets tertiærstruktur og således eliminering av IgE-bindingen idet det antas at det viktigste terapeutiske mål er den allergenspesifikke T-cellen. Slike vaksiner inneholder allergensekvensavledede syntetiske peptider som representerer minimale T-celle-epitoper, lengre peptider som representerer sammenkoblede T-celle-epitoper, lengre allergensekvensavledede syntetiske peptider som representerer områder med immundominante T-celle-epitoper eller allergenmolekyler kuttet i to halvdeler ved rekombinante teknikker. En annen tilnærming basert på denne tankegang er den fore-slåtte anvendelse av rekomibante isoformer med "lav IgE-binding". I de senere år har det blitt klarlagt at naturlige allergener er heterogene og inneholder isoallergener og varianter hvor opptil tilnærmet 25% av aminosyrene er substituert. Noen rekombinante isoallergener har vist seg mindre effektive når det gjelder IgE-binding, muligens grunnet irreversibel denaturering og følgelig total ødeleggelse av tertiærstrukturen.

In vitro- mutagenese og allergivaksinasjon

Forsøk på å redusere allergenisiteten ved in vjTro-setestyrt mutagenese har blitt utført med en rekke allergener, innbefattet Der p 2 (Takai et al., ref. 4), Der p 2 (Smith et al, ref. 5), en 39 kDa Dermatophagoides farinae- dXlexgen (Aki et al, ref. 6), fosfolipase A2 fra bigift (Forster et al, ref. 7), Ara h 1 (Burks et al, ref. 8), Ara h 2 (Stanley et al, ref. 9), Bet v 1 (Ferreira et al, ref. 10 og 11), profilin fra bjerk (Wiedemann et al, ref. 12) og Ory s 1 (Alvarez et al, ref. 13).

Tankegangen bak disse tilnærminger er igjen å påvirke allergenspesifikke T-celler og samtidig redusere faren for IgE-formidlede bivirkninger ved å redusere eller eliminiere IgE-bindingen ved å ødelegge tertiærstrukturen til det rekombinante mutante allergen. Tankegangen bak disse tilnærminger omfatter ikke begrepet dominante IgE-bindende epitoper, og den omfatter ikke konseptet initiering av en ny beskyttende immunrespons som også involverer B-celler og antistoffdannelse.

Artikkelen til Ferreira ét al, (ref. 11) beskriver anvendelse av setestyrt mutagenese med det formål å redusere IgE-binding. Selv om den tredimensjonale strukturen til Bet v 1 er nevnt i artikkelen, benytter forfatterne ikke strukturen for utvelgelse av overflateeksponerte aminosyrerester for mutasjon, av hvilke halvparten har en lav grad av løse-middeleksponering. De benytter snarere en fremgangsmåte utviklet for utvelgelse av funksjonelle aminosyrerester i proteiner som avviker fra konseptet om strukturbasert identifisering av konserverte overflateområder som beskrives her. Selv om forfatterne diskuterer konservering av a-karbonryggradens tertiærstruktur, er dette konseptet ikke en del av den terapeutiske strategi, men inngår kun for å anslå IgE-binding in vitro. Videre er bevismaterialet som presenteres ikke tilstrekkelig, siden normalisering av CD-spektret forhindrer evaluering av denaturering av en andel av prøven, noe som er et vanlig problem. Den terapeutiske strategi som beskrives er rettet mot å indusere toleranse i allergenspesifikke T-celler, og initiering av en ny immunrespons er ikke nevnt.

Artikkelen av Wiedemann et al, (ref. 12) beskriver anvendelse av setestyrt mutagenese og peptidsyntese med det formål å karakterisere epitoper til monoklonale antistoffer. Forfatterne har kunnskap om antigenets tertiærstruktur, og de benytter denne kunnskap for utvelgelse av en overflate-eksponert aminosyre for mutasjon. Den benyttede algorit-men kan sies å være motsatt av den som beskrives av de foreliggende oppfinnere, siden en aminosyre som avviker fra homologe sekvenser utvelges. Undersøkelsen viser at substitusjon av en overflateeksponert aminosyre kan modifisere bindingsegenskapene til et monoklonalt antistoff, noe som ikke er overraskende dersom alminnelige kunnskaper tas i betraktning. De beskrevne eksperimenter er ikke utformet for å anslå modulering av bindingen av polyklonale antistoffer, for eksempel IgE fra allergiske pasienters serum. Ett av eksperimentene som inngår benytter serum-IgE, og selv om dette eksperiment ikke er egnet for kvantitative målinger, ser IgE-bindingen ikke ut til å påvirkes av de utførte mutasjoner.

Artikkelen av Smith et al, beskriver anvendelse av setestyrt mutagenese med det formål å kartlegge epitoper for monoklonale antistoffer og redusere IgE-bindingen. Forfatterne har ikke kjennskap til tertiærstrukturen, og gjør ikke forsøk på å anslå konserveringen av a-karbonryggradens tertiærstruktur. Den benyttede algoritme sikrer ikke at aminosyrer som utvelges for mutasjon faktisk er eksponert på molekylets overflate. Kun én av de beskrevne mutanter fører til en vesentlig reduksjon av IgE-binding. Denne mutant mangler evnen til å binde alle analyserte antistoffer, noe som tyder på at tertiærstrukturen er ødelagt. Forfatterne definerer ingen terapeutisk strategi, og initiering av en ny immunrespons nevnes ikke.

Artikkelen av Colombo et al, (ref. 14) beskriver en undersøkelse av en IgE-bindende epitop ved benyttelse av setestyrt mutagenese og peptidsyntese. Forfatterne benytter en tredimensjonal datamaskinmodellstruktur basert på krystallstrukturen til et homologt protein for å illustrere nærvær av epitopen på molekylets overflate. Videre nærvær av en epitop i et forskjellig allergen med primær strukturhomologi undersøkes ved å benytte syntetiske peptider som representerer epitopen. Den terapeutiske strategi er basert på behandling ved å benytte dette syntetiske peptid som representerer en monovalent IgE-bindende epitop. Konserverte overflateområder blant homologe allergener såvel som det terapeutiske konsept å initiere en ny beskyttende immunrespons, nevnes ikke.

Artikkelen av Spangfort et al, (ref. 15) beskriver den tredimensjonelle strukturen og de konserverte overflate-eksponerte områder på det viktigste bjerkeallergen. Artikkelen nevner ikke viktige IgE-bindende epitoper og heller ikke setestyrt mutagenese, og terapeutisk anvendelse blir heller ikke nevnt.

Ikke i noen av undersøkelsene beskrevet ovenfor reduseres IgE-bindingen ved substitusjon av overflateeksponerte aminosyrer samtidig som a-karbonryggradens tertiærstruktur bibeholdes. Tankegangen bak de ovenfornevnte tilnærminger omfatter ikke konseptet begrepet dominante IgE-bindende epitoper, og omfatter ikke det terapeutiske konseptet å innlede en ny, beskyttende immunrespons.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser mutantspesifikke oligonukleotidprimere benyttet for Bet v 1-mutant nummer 1. Muterte nukleotider er understreket. Figur 2 viser to generelt anvendbare primere (betegnet "all-sense" og "all non-sense") som ble syntetisert og benyttet for alle mutanter.

Figur 3 viser en oversikt over alle Bet v 1 -mutasjoner.

Figur 4 viser inhibering av binding av biotinylert rekombinant Bet v 1 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Bet v 1 og ved Bet v 1 Glu45Ser-mutant. Figur 5 inhibering av bindingen av biotinylert rekombinant Bet v 1 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Bet v 1 og ved Bet v 1-mutant Asn28Thr+Lys32Gln. Figur 6 viser inhiberingen av binding av biotinylert rekombinant Bet v 1 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Bet v 1 og ved Bet v 1 Prol08Gly-mutant. Figur 7 viser inhiberingen av binding av biotinylert rekombinant Bet v 1 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Bet v 1 og ved Bet v 1 Glu60Ser-mutant. Figur 8 viser CD-spektret for rekombinant mutant og "Triple-patch"-mutant målt ved tilnærmet like konsentrasjoner. Figur 9 viser inhiberingen av binding av biotinylert rekombinant Bet v 1 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Bet v 1 og ved Bet v 1 "Triple-patch"-mutant. Figur 10 viser løsemiddeltilgjengeligheten for enkelt-aminorester i sammenstilte antigen-5-sekvenser og en sammenstilling av Vespula- antigen 5-sekvenser (venstre felt). I høyre felt i figur 10 vises molekyloverflaten til antigen 5 med områder som er konservert blant Vespitla- antigen 5:s. Figur 11 viser sekvensen til primeren som tilsvarer aminoterminal av Ves v 5, avledet fra "sense"-tråden. Sekvensen til nedstrømsprimeren er avledet fra "non-sense"-tråden. Figur 12 viser to generelt anvendbare primere (betegnet "all sense" og "all non-sense", som ble syntetisert og benyttet for alle mutanter.

Figur 13 viser en oversikt over alle Ves v 5-mutasjoner.

Figur 14 viser inhiberingen av binding av biotinylert rekombinant Ves v 5 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Ves v 5 og ved Ves v 5 Lys72Ala-mutant.

OPPFINNELSENS FORMÅL

Tankegangen bak foreliggende oppfinnelse

Foreliggende oppfinnelse er basert på en unik tankegang. Ifølge denne tankegang er mekanismen for vellykket allerginvaksinasjon ikke en endring av den pågående

immunrespons av Th2-type, men snarere en samtidig initiering av en ny immunrespons av Thl-type som omfatter tertiær epitopgjenkjenning ved B-celler og antistoffdannelse. Denne modell understøttes av observasjonen av at nivåer av spesifikke IgE ikke endres ved vellykket vaksinasjonsbehandling, og at vellykket behandling ofte ledsages av en

omfattende økning i mengden allergenspesifikk IgG4.1 tillegg viser undersøkelser av nesebiopsier før og etter allergenbehandling ingen reduksjon i T-celler med Th2-lignende fenotype. Det observeres snarere en økning av Thl-lignende T-celler. Dersom vaksinen (eller de farmasøytiske preparater) tilføres via en annen vei enn luftveiene, er hypotesen at den nye Thl-lignende immunrespons utvikles i et sted som er fysisk adskilt fra den pågående Th2-responsen, noe som tillater at de to responser kan forløpe samtidig.

En annen viktig side ved tankegangen bak foreliggende oppfinnelse er den påviste eksi-stens av dominant IgE-bindende epitoper. Det foreslås at disse dominante IgE-bindende epitoper består av tertiærstrukturavhengige, sammenhengende overflateområder som er tilstrekkelig store til å tillate antistoffbinding og som er konservert blant isoallergener, varianter og/eller homologe allergener fra beslektede arter. Eksistensen av kryssreager-ende IgE som kan bindes til tilsvarende epitoper i homologe allergener, understøttes av den kliniske observasjon at allergiske pasienter ofte reagerer på flere nært beslektede arter, f.eks. or, bjerk og hassel, flere gressarter, eller flere arter fra husstøvmiddslekten Dermatophagoides. Dette understøttes videre av laboratorieeksperimenter som viser IgE-kryssreaktivitet mellom homologe allergener fra beslektede arter og et allergens evne til å inhibere bindingen av IgE til homologe allergener (Ipsen et al. 1992, ref. 16). Det er velkjent at eksponering og immunresponser er forbundet på en doseavhengig måte. Basert på en kombinasjon av disse observasjoner, er hypotesen at konserverte overflateområder eksponeres for immunsystemet i høyere doser enn ikke-konserverte overflateområder, noe som fører til dannelse av IgE-antistoffer med høyere affinitet, hvorav begrepet "dominante IgE-bindende epitoper".

Ifølge denne tankegang er det essensielt at allergenet har en tertiær struktur for a-karbonryggraden som i det vesentlige er den samme som strukturen til det naturlige allergenet, noe som sikrer konservering av overflatetopologien til områder som omgir konserverte flekker som representerer mutagenesemål hvor målet er å redusere IgE-bindingen. Ved å oppfylle disse kriterier har allergenet evnen til å tilføres i relativt høyere doser, noe som forbedrer effektiviteten når det gjelder frembringelse av en beskyttende immunrespons uten å redusere sikkerheten.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse gjelder innføringen av kunstige aminosyresubsti tusj oner i definerte, avgjørende posisjoner, samtidig som tertiærstrukturen til allergenets a-karbonryggrad bibeholdes.

Oppfinnelsen tilveiebringer et ikke-naturlig forekommende rekombinant allergen avledet fra et naturlig forekommende allergen, kjennetegnet ved det naturlig forekommende allergen omfatter minst ett område av konserverte aminosyrerester som er sammenhengende forbundet over minst 400 Å<2> på overflaten av allergenmolekylets tredimensjonale struktur, definert ved å ha en løsemiddeltilgjengelighet på minst 20% og som er konservert ved at det er identisk i mer enn 70% av sekvensene til homologe sekvenser innen den samme taksonomiske orden som det naturlig forekommende allergen har opprinnelse fra, hvor området omfatter minst én B-celle-epitop; hvori 1) mutanten omfatter minst en substitusjon av en konservert aminosyre lokalisert i det minst ene området, hvor den konserverte aminosyrerest har en løsemiddel-^tilgjengeUgheLpå-minst-20%,.med_en-aminosyrerestsorn-ikkejbrekommer_i samme posisjon i aminosyresekvensen til noen av de kjente homologe proteiner innen den samme taksonomiske orden som det naturlig forekommende allergen, 2) mutant allergen har vesentlig samme tertiærstruktur for a-karbonryggraden som det naturlig forekommende allergen, og 3) den spesifikke IgE-binding til det muterte allergen er redusert sammenlignet med bindingen til det naturlig forekommende allergen.

I en utførelse er det naturlig forekommende allergen et inhalasjonsallergen, spesielt et pollenallergen.

Spesifikk IgE-binding til det muterte allergen reduseres fortrinnsvis med minst 5%, mer foretrukket minst 10% sammenlignet med naturlig forekommende isoallergener eller tilsvarende rekombinante proteiner i en immunanalyse med serum fra kildespesifikke IgE-reaktive allergiske pasienter eller fra grupper av slike.

I en utførelse er det rekombinante allergen ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at den spesifikke IgE binding til det muterte allergen er redusert med minst 5%, fortrinnsvis minst 10%.

I en annen utførelse er det rekombinante allergen ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at det kvadratiske middelverdiawik for atomkoordinantene er under 2Å ved sammenligning av a-karbonryggradens tertiærstruktur for mutanten og det naturlig forekommende allergenmolekyl.

I en annen utførelse er det rekombinante allergen ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at det minst ene området omfatter atomer fra 15-25 aminosyrerester.

I en annen utførelse er det rekombinante allergen ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at aminosyrerestene i det minst ene området er rangert ut fra løsemiddeltilgjengelig-heten, og at én eller flere aminosyrer blant de mest løsemiddeltilgjengelige er substituert.

I en annen utførelse er det rekombinante allergen ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at én eller flere aminosyrerester i det minst ene området som har en løsemiddeltilgjenge-lighet på 20-80% er substituert.

I en annen utførelse er det rekombinante allergen ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at 1-5 aminosyrerester pr. 400 Å<2> i det minst ene området er substituert.

I en annen utførelse er det rekombinante allergen ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at minst en aminosyrerest i B-celle-epitopen er substituert.

I en annen utførelse er det rekombinante allergen ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at substitusjonen av én eller flere aminosyrerester i B-celle-epitopen eller i det minst ene området er utført ved setestyrt mutagenese.

Rekombinante allergener ifølge oppfinnelsen kan på egnet vis avledes fra inhalasjonsallergener med opphav i bl.a. trær, gress, urter, sopp, husstøvmidd, kakerlakker, dyrehår og -flass. Viktige pollenallergener fra trær, gress og urter har opphav i de taksonomiske ordener av Fagales, Oleales og Finales, innbefattet bl.a. bjerk ( Betitla), or ( Alnus) hassel ( Corylus), bøk ( Carpinus) og oliven ( Olea), ordenen Poales som omfatter bl.a. gress fra slektene Lolium, Phelum, Poa, Cynodon, Dactylis og Secale, ordenene Asterales ogUrticales som omfatter bl.a. urter fra slektene Ambrosia og Artemisia. Viktige inhalsjonsallergener fra sopp er bl.a. allergener med opphav i slektene Alternaria og Cladosporium. Andre viktige inhalasjonsallergener er allergener fra husstøvmidd fra slekten genus Dermatophagoides, allergener fra kakerlakker og allergener fra dyr som katt, hund og hest. Videre kan rekombinante allergener ifølge oppfinnelsen avledes fra giftallergener, innbefattet giftallergener med opphav i stikkende eller bitende insekter, for eksempel allergener fra den taksonomiske orden Hymenoptera som omfatter bier (superfamilie Apidae), veps (superfamilie Vespided) og maur (superfamilie Formicoidae).

Spesifikke allergenbestanddeler omfatter f.eks. Bet v 1 ( B. vermcosa, bjerk), Aln g 1 ( Alnus glutinosa, or), Cor a 1 ( Corylus avelana, hassel) og Car b 1 ( Carpinus betulus, hornbøk) fra ordenen Fagales. Andre er Cry j 1 ( Pinales), Amb a 1 og 2, Art v 1 ( Asterales), Par j 1 ( Urticales), Ole e 1 ( Oleales), Ave e 1, Cyn d 1, Dac g 1, Fes p 1, Hol 1 1, Zo/ p 1 og 5, Pas n 1, P/z//? 1 og 5, Poa p\, 2 og 5, Sec c 1 og 5, og Sor /i 1 (forskjellige gresspollen), Alt a 1 og Cia h 1 (sopp), Der f\ og 2, Der p 1 og 2 (husstøv-midd, D. farinae henholdsvis D. pteronyssinus, Bla g 1 og 2, Per a 1 (kakerlakker, Blatella germanica henholdsvis Periplaneta americana, Fel d 1 (katt), Can f 1 (hund). Equ c 1, 2 og 3 (hest), ^p/s w 1 og 2 (bier), fes g 1, 2 og 5, Pol a 1,2 og 5 (alle veps) og Sol i 1,2, 3 og 4 (pissmaur).

I én utførelse er det rekombinante allergen avledet fra Bet v 1. Eksempler på substitusjoner er Asp25Gly, (Asn28Thr + Lys32Gln), Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Thr77Ala, Prol08Gly og (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Prol08Gly. De rekombinante allergener kan åpenbart ha én eller flere substitusjoner.

I en annen utførelse er det rekombinante allergen avledet fra et giftallergen fra den taksonomiske orden Vespidae, Apidae og Formicoidae.

I nok en utførelse er det rekombinante allergen avledet fra Ves v 5. Eksempler på substitusjoner er Lys72Ala og Tyr96Ala. Det er åpenbart at de rekombinante allergener kan ha én eller flere substitusjoner.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant allergen som definert heri, som omfatter: a) å identifisere aminosyrerester i et naturlig forekommende allergen som er konservert med mer enn 70% identitet i alle kjente homologe proteiner innen den taksonomiske orden som det naturlig forekommende allergen har opphav i; b) å definere minst ett område med konserverte aminosyrerester som er sammenhengende forbundet over minst 400 Å<2> på overflaten av allergenmolekylets tredimensjonale struktur, hvor det minst ene området omfatter minst en B-celle epitop; og c) å substituere minst én overflateeksponert aminosyrerest, definert ved å ha en løsemiddeltilgjengelighet på minst 20%, i det minst ene området med en

annen aminosyre som ikke forekommer i samme posisjon i aminosyresekvensen til noe kjent homologt protein innen den taksonomiske orden som det naturlig forekommende allergen har opphav i, samtidig som den

generelle tertiærstruktur til allergenmolekylets a-karbonryggrad i det vesentlig er bevart, for erholdelse av et mutert allergen hvori den spesifikke IgE-binding til det muterte allergen er redusert, sammenlignet med binding til det naturlig forekommende allergen.

I denne fremgangsmåten oppnås de beste resultater ved at aminosyrerestene i det minst ene området er rangert ut fra løsemiddeltilgjengelighet og én eller flere aminosyrer blant de mer løsemiddel tilgjengelige er substituert.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres generelt substitusjon av én eller flere amonosyrerester i B-celle-epitopen eller i minst ett slikt område ved setestyrt mutagenese. . Konservering av a-karbonryggradens tertiærstruktur bestemmes best ved å erholde identiske strukturer ved røntgenkrystallografi eller NMR før og etter mutagenesen. I fravær av strukturelle data kan det å beskrive det uendrede CD-spektret for mutanten eller immunokjemiske resultater, f.eks. antistoffreaktivitet, gjøre konservering av a-karbonryggradens tertiærstruktur sannsynlig ved sammenligning med resultater erholdt ved analyse av dets strukturbestemte molekyl.

Foreliggende oppfinnelse angår også bruk av det rekombinante allergen ifølge oppfinnelsen som et farmasøytika.

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning som omfatter et rekombinant allergen som definert heri, kombinert med et farmasøytisk akseptabelt bærestoff og/eller eksipiens og om ønskelig en adjuvans.

En slik farmasøytisk sammensetning kan foreligge i form av en vaksine for behandling eller forhindring av allergiske reaksjoner igangsatt av et naturlig forekommende allergen.

Det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter sammenblanding av minst ett rekombinant allergen ifølge oppfinnelsen og farmasøytisk aksepterbare forbindelser og/eller eksipienser.

De farmasøytiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan erholdes ved fremgangsmåten som defineres ovenfor.

I en annen utførelse angår oppfinnelsen anvendelse av et rekombinant allergen som definert ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling eller forhindring av allergiske reaksjoner.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Substitusionskriterier

For molekyler hvor tertiærstrukturen er bestemt (f.eks. ved røntgenkrystallografi eller NMR-elektronmikroskopi) bør mutanten som bærer den eller de substituerte aminosyrer fortrinnsvis oppfylle følgende kriterier: 1. Den generelle tertiærstruktur av molekylets a-karbonryggrad bør være konservert. Konservert er definert som et gjennomsnittlig kvadratisk middelverdiawik for atomkoordinatene ved sammenligning av strukturene som er lavere enn 2Å<2>. Dette er viktig av to grunner: a) Det forventes at overflaten til det naturlige allergen utgjør et sammen hengende hele av overlappende, potensielle antistoffbindende epitoper. Størstedelen av molekylets overflate påvirkes ikke av substitusjonen eller substitusjonene og bibeholder således sine antistoffbindende egenskaper, noe som er viktig for frembringelse av nye, beskyttende antistoffspesifisiteter som er rettet mot epitoper som også foreligger på det naturlige allergen, b) Stabilitet, både når det gjelder lagringstid og ved injeksjon i kroppsvæsker. 2. Aminosyren eller -syrene som skal substitueres, bør være lokalisert på overflaten og således være tilgjengelige for antistoffbinding. Aminosyrer som er lokalisert på overflaten er definert som aminosyrer i den tredimensjonale struktur som har en løsemiddel (vann)-tilgjengelighet på minst 20%, fortrinnsvis 20-80%, mer foretrukket 30-80%. Løsemiddeltilgjengelighet defineres som den del av molekylets overflate som er tilgjengelig for en kule med en radius som tilsvarer et løsemiddelmolekyl (for vann, r = 1,4 Å). 3. Den eller de substituerte aminosyrer bør foreligge i konserverte områder som er større enn 400 Å<2>. Konserverte områder defineres som sammenhengende områder med overflate-eksponerte konserverte aminosyrerester og ryggrad. Konserverte aminosyrerester defineres ved sekvenssammenstilling av alle kjente (utledede) aminosyresekvenser for homologe proteiner innen den taksonomiske orden. Aminosyreposisjoner med identiske aminosyrerester i mer enn 90% av sekvensene, ansees å være konserverte. Konserverte områder forventes å inneholde epitoper mot hvilke IgE i flertallet av pasienter er rettet. 4. Innenfor de konserverte områder bør aminosyrer for mutagenese fortrinnsvis utvelges blant de mest løsemiddel (vann) tilgjengelige, fortrinnsvis lokalisert nær sentrum av det konserverte området.

Fortrinnsvis substitueres en polar aminosyrerest med en annen polar rest og en ikke-polar aminosyrerest med en annen ikke-polar rest.

Fremstilling av vaksiner er generelt velkjent innen faget.Vaksiner fremstilles typisk som injiserbare midler, enten som væskeløsninger eller suspensjoner. Slike vaksiner kan også emulgeres eller utformes slik at nasal tilførsel tillates. Den immunogene bestanddel det gjelder (det rekombinante allergen definert heri) kan med fordel være sammenblandet med eksipienser som er farmasøytisk aksepterbar og ellers kompatible med den aktive bestanddel. Eksempler på egnede eksipienser er vann, saltvann, dekstrose, glyserol, etanol og lignende såvel som kombinasjoner av disse. Vaksinen kan i tillegg inneholde andre forbindelser som for eksempel fuktingsmidler, emulsjonsmidler, buffersubstanser eller adjuvanser som forsterker vaksinens effektivitet.

Vaksiner tilføres hyppigst parenteralt ved subkutan eller intramuskulær injeksjon. Preparater som er egnet for tilførsel via andre veier omfatter orale preparater og stikkpiller. Vaksiner for oral tilførsel kan med fordel utformes med eksipienser som vanligvis benyttes for slike preparater, f.eks. farmasøytiske renhetsgrader av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, cellulose, magnesiumkarbonat og lignende. Preparatet kan uformes som løsninger, suspensjoner, emulsjoner, tabletter, piller, kapsler, preparater for vedvarende frigivelse, aerosoler, pulvere eller granulater.

Vaksinene tilføres på en slik måte at de er kompatible med doseringsutformingen og i en mengde som vil være terapeutisk effektiv og immunogen. Mengden aktiv bestanddel som inngår i vaskingen, avhenger av individet som skal behandles, bl.a. evnen til individets immunsystem til å respondere på behandlingen, tilførselsveien og individets alder og vekt. Egnede doseringsområder kan variere innenfor området fra tilnærmet 0,0001 ug til 1000 ug.

Som nevnt ovenfor kan en forsterket virkning oppnås ved å tilsette adjuvanser til preparatet. Eksempler på slike adjuvanser er aluminiumhydroksid og aluminiumfosfat (alum) som en 0,05 til 0,1 prosent løsning i fosfatbufret saltvann eller syntetiske sukkerpolymerer benyttet som 0,25 prosent løsning. Sammenblanding med bakterieceller som C. parvum, endotoksiner eller lipopolysakkaridbestanddeler fra gram-negative bakterier, emulsjon i fysiologisk aksepterbare oljebærestoffer som mannid-monoaleat (Aracel A) eller emulsjon med en 20 prosent løsning av et perfluorkarbon (f.eks. Fluosol-DA) benyttet som en blokkeringssubstitusjon, kan også benyttes. Andre adjuvanser som Freund's fullstendige og ufullstendige adjuvans, såvel som QuilA og RIBI, kan også benyttes.

Oftest vil flere gangers tilførsel av vaksinen være nødvendig for å sikre en virkning. Vaksinen tilføres ofte som en innledende tilførsel fulgt av på hverandre følgende inoku-lasjoner eller andre former for tilførsel. Antall vaksinasjoner vil typisk ligge i området fra 1 til 50, vanligvis ikke mer enn 35 vaksinasjoner. Vaksinasjonen vil normalt utføres fra to ganger ukentlig til to ganger i måneden over et tidsrom fra 3 måneder til 5 år. Dette forventes å gi det ønskede nivå av profylaktisk eller terapeutisk virkning.

Det rekombinante allergen kan også benyttes som et farmasøytisk preparat, noe som er fordelaktig for å oppnå en viss beskyttelse mot allergiske responser i den del av året hvor symptomene forekommer (profylakse). Vanligvis vil behandling måtte gjentas hvert år for å bibeholde den beskyttende virkning. Preparater utformet for nasal tilførsel er spesielt egnet for dette formål.

Foreliggende oppfinnelse beskrives nå videre ved de påfølgende ikke-begrensende eksempler.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Identifisering av felles epitoper blant fagfl/ e. y- pollenallergener

Hovedallergenet fra bjerkepollen, Bet v 1, viser tilnærmet 90% aminosyresekvens-identitet med hovedallergener fra pollen fra taksonomisk beslektede trær, dvs. Fagales (for eksempel hassel og bøk), og bjerkepollenallergiske pasienter viser ofte kliniske symptomer med allergisk kryssreaktivitet mot disse proteinene som er homologe med Bet v 1.

Bet v 1 viser også tilnærmet 50-60% sekvensidentitet med allergiske proteiner som foreligger i visse frukter (for eksempel eple og kirsebær) og grønnsaker (for eksempel selle-ri og gulrot) og det foreligger klinisk bevismateriale for allergisk kryssreaktivitet mellom Bet v 1 og disse matrelaterte proteinene.

I tillegg viser Bet v 1 signifikant sekvensidentitet (20-40%) med en gruppe planteproteiner som betegnes patogeneserelaterte proteiner (PR-10). Det foreligger imidlertid ingen rapporter vedrørende allergisk kryssreaktivitet mot disse PR-10-proteinene.

Molekylmodellering antyder at strukturen av allergener fra Fagales og mat og PR-10-proteinene nærmest er identiske med strukturen til Bet v 1.

Det strukturelle grunnlag for allergisk Bet v 1-kryssreaktivitet ble rapportert i (Gajhede et al., 1996, ref. 17), hvor tre områder på molekyloverflaten til Bet v 1 kunne vises å være felles for de viktigste kjente tre pollenallergener. Således ville ethvert IgE som kunne gjenkjenne disse områder i Bet v 1 være istand til å kryssreagere med og binde til andre viktige Faga/es-pollenallergener og gi opphav til allergiske symptomer. Identifiseringen av disse fellesområder ble utført etter sammenstilling av alle kjente aminosyresekvenser for de viktigste tre pollenallergener, kombinert med en analyse av molekyloverflaten til Bet v 1 ut fra a-karbonryggradens tertiærstruktur, rapportert i ref. 17. I tillegg ble områdene definert til å ha en viss minimumsstørrelse (>400 Å<2>) basert på det område som dekkes av et antistoff ved binding.

Utvelgelse av aminosyrerester for setestyrt mutagenese

Aminosyrerester for setestyrt mutagene ble utvalgt blant aminosyrerester som foreligger i Bet v 1-spesifikke områder og i fellesområdene, siden modifisering av disse forventes å påvirke bindingen av serum-IgE fra flertallet av pasienter som viser kliniske trepollen-allergisk kryssreaktivitet.

Den relative orientering og prosent løsemiddeleksponering for hver aminosyrerest i det angjeldende område ble beregnet ut fra atomkoordinater. Aminosyrerester med lav grad av løsemiddeleksponering (<20%) ble ikke avsett som relevante for mutagenese, grunnet mulig forstyrrelse av strukturen eller mangel på interaksjon med antistoff. De gjenværende aminosyrerester ble rangert ut fra graden av løsemiddeleksponering.

Sekvenssammenstilling

Sekvenser som er homologe med søkesekvensen ( Bet v 1 nr. 2801, WHO IUIS Nomenclature Subcommitte on Allergens) ble ekstrahert fra sekvensdatabåsene GenBank og EMBL ved et BLAST-søk (Altschul et al., ref. 18). Alle sekvenser med sannsynligheter rapportert av BLAST som var mindre enn 0,1 ble tatt i betraktning, og en liste som inneholdt en utgave av hver homolog sekvens ble oppstilt. Disse ble sammenstilt med dataprogrammet CLUSTAL W (Higgins et al., ref. 19) og prosent identitet ble beregnet for hver posisjon i sekvensen idet enten hele listen eller kun taksonomisk beslektede arter ble tatt i betraktning. I alt 122 sekvenser viste homologi med Bet v 1 nr. 2801, av hvilke 57 sekvenser som hadde opphav i taksonomiske beslektede arter.

Kloning av genet som koder for Bet v 1.

RNA ble fremstilt fra Betitla verrucosa-^ poWen (Allergon, Sverige) ved fenolekstraksjon og utfelling med LiCl. Oligo (dT)-cellulose-afifnitetskromatografi ble utført porsjonsvis i Eppendorph-rør, og dobbelttrådet cDNA ble syntetisert ved benyttelse av et kommersi-elt tilgjengelig sett (Amersham). DNA som koder for Bet v 1 ble amplifisert ved PCR og klonet. Kort beskrevet ble PCR utført med cDNA som templat, og primere utformet for å stemme med cDNA-sekvensen i posisjoner som tilsvarer aminoenden av Bet v 1 og det 3'-ikke-translaterte området. Primerne ble forlenget i de 5'-merkede endene for innføring av restriksonsseter ( Ncol og Hindlll) for styrt kloning inn i pKK233-2.

Subkloning i pMAL- c

Genet som koder for Bet v 1 ble deretter subklonet i maltosebindende protein-fusjons-vektoren pMAL-c (New England Biolabs). Genet ble amplifisert ved PCR og subklonet i samme leseramme som malE for dannelse av operoner for maltosebindende protein ( MBP)- Bet v 1-proteinfusjon i hvilke MBP og Bet v 1 var adskilt av et faktor Xa-prote-asekløvingssete, plassert slik at den naturlige aminoterminale sekvensen av Bet v 1 ville gjendannes ved kløvingen, som beskrevet i ref. 15. Kort beskrevet ble PCR utført med pKK233-3 med Bet v 1-innskudd som templat og primere tilsvarte proteinets aminoende henholdsvis karboksyende. Primeren som lå nærmest promoteren ble forlenget i den 5'-enden for å innføre 4 kodoner som koder for et faktor Xa-proteasekløvingssete i samme leseramme. Begge primere ble videre forlenget i 5'-endene for innføring av restriksjonsseter ( Kpnl) for kloning. De Bet v 1-kodende gener ble subklonet ved benyttelse av 20 PCR-sykluser for å redusere hyppigheten av PCR-artefakter.

In vfYro- mutagenese

In v//ro-mutagenese ble utført ved PCR med rekombinant pMAL-c med Bet v l-innskudd som templat. Hvert mutant Bet v 1-gen ble dannet ved 3 PCR-reaksjoner med 4 primere.

To mutansjonsspesifikke oligonukleotidprimere ble syntetisert slik at de oppfattet hver mutasjon, én primer for hver DNA-tråd, se figurene 1 og 2. Ved benyttelse av det eller de muterte nukleotider som utgangspunkt, ble begge primere forlenget 7 nukleotider mot 5'-enden og 15 nukleotider i den 3'-enden. Nukleotidene i de forlengede områder var identiske i sekvens med Bet v 1-genet i det aktuelle området.

To generelt anvendbare primere (betegnet "all-sense" og "all non-sense" i figur 2) ble så syntetisert og benyttet for alle mutanter. Disse primere var 15 nukleotider lange og tilsvarer i sekvens områder i pMAL-c-vektoren som ligger tilnærmet 1 kilobase oppstrøms og nedstrøms for Bet v 1. Sekvensen til oppstrømsprimeren er avledet fra "sense"-tråden og sekvensen til nedstrømsprimeren fra "non-sense"-tråden, se fig. 2.

To uavhengige PCR-reaksjoner ble utført, i det vesentlige ifølge standard fremgangsmåter (Saiki et ai, 1988, ref. 20), bortsett fra at kun 20 temperatursykluser ble utført for å redusere hyppigheten av PCR-artifakter. Hver PCR-reaksjon benyttet pMAL-c med Bet v 1-innskudd som templat og én mutasjonsspesifikk og én generelt anvendbar primer i meningsfulle kombinasjoner. Innføring av de fire aminosyresubstitusjonene (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Prol08Gly) i "Triple-patch"-mutanten ble utført som beskrevet ovenfor i en trinnvis prosess. Først ble Glu45Ser-mutasjonen, så Prol08Gly-mutasjonen og til slutt Asn28Thr, Lys32Gln-mutasjonene innført ved benyttelse av pMAL-c med innsatt Bet v 1 nr. 2801, Bet v 1 ( Glu45Ser) henholdsvis Bet v 1 { Glu45Ser, Prol08Gly) som templater.

PCR-produktene ble renset ved agarosegel-elektroforese og elektroeluering fulgt av etanolutfelling. En tredje PCR-reaksjon ble utført ved benyttelse av de sammenblandede PCR-produkter fra de første to PCR-reaksjonene som templat og begge de generelt anvendbare primere. Igjen ble 20 sykluser med standard PCR benyttet. PCR-produktet ble renset ved agarosegel-elektroforese og elektroeluering fulgt av etanolutfelling, kutting med restriksjonsenzymer ( BsiWVEcoRl), og retningsstyrt ligering inn i pMAL-c med Bet v 1 -innskudd, kuttet med de samme enzymer.

Figur 3 viser en oversikt over alle 9 Bet v 1-mutasjoner, som er som følger:

ThrlOPro, Asp25Gly, Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Glu60Ser ("non-patch"), Thr77Ala og Prol08Gly. En ytterligere fire-mutant med fire mutasjoner ble også fremstilt: (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Prol08Gly). Av disse ble det for ytterligere testing valgt: Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Glu60Ser, ProlOSGly og 'Triple-patch"-mutanten Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Prol08Gly.

Nukleotidesekvensering

Bestemmelse av nukleotidsekvensen til det Bet v 1-kodende gen ble utført før og etter subkloning og etter in vzYro-mutagenese.

Plasmid DNA fra 10 ml bakteriekultur dyrket til metning over natten i LB-medium tilsatt 0,1 g/l ampicillin ble renset på Qiagen-tip 20-kolonner og sekvensert ved benyttelse av DNA-sekvenseringssettet Sequenase versjon 2,0 (USB) ifølge leverandørens rekommandasjoner.

Ekspresjon og rensing av rekombinant Bet v 1 og mutanter

Rekombinant Bet v 1 { Bet v 1 nr. 2801 og mutanter) ble overuttrykt i Escherichia coli DH 5a fusjonert til maltosebindende protein og renset som beskrevet i ref. 15. Kort beskrevet ble rekombinant E. co//-celler dyrket ved 37°C til en optisk tetthet på 1,0 ved 436 nm, hvoretter ekspresjon av Bet v 1-fusjonsproteinet ble indusert ved tilsetning av IPTG. Cellene ble høstet ved sentrifugering 3 timer etter induksjonen, resuspendert i lyseringsbuffer og oppbrutt ved ultralydbehandling. Etter ultralydbehandlingen og nok en sentrifugering, ble rekombinant fusjonsprotein isolert ved

amyloseaffinitetskromatografi og deretter kløvet ved inkubasjon med faktor Xa (ref.

15). Etter F Xa-kløving ble rekombinant Bet v 1 isolert ved gelfiltrering og, dersom dette ble funnet nødvendig, behandlet med nok en runde med

amyloseaffinitetskromatografi for å fjerne spormengder av maltosebindende protein.

Renset rekombinant Bet v 1 ble konsentrert ved ultrafiltrering til tilnærmet 5 mg/ml og lagret ved 4°C. Sluttutbyttet i de rensede preparater av rekombinant Bet v 1 var mellom 2-5 mg pr. liter E. co//-cellekultur.

Preparatene med renset rekombinant Bet v l fremstod som enkeltbånd etter sølvfarget SDS-polyakrylamidelektroforese med en tilsynelatende molekylvekt på 17,5 kDa. N-terminal sekvensering viste de forventede sekvenser som utledet fra cDNA-nukleotid-sekvensene og kvantitativ aminosyreanalyse viste de forventede aminosyresammenset-ningene.

Vi har tidligere vist (ref. 15) at rekombinant Bet v lnr. 2801 er immunokjemisk ikke til å skille fra naturlig forekommende Bet v 1.

Immunelektroforese med polvklonale antistoffer fra kanin

De syv mutante Bet v 1 ble fremstilt som rekombinante Bet v 1-proteiner og renset som beskrevet ovenfor, og analysert for reaktivitet overfor polyklonale antistoffer fra kanin rettet mot Bet v 1 isolert fra bjerkepollen. Ved analyse ved immunelektroforese (rakett-linje-immunelektroforese) under native betingelser, var kaninantistoffene istand til å utfelle alle mutanter, noe som tyder på at mutantene hadde konservert tertiærstruktur for a-karbonryggraden.

Disse resultater tydet på at ikke-naturlig forekommende substitusjoner innført på molekyloverflaten til Bet v 1 kan redusere en polyklonal antistoffrespons rettet mot naturlig forekommende Bet v 1 uten at den totale tertiærstrukturen for allergenets a-karbonryggrad ødelegges. For å analysere virkningen av en human polyklonal IgE-response, ble mutantene Glu45Ser, Prol08Gly, Asn28Ther+Lys32Gln og Glu60Ser utvalgt for videre analyse.

Bet v lGlu45Ser- mutant

Glutaminsyre i posisjon 45 viser en høy grad av løsemiddeleksponering (40%) og er lokalisert i et molekyloverflateområde som er felles for Faga/es-allergener (område I). En serinrest ble funnet i posisjon 45 i noen av PR-10-proteinene som er homologe med Bet v 1, noe som taler for at glutaminsyre kan erstattes med serin uten at a-karbonryggradens tertiærstruktur ødelegges. I tillegg gir, siden ingen av de kjente Fagales- aller-gensekvenser har serin i posisjon 45, substitusjonene av glutaminsyre med serin opphav til et ikke-naturlig forekommende Bet v 1 molekyl.

T- celle- proliferasjonsanalvse med rekombinant Glu45Ser Bet v 1- mutant

Analysen ble utført som beskrevet i Spangfort et al. 1996a. Det ble funnet at rekombinant Bet v 1 Glu45Ser-mutant var istand til å indusere proliferasjon i T-cellelinjer fra tre forskjellige pasienter allergiske mot bjerkepollen, med stimuleringsverdier tilsvarende rekombinant og naturlig forekommende allergen.

Krvstallisering og staikturbestemmelse av rekombinant Glu45Ser Bet v 1

Krystaller av rekombinant Glu45Ser Bet v 1 ble fremstilt ved dampfasediffusjon ved 25°C, i det vesentlige som beskrevet i (Spangfort et al., 1996b, ref. 21). Glu45Ser Bet v 1 i en konsentrasjon på 5 mg/ml ble blandet med et likt volum 2,0 M ammoniumsulfat, 0,1 M natriumcitrat, 1% (v/v) dioksan, pH 6,0 og ekvilibrert mot 100x volumer 2,0 M ammoniumsulfat, 0,1 M natriumcitrat, 1% (v/v) dioksan, pH 6,0. Etter 24 timers ekvilibrering ble krystallveksten indusert ved benyttelse av kimteknikken beskrevet i ref. 21, med krystaller av rekombinant vill-type- Bet v 1 som kimkilde.

Etter tilnærmet 2 måneder ble krystallene høstet og analysert med røntgenstråler dannet fra en Rigaku roterende anode som beskrevet i ref. 21, og strukturen ble bestemt ved benyttelse av molekylær utskiftning.

Struktur av Bet v 1 Glu45Ser- mutant

Den strukturelle virkning av mutasjonen ble undersøkt ved å dyrke tredimensjonale Bet v lGlu45Ser-proteinkrystaller som ga diffraksjon til 3,0 Å-resolusjon ved analyse ved røntgenstråler dannet fra en roterende anode. Substitusjonen av glutaminsyre til serin i posisjon 45 ble bekreftet ved Bet v 1 Glu45Ser-strukturen elektrontetthetskart, som også viste at a-karbonryggradens generelle tertiærstruktur er bevart.

IgE- bindingsegenskaper til Bet v 1 Glu45Ser- mutant

IgE-biningsegenskapene til Bet v 1 Glu45Ser-mutant ble sammenlignet med rekombinant Bet v 1 i en IgE-inhibeirngsanalyse i væskefase ved benyttelse av en blanding av serum-IgE erholdt fra pasienter allergiske mot bjerk.

Rekombinant Bet v 1 nr. 2801 ble biotinylert ved et molart forhold på 1:5 ( Bet v 1 nr. 2801:biotin). Inhiberingsanalyse ble utført som følger: En serumprøve (25 ul) ble inkubert med anti-IgE i fast fase, vasket, resuspendert og inkubert videre med en blanding av biotinylert Bet v 1 nr. 2801 (3,4 nM) og en gitt mutant (0-28,6 nM). Mengden biotinylert Bet v 1 nr. 2801 bundet til den faste fasen, ble beregnet ut fra den målte RLU etter inkubering med akridiniumestermerket streptavidin. Inhiberingsgraden ble beregnet som forholdet mellom RLU erholdt med buffer og RLU erholdt med mutant som inhibitor.

Figur 4 viser inhiberingen av binding av biotinylert rekombinant Bet v 1 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Bet v 1 og ved Bet v 1 Glu45Ser-mutant.

Det er en klar forskjell i mengden av de rekombinante proteiner som er nødvendig for å oppnå 50% inhibering av bindingen til serum-IgE som foreligger i serumblandingen. Rekombinant Bet v 1 gir 50% inhibering ved tilnærmet 6,5 ng, mens den tilsvarende konsentrasjon for Bet v 1 Glu45Ser-mutant har tilnærmet 12 ng. Dette viser at punktmutasjonen innført i Bet v 1 Glu45Ser-mutanten reduserer affiniteten for spesifikt serum-IgE med en faktor på tilnærmet 2. Det maksimale inhiberingsnivået som ble oppnådd med Bet v 1 Glu45Ser-mutanten er klart lavere enn nivået for rekombinant Bet v 1. Dette kan tyde på noen at de spesifikke IgE som foreligger i serumblandingen er ute av stand til å gjenkjenne Bet v 1 Glu45Ser-mutanten etter Glu45Ser-substitusjonen.

Bet v 1- mutant Asn28Thr+ Lvs32Gln

Aspartat og lysin i posisjon 28 henholdsvis 32, viser høy grad av løsemiddeleksponering (35% henholdsvis 50%) og er lokalisert i et molekyloverflateområde som er felles for Fagales- ahergener (område II). I strukturen er aspartat 28 og lysin 32 plassert nær hverandre på molekyloverflaten, og interagerer sannsynligvis via hydrogenbindinger. En treoninrest og en glutamatrest ble funnet å besitte posisjonene 28 henholdsvis 32 i noen av PR-10-proteinene som er homologe med Bet v 1, noe som taler for at aspartat og lysin kan erstattes med treonin henholdsvis glutamat, uten å forstyrre ct-karbonryggradens tertiærstruktur. I tillegg gir, siden ingen av de naturlig forekommende isoallergensekvenser har treonin og glutamat i posisjonene 28 henholdsvis 32, substitusjonene opphav til et ikke-naturlig forekommende Bet v 1-molekyl.

IgE- bindingsegenskaper av Bet v 1- mutant

Asn28Thr+ Lvs32Gln

IgE-bindingsegenskapene til mutant Asn28Thr+Lys32Gln ble sammenlignet med rekombinant Bet v li en IgE-inhibeirngsanalyse i væskefase ved benyttelse av blandingen av serum-IgE erholdt fra pasienter allergiske mot bjerk, beskrevet ovenfor.

Figur 5 viser inhiberingen av binding av biotinylert rekombinant Bet v 1 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Bet v 1 og ved Bet v 1-mutant Asn28Thr+Lys32Gln.

Det er en klar forskjell i mengden av de rekombinante proteiner som er nødvendige for å oppnå 50% inhibering av bindingen til serum-IgE som foreligger i serumblandingen. Rekombinant Bet v 1 gir 50% inhibering ved tilnærmet 6,5 ng, mens den tilsvarende konsentrasjon for Bet v 1-mutant Asn28Thr+LysGln er tilnærmet 12 ng. Dette viser at punktmutasjonene innført i Bet v 1-mutant Asn28Thr+Lys32Gln reduserer affiniteten for spesifikt serum-IgE med en faktor på tilnærmet 2.

Det maksimale inhiberingsnivå som nås av Bet v 1-mutant Asn28Thr+Lys32Gln-mutanten er klart lavere enn nivået oppnådd med rekombinant Bet v 1. Dette kan tyde på at etter Asn28Thr+Lys32Gln-substitusjonene er noen av de spesifikke IgE som foreligger i serumblandingen ute av stand til å gjenkjenne Bet v 1-mutant Asn28Thr+Lys32Gln.

Bet v 1- mutant Prol08Glv

Prolin i posisjon 108 viser en høy grad av løsemiddeleksponering (60%) og er lokalisert i et molekyloverflateområde som er felles for Faga/es-allergener (område III). En glysinrest ble funnet i posisjon 108 i noen av PR-10-proteinene som er homologe med Bet v 1, noe som taler for at prolin kan erstattes med glysin uten å forstyrre cc-karbonryggradens tertiærstruktur. Siden ingen av de naturlig forekommende isoallergensekvenser har glysin i posisjon 108, vil substitusjon av prolin med glysin i tillegg gi opphav til et ikke-naturlig forekommende Bet v 1-molekyl.

IgE- bindingsegenskaper til Bet v i Prol08Gly- mutant

IgE-bindingsegenskapene til Bet v 1 Prol08Gly-mutant ble sammenlignet med rekombinant Bet v 1 i en IgE-inhiberingsanalyse i væskefase, ved benyttelse av blandingen av serum-IgE erholdt fra pasienter allergiske mot bjerk, beskrevet ovenfor.

Figur 6 viser inhiberingen av binding av biotinylert rekombinant Bet v 1 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Bet v 1 og ved Bet v 1 Prol08Gly-mutant.

Det er en klar forskjell i mengden av de rekombinante proteiner som er nødvendige for å nå 50% inhibering av bindingen av serum-IgE som foreligger i serumblandingen. Rekombinant Bet v 1 gir 50% inhibering ved tilnærmet 6,5 ng, mens den tilsvarende konsentrasjon for Bet v 1 Prol80Gly er 15 ng. Dette viser at den enkle punktmutasjon som er innført i Bet v 1 Prol08Gly reduserer affiniteten for spesifikt serum-IgE med en faktor på tilnærmet 2.

Det maksimale inhiberingsnivået som oppnås med Bet v 1 Prol08Gly-mutanten er noe lavere enn for rekombinant Bet v l. Dette kan tyde på at etter Prol08Gly-substitusjonen, er noen av de spesifikke IgE som foreligger i serumblandingen ute av stand til å gjenkjenne Bet v 1 Prol08Gly-mutanten.

Bet v 1- mutant Glu60Ser (" non- patch"- mutant)

Glutaminsyre i posisjon 60 viser høy grad av løsemiddeleksponering (60%), aminosyreresten er imidlertid ikke lokalisert i et molekyloverfiateområde som er felles for Fflga/es-allergener. En serinrest ble funnet i posisjon 60 inne i noen av PR-10-proteinene som er homologe med Bet v 1, noe som taler for at glutaminsyre kan erstattes med serin uten å forstyrre a-karbonryggradens tertiærstruktur. Siden ingen av de naturlig forekommende isoallergensekvenser har serin i posisjon 60, vil substitusjon av glutaminsyre med serin i tillegg gi opphav til et ikke-naturlig forekommende Bet v 1-molekyl.

IgE- bindingsegenskapene til Bet v 1 Glu60Ser- mutant

IgE-bindingsegenskapene til Bet v 1 Glu60Ser-mutant ble sammenlignet med rekombinant Bet v 1 i en IgE-inhibeirngsanalyse i væskefase ved benyttelse av blandingen serum-IgE erholdt fra pasienter allergiske mot bjerk, beskrevet ovenfor.

Figur 7 viser inhibering av bindingen av bitinylert rekombinant Bet v 1 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Bet v 1 og ved Bet v 1 Glu60Ser-mutant. I motsetning til Glu45Ser-, Prol08Gly- og Asn28Thr+Lys32Gln-mutantene, viser substitusjonen glutaminsyre 60 til serin, ingen signifikant virkning på IgE-bindingsegenskapene til molekylet. Dette tyder på at substitusjoner utenfor de definerte fellesområder for Fagales kun har en marginal virkning på bindingen av spesifikt serum-IgE, noe som understøtter idéen om at konserverte molekyloverflateområder i allergener verner dominante IgE-bindende epitoper.

Bet v 1 " Triple- patch"- mutant

I 'Triple-patch"-mutanten ble punktmutasjonene (Glu45Ser, Asn28Thr+Lys32Gln og Prol08Gly) innført i de tre forskjellige fellesområdene i Fagales, beskrevet ovenfor, samtidig innført ved dannelse av en kunstig mutant med fire aminosyresubstitusjoner.

Strukturanalyse av Bet v 1 " Triple- patcrT- mutant

Den strukturelle integritet av den rensede "Triple-patch"-mutanten ble analysert ved sirkulær dikroisme (CD)-spektroskopi. Figur 8 viser CD-spektret for rekombinant protein og "Triple-patch"-mutant, oppsamlet ved tilnærmet like konsentrasjoner. Overlappet i topp-amplityder og posisjoner i CD-spektrene fra de to rekombinante proteiner, viser at de to preparater inneholder like mengder av sekundære strukturer, noe som i høy grad tyder på at a-karbonryggradens tertiærstruktur ikke påvirkes av de innførte aminosyresubstitusjoner.

IgE- bindingsegenskapene til Bet v 1 " Triple- patch"- mutant

IgE-bindingsegenskapene til Bet v 1 "Triple-parch"-mutant ble sammenlignet med rekombinant Bet v 1 i en IgE-inhibeirngsanalyse i væskefase ved benyttelse av blandingen av serum-IgE erholdt fra pasienter allergiske mot bjerk, beskrevet ovenfor.

Figur 9 viser inhibering av bindingen av biotinylert rekombinant Bet v 1 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Bet v 1 og ved Bet v 1 "Triple-patch"-mutant. I motsetning til de enkle mutanter beskrevet ovenfor, er

inhiberingskurven for "Triple-patch"-mutanten ikke lenger parallell med kurven relativ til rekombinant Bet v 1. Dette viser at substitusjonene innført i "Triple-patch"-mutanten har endret IgE-bindingsegenskapene og epitop-profilen sammenlignet med rekombinant Bet v 1. Denne manglende parallellitet gjør det vanskelig å kvantitere reduksjonen i 'Triple-patch"-mutantens affinitet for spesifikt serum-IgE.

Rekombinant Bet v 1 gir 50% inhibering ved tilnærmet tilnærmet 6 ng, mens den tilsvarende konsentrasjon for Bet v 1 "Triple-patch"-mutanten er 30 ng, dvs. en affinitet redusert med en faktor på 5. For å nå 80% inhibering er imidlertid de tilsvarende verdier 20 ng henholdsvis 400 ng, dvs. en reduksjon med en faktor på 20.

T- celleproliferasionsanalyse ved rekombinant Bet v 1 ' Triple- patch"- mutant

Analysen ble utført som beskrevet i ref. 15. Det ble funnet at rekombinant Bet v 1 'Triple-patch"-mutanten var istand til å indusere proliferasjon i T-cellelinjer fra tre forskjellige pasienter allergiske mot bjerkepollen med stimuleringsverdier tilsvarende rekombinant og naturlig forekommende allergen. Dette tyder på at "Triple-patch"-mutanten kan initiere den cellulære immunresponsen som er nødvendig for antistoffproduksjon.

EKSEMPEL 2

Identifisering av epitoper som er felles for Vespula vulsaris gift hovedallergen antigen 5 Antigen 5 er ett av de tre vespidgiftproteinene som er kjente allergener hos mennesker. Vespidene omfatter geitehams, "yellow-jacket" og veps. De andre kjente to allergener i vespidgifter er fosfolipase Ai og hyaluronidase. Antigen 5 fra Vespula vulgaris ( Ves v 5) har blitt klonet og uttrykt som rekombinant protein i gjærsystemet (Monsalve et al. 1999, ref. 22). Den tredimensjonelle krystallstruktur av rekombinant Ves v 5 er nylig bestemt ved 1,8 Å-resolusjon (manuskript under forberedelse). Strukturens hovedegenskaper består av fire pMråder og fire a-helikser arrangert i tre lag over hverandre, noe som gir opphav til en "o>P-a-"sandwich". Sekvensidentiteten mellom antigen 5-homologe allergener fra forskjellige Vespula- avter er tilnærmet 90%, noe som tyder på nærvær av konserverte molekyloverflateområder og B-celle-epitoper.

Nærvær og identifisering av felles områder ble utført etter sammenstilling som tidligere beskrevet for trepollenallergener, av alle kjente aminosyresekvenser for Vespula- antigen 5-allergener kombinert med en analyse av molekyloverflaten av antigen 5 utfra den tredimensjonelle struktur av Ves v 5. Figur 10 viser løsemiddeltilgjengeligheten av enkeltvis sammenstilte antigen 5-aminosyrerester og sammenstilling av Vespulci- antigen 5-sekvensene (venstre felt). I høyre felt i figur 10 vises molekyloverflaten til antigen 5 med områder som er konservert blant Vespula- antigen 5 i farve.

Utvelgelse av aminosyrerester for setestyrt mutagenese

Aminosyrerester for setestyrt mutagenese ble utvalgt blant aminosyrerester som representerer områdene som er felles for Vespula siden modifisering av disse forventes å påvirke bindingen av serum-IgE fra flertallet av pasienter som viser klinisk Vespula-allergisk kryssreaktivitet.

Den relative orientering og prosent løsemiddeleksponering for hver aminosyrerest i de angjeldende områder, ble beregnet basert på atomkoordinatene. Aminosyrerester med lav grad av løsningsmiddeleksponering ble ikke ansett egnede for mutagenese, grunnet mulig ødeleggelse av strukturen eller mangel på interaksjon med antistoff. De gjenværende aminosyrerester ble rangert ut fra graden av løsemiddeleksponering.

Kloning av genet som koder for Ves v 5

Totalt-RNA ble isolert fra giftsyrekjertlene fra Vespula vw/gam-vespider som beskrevet i (Fang et al., 1988, ref. 23).

Første-tråds cDNA-syntese, OCR-amplifisering og kloning av Ves v 5-genet ble utført som beskrevet i (Lu et al. 1993, ref. 24).

Subkloning i pPICZaA Genet som koder for Ves v 5 ble deretter suklonet i vektoren pPICZaA (Invitrogen) for ekspresjon og utskillelse av Ves v 5 i Pichia pastoris. Genet ble amplifisert ved PCR og subklonet i samme leseramme som den kodende sekvensen for cc-faktorsekresjonssig-naiet fra Saccharomyces cerevisiae. I denne konstruksjon avkløves a-faktoren in vivo ved Pichia pastoris fø.r2-proteasesystemet under utskillelsen av proteinet.

Kort beskrevet ble PCR utført med Ves v 5 som templat og primere som tilsvarer proteinets amino-ende henholdsvis karboksy-ende. Primerne var forlenget i 5'-enden for innføring av restriksjonsseter for kloning, EcoRI og Xbal. Nukleotider som koder for Kex2-kløyvingssetet var i denne konstruksjonen plassert 18 nukleotider oppstrøms for proteinets amino-ende, noe som fører til ekspresjon av Ves v 5 med seks ekstra aminosyrer, Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe i aminoenden.

Innføring av pPICZaA- Ves v 5 i P . pastoris

pPICZctA-vektorer med Ves v 5-genet ble lineærisert ved Sac I-kutting og innsatt i AOX1 locus i Pichiapastoris- <g>enomet Innføringen ble utført ved homolog rekombinasjon i Pichia pastoris KM71-celler ifølge anbefalingene til Invitrogen.

In vtVro- mutagenese

In v/Vro-mutagenese ble utført ved PCR ved rekombinant pPICZaA med Ves v 5 innsatt som templat. Hvert mutant Ves v 5-gen ble dannet ved 3 PCR-reaksjoner ved benyttelse av 4 primere.

To mutasjonsspesifikke oligonukleotidprimere ble syntetisert for hver mutasjon, én primer for hver DNA-tråd, se figurene 11 og 12. Ut fra det eller de muterte nukleotider ble hver primer forlenget 6-7 nukleotider i 5'-enden og 12-13 nukleotider i 3'-enden. Nukleotidene i de forlengede områdene var identiske i sekvens med Ves v 5-genet i det aktuelle området.

To generelt anvendbare primere (betegnet "all sense" og "all non-sense" i figur 12) ble også syntetisert og benyttet for alle mutanter. For å sikre ekspresjon av Ves v 5-mutanter med korrekt amino-ende, ble én primer tilsvarende proteinets amino-ende forlenget i 5'-enden med et Xho I-sete. Ved innføring av de mutante Ves v 5-genene i pPICZaA-vektoren, ble Kex2-proteasekløvingssetet gjendannet umiddelbart oppstrøms for aminoenden til Ves v 5. Den andre primer tilsvarte i sekvens et område i pPICZaA-vektoren som ligger tilnærmet 300 bp nedstrøms for Ves v 5-genet. Sekvensen til primeren som tilsvarer aminoenden av Ves v 5 er avledet fra "sense"-tråden, mens sekvensen til nedstrømsprimeren er avledet fra "non-sense"-tråden, se figur 11.

To uavhengige PCR-reaksjoner ble utført i det vesentlige ifølge standar fremgangsmåter (Saiki et al 1988) bortsett fra at kun 20 temperatursykluser ble utført for å redusere hyppigheten av PCR-artefakter. Hver PCR-reaksjon benyttet pPICZaA med Ves v 5-innskudd som templat og én mutasjonsspesifikk og én generelt anvendbar primer i meningsfulle kombinasjoner.

PCR-produktene ble renset ved benyttelse av "Concert, Rapid PCR Purification System" (Life Technologies). En tredje PCR-reaksjon ble utført med de sammenblandede PCR-produktene fra de første to PCR-reaksjoner som templat og begge de generelt anvendbare primere. Igjen ble 20 sykluser med standard PCR benyttet. PCR-produktet ble renset med "Concert, Rapid PCR Purification System"

(Life Technologies), kuttet med restriksjonsenzymer ( Xhol/ Xbal) og retningsstyrt ligert inn i pPICZaA-vektor kuttet med de samme enzymer. Figur 13 viser en oversikt over alle Ves v 5-mutasjonene.

Innføring av pPICZctA- Fe. y v 5- mutanter i P . pastoris

pPICZaA-vektorene med de mutante Ves v 5-gener innsatt ble lineærisert ved Sac I-kutting og innsatt i AOX1- locus i Pichia pastoris- genomet. Innsettingen ble utført ved homolog rekombinasjon i Pichia pastoris KM71-celler ifølge anbefalingene til Invitrogen.

Nukleotidsekvensering

Bestemmelse av nukleotidsekvensen til det Ves v 5-kodende genet ble utført før og etter subkloningen og etter in v/Vro-mutagenese.

Plasmid DNA fra 10 ml bakteriekultur dyrket til metning over natten i LB-medium tilsatt 0,1 g/l-ampicillin ble renset på Qiagen-tip 20 kolonner og sekvensert ved benyttelse av DNA-sekvenseirngs-settet Sequenase versjon 2,0 (USB) ifølge leverandørens anbefalinger.

Ekspresjon og rensing av rekombinant Ves v 5

Rekombinante gjærceller av Pichia pastoris- stamme KM71 ble dyrket i 500 ml kolber tilsatt 100 ml fosfatbuffer pH 6,0 tilsatt gjærnitrogenbase, biotin, glyserol og histidin ved 30°C under orbital omrysting ved 225 rpm inntil absorbansen ved 6000nm nådde 4-6. Cellene ble oppsamlet ved sentrifugering og resuspendert i 10 ml av tilsvarende bufret medium inneholdende metanol isteden for glyserol. Inkubasjon ble fortsatt ved 30°C i 7 dager med daglig tilsetning av 0,05 ml metanol.

Cellene ble høstet ved sentrifugering og den samlede dyrkningsvæske konsentrert ved ultrafiltrering. Etter dialyse oppmot 50 mM ammoniumacetatbuffer, pH 4,6, ble prøven påsatt en FPLC (Pharmacia) SE-53 kationbytterkolonne ekvilibrert med den samme buffer. Kolonnen ble eluert med en lineær gradient bestående av 0-1,0 M NaCl, 50 mM ammoniumacetat lineær gradient. Toppen for rekombinant Ves v 5, som eluerte ved tilnærmet 0,4 M NaCl, ble oppsamlet og dialysert mot 0,02 N eddiksyre. Etter oppkonsentrering til tilnærmet 10 mg/ml ble det rensede Ves v 5 lagret ved 4°C.

Krvstallisering av rekombinant Ves v 5

Krystaller av Ves v 5 ble fremstilt ved dampfasediffusjonsteknikken ved 25°C. For krystalliseringen ble 5 ul 5 mg/ml Ves v 5 blandet med 5 ul 18% PEG 6000, 0,1 M natriumsitrat, pH 6,0 og ekvilibrert mot 1 ml 18% PEG 6000,0,1 M natriumsitrat, pH 6,0.

Røntgendiffraksjonsverdier ble oppsamlet ved 100K fra native Ves v 5-krystaller og etter innføring av tungatomderivater, og benyttet for å løse den tredimensjonale struktur av Ves v 5, se figur 10 (manuskript under forberedelse).

Immunelektroforese med polyklonale antistoffer fra kanin

De to Ves v 5-mutantene ble fremstilt som rekombinante Ves v 5-proteiner og analysert for reaktivitet overfor polyklonale kaninantistoffer rettet mot rekombinant Ves v 5. Ved analyse ved rakett-immunelektroforese under native betingelser, var kaninantistoffene istand til å utfelle rekombinant Ves v 5 såvel som begge mutanter, noe som tyder på at mutantene har bevart a-karbonryggradens tertiærstruktur.

Inhibering av spesifikt serum- IgE

IgE-bindingsegenskapene til Ves v 5-mutantene ble sammenlignet med egenskapene til rekombinant Ves v 5 i en IgE-inhibeirngsanalyse i væskefase ved benyttelse av en blanding av serum-IgE erholdt fra pasienter allergiske mot vespidgift.

Inhiberingsanalyse ble utført som beskrevet ovenfor med biotinylert rekombinant Ves v 5 i stedet for Bet v 1.

Ves v 5 Lvs72Ala- mutant

Lysin i posisjon 72 viser høy grad av løsemiddeleksponering (70%) og er lokalisert til et molekyloverflateområde felles for Vespula- antigen 5. Den relative orientering og den høye grad av løsemiddeleksponering taler for at lysin 72 kan erstattes med en alaninrest uten å forstyrre a-karbonryggradens tertiærstruktur. Siden ingen av de naturlig forekommende isoallergensekvenser har alanin i posisjon 72, vil substitusjon av lysin med alanin i tillegg gi opphav til et ikke-naturlig forekommende Ves v 5-molekyl.

IgE- bindingsegenskapene til Ves v 5 Lvs72Ala- mutant

IgE-bindingsegenskapene til Ves v 5 Lys72Ala-mutant ble sammenlignet med rekombinant Ves v 5 i en IgE-inhibeirngsanalyse i væskefase ved benyttelse av blandingen av serum-IgE, erholdt fra pasienter allergiske mot vespidgift, beskrevet ovenfor.

Figur 14 viser inhibering av bindingen av biotinylert rekombinant Ves v 5 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Ves v 5 og ved Ves v 5 Lys72Ala-mutant.

Det er en klar forskjell i mengde av de rekombinante proteiner som er nødvendig for å nå 50% inhibering av bindingen til serum-IgE som foreligger i serumblandingen. Rekombinant Ves v 5 gir 50% inhibering ved tilnærmet 6 ng, mens den tilsvarende konsentrasjonen for Ves v 5 Lys72 Ala-mutant er 40 ng. Dette viser at den enkle punktmutasjon som er innført i Ves v 5 Lys72Ala-mutanten reduserer affiniteten for spesifikt serum-IgE med en faktor på tilnærmet 6. Det maksimale inhiberingsnivået som oppnås med Ves v 5 Lys72Ala-mutanten er signifikant lavere enn nivået for rekombinant Ves v 5. Dette kan tyde på at etter Lys72Ala-substitusjonen, er noen av de spesifikke IgE som foreligger i serumblandingen ute av stand til å gjenkjenne Ves v 5 Lys72Ala-mutanten.

Ves v 5 Tyr96Ala- mutant

Tyrosin i posisjon 96 viser høy grad av løsemiddeleksponering (65%) og er lokalisert i et molekyloverflateområde som er felles for Vespula- mtigen 5. Den relative orientering og den høye grad av løsemiddeleksponering taler for at tyrosin 96 kan erstattes med en alaninrest uten å forstyrre den tredimensjonale struktur. Siden ingen av de naturlig forekommende isoallergensekvenser har alanin i posisjon 96, gir substitusjonen av tyrosin med alanin i tillegg opphav til et ikke-naturlig forekommende Ves v 5-molekyl.

IgE- bindingsegenskapene til Ves v 5 Tvr96Ala- mutant

IgE-bindingsegenskapene til Ves v 5 Tyr96Ala-mutant ble sammenlignet med egenskapene til rekombinant Ves v 5 i en IgE-inhibeirngsanalyse i væskefase ved benyttelse av blandingen av serum-IgE erholdt fra pasienter allergiske mot vespidgift, beskrevet ovenfor.

Figur 14 viser inhibering av bindingen av biotinylert rekombinant Ves v 5 til serum-IgE fra en gruppe allergiske pasienter ved ikke-biotinylert Ves v 5 og ved Ves v 5 Tyr96Ala-mutant.

Det er en klar forskjell i mengden av de rekombinante proteiner som er nødvendig for å nå 50% inhibering av bindingen til serum IgE som foreligger i serumblandingen. Rekombinant Ves v 5 gir 50% inhibering ved tilnærmet 6 ng, mens den tilsvarende konsentrasjonen for Ves v 5 Tyr96Ala-mutant er 40 ng.

Dette viser at den enkle punktmutasjon som er innført i Ves v 5 Tyr96Ala-mutanten reduserer affiniteten for spesifikt serum-IgE med en faktor på tilnærmet 6.

Det maksimale inhiberingsnivå som oppnås med Ves v 5 Tyr96Ala-mutanten er signifikant lavere enn nivået for rekombinant Ves v 5. Dette kan tyde på at etter Tyr96Ala-substitusjonen, er noen av de spesifikke IgE som foreligger i serumblandingen ute av stand til å gjenkjenne Ves v 5 Tyr96Ala-mutanten.

REFERANSER

1. WO 97/30150 (Pangenetics B.V., Molecules for the induction of immunological tolerance) 2. WO 92/02621 (Biomay Biotechnik Produktions- und Handelsgesellschaft mbH, Allergens of Alder pollen and applications thereof) 3. WO 90/11293 (Immunologic Pharraaceutica<l> Corporation, The University of North Carolina at Chapel Hill, Allergenic proteins from ragweed and uses thereof) 4. Takai T, Yokota T, Yasue M, Nishiyama C, Yuuki T, Mori A, Okudaira H, Okumura Y: "Engineering of the major house dust mite allergen Der f 2 for allergen-specif ic immunotherapy". Nat Biotechnol 15, 754-758 (1997). 5. Smith AM, Chapman MD: "Localization of antigenic sites on Der p 2 using oligonucleotide-directed mutagenesis targeted to predicted surface residues". Clin Exp Allergy 27, 593-599 (1997). 6. Aki T, Ono K, Hidaka Y, Shimonishi Y, Jyo T, Wada T, Yamashita M, Shigeta S, Murooka Y, Oka S: "Structure of IgE epitopes on a new 39-kD allergen molecule from the house dust mite, Dermatophagoides farinae". Int Arch Allergy Immunol 103, 357-364 (1994). 7. Forster E, Dudler T, Gmachl M, Aberer W, Urbanek R,

Suter M: "Natural and recombinant enzymatically active or inactive bee venom phospholipase A2 has the same potency to release histamine from basophils in patients with Hymenoptera allergy". J Allergy Clin Immunol 95/ 1229-1235 (1995) . 8. Burks AW, Shin D, Cockrell G, Stanley JS, Helm RM, Bannon GA: "Mapping and mutational analysis of the IgE-binding epitopes on Ara hl, a legume vicilin protein and a major allergen in peanut hypersensitivity". Eur J Biochem 245, 334-339 (1997). 9. Stanley JS, King N, Burks AW, Huang SK, Sampson H, Cockrell G, Helm RM, West CM, Bannon GA: "Identification and iTiutational analysis of the immunodominant IgE binding epitopes of the major peanut allergen Ara h 2". Arch Biochem Biophys 342, 244-253 (1997). 10. Ferreira F, Rohlfs A, Hoffmann-Sommergruber K, Schenk S, Ebner C, Briza P, Jilek A, Kraft D, Breitenbach M, Scheiner 0: "Modulation of IgE-binding properties of tree poiien allergens by • aite-direcLcu Kiulayeiiesis". Adv Exp Med Biol 409, 127-135 (1996). 11. Ferreira F, Ebner C, Kramer B, Casari G, Briza P, Kungl AJ, Grimm R, Jah-Schmid B, Breiteneder H, Kraft D, Breitenbach M, Rheinberger H-J, Scheiner 0, "Modulation of IgE reactivity of allergens by site-directed mutagenesis: Potential use of hypeallergenic variants for immunotherapy", FASEB Journal for Experimental Biology Vol. 12, No. 2, February 1998, 231-242 (1998). 12. Wiedemann P, Giehl K, Almo SC, Fedorov AA, Girvin M, Steinberger P, Rudiger M, Ortner M, Sippl M, Dolecek C, Kraft D, Jockusch B, Valenta R: "Molecular and structural analysis of a continuous birch profilin epitope defined by a monocl.onal antibody"„ J Biol Chem 271, 29915-29921

(1996).

13. Alvarez AM, Fukuhara E, Nakase M, Adachi T, Aoki N, Nakamura R, Matsuda T: "Four rice seed cDNA clones belonging to the alpha-amylase/trypsin inhibitor gene family encode potential rice allergens". Biosci Biotechnol Biochem 59, 1304-1308 (1995).

14. Colombo P, Kennedy D, Ramsdale T, Costa MA, Djro G, Izzo V, Salvadori S, Guerrini R, Cocchiara R, Mirisola MG, Wood S, Geraci D, Journal of Immunology Vol. 160, No. 6, 15 March 1998, 2780-2875. 15. Spangfort MD, Ipsen H, Sparholt SH, Aasmul-Olsen S, Larsen MR, Mørtz E, Roepstorff P, Larsen JN: "Characteri-zation of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with Maltose-Binding Protein". Prot Exp Purification 8, 365-373 (1996a). 16. Ipsen H, Wihl J-A,. Petersen BN, Løwenstein H: "Specificity mapping of patients IgE response towards the tree pollen major allergens Aln g I, Bet v I and Cor a I." Clin. Exp. Allergy 22, 391-9, (1992) 17. Gajhede M, Osmark P, Poulsen FM, Ipsen H, Larsen JN, Joost van Neerven RJ, Schou C, Løwnstein H, and Spangfort MD: "X-ray and NMR structure of Bet v 1, the origin of birch pollen allergy". Nature structural biology 3, 1040-1045 (1996). 18. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, and Lipman DJ: "Basic local alignment search tool". J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990). 19. Higgins D, Thompson J, Gibson T, Thompson JD, Higgins DG, and Gibson TJ: "CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice". Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680 11QQA\ 20. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higucl R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA: "Primer-directi enzymatic amplification of DNA with a thermostable Dl polymerase". Science 239, 487-491 (1988). 21. Spangfort MD, Larsen JN, Gajhede M: "Crystallizatii and Preliminary X-ray Investigation at 2.0 Å Resolutic of Bet v 1, a Birch Pollen Protein Causing IgE-Mediat< Allergy". PROTEINS, Struc Func Genet 26, 358-360 (1996b) 22. Monsalve RI, Lu G, a»ab King TP: "Recombinant vent allergen, antigen 5 of yellowjacket (Vespula vulgari! and paper wasp (Polistes annularis) by expression : bacteria or yeast" (1999) Submitted. 23. Fang ""F.- Vitale M.. Fehlr.cr P ssé Kir« TP: <w>cD! cloning and priuiary structure of a white-face horne venom allergen, antigen 5". Proe. Nati. Acad. Sei. U£ 85, 895 (1988). 24. Lu G, Villalba M, Coscia MR,; Hoffman DR Sfcå King TI "Sequence Analysis and Antigenic Cross-reactivity of Venont Allergen, Antigen 5, from Hornets, Wasps, ai Yellow Jackets". Journal of Immunoloav 150. 2823-28;

Claims

1. Et ikke-naturlig forekommende rekombinant allergen avledet fra et naturlig forekommende allergen, karakterisert ved at det naturlig forekommende allergen omfatter minst ett område av konserverte aminosyrerester som er sammenhengende forbundet over minst 400 Å<2> på overflaten av allergenmolekylets tredimensjonale struktur, definert ved å ha en løsemiddeltilgjengelighet på minst 20% og som er konservert ved at det er identisk i mer enn 70% av sekvensene til homologe sekvenser innen den samme taksonomiske orden som det naturlig forekommende allergen har opprinnelse fra, hvor området omfatter minst én B-celle-epitop; hvori 1) mutanten omfatter minst en substitusjon av en konservert aminosyre lokalisert i det minst ene området, hvor den konserverte aminosyrerest har en løsemiddel-tilgjengelighet på minst 20%, med en aminosyrerest som ikke forekommer i samme posisjon i aminosyresekvensen til noen av de kjente homologe proteiner innen den samme taksonomiske orden som det naturlig forekommende allergen, 2) mutant allergen har vesentlig samme tertiærstruktur for ct-karbonryggraden som det naturlig forekommende allergen, og 3) den spesifikke IgE-binding til det muterte allergen er redusert sammenlignet med bindingen til det naturlig forekommende allergen.

2. Rekombinant allergen ifølge krav 1, karakterisert ved at det naturlig forekommende allergen er et inhalasjonsallergen.

3. Rekombinant allergen ifølge krav 2, karakterisert ved at det naturlig forekommende allergen er et pollenallergen.

4. Rekombinant allergen ifølge krav 3, karakterisert ved at det naturlig forekommende allergen er et pollenallergen med opphav i den taksonomiske orden Fagales, Oleales eller Pineales.

5. Rekombinant allergen ifølge krav 4, karakterisert ved at det naturlig forekommende allergen er Bet v 1.

6. Rekombinant allergen ifølge krav 5, karakterisert ved at substitusjonen eller substitusjonene er Asp25Gly, (Asn28Thr+Lys32Gln), Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Thr77Ala, Prol08Gly eller (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Prol08Gly).

7. Rekombinant allergen ifølge krav 3, karakterisert ved at det naturlig forekommende allergen er pollenallergen med opphav i den taksonomiske orden Poales.

8. Rekombinant allergen ifølge krav 3, karakterisert ved at det naturlig forekommende allergen er pollenallergen med opphav i den taksonomiske orden Urticales.

9. Rekombinant allergen ifølge krav 1 eller 2, karakterisert v e d at det naturlig forekommende allergen er et husstøvmiddallergen.

10. Rekombinant allergen ifølge krav 9, karakterisert ved at det naturlig forekommende allergen er et middallergen med opphav i den taksonomiske orden Dermatophagoides.

11. Rekombinant allergen ifølge krav 1 eller 2, karakterisert v e d at det naturlig forekommende allergen er et kakerlakkallergen.

12. Rekombinant allergen ifølge krav 1 eller 2, karakterisert v e d at det naturlig forekommende allergen er et dyreallergen.

13. Rekombinant allergen ifølge krav 12, karakterisert v e d at det naturlig forekommende allergen er et dyreallergen med opphav i katt, hund eller hest.

14. Rekombinant allergen ifølge krav 1, karakterisert ved at det naturlig forekommende allergen er et giftallergen.

15. Rekombinant allergen ifølge krav 14, karakterisert v e d at det naturlig forekommende allergen er et giftallergen med opphav i den taksonomiske orden Hymenoptera.

16. Rekombinant allergen ifølge krav 15, karakterisert ved at det naturlig forekommende allergen er et giftallergen med opphav i den taksonomiske orden Vespidae, Apidae eller Formicoidae.

17. Rekombinant allergen ifølge krav 16, karakterisert v e d at det naturlig forekommende allergen er Ves v 5.

18. Rekombinant allergen ifølge krav 17, karakterisert ved at substitusjonen er Lys72Ala eller Tyr96Ala.

19. Rekombinant allergen ifølge hvilket som helst av kravene 1-18, karakterisert ved at den spesifikke IgE binding til det muterte allergen er redusert med minst 5%, foretrukket minst 10%.

20. Rekombinant allergen ifølge hvilket som helst av kravene 1-19, karakterisert ved at det kvadratiske middelverdiawik for atomkoordinantene er under 2Å ved sammenligning av cc-karbonryggradens tertiærstruktur for mutanten og det naturlig forekommende allergenmolekyl.

21. Rekombinant allergen ifølge hvilket som helst av kravene 1-20, karakterisert ved at det minst ene området omfatter atomer fra 15-25 aminosyrerester.

22. Rekombinant allergen ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 21, karakterisert ved at aminosyrerestene i det minst ene området er rangert ut fra løsemiddeltilgjengeligheten, og at én eller flere aminosyrer blant de mest løsemiddeltilgjengelige er substituert.

23. Rekombinant allergen ifølge krav 22, karakterisert ved at én eller flere aminosyrerester i det minst ene området som har en løsemiddeltil-gjengelighet på 20-80% er substituert.

24. Rekombinant allergen ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 23, karakterisert ved at 1-5 aminosyrerester pr. 400 Å<2> i nevnte minst ene område er substituert.

25. Rekombinant allergen ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 24, karakterisert ved at minst en aminosyrerest i nevnte B-celle-epitop er substituert.

26. Rekombinant allergen ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 24, karakterisert ved at substitusjonen av én eller flere aminosyrerester i nevnte B-celle-epitop eller minst ett område er utført ved setestyrt mutagenese.

27. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant allergen ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 26, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: a) å identifisere aminosyrerester i et naturlig forekommende allergen som er konservert med mer enn 70% identitet i alle kjente homologe proteiner innen den taksonomiske orden som det naturlig forekommende allergen har opphav i; b) å definere minst ett område med konserverte aminosyrerester som er sammenhengende forbundet over minst 400 Å<2> på overflaten av allergenmolekylets tredimensjonale struktur, hvor det minst ene området omfatter minst en B-celleepitop; og c) å substituere minst én overflateeksponert aminosyrerest, definert ved å ha en løsemiddeltilgjengelighet på minst 20%, i det minst ene området med en annen aminosyre som ikke forekommer i samme posisjon i aminosyresekvensen til noe kjent homologt protein innen den taksonomiske orden som det naturlig forekommende allergen har opphav i, samtidig som den generelle tertiærstruktur til allergenmolekylets a-karbonryggrad i det vesentlig er bevart, for erholdelse av et mutert allergen hvori den spesifikke IgE-binding til det muterte allergen er redusert, sammenlignet med binding til det naturlig forekommende allergen.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at aminosyrerestene i det minst ene område er rangert ut fra løsemiddeltilgjengelighet og én eller flere aminosyrer blant de mer løsemiddeltilgjengelige er substituert.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 27 eller 28, karakterisert ved at substitusjonen av én eller flere aminosyrerester i B-celle-epitopen eller nevnte minst ett område utføres ved setestyrt mutagenese.

30. Rekombinant allergen ifølge hvilket som helst av kravene 1-26 for bruk som et farmasøytika.

31. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et rekombinant allergen ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 26, eventuelt i kombinasjon med et farmasøytisk aksepterbart bærestoff og/eller eksipiens, og eventuelt en adjuvans.

32. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 31, karakterisert v e d at det er i form av en vaksine for behandling eller forhindring av allergiske reaksjoner igangsatt av et naturlig forekommende allergen.

33. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning ifølge hvilket som helst av kravene 31 til 32, karakterisert ved at den omfatter sammenblanding av minst ett rekombinant allergen ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 26, og farmasøytisk aksepterbare forbindelser og/eller eksipienser.

34. Anvendelse av et rekombinant allergen som definert ifølge hvilket som helst av kravene 1-26, for fremstilling av et medikament for behandling eller forhindring av allergiske reaksjoner.