CN102791289B

CN102791289B - 因脯氨酸残基突变而具有降低变应原性的真禾本科第5组变应原的变体

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Publication number: CN102791289B
Application number: CN201080061431.9A
Authority: CN
Inventors: M.瓦尔德; A.南迪; H.菲比希; B.韦伯; H.卡勒特; G.雷泽; O.克伦威尔
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2010-01-14
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2030-12-17
Also published as: CN105061571A; EP3170510A1; CA2786936A1; CN102791289A; JP5871819B2; WO2011085783A1; AU2010342533B2; BR112012016768A2; AU2010342533A1; US20150140024A1; US9975932B2; EP2523685A1; RU2658767C1; JP2013516962A; RU2012134508A; US20180002387A1

Abstract

本发明涉及禾本科(<i>Poac</i><i>eae</i>)(真禾本科(true？grasses))第5组变应原的重组变体的制备和使用，其特征在于与已知野生型变应原相比，IgE反应性降低，并同时基本保留与T-淋巴细胞的反应性。

Description

因脯氨酸残基突变而具有降低变应原性的真禾本科第5组变应原的变体

发明领域

本发明涉及禾本科(Poaceae)(真禾本科(true grasses))第5组变应原重组变体的制备和使用，其特征在于与已知野生型变应原相比，降低IgE反应性，并同时基本保留与T-淋巴细胞的反应性。

降低IgE反应性主要通过某些脯氨酸残基的取代或缺失来实现，所述脯氨酸残基在第5组变应原中高度保守。另外，已认识到第211位氨基酸脯氨酸(Phl p 5.0109编号)是特异性影响变体在水性制剂中的溶解行为的关键位置。

这些低变应原性的变应原变体可用于患有禾草(grass)花粉变态反应的患者的特异性免疫治疗(脱敏作用)，或用于防止禾草花粉变态反应发展的预防性治疗中。

本发明优选实施方案涉及来自梯牧草(Timothy grass) (Phleum pratense)花粉的主要变应原Phl p 5的变体。

发明背景

1型变态反应具有全球重要性。工业化国家中有多达20%的人口遭受诸如变态反应性鼻炎、结膜炎或支气管哮喘等疾病。

这些变态反应由各种起源的来源引起，例如树木和禾草(花粉)、真菌(孢子)、螨(粪便)、猫或狗。变应原来源可直接释放到空气中(花粉、孢子)，或可与柴油机灰粒(花粉)或室内尘埃(螨粪便、皮肤颗粒、毛发)结合而到达空气中。因为变态反应-触发物质位于空气中，所以亦使用术语空气源性变应原(aeroallergen)。

1型变态反应-触发物质为蛋白质、糖蛋白或多肽。这些变应原经由粘膜摄取后，在致敏人群中与结合在肥大细胞表面的IgE分子反应。如果这些IgE分子通过变应原相互交联，其结果是效应细胞分泌介质(例如组胺、前列腺素)和细胞因子，并因此产生相应的变态反应症状。

多达40%的1型变态反应患者对真禾本科花粉提取物表现出特异IgE反应性(Burney等, 1997, J. Allergy Clin. Immunol. 99:314-322；D’Amato等, 1998, Allergy 53: 567-578；Freidhoff 等, 1986, J. Allergy Clin Immunology, 78, 1190-2002)。真禾本科(禾本科)包括10000个以上的物种，迄今认为其中超过20种为变态反应症状的触发物(Andersson和Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107；Esch, 2008, Allergy and Allergy Immunotherapy, Clinical Allergy and Immunology Series, 107-126)。

大多数变态反应-触发性真禾本科属于早熟禾亚科(Pooideae)。除作为野生形式存在的禾草物种外，例如绒毛草(Holcus lanatus)(绒毛草)、喜湿虉草(Phalaris aquatica)(金丝雀虉草)、黄花茅(Anthoxanthum odoratum)(黄花草)、鸭茅(Dactylis glomerata)(果园草)、牛尾草(Festuca pratensis)(牛尾草)、草地早熟禾(Poa pratensis)(肯塔基蓝草)或多年生黑麦草(Lolium perenne)(黑麦草)，栽培谷类植物例如普通小麦(Triticum aestivum)(小麦)、黑麦(Secale cereale)(黑麦)和大麦(Hordeum vulgare)(大麦)亦是该亚科的已知成员。

关于其变应原研究得最为透彻的早熟禾亚科(Pooideae)物种之一是梯牧草，梯牧草作为野生植物在世界范围内广泛分布，作为牧草植物和耐寒性饲用草(hardy feed grass)还有商业作用。

依据人群中单种变应原分子与变态反应患者的IgE抗体反应的相对频率，对主要和次要变应原作了区分。

梯牧草中以下六种变应原可视为主要变应原：Phl p 1 (Petersen等, 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796)、Phl p 5 (Matthiesen和Löwenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307；Petersen等, 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109)、Phl p 6 (Petersen等, 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54)、Phl p 2/3 (Dolecek等, 1993, FEBS 335 (3): 299-304)、Phl p 4 (Haavik等, 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268；Valenta 等, 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294；Nandy等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 337(2): 563-70)和Phl p 13 (Suck等, 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402)。

梯牧草中占优势的主要变应原为Phl p 1和Phl p 5 (Andersson和Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107)，其中Phl p 5以两种形式存在，即5a和5b，其由独立的基因编码，在分子量上有差别。按照变应原的正式命名法，将Phl p 5a称为Phl p 5.01而将Phl p 5b称为Phl p 5.02 (WHO/IUIS变应原命名小组委员会，www. allergen.org)。Phl p 5a和Phl p 5b二者的氨基酸序列都来源于克隆的cDNA序列。已鉴定两种同工型的天然变体，两者通过点突变区别于彼此，对应于不同的等位基因形式(Vrtala等, 1993, J. Immunol., 151: 4773-4781；Gelhar等, 1997, Eur. J. Biochem., 247: 217-23)。这些变体在WHO/IUIS数据库中记录为Phl p 5.01xx和Phl p 5.02xx。

天然Phl p 5a (nPhl p 5a)为约32 kDa的蛋白质，与85-90%的禾草花粉变态反应患者的IgE抗体反应(Rossi等, 2000, Allergy Int., 49: 93-97)。

来自禾本科特别是早熟禾亚科的亲缘真禾本科物种(例如多年生黑麦草和草地早熟禾)的花粉，含有与Phl p 5同源的变应原，将其和Phl p 5一起称作第5组变应原。这些第5组变应原的高度结构同源性相应地导致分子与IgE抗体的高度交叉反应性(Lorenz等, 2009, Int. Arch. Immunol. 148:1-17)。最终，这种交叉反应性意味着一种禾草物种的敏化可足可以触发其它亲缘禾草的变态反应。

第5组变应原的高度交叉反应性根本上是基于同源变应原的相似一级序列。这通过所选早熟禾亚科物种的第5组变应原的氨基酸序列比较来显示(图1)。

除第5组变应原彼此间的交叉反应性外，亦已知Phl p 5与梯牧草另一主要变应原的交叉反应性(Løwenstein, 1978, Allergy 33: 30-41；Petersen等, 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 55-59； Blume等, 2004, Proteomics 4: 1366-71)。变应原Phl p 6的多肽链表现出与多种Phl p 5序列N-末端半部分(N-terminal half)有很大的相似性(图1)。认为变应原可追溯到共同的起源基因。两组变应原间的相似性具有以下作用：一些Phl p 5-反应性的IgE抗体亦可结合Phl p 6 (Petersen等, 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 49-54；Andersson和Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107)。

过去，业已通过NMR光谱学或X-射线结构分析阐明了很多变应原的3D结构，尤其是将3D结构作为IgE-结合表位在蛋白质表面上定位的基础。就禾草花粉的第5组变应原而言，迄今不可能产生包括整个多肽链的模型(Rajashankar等, 2002, Acta Cryst. D58:1175-1181；Maglio等, 2002, Protein Engineering 15: 635-642)。

基于变应原Phl p 6 (RCSB蛋白质数据库条目：1NLX)和Phl p 5b半分子(RCSB蛋白质数据库条目：1N3P)的3D结构，有可能产生Phl p 5a的同源模型(Wald等, 2007, Clin. Exp. Allergy 37:441-450)。根据这个模型，由两个螺旋束构成Phl p 5a，但该同源模型无法解释两束彼此之间的精确位置(图2)。

将特异性免疫治疗(SIT)或脱敏作用视作治疗性治疗变态反应的有效方法(Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6):336-339, Bousquet等, 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562)；Cox等, 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 120:S25-85；James和Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088)。

业已成功使用注射疗法的经典治疗形式(SCIT)达约100年，在所述SCIT中，以逐渐增加的剂量将天然变应原提取物皮下注射给患者。在该疗法中，变态反应患者的免疫系统反复遭遇变应原，导致免疫系统重编程序以同时获得对变应原的耐受性。在通过抗原呈递细胞自变应原制剂摄取抗原后，将肽呈递给细胞表面上的抗原。抗原特异性T-细胞识别一些含有所谓的T-细胞表位的特定肽。这种结合尤其导致具调控功能的各种类型T-细胞的发育。在SIT疗程中，调控T-细胞的应答导致：对变应原的耐受性；T_H2细胞因子的下调；T_H1/T_H2平衡的恢复；变应原-特异性IgE的抑制；IgG4、IgG1和IgA抗体的诱导；效应细胞(肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)的抑制和炎症组织的更新(Akdis等, 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 119 (4):780-789； Larchè等, 2008, Nature Reviews 6:761-771)。因此，在脱敏作用情况下，T-细胞表位对变应原制剂的治疗作用至关重要。

由于在IgE以及T-细胞水平中存在的真禾本科主要变应原的交叉反应性，用单个代表性的禾草物种的变应原提取物通常足以成功治疗(Malling等, 1993, EAACI Position Paper: Immunotherapy, Allergy 48: 9 35；Cox 等, 2007, J Allergy Clin Immunol 120: 25-85)。

除皮下免疫治疗外，经由口腔粘膜摄入变应原或变应原衍生物的舌下治疗形式正在进行临床试验，用作注射疗法的备选(James和Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088)。

更多的可能性是用编码相关变应原的可表达的DNA (免疫治疗性接种)来治疗。在啮齿动物中通过注射编码变应原的DNA为变应原-特异性影响免疫应答提供了实验证据(Hsu等 1996, Nature Medicine 2 (5):540-544；Weiss等, 2006, Int. Arch. Allergy Immunol. 139: 332-345)。

在所有这些治疗形式中，都有变态反应或过敏性休克的根本风险(Kleine-Tebbe, 2006, Allergologie, 4:135-156)。为使这些风险最小化，采用类变应原形式的创新制剂。这些制剂为化学修饰的变应原提取物，其显著降低IgE反应性，而与未处理的提取物有相同的T-细胞反应性(Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6):336-339；Kahlert等, 1999, Int. Arch. Allergy Immunol, 120: 146-157)。

可能用通过重组方法制备的变应原来进行疗法优化。通过重组方法制备的高纯度变应原的确定混合物(cocktail) (任选与患者独特敏化模式匹配)，可取代来自天然变应原来源的提取物，因为除了各种变应原外，后者还含有相对大量的免疫原性的，但非变应原性的伴随蛋白。业已成功实施重组变应原的初期临床研究(Jutel等, 2005, J. Allergy Clin. Immunol., 116: 608-613；Valenta 和 Niederberger, 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 119: 826-830)。

通过突变的重组变应原特别提供了可用重组表达产物产生安全的脱敏作用的现实前景，在所述突变的重组变应原中，修饰了IgE表位，而未损伤治疗所必需的T-细胞表位(Schramm等 1999, J. Immunol. 162:2406-2414)。可在SIT期间以相对高剂量使用这些低变应原性蛋白，而不增加所不希望的IgE引发的副作用的可能性。

过去，针对很多空气源性变应原(尤其是花粉和室内尘螨变应原)和食物变应原，业已发表了具降低IgE结合性的此类“低变应原性”变体。基于未修饰的变应原的DNA，已有可能制备和表达重组DNA，尤其是通过变应原个别部分的片段化、寡聚化、缺失、点突变或重组(DNA改组)来制备和表达重组DNA (Ferreira等, 2006, Inflamm. ＆Allergy– Drug Targets 5: 5 14；Bhalla和Singh, 2008, Trends in Biotechnology 26:153-161)。

关于禾草花粉变应原，阐述了第1、2、5a、5b、6、7和12组的低变应原性变体(hypoallergenic variant) (Ferreira等, 2006, Inflamm. ＆ Allergy– Drug Targets 5: 5 14；Westritschnig等, 2007, J. Immunol. 179: 7624-7634)。

迄今为止，许多出版物阐述了开发低变应原性第5组变应原的方法。对于Phl p 5a和Phl p 5b，已表明两个序列部分的合并缺失导致IgE结合性的大幅降低和刺激嗜碱性效应细胞的能力降低。然而，与未修饰的变应原相比，缺失突变体的T-细胞反应性仅有轻微改变(Schramm等, 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414；Wald等, 2007, Clin. Exp. Allergy 37:441-450)。

在另一篇文章中，通过氨基酸取代和/或C末端的短的缺失来修饰来自黑麦草的第5组变应原(Lol p 5) (Swoboda等, 2002, Eur. J. Immunol. 32: 270-280)。突变不限于特定的氨基酸类型。被取代的氨基酸为赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸。同样也阐述了通过很多个别氨基酸残基的特异性突变来产生低变应原性突变体的概念性方法。Gelhar等描述了通过用丙氨酸取代位于蛋白质表面的赖氨酸残基来产生重组Phl p 5b片段(Gelhar等, 2006, Int. Arch. Allergy Immunol. 140:285-294)。然而，对于禾草花粉的第5组变应原，迄今仍未发表基于脯氨酸残基点突变的突变策略。

本发明所基于的目的在于在蛋白质和DNA水平上提供禾本科第5组变应原的新型重组变体，其区别在于降低IgE反应性而同时基本保留T-细胞的反应性，因此适于治疗性和预防性的特异性免疫治疗和免疫治疗性的DNA接种。

发明描述

意想不到地发现，与野生型变应原相比，真禾本科(禾本科)第5组变应原的变体降低了IgE反应性，同时基本保留了与T-淋巴细胞的反应性，并因此是低变应原性的，在所述变体中，将在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、211、229位脯氨酸的脯氨酸单独或组合突变。

因此，本发明涉及真禾本科(禾本科)第5组变应原的低变应原性变体，其中将在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、211、229位脯氨酸的脯氨酸单独或组合突变。

特别优选本发明的变应原变体，其特征为脯氨酸已缺失或被取代。

优选来自早熟禾亚科的第5组变应原的本发明低变应原性变体，优选来自早熟禾超族(Poodae)和小麦族(Triticodae)，优选由以下物种来代表：梯牧草、绒毛草、喜湿虉草、黄花茅、鸭茅、多年生黑麦草、草地早熟禾、牛尾草、大麦、黑麦和普通小麦。它们是来自普通小麦、黑麦和大麦的Tri a 5、Sec c 5和Hor v 5的本发明优选的低变应原性变体。特别优选来自早熟禾超族第5组变应原的本发明低变应原性变体。这些第5组变应原优选来自草地早熟禾、鸭茅、绒毛草、多年生黑麦草和喜湿虉草的Poa p 5、Dac g 5、Hol p 5、Lol p 5和Pha a 5，尤其特别优选来自梯牧草的Phl p 5。上述变应原的所有天然存在的异构体、多形体(polymorph)和变体及其前体蛋白亦符合本发明。

在本发明低变应原性变体中，突变的脯氨酸优选为在比对(图1a)中对应于以下位置脯氨酸的那些：成熟Phl p 5.0109 (Phl p 5 a，UniProtKB条目：Q84UI2)(图3和4，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)或其变体(图1b)或成熟Phl p 5.0201 (Phl p5 b；Swiss-Prot：Q40963.2；图24，SEQ ID NO: 5)或其变体(图1b)的氨基酸序列的第57、58、117、146、155、211或229位脯氨酸，特别优选成熟Phl p 5.0109的氨基酸序列的第57、58、117、146、155、211或229位脯氨酸。

尽管已知脯氨酸可对蛋白质结构产生影响，但是以脯氨酸残基的特异性点突变作为起始点来产生变应原的低变应原性突变体，仅仅只在室内尘螨粉尘螨(Dermatophaogides farinae)的第2组主要变应原(Der f 2，以丙氨酸取代脯氨酸残基)中有研究(Takai等, 2000, Eur. J. Biochem. 267: 6650-6656)。然而，在三种点突变体情况下，IgE结合能力和刺激嗜碱性粒细胞的能力仅有轻微降低，而其它三个的行为与未修饰变应原相似。因此，在Der f 2情况下，脯氨酸突变的变应原性仅表现出非常弱的降低，或一点也不降低。尚未发表通过脯氨酸交换突变来制备低变应原性突变体的更多策略。因此，本领域技术人员未预料脯氨酸突变成功作为起始点来产生低变应原性的变应原突变体。

另外，对于任意变应原，其脯氨酸残基的特异性缺失将如何影响表达产物的整体IgE结合能力及对变态反应-相关效应细胞的激活将产生什么作用，迄今尚无研究。

Phl p 5.0109 (UniProtKB：Q84UI2)的氨基酸序列含有16个脯氨酸残基(图1)。P7、P10、P13、P19、P22和P27这六个脯氨酸残基位于N-末端区域，其在第5组变应原中低程度保守。第57、58、85、117、146、155、211、229和256位氨基酸位置的脯氨酸位于α-螺旋的起始或末端，或位于连接α-螺旋的环中，并且除氨基酸P85外都高度保守(图1、2)。

从Phl p 5a同工型Phl p 5.0109的氨基酸序列开始，制备了重组未修饰野生型变应原(rPhl p 5a wt；图4，SEQ ID NO:2)和基因工程修饰的变体。与下述制备方法类似，还可制备本发明真禾本科的其它第5组变应原的本发明野生型蛋白质和低变应原性变体，所述其它第5组变应原例如Lol p 5；Poa p 5、Pha a 5、Dac g 5；Hol l 5、Tri a 5和Hor v 5。为此，使在比对中对应于野生型Phl p 5氨基酸序列的第57、58、117、146、155、211、229位脯氨酸的脯氨酸单独或组合突变，优选通过取代或缺失来突变。

除了第5组变应原的所述变异外，亦可能自然地对其它位置进行另外的修饰，例如以便增加低变应原性。这些修饰可以是例如氨基酸的插入、缺失、取代；将蛋白质裂解为片段；蛋白质或其片段与其它蛋白质或肽的融合；和通过融合相同蛋白质或片段而得到的多聚体。

本发明片段优选包含20-109个氨基酸，优选30-100个氨基酸，特别优选40-90个氨基酸。本发明变体另外包括前体蛋白质，例如带有前端自然或人工信号序列的ProPhl p 5。同样符合本发明的为以下：具有N-或C-末端融合标签的融合蛋白(例如His标签，如图5和6中，MBP标签，表达控制序列等)；杂交分子，例如与其它变应原或其低变应原性变体的融合物或以任何所需序列的片段融合物。另外，本发明变体亦包含同源序列(多形体(SNP)、同工型)，该同源序列的氨基酸序列与相关的第5组野生型变应原具有至少80%的同一性，优选与相关的第5组野生型变应原具有至少90%的同一性，特别优选与相关的第5组野生型变应原具有至少95%的同一性。在这些变体中，优选保守性取代一个或几个氨基酸，例如用另一极性氨基酸取代极性氨基酸，或用另一中性氨基酸取代中性氨基酸，但是因非保守取代而得到的变体亦符合本发明。多聚体优选包括本发明的低变应原性变体的二聚体或三聚体，其以接头序列连接或经受直接融合。

同工型的实例为变应原Phl p 5a和Phl p 5b，其中与本发明的作用不相关的个别氨基酸被取代，或其中缺少或添加了所述氨基酸序列区域(见图1a)。这些野生型变应原同工型具有例如63%-71%的氨基酸序列同一性。本发明变体的更多实例为：野生型变应原同工型Phl p 5a和Phl p 5b的变体，例如Phl p 5.0109、Phl p 5.0201、Phl p 5.0204、Phl p 5.0206、Phl p 5.0207等等；和另外的变体，其具有一个或多个氨基酸的取代、在N-和/或C-末端遗失一个或多个氨基酸或在氨基酸序列中有对应的缺失空隙。以下变体同样符合本发明，其在多个位置单独插入了一个或多个氨基酸，或在氨基酸序列内或在N和/或C末端的位置作为组(group)。

因此，本发明亦涉及真禾本科(禾本科)第5组变应原的低变应原性变体，其特征在于其为本发明的低变应原性变体的片段或变体，或为本发明的一种或多种低变应原性变体的多聚体；或其特征在于本发明的一种或多种低变应原性变体或其片段、变体或多聚体是重组融合蛋白的构成组分(constituent)。

另外，本发明涉及编码本发明的低变应原性变体的DNA分子。

此外，本发明还涉及含有本发明该类型的DNA分子的重组表达载体，所述DNA分子与表达控制序列功能性连接。表达控制序列意为例如启动子或通过其的帮助来影响靶蛋白表达的序列部分，所述表达控制序列与靶基因功能性连接，但并不一定必须在靶基因的直接邻近位置。

本发明亦涉及借助本发明的DNA分子或本发明的表达载体转化的非人宿主生物。

本发明涉及用于制备本发明的低变应原性变体的方法，所述方法通过培养本发明的非人宿主生物并从培养物中分离相应的变应原变体来进行。

适宜的非人宿主生物可为原核生物或真核生物、单细胞生物或多细胞生物，例如细菌或酵母。根据本发明优选的宿主生物为大肠杆菌(E. coli)。

可通过脯氨酸57 + 58、脯氨酸85、脯氨酸117、脯氨酸146 + 155、脯氨酸180、脯氨酸221、脯氨酸229和脯氨酸256的缺失，来研究一个或两个紧密相邻的脯氨酸缺失对Phl p 5a的IgE结合能力的影响。在Phl p 5的野生型蛋白质中，这些脯氨酸位于α-螺旋的起始或末端的环形区域(图3)。可类似地研究在本发明真禾本科的其它第5组变应原相应同源位置的脯氨酸突变对IgE结合能力的影响，所述其它第5组变应原例如Poa p 5和Lol p 5。

为更快地高产率纯化，提供了用于这些研究的编码DNA，其具有有编码N-末端六个组氨酸融合组分(+ 6His)的序列(图5，SEQ ID NO:3；图6，SEQ ID NO:4)。可用于药学目的的本发明的无标签变体和野生型蛋白质同样通过标准方法纯化，并证实His-标签蛋白质的结果。

相应地制备编码蛋白rPhl p 5a d[P57, P58] + 6His、rPhl p 5a d[P85] + 6His、rPhl p 5a d[P117] + 6His、rPhl p 5a d[P146, P155] + 6His、rPhl p 5a d[P180] + 6His、rPhl p 5a d[P211] + 6His、rPhl p 5a d[P229] + 6His和rPhl p 5a d[P256] + 6His的序列。这些序列可在所有已知的真核和原核表达系统中表达，优选在大肠杆菌中表达。随后用标准方法将蛋白质纯化为可溶性单体。最终，可通过在变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中的分析来检验纯度。

偶联了折射计(RI检测仪)和多角度光散射检测仪(MALS检测仪)的分析性凝胶过滤(SEC)，允许在线测定洗脱蛋白的分子量(SEC/MALS/RI方法)。

另外，可通过IgE抑制试验(EAST)来研究本发明的重组变体与人IgE抗体的结合能力。在该方法中，可在溶液中研究变应原/IgE相互作用，这使得能够排除受试物质表位的干涉掩蔽(mask)，例如因固定在膜上而产生的干涉掩蔽。

与未修饰的rPhl p 5a wt相比，可观测到以下突变体的IgE结合降低：rPhl p 5a d[P57, P58] + 6His、rPhl p 5a d[P117] + 6His、rPhl p 5a d[P146, P155] + 6His、rPhl p 5a d[P180] + 6His、rPhl p 5a d[P211] + 6His和rPhl p 5a d[P229] + 6His (图7)。

这基本上证明了第5组变应原中脯氨酸残基缺失降低这些变应原的IgE结合能力。另一方面，只有某些脯氨酸缺失才导致IgE结合降低。

因此，本发明此外还涉及真禾本科(禾本科)第5组变应原的低变应原性变体，其中在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、211或229位脯氨酸的脯氨酸单独突变。

本发明优选涉及Phl p 5、Poa p 5、Lol p 5、Dac g 5、Hol l 5、Pha a 5的低变应原性变体，其中在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、211或229位脯氨酸的脯氨酸单独进行突变。

本发明特别优选涉及Phl p 5的低变应原性变体，其中在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、211或229位脯氨酸的脯氨酸单独进行突变。

本发明此外还优选涉及真禾本科(禾本科)第5组变应原的本发明低变应原性变体，其中在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、211或229位脯氨酸的脯氨酸单独进行突变。

另外，本发明还涉及真禾本科(禾本科)第5组变应原的本发明低变应原性变体，其中在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、211或229位脯氨酸的脯氨酸经单独取代。此处举例而言由亮氨酸(L)取代脯氨酸。然而，依照本发明，可用任意氨基酸取代本发明的脯氨酸。

具体来说，低变应原性变体rPhl p 5a d[P57]、rPhl p 5a d[P58]、rPhl p 5a d[P57, P58]、rPhl p 5a d[P117]、rPhl p 5a d[P146]、rPhl p 5a d[P155]、rPhl p 5a d[P146, P155]、rPhl p 5a d[P180]、rPhl p 5a d[P211]、rPhl p 5a d[P229]、rPhl p 5a P57L、rPhl p 5a P58L、rPhl p 5a P57, P58L、rPhl p 5a P117L、rPhl p 5a P146L、rPhl p 5a P155L、rPhl p 5a P146L、P155L、rPhl p 5a P180L、rPhl p 5a P211L和rPhl p 5a P229L等等，包括所有下述本发明的低变应原性变体，都符合本发明，其中编号遵循Phl p 5.0109序列。

此外，这些实例不限于Phl p 5a的变体，具体来说，还涉及Phl p 5b、Poa p 5、Hol l 5、Pha a 5、Ant o 5、Dac g 5、Lol p 5、Fes p 5、Hor v 5、Sec c 5、Tri a 5和所有其它真禾本科第5组变应原的变体。应特别强调Poa p 5、Lol p 5、Dac g 5、Hol l 5、Pha a 5和Phl p 5b的相应变体。

意想不到地，来自突变组d[P57, P58]、d[P117]、d[P146, P155]、d[P180]、d[P211]和d[P229]的缺失组合的变体，在EAST方法中表现出明显更加降低的IgE结合能力，如变体rPhl p 5a d[P117, 180] + 6His (图8)实例所示。

因此，本发明此外还涉及真禾本科(禾本科)第5组变应原的低变应原性变体，其中在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、180、211、229位脯氨酸的脯氨酸经组合突变。优选通过缺失和通过其它氨基酸取代的突变。在此可选择任何氨基酸来取代脯氨酸。

本发明优选涉及Phl p 5、Poa p 5、Lol p 5、Dac g 5、Hol l 5、Pha a 5的低变应原性变体，其中在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、180、211、229位脯氨酸的脯氨酸经组合突变。

本发明特别优选涉及Phl p 5的低变应原性变体，其中在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、180、211、229位脯氨酸的脯氨酸经组合突变。

此外，这些实例不限于Phl p 5的变体，具体来说，还涉及Poa p 5、Hol l 5、Pha a 5、Ant o 5、Dac g 5、Lol p 5、Fes p 5、Hor v 5、Sec c 5、Tri a 5和所有其它真禾本科第5组变应原的变体。应特别强调Phl p 5a、Phl p 5b、Poa p 5、Lol p 5、Dac g 5、Hol l 5、Pha a 5的相应变体。

特别优选本发明的低变应原性变体，其中联合去除了第57、58、117、146、155、180、211、229位脯氨酸。还特别优选本发明的低变应原性变体，其中联合取代了第57、58、117、146、155、180、211、229位的脯氨酸。

另外，特别优选本发明的低变应原性变体，其中联合去除了和/或取代了第57、58、117、146、155、180、211、229位脯氨酸。因此，例如低变应原性变体rPhl p 5a d[57, 58, 117]、rPhl p 5a d[57, 58, 146]、rPhl p 5a d[57, 58, 150]、rPhl p 5a d[57, 58, 180]、rPhl p 5a d[57, 58, 211]、rPhl p 5a d[57, 58, 229]、rPhl p 5a d[117, 146, 155]、rPhl p 5a d[117, 146, 155, 180]、rPhl p 5a d[117, 146, 155, 229]、rPhl pa 5 P117L、P146L、P155L、P211L、rPhl p 5a d[117, 180, 229] P211L、rPhl p 5a d[117, 180, 229] P211L、rPhl p 5a d[57, 58, 117, 180, 229] P211L等等，包括所有下述本发明的低变应原性变体，都符合本发明，其中编号遵循Phl p 5.0109序列。

此处举例而言由亮氨酸(L)取代脯氨酸。然而，根据本发明，可用任意氨基酸取代本发明的脯氨酸。因此，所有提到的或可想到的用另一氨基酸取代本发明一个或多个脯氨酸的低变应原性变体都符合本发明。此外，这些实例不限于Phl p 5的变体，具体来说，还涉及Phl p 5b、Poa p 5、Hol l 5、Pha a 5、Ant o 5、Dac g 5、Lol p 5、Fes p 5、Hor v 5、Sec c 5、Tri a 5和所有其它真禾本科第5组变应原的变体。然而，特别优选本发明所提及的所有梯牧草Phl p 5a和Phl p 5b的低变应原性变体，特别是基于Phl p 5.0109的低变应原性变体。

基于这种认识，可制备变体rPhl p 5a d[P57, P58, P85, P117, P146, P155, P180, P211, P229, P256] + 6His (简短形式：MPV.1 + 6His)和rPhl p 5a d[P57, P58, P117, P146, P155, P180, P211, P229] + 6His (简短形式：MPV.2 + 6His)，其含有最大可能数量的联合缺失。

当表达这些蛋白质时，其作为不溶性聚集体(包涵体)沉积于大肠杆菌细胞中。包涵体通常可溶于变性剂中，例如6-8摩尔的盐酸胍或尿素溶液，随后转化为非变性水溶液。这种非变性溶剂环境的转化是蛋白纯化中的关键步骤。一般而言，只有在这一过程之后以可溶方式起作用的蛋白质才可包括在最终的治疗剂制剂中。用于将变性的可溶性蛋白转化为水性溶剂的工业上常规使用的方法是“快速稀释”法。在该方法中，将溶解于变性剂中的蛋白质加到大体积的非变性溶剂中，变性剂因此而高度稀释。

可系统地研究本文所述突变体的溶解行为。在该研究中，用十种不同的水性缓冲液稀释在大肠杆菌中制备并溶解于盐酸胍中的包涵体，随后通过紫外-可见光谱测定其溶解程度。

在紫外-可见光谱中，记录240-800 nm波长范围内的蛋白质溶液的吸收光谱。蛋白质溶液中不可溶聚集体在> 300 nm波长范围内吸收，而高度可溶蛋白质在该范围内不吸收。

受试溶液涵盖宽的pH范围(4.5 – 9.0)，在一些情况下包含稳定添加剂。在难以制备的重组蛋白的溶解中极为常用添加剂甘油、吐温80和L-精氨酸单盐酸盐作为助剂。它们代表最重要的三组所述共溶剂：甘油代表多元醇、吐温代表非离子表面活性剂、L-精氨酸单盐酸盐代表氨基酸衍生物。

虽然可通过使用变性剂盐酸胍来溶解变体MPV.1 + 6His和MPV.2 + 6His，但溶解性的系统研究显示，在随后将蛋白质转化为无盐酸胍制剂时，总是伴随有不可溶蛋白聚集体的形成，因此是不可能的(表1、2)。

在实施DNA合成的PCR实验过程中，通过许多聚合酶的错误形成了本实例中编码蛋白质rPhl p 5a d[P57, P58, P229] K61E、E205K、P211L + 6His (简短形式：MPV.3 + 6His)的DNA。该DNA同样在大肠杆菌中表达。与变体MPV.1和MPV.2一样，该蛋白质作为包涵体沉积于大肠杆菌细胞中。

然而，蛋白质MPV.3 + 6His意想不到地可轻易转化为无变性剂缓冲溶液(表3)。

EAST-IgE抑制试验显示，与仅在一个环中具有脯氨酸缺失的变体rPhl p 5a d[P57, P58] + 6His和rPhl p 5a d[P229] + 6His相比，该蛋白质与IgE抗体的结合能力显著降低(图9)。

为进一步鉴定变体MPV.3 + 6His的K61E、E205K和P211L突变，制备并用EAST研究了三种变体rPhl p 5a K61E + 6His、rPhl p 5a E205K + 6His和rPhl p 5a P211L + 6His的DNA。所有三种突变体表现出轻微降低IgE结合能力，这表明所有突变协同影响MPV.3 + 6His的降低的变应原性(图10)。缺失以及取代脯氨酸211两者都显示比突变K61E或E205K显著更大的个体效应(individual effect)(图10)。

借助对分离自禾草花粉变态反应患者全血的嗜碱性粒细胞的测试，在体外研究了MPV.3 + 6His的降低的IgE结合能力对人效应细胞的激活的影响。在相同rPhl p 5a wt和MPV.3 + 6His浓度下，后者表现出较低的嗜碱性粒细胞激活作用。这表明MPV.3 + 6His变应原性的功能性降低(图11)。

现在将随机产生的变体MPV.3 + 6His DNA用作定向构建更多变体的起始点。通过插入另外的脯氨酸突变，应该保持MPV.3 + 6His的高度溶解性，并应该进一步降低IgE结合能力。

首先，制备变体rPhl p 5a d[P57, P58, P117, P146, P155, P180, P229] K61E、E205K、P211L (简短形式：MPV.4)和rPhl p 5a d[P57, P58, P117, P180, P229] K61E、E205K、P211L (简短形式：MPV.5)的DNA。该DNA用带有和不带有组氨酸融合组分两者来构建并在大肠杆菌中表达。可通过简单的纯化程序从大肠杆菌细胞的包涵体中将蛋白质纯化为可溶的蛋白质。

因为带有和不带有融合组分的两种蛋白质都可纯化为可溶形式，所以溶解性不依赖于组氨酸融合组分的存在情况。如带有和不带有融合组分的蛋白质的IgE抑制试验所示(图12)，组氨酸融合组分同样对IgE结合能力无影响。

专门产生不带融合组分的变体rPhl p 5a d[P57, P58, P117, P146, P155, P180, P229] P211L (简短形式：MPV.6)和rPhl p 5a d[P57, P58, P117, P180, P229] P211L (简短形式：MPV.7)的DNA并在大肠杆菌中表达。同样可通过简单的纯化程序从包涵体中将它们纯化为高度可溶的蛋白质。

变体MPV.6与变体MPV.2的不同仅在于第211位的修饰。代替P211缺失的是，MPV.6含有交换为亮氨酸的氨基酸。因此，极为不同的溶解行为直接依赖于第211位。所有带有P211L突变的突变体(MPV.3-MPV.7)在多种水性制剂中都通过高溶解度来区分，而带有第211位缺失的突变体保持不可溶(表1–表5)。

因此，本发明涉及真禾本科第5组变应原的本发明低变应原性变体，其中对应于成熟Phl p 5.0109的第211位氨基酸的脯氨酸残基未缺失，而是用另一氨基酸取代。

因此，本发明涉及真禾本科第5组变应原的本发明低变应原性变体，其中在比对中对应于野生型Phl p 5或成熟Phl p 5.0109氨基酸序列的第211位脯氨酸的脯氨酸残基未缺失，而是用亮氨酸取代。

在分析性凝胶过滤(SEC)中，不是唯一地按照其分子量(摩尔质量)来分离蛋白质种类；构象、特定流体力学半径和与基质可能的相互作用在此同样有重要作用。可通过将折射计(RI检测仪)和多角度光散射检测仪(MALS检测仪)与SEC色谱系统(SEC/MALS/RI方法)偶联来实现分子量的真实在线测定。此处通过RI检测仪来测定在测量时间所给的颗粒浓度，MALS检测仪记录颗粒的光散射(Wen等, 1996, Anal. Biochem. 240:155-166)。通过SEC/MALS/RI可清楚地检测单体、二聚体、多聚体和聚集体。

MPV.5和MPV.7的SEC/MALS/RI结果显示，这些变体为纯化形式和可溶性单体形式(图13；图14；表6)。在每一种情况中都检测到MPV.4和MPV.6这两种变体为可溶性单体和二聚体的混合物(图15；图16；表6)。在每一种情况中，变体MPV.5和MPV.7与变体MPV.4和MPV.6的不同仅在于第146和155位。脯氨酸P146和P155存在于MPV.5和MPV.7中。这显示d[P146, P155]缺失导致相应变体的强烈二聚化倾向。

首先通过如下方法研究优化的变体MPV.4至MPV.7的IgE结合能力：将蛋白质固定在硝酸纤维膜上，并与包含IgE抗体的单个禾草花粉变态反应患者的血清孵育。随后通过酶反应将变应原变体/抗体复合物染色。在该方法中，很明显的是，所有四种蛋白质的IgE结合能力极大降低(图17)。

通过用代表性的人变态反应患者的混合血清(serum pool)的EAST-IgE抑制试验证实了这一结果，其中在每一种情况下，变体MPV.4和MPV.6的IgE结合稍低于相应的无d[P146, P155]突变的突变体MPV.5和MPV.7 (图18；图19)。若存在d[P146, P155]突变，则较低的IgE结合可能归因于这些变体的二聚化倾向，这可能导致掩蔽了在二聚化配偶体接触区的IgE表位。

嗜碱性粒细胞的激活试验结果显示，对于所有四种变体，功能性地极大降低变应原性(图20；图21；图22；图23)。

因此，本发明涉及真禾本科第5组变应原的本发明低变应原性变体，其特征为在比对中对应于野生型Phl p 5.0109的脯氨酸211的脯氨酸未缺失，而是用另一氨基酸取代。

因此，本发明亦优选涉及真禾本科第5组变应原的本发明低变应原性变体，其中在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58、117、180和229位脯氨酸的脯氨酸单独或组合突变，优选缺失，并用亮氨酸取代脯氨酸211。

因此，本发明亦优选涉及真禾本科第5组变应原的本发明低变应原性变体，其中在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58和229位脯氨酸的脯氨酸缺失，并用亮氨酸取代脯氨酸211。

因此，本发明亦涉及本发明的低变应原性变体，其中在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第146和155位脯氨酸的脯氨酸未经突变。这些优选为单体形式。

同样符合本发明的是本发明的上述所有低变应原性变体，另外，在比对中对应于野生型Phl p 5氨基酸序列的第61位赖氨酸和第205位谷氨酸的氨基酸单独或组合突变。这些氨基酸优选被取代。

通过用禾草花粉变态反应患者的Phl p 5特异性T-淋巴细胞的增殖试验，在体外检验基于T-细胞反应性的特异性免疫治疗效率。在此通过举例阐述变应原变体MPV.4和MPV.7的结果。二聚化变体MPV.4 携带在此研究的所有突变(d[P57, P58, P117, P146, P155, P180, P229] K61E, E205K, P211L)，因此代表具有经最大化修饰的氨基酸序列的分子。选择突变体MPV.7作为带有纯脯氨酸突变的单体形式的实例。两种突变体都表现出与未修饰变应原同等良好的T-细胞反应性(表7；表8)。关键T-细胞表位的保留使得实现所述变体的免疫治疗用途。

辅助性T-淋巴细胞与通过在抗原呈递细胞(APC)中的降解过程形成的变应原的肽片段反应，并被呈递给在APC表面上的MHC II类分子且与之结合。肽通常有13-18个氨基酸长度，但也可因其侧面开放的MHC 2类结合位点而更长。肽与MHC类分子的主要接触点存在于约7-10个氨基酸的核心序列中。辅助性T-淋巴细胞的变应原-特异性激活是其增殖和功能分化(例如Treg、T_H1和T_H2)的必要条件。认为变应原或变应原变体刺激变应原-特异性T-淋巴细胞的能力是其治疗效果的关键。

所有基于Phl p 5或Phl p 5.0109和本文所述变应原而产生的变应原变体在实验中表现出对关键T-细胞表位的基本保留。

因此，首次阐述禾本科第5组变应原的变体，其通过脯氨酸残基的修饰而具有新型蛋白质特性。有关的脯氨酸残基位于环形区域。只有某些脯氨酸残基的修饰才产生新型变体，其区别在于降低IgE反应性和基本保留T-细胞反应性，因此，适于治疗性和预防性的特异性免疫治疗。相应的DNA分子适于免疫治疗性接种。

因此，本发明涉及作为药物的本发明所述变应原变体、DNA分子和重组表达载体。

具体来说，可使用本发明的低变应原性变体、DNA分子和重组表达载体或本发明的药物来预防和/或治疗疾病和病况。本发明的药物尤其适于治疗和/或预防1型变态反应，即用于对具有禾草花粉变态反应的患者的特异性免疫治疗(脱敏作用)，或用于对禾本科物种第5组变应原参与触发的禾草花粉变态反应的预防性免疫治疗。可将本发明的DNA分子和重组表达载体用于相应的免疫治疗性和预防性DNA接种。

本发明亦涉及至少一种本发明的低变应原性变体在制备用于预防和/或治疗性治疗因真禾本科第5组变应原参与而触发的1型变态反应的药物中的用途。

亦符合本发明的是至少一种本发明的DNA分子和/或本发明的重组表达载体(包括其所有比率的混合物)在制备用于免疫治疗性DNA接种的药物中的用途。

此外，本发明还涉及用于预防和/或治疗性治疗1型变态反应的药物制剂，所述药物制剂包含至少一种本发明的低变应原性变体、至少一种本发明的DNA分子和/或至少一种本发明的重组表达载体，包括其所有比率的混合物，并进一步任选包含赋形剂和/或助剂。

特别地，本发明的药物制剂适于预防和/或治疗性治疗因真禾本科第5组变应原参与而触发的1型变态反应。

从本发明意义上来说，药物制剂可用作人或兽医学的治疗剂，因此可给予人和动物，特别是哺乳动物，例如猴、狗、猫、大鼠或小鼠，并且可用于人或动物体的治疗性治疗及减轻上述疾病。此外它们可用作诊断剂或试剂。

对于本发明的制剂或药物的使用，本发明的低变应原性变体、DNA分子或重组表达载体的使用通常类似于已知的、可市购的制剂，维持阶段的每一剂优选剂量为0.001-500 mg，就低变应原性变体而言为约1-500 µg，优选5-200 µg。该制剂可每天给予一次或多次，例如每天两次、三次或四次。剂量通常在剂量增加阶段增加到维持剂量。为此目的可能有多种剂量增加和维持方案。例如，就皮下免疫治疗(SCIT)而言，这些可包括短期治疗(在季节性病患开始之前的有限次数注射，通常为4-7次注射)，季节前治疗(pre-seasonal therapy)(花粉季之前开始治疗，通常为增加阶段期间每周一次注射，维持剂量每月一次注射，直到花粉季开始)或全年性治疗(剂量增加阶段通常每周一次注射，多达16周后，维持剂量阶段每月一次注射，如果必要，花粉季期间降低剂量)。就用水性制剂或固体制剂(片剂、糯米纸囊剂等)的舌下免疫治疗而言，治疗可引入或不引入剂量增加阶段。治疗优选采用全年每天一次剂量来实现，但也可在季节前或用其它施用方案(例如每两天一次、每周一次、每月一次)来实现。

表述“有效量”意为例如由研究者或医师所找寻的或针对的组织、系统、动物或人中产生生物学或医学反应的药物或药物活性化合物的量。

另外，表述“治疗有效量”意为这样的量，其与未接受该量的相应受试者比较，具有以下结果：改善对疾病、综合征、病况、病患、病症的治疗、治愈、预防或消除，或预防副作用，或减缓疾病、病患或病症的进程。术语“治疗有效量”亦包括有效提高正常生理功能的量。

药物可适于经由任意所需的适宜途径给予，例如经由口腔(包括含服或舌下)、直肠、肺、鼻、局部(包括含服、舌下或透皮)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)途径。所述药物可使用药学领域内所有的已知方法来制备，例如通过将活性化合物与赋形剂或助剂联合来制备。

具体来说，适于胃肠外使用的为溶液，优选油性或水性溶液，此外还可为混悬液、乳剂或植入物。亦可冻干本发明的变应原变体，将所得到的冻干物用于例如制备注射制剂。所指的制剂可无菌和/或包含辅药，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂和/或湿润剂、乳化剂、改变渗透压的盐、缓冲物质和/或多种另外的活性化合物。此外，可通过本发明变应原变体的相应制剂获得贮库制剂，例如通过吸附到氢氧化铝、磷酸钙或酪氨酸。

适宜的赋形剂为适于胃肠外给予和不与本发明的第5组变应原变体反应的有机或无机物质。其实例为赋形剂例如水、植物油、苄醇、聚乙二醇、三乙酸甘油酯、明胶、碳水化合物(例如乳糖或淀粉)、硬脂酸镁、滑石、羊毛脂或凡士林。

胃肠外给予优选适于给予本发明的药物。就胃肠外给予而言，特别优选静脉内给予、皮下给予、皮内给予或淋巴内给予(intralymphatic administration)。就静脉内给予而言，可直接进行注射或作为输液剂的添加物来注射。

适合胃肠外给予的药物包括水性和非水性的无菌注射液，其包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和增溶剂，藉此使制剂与待治疗受体的血液等渗；和水性及非水性的无菌混悬液，其可包含混悬剂和增稠剂。制剂可在单次剂量或多次剂量的容器中给予，例如密封的安瓿瓶或小瓶；并且以冷冻干燥(冻干)状态保存，意味着只需在临用前加入无菌载体液体，例如注射用水。可从无菌粉末、颗粒和片剂来制备依照制剂制备的注射液和混悬液。

如果需要，本发明的制剂或药物可包含一种或多种另外的活性化合物和/或一种或多种作用增强剂(佐药)。

因此，本发明此外还涉及包含另外的活性化合物和/或辅剂的药物制剂。本发明优选涉及本发明的药物制剂，其特征在于另外的活性化合物为变应原或其变体。适宜的另外的活性化合物实例为其它变应原，特别为真禾本科变应原，特别优选来自早熟禾亚科(其优选来自早熟禾超族和小麦族，优选由以下物种代表：梯牧草、绒毛草、喜湿虉草、鸭茅、多年生黑麦草、草地早熟禾、大麦、黑麦和普通小麦)的变应原，例如第1、2、3、4、5、6、7、10、12或13组变应原及其变体，例如低变应原性变体、片段、多聚体、杂交分子或重组融合蛋白。本发明此外还涉及药物制剂，所述药物制剂包含至少一种另外的助剂，特别优选所谓的佐药。佐药实例为氢氧化铝；单磷酰脂质A；Toll-样受体激活剂，例如脂多糖和CpG寡核苷酸；维生素D3；分枝杆菌抗原和来自寄生虫(例如血吸虫或丝虫)的分子，例如半胱氨酸蛋白酶抑制剂或ES-62。

本发明亦涉及由以下单独包装组成的套组(set) (试剂盒)：

a)本发明的药物制剂，其包含有效量的本发明低变应原性变体、DNA分子或重组表达载体

b)药物制剂，其包含有效量的另外的药学活性化合物和/或佐药。

套组含有适宜的容器，例如盒子或纸盒、单独的瓶子、袋或安瓿瓶。套组可含有例如单独的安瓿瓶，其每一个含有：本发明制剂，所述制剂包含有效量的本发明低变应原性变体、DNA分子或重组表达载体；和呈溶解或冻干形式的另外的药物活性化合物的制剂。

附图简述

图 1a ：禾本科第 5 组变应原的推断的氨基酸序列比对：多种物种的成熟第5组序列的比对。框部分显示Phl p 6 (PDB条目1NLX)的α-螺旋的位置和Phl p 5.02片段(PDB条目1L3P)的C-末端半部分。依照其在成熟Phl p 5.0109中的位置，标记了脯氨酸残基的氨基酸位置。

序列参考：Phl p 5.0101 (梯牧草IUIS序列，UniProtKB Q40960)、Phl p 5.0104 (梯牧草IUIS序列，UniProtKB P93467)、Phl p 5.0109 (梯牧草IUIS序列，UniProtKB Q84UI2)、Phl p 5.0201 (梯牧草IUIS序列，UniProtKB Q40963)、Phl p 6.0101 (梯牧草IUIS序列，UniProtKB P43215)、Lol p 5.0101 (多年生黑麦草IUIS序列， UniProtKB Q40237)、Pha a 5.0101 (喜湿虉草IUIS序列， UniProtKB P56164)、Dac g 5 (鸭茅，UniProtKB Q93XD9)、Hol l 5.0101 (绒毛草IUIS序列，UniProtKB O23972)、Hol l 5.0201 (绒毛草IUIS 序列，UniProtKB 23971)、Poa p 5.0101 (草地早熟禾IUIS 序列，UniProtKB Q9FPR0)、Tri a 5 (普通小麦，UniProtKB Q70JP9)、Hor v 5 (大麦，EST TC190653)。

图 1b ：脯氨酸残基的保留

图 2 ： Phl p 5a 的 3D 结构中脯氨酸残基位置的工作模型

N-末端的3D同源模型(Phl p 5.0109的第31-139位氨基酸；模型分子：Phl p 6，PDB条目1NLX；在左侧描绘)和C-末端4-螺旋束(第155-255位氨基酸；模型分子：Phl p 5b片段，PDB条目1L3P；右侧)。

a.两个4-螺旋束的高度简化模型。H1-H8：螺旋1-8。显示了脯氨酸的位置标识和原子结构。由于在模型分子3D模型中缺乏结构数据，脯氨酸残基P146和P256位于不可能显示的区域(虚线)。所描绘的位于螺旋2和3之间的环是推测性的，因为模型分子Phl p 6没有与该Phl p 5a区域同源的区域。

b.表面模型。在表面暴露了所有可描绘的脯氨酸残基(深黑色(coloured black))。

图 3 ： rPhl p 5a wt (IUIS 条目 Phl p 5.0109) ； cDNA 序列 (GenBank 条目： AJ555152 ； 855 bp) ， SEQ ID NO:1

图 4 ： rPhl p 5a wt (IUIS 条目 Phl p 5.0109) ；推断的氨基酸序列 (UniProtKB 条目： Q84UI2 ； 284 aa) ， SEQ ID NO:2

图 5 ： N- 末端组氨酸融合组分； DNA 序列 (57 bp) ， SEQ ID NO:3

图 6 ： N- 末端组氨酸融合组分；氨基酸序列 (19 aa) SEQ ID:4

图 7 ：使用混合血清，在单个环中具有脯氨酸缺失的 Phl p 5a 变体的 IgE 抑制试验结果

(a) + (b)：来自每一种情况中一个单独实验的两次测定数据。符号代表每一种情况中八个抑制剂浓度的两次重复测量的平均值。误差条上的水平线显示两次测定的各自值。

(c)：一些单独实验结果的总结。

左侧柱(深灰色)：抑制剂浓度为5 µg/ml时关于rPhl p 5a wt的IgE抑制。

右侧柱(淡灰色)：抑制剂浓度为1.25 µg/ml时关于rPhl p 5a wt的IgE抑制。

柱的高度显示从许多(n)个单独实验中获得的平均值。误差条表示在许多(n)个所评价的单独实验中获得的最大值(误差条上面的水平线)和最小值(误差条下面的水平线)。

固相：rPhl p 5a wt。混合血清：Bor 18/100，Allergopharma。

图 8 ： rPhl p 5a d[P117, 180] + 6His 与单个位置 脯氨酸突变体 rPhl p 5a d[P117] + 6His 和 d[P180] + 6His 的 IgE 抑制的比较

一些单独实验结果的总结：

柱的高度表示从许多(n)个单独实验中获得的平均值。误差条表示在许多(n)个所评价的单独实验中获得的最大值(误差条上面的水平线)和最小值(误差条下面的水平线)。

固相：rPhl p 5a wt。混合血清：Bor 18/100，Allergopharma。

图 9 ： MPV.3 + 6His 与单个位置脯氨酸突变体 rPhl p 5a d[P57, 58] + 6His 和 d[P229]+ 6His 的 IgE 抑制的比较

一些单独实验结果的总结：

柱的高度表示从许多(n)个单独实验中获得的平均值。

误差条表示从许多(n)个所评价的单独实验中获得的最大值(误差条上面的水平线)和最小值(误差条下面的水平线)。

固相：rPhl p 5a wt。混合血清：Bor 18/100，Allergopharma。

图 10 ： MPV.3 + 6His 与单个位置 脯氨酸突变体 rPhl p 5a d[P211] + 6His 、 P211L + 6His 、 K61E + 6His 和 E205K + 6His 的 IgE 抑制的比较

一些单独实验结果的总结：

柱的高度表示从许多(n)个单独实验中获得的平均值。

误差条表示在许多(n)个所评价的单独实验中获得的最大值(误差条上面的水平线)和最小值(误差条下面的水平线)。

固相：rPhl p 5a wt。混合血清：Bor 18/100，Allergopharma。

图 11 ： MPV.3 + 6His 的功能变应原性试验

借助用四个临床上确定的禾草花粉变态反应患者(P)的嗜碱性粒细胞进行的嗜碱性粒细胞激活试验，得到降低MPV.3 + 6His的功能变应原性的证据。

水平线：阴性对照的刺激水平。

图 12 ： MPV.4 + 6His 和 MPV.4 的 IgE 抑制试验

柱的高度表示从许多(n)个单独实验中获得的平均值。

固相：rPhl p 5a wt。混合血清：Bor 18/100，Allergopharma。

图 13 ： MPV.5 分子量的测定

带有在线分子量测定的分析性SEC的色谱图。

图中显示280 nm时的相对紫外信号(右侧Y轴)和分子量(左侧Y轴；在峰值区测量的点线)，其相对于洗脱时间(X轴)作图。

为了在线测定蛋白质浓度，采用了OptilabrEX折射率检测仪(Wyatt, Santa Barbara, USA)。用MiniDAWN Treos多角度检测仪(Wyatt)测定颗粒的光散射。用ASTRA 5.3.2.17软件(Wyatt)经由具折射率增量为0.180 ml/ g的Debeye形式来计算颗粒重量。

柱：Superdex 200 GL 10/ 300 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)。尺寸排阻(t₀ )为20.45分钟(对应于约670 kD)。

洗脱液：20 mM Tris 8.0，150 mM NaCl

图 14 ： MPV.7 分子量的测定

带有在线分子量测定的分析性SEC的色谱图。

洗脱液：20 mM Tris 8.0，150 mM NaCl

图 15 ： MPV.4 分子量的测定

带有在线分子量测定的分析性SEC的色谱图。

洗脱液：20 mM Tris 8.0，150 mM NaCl

图 16 ： MPV.6 分子量的测定

带有在线分子量测定的分析性SEC的色谱图。

洗脱液：20 mM Tris 8.0，150 mM NaCl

图 17 ： IgE 与固定的 MPV.4 、 MPV.5 、 MPV.6 和 MPV.7 的结合

IgE与固定在硝酸纤维膜试纸条上的Phl p 5蛋白的结合试验。

rPhl p 5b wt：重组Phl p 5b同工型

rPhl p 5a wt：重组Phl p 5a同工型

nPhl p 5a/b：天然起源的Phl p 5变应原，其由a和b同工型蛋白(Allergopharma)组成

MPV.4：d[P57, P58, P117, P146, P155, P180, P229] K61E E205K P211L

MPV.5：d[P57, P58, P117, P180, P229] K61E E205K P211L

MPV.6：d[P57, P58, P117, P146, P155, P180, P229] P211L

MPV.7：d[P57, P58, P117, P180, P229] P211L

HAS：人血清白蛋白(阴性对照)。

总体：试纸条的均匀装料量(uniform charging)对照。用试剂DB71 (Sigma, USA)染色。

SP：混合血清Bor18/100 (Allergopharma)

图 18 ： MPV.5 和 MPV.4 的 IgE 抑制试验

柱的高度表示从许多(n)个单独实验中获得的平均值。

固相：rPhl p 5a wt。混合血清：Bor 18/100，Allergopharma。

图 19 ： MPV.6 和 MPV.7 的 IgE 抑制试验

柱的高度表示从许多(n)个单独实验中获得的平均值。

固相：rPhl p 5a wt。混合血清：Bor 18/100，Allergopharma。

图 20 ： MPV.4 的功能变应原性试验

借助用四个临床上确定的禾草花粉变态反应患者(P)的嗜碱性粒细胞进行嗜碱性粒细胞激活试验，得到降低MPV.4的功能变应原性的证据。

水平线：阴性对照的刺激水平。

图 21 ： MPV.5 的功能变应原性试验

借助用四个临床上确定的禾草花粉变态反应患者(P)的嗜碱性粒细胞进行嗜碱性粒细胞激活试验，得到降低MPV.5的功能变应原性的证据。

水平线：阴性对照的刺激水平。

图 22 ： MPV.6 的功能变应原性试验

借助用临床上确定的禾草花粉变态反应患者(P)的嗜碱性粒细胞进行嗜碱性粒细胞激活试验，得到降低MPV.6的功能变应原性的证据。

水平线：阴性对照的刺激水平。

图 23 ：功能变应原性试验； MPV.7

借助用四个临床上确定的禾草花粉变态反应患者(P)的嗜碱性粒细胞进行嗜碱性粒细胞激活试验，得到降低MPV.7的功能变应原性的证据。

水平线：阴性对照的刺激水平。

图 24 ： rPhl p 5b wt 前体 (IUIS 条目 Phl p 5.0201) ；推断的氨基酸序列 284 aa (Swiss prot ： Q40963.2) ， SEQ ID NO:5

即使没有另外的实施方案，也可假定本领域技术人员能够在最大范围内利用以上阐述。因此，优选实施方案应仅视为阐述性公开内容，而绝不以任何方式来限制。

因此，以下实施例意欲说明本发明而不是加以限制。除非另外指出，否则百分比数据意为重量百分比。所有的温度用摄氏度来表示。“常规检查(work-up)”：若需要可加水，若需要，则根据最终产物的组成将pH值调节为2-10之间的值。

通过生物技术方法制备并鉴定本发明的以下低变应原性变体。然而，对于本领域技术人员亦可通过其它方法来实现所述物质的制备和鉴定。例如，亦可化学合成本发明的低变应原性变体。本发明同样涉及下述本发明的低变应原性变体。

实施例 1 ：具一个或两个相邻脯氨酸缺失的Phl p 5a变体

以下阐述了变体rPhl p 5a d[P57, P58] + 6His、rPhl p 5a d[P85] + 6His、rPhl p 5a d[P117] + 6His、rPhl p 5a d[P146, P155] + 6His、rPhl p 5a d[P180] + 6His、rPhl p 5a d[P211] + 6His、rPhl p 5a d[P229] + 6His和rPhl p 5a d[P256] + 6His的制备及其免疫学鉴定。类似地制备和研究重组未修饰的变应原(rPhl p 5 wt + 6His)，亦可类似地制备和研究真禾本科的本发明其它第5组变应原的低变应原性变体及其野生型蛋白质，特别为Lol p 5和Poa p 5。

通过基因工程的构建：

通过使重叠的长DNA寡核苷酸和由PCR标准方法扩增的DNA键合来合成变体的DNA。选择密码子以使推断的氨基酸序列基于Phl p 5.0109中的密码子(图3、4)。在PCR反应中使用缺乏相应的脯氨酸密码子的特异寡核苷酸来引入脯氨酸缺失的突变。选择寡核苷酸以使推断的蛋白质在5'端带有六个组氨酸融合组分(图5、6)。将cDNA连接到表达载体pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA)。通过测序来确认DNA的正确性。

表达、纯化和生化分析：

在大肠杆菌(Top10菌株；Invitrogen)中实施表达。通过让N-末端组氨酸残基特异性结合到Ni2+螯合基质(固定化金属离子亲和色谱，IMAC；材料：HiTrap，GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上来纯化rPhl p 5a野生型和变体。用紫外-可见光谱来确认不存在不可溶的蛋白质聚集体。

IgE结合降低的证据：

用EAST-IgE抑制试验(酶变应原吸附试验)来实施受试物质的IgE结合能力的研究。在该方法中，可在溶液中研究变应原/IgE的相互作用，使得能够排除受试物质表位的干扰掩蔽，例如排除通过固定在膜上的干扰掩蔽。

如下实施EAST抑制试验。用变应原包被微滴定板，此处的变应原是指重组野生型Phl p 5.0109 (rPhl p 5a wt)。通过洗涤去除未结合的变应原分子后，用牛血清白蛋白封闭板以防止后面的非特异性结合。将呈单个变态反应患者血清的代表性混合形式(混合血清)的变态反应患者的IgE抗体以适宜的稀释度与变应原-包被的微滴定板一起孵育。经由抗-人-IgE/碱性磷酸酶缀合物与底物反应产生有色终产物，通过光度测定来定量变应原-结合的IgE抗体的量。

IgE抗体的结合受可溶性变应原或待测物质(重组修饰的变应原)的物质特异性抑制，该抑制为浓度的函数。图7中所示的用Phl p 5a的重组变应原变体的IgE抑制试验结果显示，Phl p 5a的IgE结合能力降低是由脯氨酸残基P57和P58；P117；P146和P155；P180；P211或P229的缺失引起的，而不是由P85或P256的缺失引起的。降低的抑制作用表明丢失IgE表位。

实施例 2 ：具有脯氨酸联合缺失的Phl p 5a的变体

通过禾本科第5组变应原的本发明低变应原性变体的实例，以下阐述了变体rPhl p 5a d[P117, P180] + 6His的制备和免疫学鉴定，所述低变应原性变体带有多个脯氨酸的联合缺失，所述缺失对应于基于Phl p 5.0109的第57和58、117、146、和155、180、211和229位氨基酸。类似地制备和研究重组未修饰的变应原(rPhl p 5 wt + 6His)，亦可类似地制备和研究真禾本科中的本发明其它第5组变应原的低变应原性变体及其野生型蛋白质，特别为Lol p 5和Poa p 5。

通过基因工程的构建：

通过使重叠的长DNA寡核苷酸和由PCR扩增的DNA键合来合成变体。选择密码子以使推断的氨基酸序列基于Phl p 5.0109的密码子。在PCR反应中使用缺乏相应的脯氨酸密码子的特异寡核苷酸来引入脯氨酸缺失的突变。选择寡核苷酸以使推断的蛋白质在5'端携带六个组氨酸融合组分。将cDNA转化到表达载体pTrcHis2 Topo (Invitrogen)和大肠杆菌中。通过测序来确认DNA的正确性。

表达、纯化和生化分析：

在大肠杆菌 (Top10菌株；Invitrogen)中实施表达。通过IMAC来纯化变体。通过SDS-PAGE来检验洗脱的蛋白质的纯度，通过紫外-可见光谱来确认不存在不可溶的蛋白质聚集体。

IgE结合降低的证据：

用EAST-IgE抑制试验来实施受试物质IgE结合能力的研究，且使用呈代表性混合血清形式的变态反应患者的IgE抗体。图8中所示结果表明，变体rPhl p 5a d[P117, P180] + 6His的IgE抑制显著低于仅有一个脯氨酸缺失的变体rPhl p 5a d[P117] + 6His和rPhl p 5a d[P180] + 6His的IgE抑制。该结果显示单独的脯氨酸缺失的联合可导致增加Phl p 5a的IgE结合能力的降低。

实施例 3 ：低变应原性变体rPhl p 5a d[P57, P58, P85, P117, P146, P155, P180, P211, P229, P256] (MPV.1 + 6His)

变应原变体MPV.1 + 6His具有所有所研究的Phl 5a脯氨酸残基的缺失联合。该制剂的目的是在可接受的蛋白质溶解性下最大程度地降低IgE结合能力。

通过基因工程的构建：

通过使重叠的长DNA寡核苷酸和由PCR扩增的DNA键合来合成变体。选择密码子以使推断的氨基酸序列基于Phl p 5.0109的密码子。在PCR反应中使用缺乏相应的脯氨酸密码子的特异寡核苷酸来引入脯氨酸缺失的突变。

选择寡核苷酸以使推断的蛋白质在5'端携带六个组氨酸融合组分。将cDNA转化到表达载体pTrcHis2 Topo (Invitrogen)和大肠杆菌中。通过测序来确认DNA的正确性。

表达：

在大肠杆菌(Top10菌株；Invitrogen)中实施表达。蛋白质作为不可溶包涵体沉积在宿主细胞中。

溶解性试验：

用标准方法消化细胞并通过用6摩尔盐酸胍溶液处理使蛋白聚集体以变性方式溶解后，以约80%的纯度分离该蛋白聚集体。

在4℃下将变性后的蛋白质以1:50稀释至本试验的25 ml体积中，并在4℃保持过夜。第二天，用感官检验任何可见的沉淀形成。部分浓缩后，使样品离心，借助紫外-可见光谱研究透明上清液中不可溶微聚集体的存在情况。

变体MPV.1 + 6His溶解行为的系统研究显示，随后将蛋白质转化为无盐酸胍制剂时，总是伴随有蛋白聚集体的形成，因此是不可能的(表1)。

实施例 4 ：低变应原性变体rPhl p 5a d[P57, P58, P117, P146, P155, P180, P211, P229] (MPV.2 + 6His)

通过禾本科第5组变应原的低变应原性变体的实例，以下阐述了变体MPV.2+ 6His的制备和免疫学鉴定，所述低变应原性变体具有脯氨酸的联合缺失，所述缺失对应于基于Phl p 5.0109的第57、58、117、146、155、180、211和229位氨基酸。类似地制备和研究重组未修饰的变应原(rPhl p 5 wt + 6His)，亦可类似地制备和研究真禾本科的本发明其它第5组变应原的低变应原性变体及其野生型蛋白质，特别为Lol p 5和Poa p 5。

通过基因工程的构建：

通过使重叠的长DNA寡核苷酸和由PCR扩增的DNA键合来合成变体。选择密码子以使推断的氨基酸序列基于Phl p 5.0109的密码子。

在PCR反应中使用缺乏相应的脯氨酸密码子的特异寡核苷酸来引入脯氨酸缺失的突变。

选择寡核苷酸以使推断的蛋白质在5'端携带六个组氨酸融合组分。将cDNA连接到表达载体pTrcHis2 Topo (Invitrogen)并转化到大肠杆菌中。通过测序来确认DNA的正确性。

表达：

溶解性试验：

在所研究的整个pH范围4.5-9.0内，MPV.2 + 6His表现出弱溶解性。仅可用包含吐温80和L-精氨酸单盐酸盐的溶液防止可见沉淀的形成，但在以下的该批次中亦可检测到微聚集体(表2)。

实施例 5 ：低变应原性变体rPhl p 5a d[P57, P58, P229] K61E, E205K, P211L (MPV.3 + 6His)

通过禾本科第5组变应原的低变应原性变体的实例，以下阐述了变体MPV.3+ 6His的制备和免疫学鉴定，所述低变应原性变体具有对应于Phl p 5.0109中氨基酸位置的脯氨酸残基57、58、117、146、155、180或229的联合缺失，其中将脯氨酸残基211突变为任何所需的其它氨基酸，或其中将赖氨酸61另外地转变为谷氨酸，或谷氨酸205转变为赖氨酸。类似地制备和研究重组未修饰的变应原(rPhl p 5 wt + 6His)，亦可类似地制备和研究真禾本科中的本发明其它第5组变应原的低变应原性变体及其野生型蛋白质，特别为Lol p 5和Poa p 5。

可通过制备并在免疫学上鉴定变体rPhl p 5a K61E + 6His、rPhl p 5a E205K + 6His和rPhl p 5a P211L + 6His，来研究MPV.3 +6His氨基酸序列中存在的突变K61E、E205K和P211L对IgE结合能力的影响。

通过基因工程的构建：

在本实施例中通过cDNA合成时许多聚合酶的错误，意想不到地产生了编码MPV.3 + 6His的核苷酸序列。将DNA连接到表达载体pTrcHis2 Topo (Invitrogen)。逐一制备编码变体rPhl p 5a K61E + 6His、rPhl p 5a E205K + 6His和rPhl p 5a P211L + 6His的DNA，并将其连接到表达载体pTrcHis2 Topo。通过DNA测序来检验所产生的cDNA序列的正确性。

表达：

MPV.3 + 6His的溶解性试验：

在消化细胞并用6摩尔盐酸胍溶液处理使蛋白聚集体以变性方式溶解后，以约80%的纯度分离该蛋白聚集体。为了检验MPV.3 + 6His在非变性环境下的溶解特性，用类似于变体MPV.1 + 6His和MPV.2 + 6His的实验来实施多种溶液的系列试验。

意想不到地，在稀释过程中观察到变体MPV.3 + 6His在微碱性的pH条件下具有高溶解度(表3)。这种行为与上面研究的变体MPV.1 + 6His和MPV.2 + 6His相反，并且是非变性环境下所述蛋白质制剂的关键优势。

MPV.3 + 6His和突变体rPhl p 5a K61E + 6His、rPhl p 5a E205K + 6His及rPhl p 5a P211L + 6His的纯化：

将变性后的蛋白质用20 mM Tris、150 mM NaCl，pH 9.0以1:50稀释，8℃保持过夜。用IMAC (HiTrap材料, GE Healthcare)和SEC (Superdex 75材料, GE Healthcare)实施色谱纯化。蛋白质最终在含有150 mM NaCl，pH 7.5的25 mM磷酸钠缓冲液中为稳定和可溶形式。

生化分析：

通过SDS-PAGE检验纯度。通过紫外-可见光谱来确认不存在不可溶蛋白质聚集体。

MPV.3 + 6His的IgE结合降低的证据：

用EAST抑制试验来实施MPV.3 + 6His的IgE结合能力的研究，且采用呈代表性混合血清形式的变态反应患者的IgE抗体。图9所示结果显示，MPV.3 + 6His的IgE抑制显著低于变体rPhl p 5a d[P57, P58] + 6His和rPhl p 5a d[P229] + 6His的IgE抑制。

为进一步鉴定变体MPV.3 + 6His的突变K61E、E205K和P211L，通过EAST研究了三种变体rPhl p 5a K61E + 6His、rPhl p 5a E205K + 6His和rPhl p 5a P211L + 6His。

变体rPhl p 5a P211L+ 6His表现出与前面测试的点突变体rPhl p 5a d[P211] + 6His同等低的抑制行为。变体rPhl p 5a K61E + 6His和rPhl p 5a E205K+ 6His表现出稍微降低的IgE结合(图10)。

可得出结论，三种点突变K61E、E205K和P211L促使MPV.3 + 6His的IgE结合显著降低。

MPV.3 + 6His功能变应原性降低的证据：

在体外研究了MPV.3 + 6His在效应细胞的膜结合-IgE交联及其激活中的功能作用。

对于嗜碱性粒细胞激活试验，让禾草花粉变态反应患者的肝素化全血与多种浓度的受试物质一起孵育。变应原性物质能结合特异的IgE抗体，所述IgE抗体与嗜碱性粒细胞的高亲和性IgE受体缔合。由变应原分子触发的IgE/受体复合物的交联导致信号转导，信号转导导致效应细胞脱粒并因此触发体内的变态反应。

可通过定量与IgE-受体交联的信号转导相偶联的表面蛋白(CD203c)的表达，来体外测定变应原-诱导的嗜碱性免疫细胞的激活(Kahlert等, Clinical Immunology and Allergy in Medicine Proceedings of the EAACI 2002 (2003) Naples, Italy 739-744)。经由荧光标记的单克隆抗体与表面蛋白结合并随后通过荧光激活的流式细胞术分析，来高灵敏度地测量细胞上表达的表面蛋白的数量和细胞库(cell pool)中被激活细胞的百分比值。

与rPhl p 5a wt相比，MPV.3 + 6His在此表现出对禾草花粉变态反应患者的嗜碱性粒细胞的激活作用降低，并因此表现出功能性降低的变应原性(图11)。

实施例 6 ：低变应原性变体rPhl p 5a d[P57, P58, 117, 146, 155, 180, P229] K61E, E205K, P211L (MPV.4)

通过禾本科第5组变应原的低变应原性变体的实例，以下阐述了变体MPV.4的制备及免疫学鉴定，所述低变应原性变体具有对应于Phl p 5.0109中氨基酸位置的脯氨酸残基57、58、117、146、155、180或229的联合缺失，其中将脯氨酸残基211突变为任何所需的其它氨基酸，或其中将赖氨酸61另外地转变为谷氨酸，或将谷氨酸205转变为赖氨酸。类似地制备和研究重组未修饰的变应原(rPhl p 5 wt + 6His)，亦可类似地制备和研究真禾本科中本发明其它第5组变应原的低变应原性变体及其野生型蛋白质，特别为Lol p 5和Poa p 5。

通过基因工程构建MPV.4 (+ 6His)：

为了制备MPV.4 (MPV.4 + 6His)的组氨酸融合蛋白的cDNA，将已克隆好的MPV.1 + 6His的cDNA片段重新克隆至已存在的质粒MPV.3 + 6His/ pTrcHis2 Topo中。为制备无融合组分的蛋白质(MPV.4)，将不带有编码组氨酸融合组分的部分的DNA连接到载体pTMP (Allergopharma, Reinbek)中。通过DNA测序来检验序列的正确性。

MPV.4 (+ 6His)的表达：

在大肠杆菌(Top10菌株；Invitrogen)中作为组氨酸融合蛋白(表达载体pTrcHis2Topo；Invitrogen)或在大肠杆菌(BL21菌株；Merck，Darmstadt Invitrogen)中无融合组分(表达载体pTMP)实施表达。在两种情况下，重组蛋白都作为包涵体沉积。用6摩尔的盐酸胍溶液溶解蛋白质。

MPV.4 + 6His的溶解性试验：

为了检验MPV.4 + 6His在非变性环境下的溶解特性，以类似于变体MPV.1 + 6His的实验来实施多种溶液的系列试验。观察到变体MPV.4 + 6His在弱碱性pH下具有溶解性(表4)。

MPV.4 + 6His的纯化：

通过IMAC (HiTrap材料, GE Healthcare)和SEC (Superdex 75材料, GE Healthcare)以制备规模纯化融合蛋白，所述融合蛋白最终存在于含有150 mM NaCl、pH 7.5的25 mM磷酸钠缓冲液中。

非融合蛋白MPV.4的纯化：

首先，用20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 9.0将变性后的非融合蛋白溶液以1:50稀释，其类似于融合蛋白的纯化方案，并在4℃保持过夜。在第一步纯化步骤中，通过疏水作用色谱法(HIC)富集靶蛋白。

在高离子强度下，蛋白质视其表面疏水性而定与HIC柱以特定强度结合，这使得能通过逐渐降低的盐浓度来选择性地洗脱所述蛋白质。

首先用20 mM Tris、2 M硫酸铵、150 mM NaCl、pH 9.0将稀释后的蛋白质溶液进一步以1:2稀释，以使硫酸铵的终浓度达到1 M。然后将此蛋白质溶液通过HiTrap butyl-S FF HIC柱(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，在靶蛋白结合之后，用20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 9.0逐步洗脱。

作为第二步纯化步骤的准备，用20 mM Tris、50 mM NaCl、pH 8.0经由Sephadex G25柱(GE Healthcare)重新缓冲HIC洗出液。

作为第二步纯化步骤，将洗出液上样到阴离子交换色谱柱(HiTrap Q HP，GE Healthcare)，收集通过色谱柱的物质。靶蛋白位于通过柱的物质中，而外来蛋白(foreign protein)结合在柱上并有效去除。

在AIEX过程中，具有负表面电荷的蛋白质在低离子强度下与柱材料结合，而不带电或带正电的蛋白质却不结合。

在最后的步骤中，随后经由SEC柱(Superdex 75，GE Healthcare)纯化AIEX输出物(output)，以使靶蛋白最终存在于20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 8.0中。

MPV.4 (+ 6His)的生化分析：

通过SDS-PAGE检验蛋白质的纯度。通过借助质谱(MALDI-TOF)测定分子量并对N-末端氨基酸(序列：A D-L-G-Y-G-P-A-T)(表6)进行测序，来确认无融合组分的MPV.4的身份。通过紫外-可见光谱来确认不存在不可溶蛋白质聚集体。

借助SEC/MALS/RI的MPV.4分子量分析意想不到地显示洗脱蛋白质的质量为28.2-49.3 kD (平均质量36.9 kD)。因为单体的理论质量为27.6 kD，可设想存在单体和二聚体的混合物(图15、表6)。从定性上看，用融合蛋白获得了相同的结果。

MPV.4 (+ 6His)的IgE结合降低的证据：

用EAST抑制试验来实施IgE结合能力的研究，且使用呈代表性混合血清形式的变态反应患者的IgE抗体。

图12所示的结果显示，在带有和不带有融合组分的两种情况下，MPV.4的IgE结合均降低至相同程度。因此表明，降低的IgE反应性不依赖于组氨酸标签的存在情况。

用于测定来自变态反应患者血清中特异性IgE对结合膜的受试蛋白的IgE反应性的简单测试方法是试纸条试验(strip test)。为此目的，在非变性条件下将相同浓度和量的受试物质顺次结合在硝酸纤维膜试纸条上。可让一系列这样的膜试纸条与不同变态反应患者的血清平行孵育。在洗涤步骤之后，通过颜色反应使特异性结合的IgE抗体在膜上变得可见，所述颜色反应通过抗-人IgE/碱性磷酸酶缀合物来促进。

用单个的禾草花粉变态反应患者血清的变体MPV.4的结果示于图17。使用带有抗天然Phl p 5 (nPhl p 5a/b，Phl p 5a和b同工型的混合物)抗体的变态反应患者的血清。IgE抗体同样与重组rPhl p 5a wt反应，并同样与所研究的重组野生型b同工型(rPhl p 5b wt)反应。

很明显所有变态反应患者血清的Phl p 5特异性IgE抗体以大幅降低的程度结合变体MPV.4，而重组野生型蛋白质rPhl p 5a wt和rPhl p 5b wt的结合却与nPhl p 5a/b一样强。

MPV.4功能变应原性降低的证据：

在体外研究了带有融合蛋白和不带有融合蛋白的MPV.4在效应细胞的膜-结合IgE交联及其激活中的功能作用。与rPhl p 5a wt相比，带有融合蛋白和不带有融合组分的MPV.4二者在此都表现出对禾草花粉变态反应患者的嗜碱性粒细胞激活作用极大降低，并因此表现高度降低的功能变应原性(图20)。

实施例 7 ：低变应原性变体rPhl p 5a d[P57, P58, P117, P180, P229] K61E, E205K, P211L (MPV.5)

通过禾本科第5组变应原的低变应原性变体的实例，以下阐述了变体MPV.5的制备及免疫学鉴定，所述低变应原性变体具有对应于Phl p 5.0109中氨基酸位置的脯氨酸残基57、58、117、180或229的联合缺失，其中将脯氨酸残基211突变为任何所需的其它氨基酸，或其中将赖氨酸61另外地转变为谷氨酸，或将谷氨酸205转变为赖氨酸。类似地制备和研究重组未修饰的变应原(rPhl p 5 wt + 6His)，亦可类似地制备和研究真禾本科中本发明其它第5组变应原的低变应原性变体及其野生型蛋白质，特别为Lol p 5和Poa p 5。

通过基因工程构建MPV.5 (+ 6His)：

为制备组氨酸融合蛋白(MPV.5 + 6His)的cDNA，将已克隆好的rPhl p 5a d[P117, P180] + 6His的cDNA片段重新克隆至已存在的质粒MPV.3 + 6His/ pTrcHis2 Topo中。

为制备无融合组分的蛋白质(MPV.5)，将不带有编码组氨酸融合组分的部分的DNA连接到载体pTMP (Allergopharma, Reinbek)中。通过DNA测序来确认序列的正确性。

MPV.5 (+ 6His)的表达：

在大肠杆菌(Top10菌株；Invitrogen)中作为组氨酸融合蛋白(表达载体pTrcHis2Topo；Invitrogen)或在大肠杆菌(BL21菌株；Merck，Darmstadt Invitrogen)中无融合组分(表达载体pTMP)实施表达。

在两种情况下，重组蛋白都作为包涵体沉积。借助6摩尔的盐酸胍溶液溶解蛋白质。

MPV.5 + 6His的纯化：

通过IMAC (HiTrap材料, GE Healthcare)和SEC (Superdex 75材料, GE Healthcare)以制备规模纯化融合蛋白，所述蛋白质最终存在于含有150 mM NaCl、pH 7.5的25 mM磷酸钠缓冲液。

非融合蛋白的纯化：

首先，用20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 9.0将变性后的非融合蛋白的IB溶液以1:50稀释，其类似于融合蛋白的纯化方案，并在4℃保持过夜。

在第一步纯化步骤中，通过疏水作用色谱法(HIC)富集靶蛋白。首先用20 mM Tris、2 M硫酸铵、150 mM NaCl、pH 9.0将稀释的蛋白质溶液进一步以1:2稀释，以使硫酸铵的终浓度达到1 M。然后将此蛋白质溶液通过HiTrap butyl-S FF HIC柱(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，在靶蛋白结合之后，用20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 9.0逐步洗脱。

作为第二步纯化步骤的准备，用20 mM Tris、50 mM NaCl、pH 8.0经由Sephadex-G25柱(GE Healthcare)重新缓冲HIC洗出液。作为第二步纯化步骤，将洗出液上样到阴离子交换色谱柱(HiTrap Q HP，GE Healthcare)，收集通过色谱柱的物质，所述物质包含靶蛋白。

在最后的步骤中，随后经由SEC柱(Superdex 75，GE Healthcare)纯化AIEX输出物，以使靶蛋白最终存在于20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 8.0中。

MPV.5 (+ 6His)的生化分析：

通过SDS-PAGE检验蛋白质的纯度。通过紫外-可见光谱来确认不存在不可溶蛋白质聚集体。通过借助质谱(MALDI-TOF)测定分子量并对N-末端氨基酸序列(序列：A D-L-G-Y-G-P-A-T)(表6)进行测序，来确认无融合组分的MPV.5的身份。

通过SEC/MALS/RI对MPV.5的分析显示，蛋白质专一地呈单体形式(图13、表6)。用融合蛋白得到了同等的结果。因此，在变体MPV.4情况下观察到的高度二聚化倾向取决于突变d[P146, P155]的存在情况。

MPV.5 (+ 6His)的IgE结合降低的证据：

用EAST抑制试验来进行IgE结合能力的研究，且使用呈代表性混合血清形式的变态反应患者的IgE抗体。在带有和不带有融合组分的两种情况下，MPV.5表现出的IgE结合能力降低至相等程度。该IgE结合能力稍微高于变体MPV.4的IgE结合能力，这可能是由于在专一地呈单体形式的MPV.5情况下，IgE表位的可及性更好(图18)。

使用单个禾草花粉变态反应患者血清的变体MPV.5的试纸条试验结果示于图17。很明显所有变态反应患者血清中Phl p 5特异性的IgE抗体以大幅降低的程度结合变体MPV.5。

MPV.5功能变应原性降低的证据：

在体外研究了带有融合蛋白和不带有融合蛋白的MPV.5在效应细胞的膜-结合IgE交联及其激活中的功能作用。与rPhl p 5a wt相比，MPV.5此处表现出对禾草花粉变态反应患者的嗜碱性粒细胞激活作用极大降低，因此表现出高度降低的功能变应原性(图21)。

实施例 8 ：低变应原性变体rPhl p 5a d[P57, P58, P117, P146, P155, P180, P229] P211L (MPV.6)

通过禾本科第5组变应原的低变应原性变体的实例，以下阐述了变体MPV.6的制备和免疫学鉴定，所述低变应原性变体具有对应于Phl p 5.0109中氨基酸位置的脯氨酸残基57、58、117、146、155、180或229的联合缺失，其中将脯氨酸残基211突变为任何所需的其它氨基酸。类似地制备和研究重组未修饰的变应原(rPhl p 5 wt + 6His)，亦可类似地制备和研究真禾本科中本发明其它第5组变应原的低变应原性变体及其野生型蛋白质，特别为Lol p 5和Poa p 5。

通过基因工程的构建：

为制备DNA，将MPV.2 + 6His的DNA片段连接到此时已存在的载体rPhl p 5a d[57, 58, 117, 180, 229] P211L/ pTMP (Allergopharma)中。通过DNA测序来检验序列的正确性。

表达：

在大肠杆菌(BL21菌株；Merck，Darmstadt)的表达载体pTMP(Allergopharma)中专一地作为无融合组分蛋白质来实施表达。重组蛋白作为包涵体(IB)沉积。

纯化：

首先，用20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 9将变性后的非融合蛋白的IB溶液以1:50稀释，并在4℃保持过夜。

在第一步纯化步骤中，通过疏水作用色谱法(HIC)富集靶蛋白。

首先用20 mM Tris、2 M硫酸铵、150 mM NaCl、pH 9.0将稀释的蛋白质溶液进一步以1:2稀释，以使硫酸铵的终浓度达到1 M。然后将此蛋白质溶液通过HiTrap butyl-S FF HIC柱(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，在靶蛋白结合之后，用20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 9.0逐步洗脱。

作为第二步纯化步骤的准备，用20 mM Tris、50 mM NaCl、pH 8.0经由Sephadex G25 柱(GE Healthcare)重新缓冲HIC洗出液。作为第二步纯化步骤，将洗出液上样到阴离子交换色谱柱(HiTrap Q HP，GE Healthcare)，收集通过色谱柱的物质，该物质包含靶蛋白。在最后的步骤中，随后经由SEC柱(Superdex 75，GE Healthcare)纯化AIEX输出物，以使靶蛋白最终存在于20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 8.0中。

生化分析：

通过SDS-PAGE检验蛋白质的纯度。通过借助质谱(MALDI-TOF) 测定分子量并对N-末端氨基酸序列(序列：A D-L-G-Y-G-P-A-T)(表6)进行测序，来确认无融合组分的MPV.6的身份。

通过紫外-可见光谱来确认不存在不可溶蛋白质聚集体。在借助SEC/MALS/RI对MPV.6的分析中，纯化的蛋白质洗脱为两个峰。峰1代表单体形式，峰2代表二聚体形式(图16；表6)。

亦如关于变体MPV.4和MPV.5所显示，其二聚化能力归因于突变d[P146, 155]的存在。

IgE结合降低的证据：

用EAST抑制试验来实施IgE结合的研究，且使用呈代表性混合血清形式的变态反应患者的IgE抗体。图19所示的结果表明MPV.6的IgE结合大幅降低。使用单个禾草花粉变态反应患者血清的试纸条试验结果示于图17。很明显所有变态反应患者血清中Phl p 5 特异性IgE抗体以大幅降低的程度结合变体MPV.6。

功能变应原性降低的证据：

与rPhl p 5a wt相比，MPV.6在嗜碱性粒细胞的膜-结合IgE交联及激活中的功能作用大幅降低，其如两个禾草花粉变态反应患者的全血结果所显示(图22)。

实施例 9 ：低变应原性变体rPhl p 5a d[P57, P58, P117, P180, P229] P211L (MPV.7)

通过禾本科第5组变应原的低变应原性变体的实例，以下阐述了变体MPV.7的制备和免疫学鉴定，所述低变应原性变体具有对应于rPhl p 5a野生型或Phl p 5.0109中氨基酸位置的脯氨酸残基57、58、117、180或229的联合缺失，其中将脯氨酸残基211突变为任何所需的其它氨基酸。类似地制备和研究重组未修饰的变应原(rPhl p 5 wt + 6His)，亦可类似地制备和研究真禾本科中本发明其它第5组变应原的低变应原性变体及其野生型蛋白质，特别为Lol p 5和Poa p 5。

通过基因工程的构建：

通过借助PCR过程的特异寡核苷酸制备DNA片段来制备DNA，然后将所述DNA重新克隆到此时已存在的载体rPhl p 5a d[P57, P58, P117, P180, P211, P229]/ pTMP (Allergopharma)中。通过DNA测序来检验序列的正确性。

表达：

在大肠杆菌(BL21菌株；Merck，Darmstadt)中在表达载体pTMP (Allergopharma)中以无融合组分蛋白质实施表达。重组蛋白作为包涵体(IB)沉积。

溶解性试验：

为了检验重组蛋白在非变性环境下的溶解特性的系列试验显示，蛋白质在弱碱性pH范围下具有高溶解性(表5)。

纯化：

首先，用20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 9.0将变性后的非融合蛋白的IB溶液以1:50稀释，并在4℃保持过夜。在第一步纯化步骤中，通过疏水作用色谱法(HIC)富集靶蛋白。首先用20 mM Tris、2 M硫酸铵、150 mM NaCl、pH 9.0将稀释的蛋白质溶液进一步以1:2稀释，以使硫酸铵的终浓度达到1 M。然后将此蛋白质溶液通过HiTrap butyl-S FF HIC柱(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，在靶蛋白结合之后，用20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 9.0逐步洗脱。

作为第二步纯化步骤的准备，用20 mM Tris、50 mM NaCl、pH 8.0经由Sephadex G25柱(GE Healthcare)重新缓冲HIC洗出液。作为第二步纯化步骤，将洗出液上样到阴离子交换色谱柱(HiTrap Q HP，GE Healthcare)，收集通过色谱柱的物质，该物质包含靶蛋白。在最后的步骤中，随后经由SEC柱(Superdex 75，GE Healthcare)纯化AIEX输出物，以使靶蛋白最终存在于20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 8.0中。

生化分析：

通过SDS-PAGE检验蛋白质的纯度。通过借助质谱(MALDI-TOF) 测定分子量并对N-末端氨基酸序列(序列：A D-L-G-Y-G-P-A-T)(表6)进行测序，来确认无融合组分的MPV.7的身份。通过紫外-可见光谱来确认不存在不可溶蛋白质聚集体。SEC/MALS/RI分析表明，洗脱的蛋白质专一地以单体形式存在(图14；表6)。这归因于不存在突变d[P146, 155]。

IgE结合降低的证据：

用EAST抑制试验来实施IgE结合的研究，且使用呈代表性混合血清形式的变态反应患者的IgE抗体。图19所示的结果表明MPV.7的IgE结合大幅降低。使用单个禾草花粉变态反应患者血清的试纸条试验结果示于图17。很明显所有变态反应患者血清中Phl p 5特异性IgE抗体以大幅降低的程度结合变体MPV.7。

功能变应原性降低的证据：

与rPhl p 5a wt相比，在禾草花粉变态反应患者的嗜碱性粒细胞的膜-结合IgE交联及激活中的功能作用大幅降低(图23)。

低变应原性Phl p 5a变体的T-细胞反应性：

为研究T-细胞反应性，通过常规方法用天然nPhl p 5a或rPhl p 5a wt分子刺激来建立禾草花粉变态反应患者的寡克隆T-细胞系。在增殖试验中，用参考变应原rPhl p 5a wt和修饰的重组变应原变体刺激不同的T-细胞系。通过常规方法掺入[3H]-胸腺嘧啶核苷来测定增殖速率。

通过所述修饰的变应原变体的实例，在此阐述了12个禾草花粉变态反应患者的T-细胞系的MPV.4和MPV.7增殖试验结果。

虽然与未修饰的rPhl p 5a wt相比具有氨基酸序列的修饰，但在所有研究的分子中携带最多突变的变体MPV.4的T-细胞反应性没有降低，这表明保留了关键的T-细胞表位(表7)。

在所有所研究的多脯氨酸突变体中，突变体MPV.7含有最小数量的修饰氨基酸位置。正如预期的一样，该分子可与未修饰变应原rPhl p 5a同等良好地刺激人T-淋巴细胞(表8)。

表 1 ： MPV.1 + 6His 的溶解行为

¹首先用6 M的盐酸胍将分离自包涵体的蛋白质变性，随后用非变性溶液(溶液1-10)以1:50稀释并在4℃保持过夜。第二天，对由可见大聚集体或沉淀引起的浊度进行感官检验(OC)。(-)浑浊；(+)清澈溶液。

²用于通过测定在280和330 nm处的吸收比率来检测清澈溶液中不溶性微聚集体的紫外/可见光谱分析。离心后测试各批次。A₂₈₀/A₃₃₀ ≤ 20：沉淀(-)；A₂₈₀/A₃₃₀≤ 30：有沉淀倾向(o)；A₂₈₀/A₃₃₀ > 30：无沉淀(+)。(n.p.)未进行检测。

³基于感官和分光光度分析对溶解行为的评价。(-)倾向于不溶；(+)可溶。

表 2 ： MPV.2 + 6His 的溶解行为

²用于通过测定在280和330 nm处的吸收比率来检测清澈溶液中不溶性微聚集体的紫外/可见光谱分析。离心后测试各批次。A₂₈₀/A₃₃₀≤ 20：沉淀(-)；A₂₈₀/A₃₃₀≤ 30：有沉淀倾向(o)；A₂₈₀/A₃₃₀ > 30：无沉淀(+)。(n.p.)未进行检测。

表 3 ： MPV.3 + 6His 的溶解行为

表 4 ： MPV.4 + 6His 的溶解行为

表5：MPV.7的溶解行为

表 6 ：与 rPhl p 5a wt 相比， MPV.4 、 MPV.5 、 MPV.6 和 MPV.7 的分子量分析结果

¹基于氨基酸序列所计算的不含有起始甲硫氨酸的分子量(MW_calc. )(软件：DNA-Star, Lasergene, USA)

²通过SEC-MALS测定颗粒质量。引用的数字是峰窗口设置中洗脱的蛋白质颗粒的平均质量，但MPV.4 (*)的测量除外，其中指出了整个峰的质量的分散范围。

为了在线测定蛋白质浓度，采用了OptilabrEX折射率检测仪(RI) (Wyatt, Santa Barbara, USA)。用MiniDAWN Treos多角度检测仪(Wyatt)测定颗粒的光散射。用ASTRA 5.3.2.17软件(Wyatt)经由假设的折射率增量为0.180 ml/ g的Debeye形式来计算颗粒质量。

洗脱液：20 mM Tris 8.0，150 mM NaCl

表 7 ： MPV.4 的 T- 细胞反应性的证据

¹刺激指数(SI)，计算自增殖试验中[³H]的测量值。变应原-刺激的细胞培养物的cpm测量值/未受刺激的细胞培养物的cpm测量值。

²供体：临床上确定的禾草花粉变态反应患者。

³用SI (MPV.4)/ SI (rPhl p 5a wt)计算的值。SD：标准差。

表 8 MPV.7 的 T- 细胞反应性的证据

¹刺激指数(SI)，计算自增殖试验中[3^H]的测量值。变应原-刺激的细胞培养物的cpm测量值/未受刺激的细胞培养物的cpm测量值。

²供体：临床上确定的禾草花粉变态反应患者。

³用SI (MPV.4)/ SI (rPhl p 5a wt)计算的值。SD：标准差。

Claims

1.Phl p 5的低变应原性变体，其中将在比对中对应于野生型Phl p 5.0109氨基酸序列的第57、58、117、146、155、180、211、229位脯氨酸的脯氨酸通过选自缺失和氨基酸取代的点突变而突变，特征在于所述点突变选自：

a. d[P57和P58]；dP117；dP180；d[P146和P155]；dP211；dP229；和d[P117和P180]；

b. d[P57, P58, P85, P117, P146, P155, P180, P211, P229, P256]；d[P57, P58, P117, P146, P155, P180, P211和P229]；

c. P211L；

d. d[P57, P58, P229]K61E, E205K, P211 L；d[P57, P58, P117, P146, P155, P180, P229] K61E, E205K, P211L；d[P57, P58, P117, P180, P229] K61E, E205K, P211L；d[P57, P58, P117, P146, P155, P180, P229] P211L；d[P57, P58, P117, P180, P229]P211L。

2.DNA分子，其编码权利要求1的低变应原性变体。

3.重组表达载体，其含有与表达控制序列功能上连接的权利要求2的DNA分子。

4.借助权利要求2的DNA分子或权利要求3的重组表达载体转化的非人宿主生物的细胞。

5.用于制备权利要求1的低变应原性变体的方法，所述方法通过培养权利要求4的非人宿主生物的细胞并从培养物中分离相应的变应原变体来进行。

6.权利要求1的至少一种低变应原性变体用于制备用于预防和/或治疗性治疗因真禾本科第5组变应原参与而触发的1型变态反应的药物的用途。

7.权利要求2的至少一种DNA分子和/或权利要求3的重组表达载体用于制备用于免疫治疗性DNA接种的药物的用途。

8.用于预防和/或治疗性治疗1型变态反应的药物制剂，所述药物制剂包含权利要求1的至少一种低变应原性变体、权利要求2的至少一种DNA分子和/或权利要求3的至少一种重组表达载体和任选另外的活性化合物和/或助剂。

9.权利要求8的药物制剂，其特征在于所述另外的活性化合物是真禾本科的变应原或其变体。