JP2002516340A

JP2002516340A - ワクチン

Info

Publication number: JP2002516340A
Application number: JP2000550877A
Authority: JP
Inventors: デスモン，ピエール; リベイン，ロベール; メルタン，エマニュエル; シャンルビエ，ベノワ; プラーンシャン，ドミニク; コラッツァ，イボン
Original assignee: スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム
Priority date: 1998-05-26
Filing date: 1999-05-25
Publication date: 2002-06-04
Also published as: CN1311795A; CA2333167A1; NO20005951L; AU752196B2; ATE244730T1; KR20010043817A; TR200003468T2; PL345273A1; EP1080109A1; HUP0102774A2; NO20005951D0; EP1080109B1; BR9910715A; DE69909469D1; GB9811219D0; AU4367999A; DE69909469T2; WO1999061473A1; HUP0102774A3; ZA200006873B

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト臨床用途に好適なＢｏｒｒｅｌｉａリポタンパク質ＯｓｐＡの精製方法であって、これにより、双極性イオン界面活性剤の存在下でリポタンパク質ＯｓｐＡを発現する宿主細胞が溶解され、その後非イオン界面活性剤中でのいくつかのクロマトグラフィー・ステップが行われる、前記精製方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の分野：本発明は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）リポタンパク質ＯｓｐＡの改良精製
に関する。

【０００２】本発明の背景：ヒトにおけるライム（Ｌｙｍｅ）病は、主にマダニ（Ｉｘｏｄｅｓｔｉｃｋ
ｓ）によりヒトに媒介される、ボレリア・ブルグドルフュリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏ
ｒｆｅｒｉ）により引き起こされる慢性進行性病変である。この病気は、多くの
臓器、特に、皮膚、心臓、肝臓、中枢及び末梢神経系・腎臓、並びに筋骨格系を
攻撃する。

【０００３】広義のボレリア・ブルグドルフュリは、ライム・ボレイア症（ｂｏｒｒｅｌｉ
ｏｓｉｓ）（ライム病）の原因物質であると信じられている数種のボレリア種を
包含する普通名である。狭義には、これは、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（狭義
）、Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ、とＢ．ａｆｚｅｌｉｉを含む。この病気は、スピロヘ
ータを担持する各種マダニにかまれることにより伝播される。米国におけるこの
感染の主な貯蔵庫は、シロアシネズミ（ｗｈｉｔｅ−ｆｏｏｔｅｄｍｏｕｓｅ
）であり、そしてこの感染は、ヒトを含む多くの哺乳動物に伝播されることがで
きる。

【０００４】ＯｓｐＡは、ライム病スピロヘータＢｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｉ（広義）の保護抗原である。Ｂｏｒｒｅｌｉａ又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に
おける全長ＯｓｐＡ遺伝子の発現は、シグナル・ペプチダーゼIIにより翻訳後に
プロセスされるそして付着された脂質成分を含有するタンパク質をもたらす。本
明細書中に言及するが、今般、臨床用途に好適な、工業的規模におけるリポタン
パク質ＯｓｐＡの精製が、その精製手順において加熱又はアルコール抽出を伴わ
ずに行われることができ、そして界面活性剤を本質的に含有しないＯｓｐＡリポ
タンパク質を産生することが示された。

【０００５】本発明の要約：１の局面においては、本発明は、ヒト臨床用途に好適なボレリア・リポタンパ
ク質ＯｓｐＡの精製方法であって、（ａ）双極性イオン界面活性剤の存在下、リ
ポタンパク質ＯｓｐＡを発現する宿主細胞を溶解させて、リポタンパク質Ｏｓｐ
Ａを含有する不純溶液を作り；（ｂ）リポタンパク質ＯｓｐＡを含有する上記不
純溶液を浄化して、宿主細胞の死骸を除去し；（ｃ）非イオン性界面活性剤の存
在下、上記不純溶液をアニオン交換樹脂と接触させ；（ｄ）上記アニオン交換樹
脂からの流出物を集め、そしてその流出物をカチオン交換樹脂と接触させ；そし
て（ｅ）ＯｓｐＡを溶出させ、その後ゲル濾過ステップを行う、を含み、ここで
上記精製方法が加熱を伴わずに生じる、前記精製方法を提供する。

【０００６】関連局面においては、本発明は、界面活性剤を含有しないボレリア・リポタン
パク質ＯｓｐＡの精製方法を提供する。さらなる他の関連局面においては、本発明は、界面活性剤を含有せず、かつ、
ヒト臨床用途に好適な、純粋かつ安定性のリポタンパク質ＯｓｐＡを提供する。発明の詳細な説明：本発明は、実験室規模から工業的規模へのＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉリポタ
ンパク質ＯｓｐＡの精製をスケールアップするための単純な方法を提供する。本
法は、それが精製のために加熱又はアルコール又は２相抽出を要求せず、そして
１ステップ内で高程度の純度をもたらすという点で、利点をもつ。本発明の方法
は、ヒト臨床用途に好適であるＯｓｐＡタンパク質をもたらす。本発明は、界面
活性剤を本質的に含有せず（すなわち、微量だけ残存し）、そして長時間（２〜
８℃においてＰＢＳ中２年間）安定である、ＯｓｐＡをも提供する。

【０００７】本発明は、その精製方法において加熱又はアルコール抽出の必要性を伴わずに
、ＯｓｐＡを可溶化するための双極性界面活性剤の存在下で、リポタンパク質Ｏ
ｓｐＡを精製する方法を提供する。有利には、これは、最終製品の免疫原性に対
する潜在的な弱化（例えば、変性、脂脂質化、等）を回避する。一旦、ＯｓｐＡ
リポタンパク質が可溶化されれば、たとえ界面活性剤がその最終製品中で望まし
くないとしても、界面活性剤の存在下で精製を続けることが好ましい。なぜなら
、リポタンパク質は、界面活性剤中の非存在下精製プロセスの間に脂質凝集物を
形成する傾向があるからである。好ましくは、他の界面活性剤が、溶液中に、か
つ、非凝集無秩序状態にリポタンパク質ＯｓｐＡを保つために、イオン交換精製
の間に添加される。このような界面活性剤は、好ましくは、非イオン界面活性剤
、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）（ポリオキシエチレン・エーテル）又はＴｗｅ
ｅｎ（商標）（ポリオキシエチレンソルビタン・エステル）である。一旦、精製
されれば、リポタンパク質ＯｓｐＡは、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ（Ｓｕ
ｒｆａｃｔａｎｔ））の非存在下で、ＰＢＳ（ホスフェート緩衝液化生理食塩水
）中で安定である。精製されたリポタンパク質ＯｓｐＡは最終製品中で界面活性
剤を要求しない。なぜなら、一旦、それが純粋となれば、それはミセル様形態で
も安定であるからである。

【０００８】有利には、本発明は、Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（広義）株
からリポタンパク質ＯｓｐＡを精製する方法を提供する。このような株は、Ｂｏ
ｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（狭義）（例えば、ＺＳ７，Ｂ３１，Ｎ
４０，ＪＤ１，２９７，Ｓｈ−２−８２、等）、Ｂｏｒｒｅｌｉａｇａｒｉｎ
ｉｉ（例えば、ＺＱ１，ＩＰ９０，ＮＥ１１Ｈ，ＩＰ３、等）、及びＢｏｒｒｅ
ｌｉａａｆｚｅｌｌｉ（例えば、ＡＣＡ−１，ＰＫＯ，Ｂｏ２３、等）を含む
。

【０００９】本発明の精製スキームは以下のステップを包含する。双極性イオン界面活性剤
の存在下でリポタンパク質ＯｓｐＡを発現する宿主細胞の細胞溶解、それにより
リポタンパク質ＯｓｐＡが可溶化される；流動床イオン交換その後のダイアフィ
ルトレーション（又は代替的には遠心分離）を含む、宿主細胞死骸を除去するた
めの浄化ステップ；場合により、残存粒状物を除去するための濾過ステップ；ア
ニオン交換；カチオン交換；及びリポタンパク質ＯｓｐＡから非脂質化ＯｓｐＡ
を除去するためのゲル濾過（サイジング・カラム）。さらに、ゲル濾過後に滅菌
濾過ステップ追加することが好ましい。

【００１０】リポタンパク質ＯｓｐＡの精製を、実施例セクション中でさらに説明する。ス
キームＩは４つのクロマトグラフィーのステップと１のダイアフィルトレーショ
ンを含む。そのプロセスは：例えば、高圧細胞ホモジェナイザーによる、細胞ホ
モジェナイゼーション（破壊）；（例えば、約２０の光学濃度（ＯＤ）までの）
上記ホモジェネートの希釈及び上記ホモジェネートの酸性化；その後の、（しば
しば拡大床吸着という、例えば、ｔｈｅＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）ＳＰシ
ステム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）流動床上でのカチオン交換、を含む。上記ホモジ
ェネートは上記流動床上にロードされ、洗浄され、そしてそのイオン強度の増加
、及び／又はそのpHの上昇により溶出される。溶出液は場合により滅菌濾過され
、そして次にダイアフィルトレートされる。リポタンパク質ＯｓｐＡを含有する
サンプルは、次に、アニオン交換樹脂上にロードされる。流出物（ｆｌｏｗ−ｔ
ｈｒｏｕｇｈ）は、他のカチオン交換樹脂上にロードされる。この樹脂は洗浄さ
れ、そしてＯｓｐＡはイオン強度の増加及び／又はpHの上昇により溶出される。
溶液中のＯｓｐＡは、サイジング・カラムを通され、そして次に滅菌濾過される
。

【００１１】上記拡大床吸着は流動化（ｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に基づく。実際には、
これは、吸着粒子は、重力の下方向の力をバランスさせるように、上方向の液体
により持ち上げられる。安定性の均質拡大床は、液体の流れの中でそれらをつり
下げるためにちょうど十分な程、粒子を持ち上げることにより創製される。１の
態様においては、それは、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）といわれる吸着物（カ
チオン交換のためのスルホプロピル誘導体化樹脂）を使用する。

【００１２】ダイアフィルトレーションは、上記双極性イオン界面活性剤を除去し、そして
ＯｓｐＡタンパク質を濃縮するために使用される。保持物は、非イオン界面活性
剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００）の存在下、アニオン交換カラム
（例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に適用される。９５％を超える汚染物質は
上記アニオン交換ステップ後に除去される。リポタンパク質ＯｓｐＡは上記カラ
ムに結合されず、そして上記流出物は、カチオン交換（例えば、ＳＰＳｅｐｈ
ａｒｏｓｅ）カラム上にインジェクトされる。上記カラムは洗浄され、そしてリ
ポタンパク質ＯｓｐＡは、バッファーを交換し、脂質化ＯｓｐＡから非脂質化Ｏ
ｓｐＡを分離し、そして上記界面活性剤を除去するために、ゲル濾過カラム（例
えば、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲ）上にインジェクトされるために溶
出される。精製されたリポタンパク質−ＯｓｐＡは、標準濃度に希釈され、そし
て０．２μｍ滅菌膜上の確証濾過により滅菌される。

【００１３】イオン交換樹脂は、本分野において周知である。カチオン交換樹脂は、ＣＭ
Ｓｅｐｈａｄｅｘ，ＳＰＳｅｐｈａｄｅｘ，ＣＭＳｈｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｓ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，ＣＭｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、等を含む。カチオン交換ク
ロマトグラフィーのために好ましい樹脂は、ＳＰ又はＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。アニオン交換樹脂は、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄ
ｅｘ，ＱＡＥＳｈｅｐｈａｄｅｘ，ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅ，ＱＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ，ＤＥＡＥＳｅｐｈａｃｅｌ、等を含む。アニオン交換クロマ
トグラフィーのために好ましい樹脂は、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）である。ゲル濾過（サイジング）樹脂は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ，Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｓｕｐｅｒｄｅｘ，Ｓｕｐｅｒｏｓｅ、等を
含む。好ましい樹脂は、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ樹脂、例えばＳ−３００ＨＲ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。

【００１４】得られる精製（された）ＯｓｐＡタンパク質は界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎ
ｔｓｏｒｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）を含有しない。スキームIIは３つの精製ステップを含む。双極性イオン界面活性剤の存在下で
の細胞溶解（例えば、冷凍解凍）；ＯｓｐＡを含有する上清（不純溶液）の遠心
分離、そして任意的な濾過である。上記の任意的濾過ステップを行うとき、プレ
フィルター、例えば、１．２μｍフィルター、その後、０．４５μｍフィルター
、そして次に、０．２２μｍ濾過を使用することが好ましい。リポタンパク質Ｏ
ｓｐＡを含有する濾液は、次に、非イオン界面活性剤の存在下、アニオン交換樹
脂上にロードされる。上記流出物はカチオン交換樹脂上にロードされる。上記樹
脂は洗浄され、そしてＯｓｐＡはそのイオン強度を高め、そして／又はそのpHを
上昇させることにより溶出される。溶液中のＯｓｐＡは、サイジング・カラムを
通され、そして次に滅菌濾過される。

【００１５】スキームIIの下では、細胞溶解は、双極性イオン界面活性剤の存在下で自動的
に起こる。細胞破壊の必要性はない。上記ダイアフィルトレーション・ステップ
は必要ない。スキームＩと同様に、９５％を超える汚染物質がアニオン交換ステ
ップ後に除去される。ＯｓｐＡは、塩基性条件下、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅに結
合しない。

【００１６】一旦、界面活性剤の非存在下で精製されれば、リポタンパク質ＯｓｐＡは純粋
であり、そしてＰＢＳ（ホスフェート緩衝液化生理食塩水）中で安定である。双極性イオン界面活性剤は、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ−１
−プロパンスルホネート（すなわち、ＳＢ８，１０，１２，１４，１６，１８）
、ＣＨＡＰＳ（３−〔（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ〕−１−
プロパンスルホネート）、及びＣＨＡＰＳＯ（３−〔（３−コラミドプロピル）
ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）を含む。
好ましくは、上記双極性イオン界面活性剤は、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチル
アンモニオ−１−プロパンスルホネートから選ばれる。より好ましくは、それは
、（ラウリル−スルホベタインとしても知られる、ＳＢ１２といわれる）Ｎ−ド
デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートである
。ＳＢ１２は水性溶液中で２相（ｂｉｐｈａｓｉｃ）を形成せず、そしてこれ故
、ＯｓｐＡの精製をスケールアップするために、より容易である。

【００１７】本発明の精製スキームに従うことにより、精製リポタンパク質ＯｓｐＡ溶液（
１mg／ml）中のＳＢ１２のレベルは、１０００ppb 〔パート・パー・ビリオン〕
（１ppm ）未満である。より好ましくは、それは、検出限界レベルに近づく、１
０ppb （０．０１ppm ）未満である。非イオン界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）（ポリオキシエチレン・エーテ
ル）、Ｔｗｅｅｎ（商標）（ポリオキシエチレンソルビタン・エステル）、ポリ
オキシエチレン・エステル、及びＮｏｒｉｄｅｔＰ−４０を含む。好ましくは
、それは、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）（Ｘ−１００，Ｘ−１１４，Ｘ−４０５，Ｎ−
１０１）又はＴｗｅｅｎ（商標）（２０−８０）である。より好ましくは、それ
は、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００又はＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１１４であ
る。Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００は安全であることが知られ、かつ、ＦＤＡ
により認可されているので、それが最も好ましい界面活性剤である。

【００１８】本発明の精製スキームに従うことにより、精製リポタンパク質ＯｓｐＡ溶液（
１mg／ml）中のＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００のレベルは、１０００ppm 〔パ
ート・パー・ミリオン〕（０．１％）未満である。好ましくは、それは１００pp
m 未満である。より好ましくは、それは１０ppm 未満である。リポタンパク質Ｏ
ｓｐＡの３０μｇ投与のためには、投薬当りのＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００
のレベルは３００ng／投薬未満である。

【００１９】本発明の精製リポタンパク質ＯｓｐＡは、界面活性剤を含有せず、ヒト臨床用
途に好適であり、そして安定である。“精製リポタンパク質ＯｓｐＡ”とは、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色）により測定されるとき９５％を超え
る純度を意味し；好ましくは、それは９８％より高い純度である。 “界面活性剤を含有しない”とは、精製リポタンパク質ＯｓｐＡ溶液（１mg／
ml）中の界面活性剤のレベルが１０００ppm 〔パート・パー・ミリオン〕（０．
１％）未満であることを意味する。好ましくは、それは１００ppm 未満である。
より好ましくは、それは１０ppm 未満である。これ故、リポタンパク質ＯｓｐＡ
の３０μｇ投与のためには、投薬当りの界面活性剤（非イオン性又は双極性イオ
ン）のレベルは３００ng／投薬未満である。

【００２０】 “ヒト臨床用途に好適な”とは、３０μｇのリポタンパク質ＯｓｐＡについて
の内毒素含有量が、発色ＬＡＬテストにより測定されるとき、５ＥＵ未満である
ということを意味する。さらに、３０μｇのリポタンパク質ＯｓｐＡ当りのＤＮ
Ａレベルは１００pg未満であり；好ましくは、それは２０pg未満であり；より好
ましくは、それは２pg未満である。さらに、３０μｇのリポタンパク質ＯｓｐＡ
当りのＥ．ｃｏｌｉ汚染物質のレベルは、全タンパク質含量の０．１００％未満
であり；好ましくは、それは０．０５０％未満であり；より好ましくは、それは
０．０２５％未満である。

【００２１】 “安定”とは、リポタンパク質ＯｓｐＡが容易に分解しない、すなわち、２〜
８℃において１年間保管した後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されるとき単一
バンドとして９５％以上のＯｓｐＡが残存し（好ましくは、それは、９８％以上
であり）、そして／又はそれは約２（２．０±０．５）の脂質対タンパク比化を
保ち、そして／又はそれは、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいてその免疫原性の８０％
以上を保ち（好ましくは、それは９０％以上、より好ましくは、それは９５％以
上である）ことを意味する。

【００２２】本発明に係る脂質化ＯｓｐＡの精製は、ＯｓｐＡを発現する天然Ｂｏｒｒｅｌ
ｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（広義）上で、又は本分野において知られた好適
な組換え発現系を介して、行われることができる。例えば、組換え分子又はベク
ターであって、その中で、全長ＯｓｐＡコーディング領域が上記タンパク質の発
現を許容する異種発現制御配列に作用可能な状態で連結されているものが構築さ
れる。このような発現ベクターの獲得方法は周知である。Sambrook et al.,“Mo
lecular Cloning. A Laboratory Manual”，2d edition, Cold Spring Harbor L
aboratory, Ney York (1989)を参照のこと。

【００２３】トランスフェクションのために好適な宿主細胞又は細胞系はバクテリア細胞を
含む。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのさまざまな株（例えば、ＡＲ５８，ＡＲ６８，Ｈ
Ｂ１０１，ＭＣ１０６１、等）は、好適な宿主細胞として本分野において周知で
ある。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、その他のバチルスの
各種株も本法において使用され得る。

【００２４】本発明がよりよく理解されるように、以下の実施例を記載する。これら実施例
は説明のみを目的としたものであり、いかなる方法によっても本発明の範囲を限
定するものと解釈してはならない。実施例：実施例１：リポタンパク質ＯｓｐＡの精製−スキームＩ：発酵：熱誘導性ラムダｐＬプロモーターの制御下、Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏ
ｒｆｅｒｉ（狭義）株ＺＳ７リポタンパク質ＯｓｐＡ（米国特許第５，４３４，
０７７号参照）のためのコーティング配列を担持する、ｐＯＡ１５（ｐＡＳ１（
Young et al., PNAS, 80 : 6105-6109) (1983)）の調節／発現要素とカナマイシ
ン耐性遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉプラスミド発現ベクター）により形質転換さ
れていたＥ．ｃｏｌｉ（株ＡＲ５８，Strickler et al., Proteins, 6 : 139-15
4 (1989)内で、全長ＯｓｐＡを発現させた。誘導は、約２３時間、３９．５℃±
２．０℃であった。

【００２５】発酵ブロスを、筒状ボウル（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ）遠心分離により浄化した。
このペレットを上記ボウルから回収し、そして−７０℃で冷凍した。このペレッ
トは、さらに処理する前１２ヶ月まで−７０℃で保存することができる。抽出：細胞を解凍し、そしてＯＤ₆₅₀ の等価物＝６０（発酵の終りに得られたＯＤ₆₅ ₀ から計算した理論値−３０ｇ乾燥重量／リッターに等しい）まで、ＳＢ１２界
面活性剤を含有する細胞破壊バッファー（２５mMアセテート、４mM ＥＤＴＡ、
pH６．０、３％ＳＢ１２を含有するＴＢＲＯバッファー）中に再懸濁させた。上
記細胞を、高圧細胞ホモジェナイザー（Ｒａｎｎｉｅ）に通すことにより機械的
に破壊する。上記細胞ホモジェネートを、ＴＢＤＩバッファー（２５mMアセテー
ト、４mM ＥＤＴＡ、pH４．８、3％ＳＢ１２）により（ＯＤ₆₅₀ ＝２０まで
）３倍希釈し、そしてその希釈されたホモジェネートを１時間静置した。pHを、
酢酸で４．８±０．１に調整し、そして導電率を３．８mS±０．２mSに調整する
。（全導電率を２０℃に換算する。）適宣、導電率を高めるためにＮａＣｌを又
は導電率を下げるためにＨ₂ Ｏを添加することができる。

【００２６】精製：精製を、４つのクロマトグラフィーのステップと１つのダイアフィルトレーシ
ョン・ステップにより達成する。まず、リポタンパク質−ＯｓｐＡを拡大床カラ
ム内のＳｔｒｅａｍｌｉｎｅＳＰマトリックス上に吸着させる。このゲルを洗
浄して細胞死骸を除去する。次にリポタンパク質−ＯｓｐＡを溶出させ、そして
濾過して、残存Ｅ．ｃｏｌｉを除去する。第２に、ダイアフィルトレーションを
上記ＳＢ１２界面活性剤を除去し、そして上記生成物を濃縮することに使用する
。第３に、上記保持物を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下、イオン交換Ｑ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に適用する。リポタンパク質−ＯｓｐＡは上記カラ
ムに結合されず、そして上記流出物を、ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム上にイ
ンジェクトする。このカラムを洗浄し、リポタンパク質−ＯｓｐＡを、バッファ
ーを交換し、そしてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を除去するために、Ｓｅｐｈａｃ
ｒｙｌＳ３００ＨＲゲル濾過カラム上にインジェクトされるように溶出させる
。精製されたリポタンパク質−ＯｓｐＡを標準濃度に希釈し、そして濾過（０．
２μｍ）により滅菌する。その後のステップを以下より詳細に説明する。

【００２７】ＳｔｒｅａｍｌｉｎｅＳＰ後の精製ステップの全てが＋２〜＋８℃において
冷温室内で行われる。ＳｔｒｅａｍｌｉｎｅＳＰ：発酵後、希釈された細胞ホモジェネートを、ＴＳＴＡバッファー（２５mM Ｎ
ａＣｌ、２５mMアセテート、pH４．８、３％ＳＢ１２）中で平衡にされた拡大
床ＳｔｒｅａｍｌｉｎｅＳＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に適用し
た。このカラムをＴＳＴＡバッファーで洗浄して、非結合物質の全てを除去した
。次に、このカラムを、流れを逆にすることにより同一バッファー中で充填する
。溶出は、ＴＳＴＣバッファー（２５mMシトレート、pH６．０、０．２５％Ｓ
Ｂ１２）により生じる。生成物を、２８０nmにおけるＵＶ吸収クロマトグラムに
基づきプールした。

【００２８】上記ＳｔｒｅａｍｌｉｎｅＳＰ溶出液のpHを、ジエタノールアミン溶液で７
．９±０．３に調整し、そして０．２μｍ膜（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ０．４５μ
ｍ＋０．２μｍ，４５００cm² ）上で濾過して、潜在的な残存Ｅ．ｃｏｌｉを除
去した。濾過後、ＳｔｒｅａｍｌｉｎｅＳＰ溶出液を、ダイアフィルトレーシ
ョン前＋２〜＋８℃において一夜保存することができる。

【００２９】ダイアフィルトレーション：ダイアフィルトレーションは、プレートとフレーム装置を使用する。３０Kdカ
ット・オフをもつＦｉｌｔｒｏｎＯｍｅｇａ膜（低結合性ポリエーテルスルホ
ン）を使用した。第１ステップは、約２４０Ｌから約２４Ｌまで、約１０倍、リポタンパク質−
ＯｓｐＡ含有溶出液を濃縮し、その後、最小１０容量（約２４０Ｌ）のジエタノ
ールアミン・バッファー（２５mM ＤＥＡ pH８．６）に対するダイアフィルト
レーションを行う。（リポタンパク質−ＯｓｐＡの溶解度を維持するための）Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００を１％の濃度まで上記保持物に添加した。

【００３０】上記保持物は、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムに流すまで、＋２〜＋８℃にお
いて一夜放置することができる。アニオン交換−ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ：ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラム
を、ジエタノールアミン・バッファー（２５mM ＤＥＡ pH８．６、０．１％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＴＱＡ）で平衡にした。上記ダイアフィルト
レーション保持物を上記カラム上にロードし、そして流出物を集める。２８０nm
におけるＵＶシブナルがベースラインに戻るまで、ＴＱＡバッファーによる洗浄
ステップが含まれる。流出物のpHを酢酸でpH４．８に下げる。

【００３１】カチオン交換−ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅ：ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラ
ムをＴＳＰＡバッファー（２５mM アセテート、pH４．８、０．１％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００）中で平衡にし、そして次に、上記流出物と洗浄画分を適用した
。このカラムを、２カラム容量の同一ＴＳＰＡバッファーで洗浄した。リポタン
パク質−ＯｓｐＡを２５mMクエン酸pH５．７、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０（ＴＳＰＣバッファー）で溶出させる。

【００３２】ゲル濾過−ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲ：ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）ゲルパーミエーション・カラム上にインジェ
クトした（最大９．５Ｌ）。このカラムを、１０mM ＰＯ₄ 、１５０mM ＮａＣ
ｌ pH６．８バッファー（ＴＨＲ）中で実行した。溶出画分のサンプルを採取し
、そしてプロセス内制御分析のために＋２〜＋８℃で、又は、−７０℃で保存し
た。リポタンパク質−ＯｓｐＡピークを、ＨＰＬＣ分析に基づきプールした。Ｈ
ＰＬＣのために、２００mLホスフェート・バッファー、pH７．６中のＺｏｒｂａ
ｘＧＦ４５０カラムを使用した。流量は１mL／分であり、そしてサンプル容量
は１０μｌであった。光学濃度を２１０nmで計測した。ショルダー・ピークの表
面が≦リポタンパク質−ＯｓｐＡピークの１．２％になったとき、プーリング（
ｐｏｏｌｉｎｇ）を開始し；リポタンパク質−ＯｓｐＡの濃度が＜４００μｇ／
mLになったとき、プーリングを終了した。

【００３３】滅菌濾過：リポタンパク質−ＯｓｐＡピークを含むＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲ画
分プールを、同一ＴＨＲバッファーで１mgタンパク質／mLの濃度（目標値）に希
釈し、そして直ちに滅菌濾過した。上記の希釈精製リポタンパク質−ＯｓｐＡを０．２μｍ膜上の濾過により滅菌
した。濾過後、サンプルを吸引し、そしてｉｎ−ｐｒｏｃｅｓｓ及びＱＣ分析の
ために＋２〜＋８℃で保存する。

【００３４】滅菌精製抗原を、配合まで＋２〜＋８℃で保存した。Ｂｏｒｒｅｌｉａｇａｒｉｎｉｉ株ＺＱ１又はＢｏｒｒｅｌｉａａｆｚｅ
ｌｌｉ株ＡＣＡ−１からのリポタンパク質ＯｓｐＡの精製は、以下のプロセスを
使用して行われることもできる。しかしながら、その収率は、おそらく、ＺＱ１
とＡＣＡ−１ＯｓｐＡタンパク質のより高いpKに因り、ＺＳ７ＯｓｐＡにつ
いてより低い。上記プロセスの初期における酸ステップの削除又は修正は、この
収率を約３倍改善する。表１は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現されたリポタンパク質Ｏ
ｓｐＡＺＳ７の精製を概説する。

【００３５】

【表１】実施例２：リポタンパク質ＯｓｐＡの精製−スキームII：発酵：実施例１におけるように、熱誘導性ラムダｐＬプロモーターの制御下でＢｏｒ
ｒｅｌｉａｇａｒｉｎｉｉ株ＺＡ１リポタンパク質ＯｓｐＡ（ＷＯ９３／０４
１７５参照）のためのコーディング配列を担持するｐＯＡ１５で形質転換されて
いたＥ．ｃｏｌｉ（株ＡＲ５８）内で、全長ＯｓｐＡを発現させた。誘導は約２
３時間で３９．５℃±２．０℃であった。発酵ブロスを、筒状ボウル（Ｓｈａｒ
ｐｌｅｓｓ）遠心分離により浄化した。このペレットを上記ボウルから回収し、
そして−７０℃で冷凍した。上記ペレットを、さらに処理する前１２ヶ月までの
間−７０℃で保存することができる。

【００３６】細胞を解凍し、そして室温（２０〜２５℃）において撹拌しながら２時間、Ｏ
Ｄ₆₅₀ の等価物＝６０（３０ｇ乾燥重量／リッターに等価な発酵の終りに得られ
るＯＤ₆₅₀ から計算した理論値）まで、ＳＢ１２界面活性剤（１０mM Ｂｉｓ
Ｔｒｉｓ、pH６．５、３％ＳＢ１２）を含有する細胞破壊バッファー中に再懸濁
させた。

【００３７】発酵及び細胞溶解後に、不純溶液を遠心分離（１７０００×ｇ，３０分間）し
、そして濾過して（１．２μｍ、その後０．４５μｍと０．２μｍ）、潜在的な
残存Ｅ．ｃｏｌｉを除去した。精製：精製を３つのクロマトグラフィー・ステップにより達成する。好ましくは、リ
ポタンパク質−ＯｓｐＡを含有する不純溶液を遠心分離し、そして残存Ｅ．ｃｏ
ｌｉを濾過除去する。次に、不純溶液を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下、
アニオン交換（ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ又はＸＬ）カラム上に適用する。
リポタンパク質−ＯｓｐＡは上記カラムに結合されず、そして上記流出物をカチ
オン（ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅ又はＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム上にイ
ンジェクトする。このカラムを洗浄し、そしてリポタンパク質−ＯｓｐＡをＳｅ
ｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲゲル濾過カラム上にインジェクトされるように溶
出されて、バッファーを交換し、そしてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を除去する。
精製されたリポタンパク質−ＯｓｐＡを標準濃度まで希釈し、そして濾過（０．
２μｍ）により滅菌する。その後のステップを以下より詳細に説明する。

【００３８】精製ステップの全てを＋２〜＋８℃において低温室内で行う。アニオン交換−ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ：ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｍ）カラム
を、ジエタノールアミン・バッファー（２５mM ＤＥＡ pH８．８、０．１％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＴＱＡ）で平衡にした。不純溶液を、上記カ
ラムにロードし、そして上記流出物を集めた。これは、そのＵＶシグナルがベー
スラインに復帰するまでの、ＴＱＡバッファーによる洗浄ステップを含む。

【００３９】上記流出物のpHを酢酸でpH４．８に下げる。カチオン交換−ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｍ）カラ
ムを、ＴＳＰＡバッファー（２５mMアセテート、pH４．８、０．１％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００）中で平衡にし、そして次に上記流出物と洗浄画分を適用した。
このカラムを、２カラム容量の同一ＴＳＰＡバッファーで洗浄した。リポタンパ
ク質−ＯｓｐＡを２５mMアセテート、０．２ＭＮａＣｌ、pH４．８、０．１％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶出させる。

【００４０】ゲル濾過−ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲ：ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）ゲルパーミエーション・カラム上にインジェ
クトした（最大９．５Ｌ）。このカラムを、１０mM ＰＯ₄ 、１５０mM ＮａＣ
ｌ pH６．８バッファー（ＴＨＲ）中で実行した。溶出画分のサンプルを採取し
、そしてプロセス内制御分析のために＋２〜＋８℃で、又は、−７０℃で保存し
た。リポタンパク質−ＯｓｐＡピークを、ＨＰＬＣ分析に基づきプールした。Ｈ
ＰＬＣのために、２００mLホスフェート・バッファー、pH７．６中のＺｏｒｂａ
ｘＧＦ４５０カラムを使用した。流量は１mL／分であり、そしてサンプル容量
は１０μｌであった。光学濃度を２１０nmで計測した。ショルダー・ピークの表
面が≦リポタンパク質−ＯｓｐＡピークの１．２％になったとき、プーリング（
ｐｏｏｌｉｎｇ）を開始し；リポタンパク質−ＯｓｐＡの濃度が＜４００μｇ／
mLになったとき、プーリングを終了した。

【００４１】滅菌濾過：リポタンパク質−ＯｓｐＡピークを含むＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲ画
分プールを、同一ＴＨＲバッファーで１mgタンパク質／mLの濃度（目標値）に希
釈し、そして直ちに滅菌濾過した。上記の希釈精製リポタンパク質−ＯｓｐＡを０．２μｍ膜上の濾過により滅菌
した。濾過後、サンプルを吸引し、そしてｉｎ−ｐｒｏｃｅｓｓ及びＱＣ分析の
ために＋２〜＋８℃で保存する。

【００４２】滅菌精製抗原を、配合まで＋２〜＋８℃で保存した。実施例３：リポタンパク質ＯｓｐＡの精製−スキームIIＡ：発酵：実施例１におけるように、熱誘導性ラムダｐＬプロモーターの制御下でＢｏｒ
ｒｅｌｉａａｆｚｅｌｌｉ株ＡＣＡ−１リポタンパク質ＯｓｐＡ（米国特許第
５，７７７，０９５号参照）のためのコーディング配列を担持するｐＯＡ１５で
形質転換されていたＥ．ｃｏｌｉ（株ＡＲ５８）内で、全長ＯｓｐＡを発現させ
た。誘導は約２３時間で３９．５℃±２．０℃であった。発酵ブロスを、筒状ボ
ウル（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ）遠心分離により浄化した。このペレットを上記ボウ
ルから回収し、そして−７０℃で冷凍した。上記ペレットを、さらに処理する前
１２ヶ月までの間−７０℃で保存することができる。

【００４３】細胞を解凍し、そして室温（２０〜２５℃）において撹拌しながら２時間、Ｏ
Ｄ₆₅₀ の等価物＝６０（３０ｇ乾燥重量／リッターに等価な発酵の終りに得られ
るＯＤ₆₅₀ から計算した理論値）まで、ＳＢ１２界面活性剤（１０mM Ｂｉｓ
Ｔｒｉｓ、pH６．５、３％ＳＢ１２）を含有する細胞破壊バッファー中に再懸濁
させた。

【００４４】発酵及び細胞溶解後に、不純溶液を遠心分離（１７０００×ｇ，３０分間）し
、そして濾過して（１．２μｍ、その後０．４５μｍと０．２μｍ）、潜在的な
残存Ｅ．ｃｏｌｉを除去した。精製：実施例２におけるように、いくらかの修正を加えながら、３つのクロマトグラ
フィー・ステップにより精製を達成する。

【００４５】アニオン交換−ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ：ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＸＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｍ）カラム
を、ジエタノールアミン・バッファー（２５mM ＤＥＡ pH９．１、０．１％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＴＱＡ）で平衡にした。不純溶液を、上記カ
ラムにロードし、そして上記流出物を集めた。これは、その２８０nmにおけるＵ
Ｖシグナルがベースラインに復帰するまでの、ＴＱＡバッファーによる洗浄ステ
ップを含む。

【００４６】上記流出物のpHを酢酸でpH４．８に下げる。カチオン交換−ＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラ
ムをＴＳＰＡバッファー（２５mM アセテート、pH４．８、０．１％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００）中で平衡にし、そして次に、上記流出物と洗浄画分を適用した
。このカラムを、２カラム容量の同一ＴＳＰＡバッファーで洗浄した。リポタン
パク質−ＯｓｐＡを５０mMシトレート、pH６．２、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００で溶出させる。

【００４７】ゲル濾過−ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲ：ＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）ゲルパーミエーション・カラム上にインジェ
クトした（最大９．５Ｌ）。このカラムを、１０mM ＰＯ₄ 、１５０mM ＮａＣ
ｌ pH６．８バッファー（ＴＨＲ）中で実行した。溶出画分のサンプルを採取し
、そしてプロセス内制御分析のために＋２〜＋８℃で、又は、−７０℃で保存し
た。リポタンパク質−ＯｓｐＡピークを、ＨＰＬＣ分析に基づきプールした。Ｈ
ＰＬＣのために、２００mLホスフェート・バッファー、pH７．６中のＺｏｒｂａ
ｘＧＦ４５０カラムを使用した。流量は１mL／分であり、そしてサンプル容量
は１０μｌであった。光学濃度を２１０nmで計測した。ショルダー・ピークの表
面が≦リポタンパク質−ＯｓｐＡピークの１．２％になったとき、プーリング（
ｐｏｏｌｉｎｇ）を開始し；リポタンパク質−ＯｓｐＡの濃度が＜４００μｇ／
mLになったとき、プーリングを終了した。

【００４８】滅菌濾過：リポタンパク質−ＯｓｐＡピークを含むＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲ画
分プールを、同一ＴＨＲバッファーで１mgタンパク質／mLの濃度（目標値）に希
釈し、そして直ちに滅菌濾過した。上記の希釈精製リポタンパク質−ＯｓｐＡを０．２μｍ膜上の濾過により滅菌
した。濾過後、サンプルを吸引し、そしてｉｎ−ｐｒｏｃｅｓｓ及びＱＣ分析の
ために＋２〜＋８℃で保存する。

【００４９】滅菌精製抗原を、配合まで＋２〜＋８℃で保存した。Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（狭義）株ＺＳ７からのリポタン
パク質も、スキームIIを使用して精製されている。実施例４：汚染物質の分析：４．１．ＥＬＩＳＡとＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔを介してのＥ．ｃｏｌｉ汚染
物質：ポリクローナル抗体を以下のように調製し、そして使用した。

【００５０】４．１．１．抗−Ｅ．ｃｏｌｉポリクローナル抗体調製：熱誘導された野生型Ｅ．ｃｏｌｉ親株ＡＲ５８の粗抽出物を上記抗体を作るた
めに使用した。この株は、リポ−ＯｓｐＡをコードするプラスミドを含んでいな
い。３匹のニュージーランド白ラビットに、完全フロイント・アジュバント中の
上記粗抽出物１００μｇを皮下注射した。２１日目に不完全フロイント・アジュ
バント（ＩＦＡ）中１００μｇの抗原、４２日目にＰＢＳ（ホスフェート・バッ
ファー生理食塩水）中１００μｇ、そして１０９日目にＩＦＡ中１００μｇを注
射することにより、動物を３回ブーストした。個体の免疫血清を１２３日目（最
後のブーストから１４日後）に集め、そしてウェスタン・ブロット（ＷＢ）によ
りテストした。それらは、２００〜２０kDa にわたる約２０の別個のバンドの認
識パターンを示した。上記認識パターンは、上記３つの免疫血清間の僅かな差異
を示したので、上記３つの血清を、その認識特性を最適化するためにプールした
。このプールをウェスタン・ブロット分析においてそのまま使用した。抗−Ｅ．
ｃｏｌｉ特異的抗体の一部を、プロテインＡセファロース・カラム（ｐ−Ｒｂ−
ＩｇＧ）に対するアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製し、そしてＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付けして、ウサギ血清アルブミンの非存在について確
認した。精製された抗体の画分を、標準的な手順（Ａｍｅｒｓｈａｍｋｉｔ）
に従ってビオチン化し（ビオチン化ｐ−Ｒｂ−ＩｇＧ）、そしてＥＬＩＳＡアッ
セイにおいて１／２００の作業用希釈において使用した。

【００５１】４．１．２．抗−Ｅ．ｃｏｌｉポリクローナル抗体の特徴付け：精製されたポリクローナル抗体（ｐ−Ｒｂ−ＩｇＧ）のさらなる特徴付けをＷ
ＢとＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により行った。潜在的交差反応についてテストするた
めに、上記Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質抽出物に特異的なポリクローナル抗体及びリ
ポ−ＯｓｐＡに対するモノクローナル抗体（ＬＡ−２とＬＡ−３１（米国特許第
５，７８０，０３０号参照））を、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質抽出物（ＥＰＥ）、
ワクチン抗原（リポ−ＯｓｐＡ）、並びにリポ−ＯｓｐＡとＥＰＥの両者の混合
物に対してテストした。

【００５２】上記ポリクローナル抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質に特異的であり、そして
ＥＰＥがリポ−ＯｓｐＡと混合され又は混合されなかったとき、同様の認識特性
を示した。これは、リポ−ＯｓｐＡがＥ．ｃｏｌｉタンパク質の検出を妨害しな
いことを示している。それ故、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質は、ポリクローナル・ウ
サギＥ．ｃｏｌｉタンパク質により特異的に検出される。

【００５３】４．１．３．ウェスタン・ブロット分析：上記宿主細胞誘導タンパク質のレベルを、ウェスタン・ブロット分析により定
性的に評価した。タンパク質サンプルを、β−メルカプトエタノールの存在下で
還元し、ＳＤＳサンプル・バッファー中で変性させ、そして１２．５％ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲル上で２０μｇ／レーンにおいてロードした。ＥＰＥの一連の希釈物
（レーン当り、２０，１０，５、と１μｇ）を同様にロードした。電気泳動後、
上記タンパク質を、転写バッファー（２０％メタノールと０．１％ＳＤＳを含有
するトリス０．０２５Ｍ pH８．３、グリシン０．１９２Ｍ）を使用してニトロ
セルロース膜に移した。この膜を次に、インキュベーション・バッファー（０．
１％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）でブロックし、そして上記インキュベー
ション・バッファー中で２５０倍希釈されたポリクローナル−Ｅ．ｃｏｌｉ抗血
清の存在下で１時間インキュベートした。全てのステップを、ロッキング・プラ
ットホーム上で室温で行った。上記抗体とのインキュベーション後、上記膜を上
記インキュベーション・バッファー（各洗浄当り５分間）中で３回洗浄し、そし
て次に、上記インキュベーション・バッファー中で１／５００希釈した、ロバか
らの抗−ウサギＩｇビオチン化種特異的全抗体と共に１時間インキュベートした
。洗浄及びストレプトアビジン−ビオチン化ホースラディシュ・ペルオキシダー
ゼ試薬（上記インキュベーション・バッファー中１／１０００希釈）の添加の後
、抗原−抗体複合体が、４−クロロ−１−ナフトール／メタノール／Ｈ₂ Ｏ₂ 溶
液の添加により現れ、そしてその反応を水の添加により停止させた。

【００５４】４．１．４．ＥＬＩＳＡアッセイ：サンプルの宿主細胞誘導タンパク質レベルを定量的に評価するために、酵素結
合イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発した。マイクロタイター・プレートを、重炭酸塩バッファー（pH＝９．６）中に溶解
した精製ウサギ抗−Ｅ．ｃｏｌｉＩｇＧ画分（ｐ−Ｒｂ−ＩｇＧ）で、３７℃
において２時間コートした。異なるステップの間、プレートを、０．１％ｔｗｅ
ｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ（ウ
シ血清アルブミン）でブロックする。テスト・サンプル（又は対照）を（０．２
％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で）逐次的に希釈し、そして３７℃で９０分間イン
キュベートする。次に、プレートを、３７℃で１時間、希釈ビオチン化ｐ−Ｒｂ
−ＩｇＧと共にインキュベートする。（０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ中の）ストレプ
トアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ試薬を各ウェルに添加し、そしてプレ
ートを室温で３０分間インキュベートする。抗体−抗原複合体を現すために、基
質（ＴＭＢ＝３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を添加し、そ
して反応をＨ₂ ＳＯ₄ の添加により停止させた。吸収を４０５nmにおいて測定し
た。

【００５５】サンプル中のＥ．ｃｏｌｉ濃度を、４変数のロジスティック等式（Karpinski
KF et al., 1987, J. Immunology Methods 103 : 189) を使用して確立されたＥ
ＰＥ（２０μｇ／mlからの２倍希釈物）の対照曲線に対して計算した。２０％〜
８０％計算プログラム（ＳＯＦＴ_max ＰＲＯ）を、低及び高漸近ＯＤ値に適用す
る。全てのサンプルは（Ｌｏｗｒｙアッセイにより）２００μｇタンパク質／ml
から出発して２倍希釈されていた。異なる希釈物について得た濃度の平均を計算
し、上記対照曲線の直線部分（２０％〜８０％カット−オフ）に属する全ＯＤ値
を考慮に入れる。結果を、線形回帰法を使用して確認した。

【００５６】ＥＬＩＳＡアッセイの検出限界（ブランク〔０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ
〕の平均ＯＤ４０５）は、１ml当り５０ngのＥ．ｃｏｌｉタンパク質抽出物であ
ることが示された。１ml当り２００μｇタンパク質の最大濃度（第１希釈物）に
おいてサンプルがテストされた場合、検出されることができるＥ．ｃｏｌｉタン
パク質の最低レベルは、全タンパク質含量の０．０２５％である。

【００５７】４．１．５．結論：ウェスタン・ブロット分析とＥＬＩＳＡアッセイの両者を使用した。上記の実
験に基づき、実施例１の下で、発酵生成物からのＥ．ｃｏｌｉタンパク質汚染物
質の浄化は、ＳＰＣ（ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（カチオン交換）カラム
の流出物）ステップの後、ほぼ完全である。残存Ｅ．ｃｏｌｉ汚染物質は、ＥＬ
ＩＳＡにより０．０２５％未満であると推定される。上記精製プロセスは、２０
Ｌバッチ上で、及び７５Ｌスケールにおいて証明されたように、再現可能である
。同様の結果が実施例２と３の下で得られる。

【００５８】４．２．ＤＮＡの定量４．２．１：異なるサンプルにおけるＤＮＡ定量のために使用した方法は、Ｔｈｒｅｓｈｈ
ｏｌｄ（商標）システム（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｒｉｃｅｓＣｏｒｐ．）
であった。このシステムは、半自動化されたワークステーション、リーダー、パ
ーソナルコンピューター、ソフトウェア、ＤＮＡ決定のために必要な全試薬及び
使い捨て材料、並びに上記テストを行うための手順を含む。

【００５９】ＤＮＡの検出は、ストレプトアビジンを用いたサンドイッチ・アッセイにおけ
る２つのＤＮＡ結合性タンパク質による、プロテイナーゼＫ処理及び熱変性後に
得られた、１本鎖ＤＮＡの認識に基づく。上記タンパク質の中の１、Ｅ．ｃｏｌ
ｉからの１本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質（ＳＳＢ）は、膜上のＤＮＡ複合体の特
異的捕獲のためのビオチンに連結され、他は、シグナル生成のためのウレアーゼ
に結合された抗−ＤＮＡモノクローナル抗体である。

【００６０】両タンパク質は、１本鎖ＤＮＡについての高いアフィニティーをもつが、低い
配列特異性をもち、そしてＤＮＡとストレプトアビジンとともに、ストレプトア
ビジン−ビオチン−ＳＳＢ−ＤＮＡ−抗体−ウレアーゼ複合体を形成する。この複合体は、真空下、濾過を通じてビオチン化膜上に捕獲される。非結合試
薬は洗浄により除去される。

【００６１】捕獲されたウレアーゼの量はＤＮＡの量に比例するので、ウレアーゼ活性はＤ
ＮＡを定量するために使用されることができる。尿素のアンモニアと二酸化炭素
への変換率をpH感受性半導体により測定する。サンプル中のＤＮＡの量を、２pg〜２００pgの子ウシ胸腺ＤＮＡ換算曲線の標
準曲線に対して決定する。それ故、定量されることができる最小量は２pgである
。

【００６２】４．２．２．サンプル処理：各容量のテスト・サンプルを、２０分間１００℃での変性及び製造者のプロト
コールに従うラベリング反応の前に、５００μｌの最終容量において１６時間５
５℃で、プロテイナーゼＫ（０．１mg／ml）とＳＤＳ（０．１％）により処理し
た。

【００６３】前処理物を確認し、そしてサンプルに関連する阻害効果をモニターするために
、スパイク回収テストを、（製造者のプロトコールに従って）外来ＤＮＡ５０
pgを添加することにより、そしてバッファー中５０pgの子ウシ胸腺ＤＮＡを含有
する対照に比較して、定量回収を表すことにより、各サンプルに対して行った。上記のスパイクされたサンプル中のＤＮＡの回収を、以下の式を使用して計算
する：

【００６４】

【数１】テストを有効とするためには、スパイクされたサンプル中のＤＮＡの回収は、
約８０〜１２０％の間になければならない。４．２．３．結果：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムは、ＤＮＡの除去において最も効率的なプロセ
ス・スナップである。

【００６５】実施例１からの精製されたＯｓｐＡサンプルにおいては、１００μｌの非希釈
サンプル中の残存ＤＮＡの定量は、そのシステムの検出限界（２pg）に近い。精
製されたバルクのタンパク質濃度（１mg／ml）を考慮すると、これは、１００μ
ｇの抗原当り２pgに対応する。３０μｇのリポ−ＯｓｐＡのワクチン投与量にお
けるＤＮＡ濃度は、それ故、２pg未満にも対応するであろう。同様の結果が実施
例２と３からのサンプルをもって見られる。

【００６６】４．３リポ−ＯｓｐＡの精製プロセスによるＳＢ１２の浄化の評価：精製タンパク質中のＳＢ１２の残存レベル：４．３．１．序：Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのリポ−ＯｓｐＡの抽出は、界面活性剤Ｎ−ドデシル−
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ラウリル−ス
ルホベタイン又はＳＢ１２）を含有するバッファーを使用する。細胞抽出物中の
３％（Ｗ／Ｖ）の上記界面活性剤の存在は、その後の精製ステップのために上記
リポ−ＯｓｐＡを可溶化する。

【００６７】異なる精製ステップによる上記製品からのＳＢ１２の浄化の程度を評価し、そ
して精製されたバルク・ステージにおいて残存ＳＢ１２を定量するために、実験
を行った。４．３．２．ＳＢ１２のアッセイのための分析方法：４．３．２．１．上記方法の原理ＳＢ１２を、Ｃ１８カラム上での逆相ＨＰＬＣによりバッファー成分（リン酸
塩）から分離し、そしてそのカラム溶出液を、ＥＳＭＳ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒ
ａｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）内にインジェクトした。上記物質
を、ｍ／ｚ３３６，ＳＢ１２の分子イオンにおいてＳＩＭ（ｓｉｎｇｌｅｉｏ
ｎｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）により検出する。

【００６８】４．３．２．２．実験条件：上記ＨＰＬＣシステムは、ｔｈｅＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
１４０溶媒デリバリー・システム、ＶｙｄａｃＣ１８カラム（２５０×２．１
mm）、ＥＳＭＳ、及び２１４nmにおけるＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
７５９ＡＡｂｓｏｒｂａｎｃｅディテクターから構成された。上記カラム
溶出液は、９０／１０の比で分かれる：ＥＳＭＳに対して１０％、ＵＶディテク
ターに対して９０％、バイパス・システムが、上記塩を含有するインジェクショ
ン・ピークが取り除かれるように、上記カラムの後にインストールされる。この
ようなシステムの使用は、上記方法の再現性を高め、そして上記源の閉塞を回避
する。移動相（流速２００μｌ／分）は、０．１％のトリフルオロ酢酸を含有し
、メタノール：水７４：１０から成る。インジェクション容量は２０μｌであっ
た。

【００６９】ＥＳＭＳ（ＶＧＰｌａｔｆｏｒｍ II，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を、陽イオン
・モード（ＥＳ＋）において行い、そしてＳＢ１２の分子イオン（ｍ／ｚ３３
６）を、シングル・イオンとしてモニターして、最高の可能感受を得た。ＥＳＭ
Ｓのチューニング・パラメーターは以下の通りであった：源：キャピラリー３．５kV、ＨＶレンズ０．５kV、コーン４５Ｖ、源の温度６
０〜１２０℃ ＭＳ：イオン・エネルギー１Ｖ、ＬＭ分解能１０、ＨＭ分解能１０、増幅器６
５０ＶＳＩＲ：平均質量３３６、滞留時間０．２秒間、チャンネル間遅れ０．０２秒
間。

【００７０】質量スケールの換算のために、ＮａＩのクラスターを使用する。４．３．２．３．標準曲線：１０ppm のＳＢ１２を含有する保存溶液を、５．０、２．５、１．０、０．５
０、０．２５、０．１００、０．０５０、０．０２５、及び０．０１ppm におい
て溶液が得られるように希釈する。標準曲線のデータを表２に与える。

【００７１】

【表２】４．３．２．４．サンプル調製：可能ならば、最高の可能感度を得るために、希釈せずに、サンプルをそのまま
インジェクトした。高濃度のＳＢ１２が存在する、精製プロセスの第１ステップ
においては、換算曲線の範囲内の応答を得るために、適当な希釈（１０００Ｘ，
１００Ｘ又は１０Ｘ）を行った。

【００７２】４．３．３．精製プロセスによるＳＢ１２の除去の評価：異なるバッチの精製プロセスにおける中間ステップの異なるサンプルを、それ
らのＳＢ１２含有量について分析した。表３は、精製プロセスの異なるステージ
における７５Ｌに一致するバッチについて得られた結果を示す。

【００７３】

【表３】上記表から分かるように、同一の精製中間物中に存在するＳＢ１２の濃度は、
７５Ｌバッチと２０Ｌバッチについて一貫している。ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅ
後に存在するＳＢ１２のレベルは、１００ppb （０．１００ppm ）未満である。

【００７４】全てのステップについての浄化は９０％を上廻る。但し、ＱＳｅｐｈａｒｏ
ｓｅステップはＳＢ１２を除去しない。このステップ後の低濃度は、高プロセス
容量（希釈効果）だけに因る。図１は、異なる精製ステップによるＳＢ１２濃度の低下を表す。除去は、調べ
た７５Ｌと２０Ｌロットの全てについて一貫していた。

【００７５】４．３．４．結論：ＳＢ１２の検出のためのひじょうに敏感、かつ、正確な方法を使用して、精製
リポ−ＯｓｐＡバルク中のＳＢ１２の残存レベルが１０ppb 未満であることが証
明された。２０Ｌと７５Ｌスケールの両者における、上記精製ステップの異なる
中間物の分析は、上記精製プロセスが、上記開始抽出物からＳＢ１２を一貫して
除去することを示している。

【００７６】４．４．比色計測によるＴｒｉｔｏｎＸ−１００含量：４．４．１．序：本セクションは、リポ−ＯｓｐＡ精製バルク中のＴｒｉｔｏｎ含量についての
アッセイを実証するために行われた実験の結果を説明する。比色計測を以下に説明する：４．４．２．分析方法：使用した方法は、Huddleston, R.L. and Allred, R.C.,(J. Am. Oil Chemist
Soc., 1965, 42, 983)による刊行物に基づく。

【００７７】このアッセイは、非イオン界面活性剤の測定のためにも使用された手順に基づ
く。界面活性剤は、チオシアン酸コバルトと錯体を形成する。この着色錯体は、
二塩化エチレンで抽出され、そしてこの吸収は３２０nmにおいて計測される。試薬及び標準溶液：１．試薬：二塩化エチレン、硝酸コバルト６Ｈ₂ Ｏ、チオシアン酸アンモニウム、９８％
ギ酸。

【００７８】２．チオシアン酸コバルト試薬：１００mlの精製水中に１２．７ｇのチオシアン酸アンモニウムと２．０ｇの硝
酸コバルトを溶解させ、そしてよく混合する。３．標準溶液：１００ml容積フラスコ内に１００mgのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を正確に秤量
する。二塩化エチレンで容量まで溶解させ、そして希釈する。

【００７９】手順：Ａ．換算：二塩化エチレン中に、０、２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、及び
４０μｇ／mlのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する一定レンジの標準溶液を調
製する。１mlの各標準溶液に、１００μｌのギ酸と１mlのコバルトチオシアネー
ト試薬を添加する。約２０分間よく混合する。

【００８０】約５０００rpm で約１５分間遠心分離し、吸引し、そして上（水）層を捨てる
。マイクロキュベット内の３２０nmにおける下（二塩化エチレン）層の吸光度を
計測する。上記吸光度に対する濃度（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のμｇ／ml）をプロット
する（換算曲線）。

【００８１】Ｂ．サンプル処理：２連で、１mlのサンプルを上記管に移し、そしてＳａｖａｎｔＳｐｅｅｄ
Ｖａｃ濃縮器内で蒸発乾燥させる。残渣に、１００μｌのギ酸と１mlの二塩化エチレンを添加する。音波処理によ
り上記残渣を懸濁液にする。第１の管内に、１mlのコバルトチオシアネート試薬
を添加する（試験管）。第２の管内に、１mlの精製水を添加する（ブランク管）
。約２０分間よく混合する。約５０００rpm で約１５分間遠心分離し、吸引し、
そして上（水）層を捨てる。マイクロキュベット内の３２０nmにおける下（二塩
化エチレン）層の吸光度を計測する。

【００８２】上記試験管を用いて得られた値と上記ブランクのＯ．Ｄ．値の間のＯ．Ｄ．の
差を計算する。上記換算曲線から上記サンプルのｔｒｉｔｏｎ含量を決定する。検出限界：２μｇ／ml。４．４．３．分析方法の実証４．４．３．１．検出限界（ＬＯＤ）：換算曲線に基づく計算換算曲線を、４つの異なる日に測定した（１日当り３〜５連の希釈物）。各日
に得られた回帰曲線のｙ−切片の平均及び標準偏差（ＳＤ）を決定し、そして平
均＋３ＳＤを計算した。各日の平均値とその日についての平均換算曲線に基づき
、ＬＯＤを計算した。４つの日についての結果を表４に報告する。４つの日につ
いて得られた結果の平均は１．８μｇ／mlである。

【００８３】４．４．３．２．標準偏差及び勾配に基づく計算：ＬＯＤ＝３．３SD／ＳＳＤ＝ｙ−切片の標準偏差Ｓ＝平均換算曲線の勾配４つの日において得られた結果を表４に与える。表から分かるように、４つの
値の平均は１．９μｇ／mlであり、これは、４．４．３．１．の下で得られた値
に近似する。

【００８４】上記実験に基づき、ＬＯＤが２μｇ／mlであると結論することができる。４．４．３．３．定量限界（ＬＯＱ）：定量限界を、４．４．３．１．下に記載した実験において得られた結果を使用
して計算する。ＬＯＱ＝１０SD／Ｓ¹ ＳＤ＝ｙ−切片の標準偏差Ｓ＝平均換算曲線の勾配個々の結果を表４に要約する。ＬＯＱが６μｇ／mlであると結論することがで
きる。

【００８５】

【表４】４．４．３．４．直線性及びレンジ：比色計測法の直線性と、それにわたりＴｒｉｔｏｎ含量が正確かつ的確な方法
で測定されることができるところの濃度レンジを評価するために、３つの換算曲
線を、０〜４０μｇのＴｒｉｔｏｎ／mlにわたり確立した。これらのデータを線
形回帰により分析した。

【００８６】テストした濃度レンジ（０〜４０μｇ／ml）内で、比色計測は直線、正確、か
つ、的確であると結論することができる。６μｇ／mlのＬＯＱを与えた場合、的
確かつ正確な結論が得られるところのレンジは、６〜４０μｇ／mlである。４０
μｇ／mlを超えるＴｒｉｔｏｎ濃度をもつサンプルは希釈後にテストされるべき
である。

【００８７】４．４．３．５．特異性：Ｔｒｉｔｏｎを全く含有しない絶対的に“純粋な”リポ−ＯｓｐＡは入手でき
ないので、製品中に存在する物質が上記アッセイを妨害するかどうかをチェック
することにより、上記アッセイの特異性を実証することはできない。しかしなが
ら、先に述べたように、上記バルク中に存在し、そして同一波長（３２０nm）に
おいて吸収する成分の妨害は、各サンプル分析においてブランク（コバルト試薬
を含まないサンプル）を差引くことにより、明らかにされる。

【００８８】２つの異なる濃度におけるスパイキングの後に得られた良好なリカバリーは、
Ｔｒｉｔｏｎ以外の成分からの大きな妨害が存在しないということをも示してい
る。４．４．３．６．結論：先に提示されたデータに基づき、リポ−ＯｓｐＡバルク中のＴｒｉｔｏｎのア
ッセイについてのテスト方法はその意図された用途に好適であると結論すること
ができる：最大１０μｇ／mlの仕様の限界もつ、リポ−ＯｓｐＡバルク中の残存
ｔｒｉｔｏｎのアッセイ。

【００８９】上記比色計測法は、６〜４０μｇ／mlのレンジについて的確かつ正確な結果を
与える。上記アッセイの最終結果は２つの実験値の間の差異であり、そしてそれ
故、６μｇ／mL未満の値として報告されることができるということに注目すべき
である。検出限界は２μｇ／mLである。３２０nmにおいて吸収するサンプル成分
の妨害は、バルクを使用して排除される。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｃｏｂａｌｔ錯体の色
は少なくとも２時間安定である。

【００９０】実施例５．リポタンパク質ＯｓｐＡの特徴付け：内毒素：発色性ＬＡＬ法による日常試験：精製されたＯｓｐＡ抗原を、３０μｇのタンパク質当り≦５EUの仕様をもつ、
発色性ＬＡＬ（カブトガニ遊走細胞溶解産物（ｌｉｍｕｌｕｓａｍｅｂｏｃｙ
ｔｅｌｙｓａｔｅ））テストにより、内毒素含量について日常的にテストする
。このテストを、End-Product Endotoxin Test for Human and Animal Parenter
al Drugs, Biological Products, and Medical Devices (１９８７年１２月）と
してthe Gaide line on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate中に記載
されたように、the FDA Interim Guidance for Human and Veterinary Drug Pro
ducts and Biologicals on Kinetic LAL Techniques に従って、実施し、そして
実証する。

【００９１】ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：比色方法による日常テスト：ＴｒｉｔｏｎＸ−１００が（ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム前の）精製プロ
セスの中間ステップにおいて添加されるとき、精製されたバルク抗原中のその含
有量は比色計測法により日常的に定量される。リポタンパク質ＯｓｐＡの１mg／
ml溶液中のＴｒｉｔｏｎＸ−１００の量は１０μｇ／ml以下（１０ppm 以下）
である。３０μｇ投与量のＯｓｐＡに基づき、最終製品中の残存量は（１０μｇ
／ml未満の許容基準に基づき）３００ng／投与量未満であろう。

【００９２】Ｔｒｉｔｏｎ毒性研究についての文献サーチは筋中毒性試験を全くもたらさな
かった。静脈内投与後のＴｒｉｔｏｎＸ−１００についてのマウスＬＤ₅₀は１
２００mg／kgとして報告された。Ｅ．ｃｏｌｉ汚染物質：ＥＬＩＳＡとウェスタン・ブロット法を使用した浄化
試験Ｅ．ｃｏｌｉ汚染物質の除去における精製プロセスの効果を評価するために、
浄化試験を、２つの分析技術を使用して行った。ウェスタン・ブロットとＥＬＩ
ＳＡの両者は、上記精製プロセスが一貫して汚染タンパク質を除去し、そして精
製プロセスの終りに、ひじょうに少量のＥ．ｃｏｌｉ汚染物質が残ることを示し
た。ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質の残存量の推定を許容した
（＜０．０２５％）。

【００９３】ＤＮＡ：しきい値法（ｔｈｅＴｈｒｅｓｈｏｌｄＭｅｔｈｏｄ）を使用し
た浄化試験Ｅ．ｃｏｌｉ汚染物質について、異なる精製ステップによりＤＮＡの浄化を評
価するために、そして精製されたバルク抗原中の残存ＤＮＡを定量するために、
試験を企てた。ＤＮＡが上記精製プロセスにより効率的に、かつ、一貫して除去
される（約５対数の低下が得られる）と結論することができる。残存ＤＮＡはひ
じょうに低く、３０μｇの（ＯｓｐＡ）ワクチン投与量当り２pgの未満のＤＮＡ
をもたらす。これは、ＷＨＯ諮問機関により推奨されるレベル、すなわち、１０
０pgの細胞ＤＮＡ／投与量（WHO Technical Report Series, 747, 1987）よりは
るかに低いものである。

【００９４】ＳＢ１２：ＨＰＬＣ−ＥＳＭＳ法を使用した浄化試験上記浄化試験の結果は、上記精製プロセスが収穫液からＳＢ１２を一貫して除
去し（浄化係数約７対数）、上記精製産物中の１０ppb 未満のＳＢ１２をもたら
すことを証明する。この量は、毒物学的効果をもたないものとして、文献中に記
載されたもの（３７．５μｇ／ml）よりもはるかに低い。〔Speijers et al., V
accine, 7 : 364, 1989 ; Speijers et al., Vaccine, 6 : 419, 1988 ; Ernst
and Arditti, Toxicology, 15 : 233, 1980〕。

【００９５】実施例６．リポタンパク質ＯｓｐＡの精製及び試験：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ＺＳ７ＯｓｐＡのいくつかのロット（２×７５Ｌ，３×２０Ｌ）をＳＤＳ−
ＰＡＧＥ上で分析した。分析された各ロットは、３１kDの見掛け分子量をもつ主
要なバンドを示した。ＯｓｐＡの純度と均一性は、単一の主要バンドの検出によ
り証明された。７５Ｌロットからのサンプルの処理物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥパタ
ーンに影響を及ぼすことなく１週間３７℃でインキュベートされ、このタンパク
質の安定性を示した。同様の結果がＺＱ１とＡＣＡ−１株からのＯｓｐＡについ
て見られた。しかしながら、両株からのＯｓｐＡタンパク質は、３０kDの見かけ
分子量をもっていた。６０kDにおける小さな２量体バンドも、両タンパク質につ
いて観察された。

【００９６】ウェスタン・ブロッティング：ＺＳ７ＯｓｐＡのいくつかのロット（２×７５Ｌ，２×２０Ｌ）を、モノク
ローナル抗体ＬＡ−２、ＯｓｐＡ特異的抗体によるウェスタン・ブロッティング
により分析した。分析された各ロットは、３１kDの見掛け分子量をもつ主要なバ
ンドを示した。ＯｓｐＡの純度と均一性の両者が、単一の主要バンドの存在によ
り証明される。７５Ｌロットからのサンプルの処理物は、ウェスタン・ブロット
のパターンに影響を及ぼさなかった１週間３７℃でインキュベートされた。

【００９７】Ｎ−末端配列分析：Ｎ−末端配列分析を、ＺＳ７株からのＯｓｐＡの２つの２０Ｌと２つの７５Ｌ
ロット、及びＡＣＡ−１株からのＯｓｐＡの３ロットについて行い、４℃で、そ
して３７℃における７日間のインキュベーション後に保存した。非修飾リポタン
パク質ＯｓｐＡ（すなわち、シグナル配列をもつプロリポプロテイン）のＮ−末
端配列はひじょうに弱く検出された。非脂質化ＯｓｐＡの配列も、ひじょうに低
いレベルではあるが同定された。非修飾及び非脂質化（不完全修飾）ＯｓｐＡの
ひじょうに低いレベル（すなわち、全量の１％未満）並びに上記技術により示さ
れた分解生成物及び他のタンパク質汚染物の非存在は、高純度のＯｓｐを確証し
た全ロット間の一致データは、上記精製プロセスの一貫性と均一性をさらに支持
する。

【００９８】レーザー光散乱分析：レーザー光散乱検出器は、巨大分子溶液による１５度において散乱した光の強
度を計測する。これらの強度から、溶液中の巨大分子のサイズと形状を測定する
ことができる。上記検出器は、それから上記リポタンパク質が溶出されるところ
のＨＰＬＣサイズ排除カラムに接続される。オンラインに置かれた干渉屈折計は
、溶出されたリポタンパク質の量の測定を許容する。平均分子量（Mm）は、それ
らの対応分子量をかけ、そして全種の重量の合計で割った。全種の重量の合計と
して定義される。

【００９９】５００kD付近の（４４１〜５８１kDにわたる）計算された平均分子量は、ＺＳ
７株からのＯｓｐＡについて３７℃で７日間の前後に、テストされた２つの７５
Ｌロットについて見られた。ＡＣＡ−１株からのＯｓｐＡについては、平均分子
量は、３つのロットに基づいて４５０kD付近である。３７℃において０〜７日目
の間には有意差はなかった。

【０１００】さらなる試験を、４℃において１２ヶ月の保存後にＺＳ７株からリポタンパク
質ＯｓｐＡの３つのバッチについて行った。１２ヶ月後、主要なＯｓｐＡ集団は
、４５０〜５５０kDの間の分子量をもち、上記ＯｓｐＡミセル構造の安定性を示
した。マス・スペクトロメトリー：１２ヶ月間４℃で保存された（ＺＳ７株からの）リポタンパク質ＯｓｐＡの３
つのバッチからの分子質量を、エレクトロスプレー・イオン化（Ｐｌａｔｆｏｒ
ｍ II装置）により測定された。主要ピークの平均分子質量は、２８，５２３．
１３±０．５２ダルトンであり、これは、２８，５２３．１ダルトンの予想値と
よく一致する。２８，２８４．８１±１．３２ダルトンにおけるより小さなピー
クもあり、これは、１のパルミトイル脂質鎖の損失に対応する。他の分解生成物
に対応する他の質量は、４℃において１年後に全く観察されず、ＯｓｐＡの安定
性を示す。

【０１０１】脂質含量の測定：１年間４℃で保存されたリポタンパク質ＯｓｐＡ（株ＺＳ７）の３つのバッチ
からの脂質含量を、アルカリ加水分解の後、ガス・クロマトグラフィーにより測
定した。放出された脂肪酸を、酸メタノリシスの後にＦＡＭＥ（脂肪酸メチル・
エステル）として評価した。ＨＰ７６７３自動インジェクターとＨＰ３３６５
ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎモジュールを備えた。ガス・クロマトグラフＨＰ５８９
０シリーズIIを、データ分析のために使用した。脂質対タンパク質の比を、４℃
で１年間保存した前後に計算した。実験誤差内に、２つの脂質鎖が、時間＝０及
び１年において、アルカリ加水分解によりリポタンパク質ＯｓｐＡから放出され
る。これは、リポタンパク質ＯｓｐＡの予想された２エステル−結合脂質鎖と一
致する。

【０１０２】追加の安定性試験：２つの臨床ロットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタン・ブロッティング、Ｂａ
ｌｂ／Ｃマウスにおけるｉｎｖｉｖｏ効力（１２ヶ月目について９０％以上の
比効力、０〜２４ヶ月目の間８０％以上）等について、０，６，１２、及び２４
ヶ月目にテストした。結論は、ＯｓｐＡは２〜８℃において２年間まで安定であ
るということであった。

【０１０３】本明細書中に引用する特許及び特許出願明細書で非限定的に含む全ての刊行物
を、あたかも個々の刊行物が、本明細書に特別かつ個別的に援用されるべく示さ
れるように、全体として言及するけれども、本明細書中援用する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１の異なる精製ステップにおけるＳＢ１２濃度における低下を
示す。３つの７５Ｌバッチ（ＯＰＡ１１３，ＯＰＡ１１４、及びＯＰＡ１１５）
と３つの２０Ｌバッチ（ＯＰＡ０１３，ＯＰＡ０１４、及びＯＰＡ０１５）を分
析した。ＳＢ１２の量は、対応の希釈係数を考慮して換算曲線から得た。ＢＺ５
Ｓ＝細胞ホモジェネート；ＳＴＣ＝ＳｔｒｅａｍｌｉｎｅＳＰカラムの溶出プ
ール；ＲＤ＝ダイアフィルトレーションの保持物；ＱＦＴ＝Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅＦＦカラムの流出物；ＳＰＣ＝ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラムの
流出物。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年５月２３日（２０００．５．２３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者リベイン，ロベールベルギー国，ベ−1330 リクサンサール，リュドゥランスティテュ 89，スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム (72)発明者メルタン，エマニュエルベルギー国，ベ−1330 リクサンサール，リュドゥランスティテュ 89，スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム (72)発明者シャンルビエ，ベノワベルギー国，ベ−1330 リクサンサール，リュドゥランスティテュ 89，スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム (72)発明者プラーンシャン，ドミニクベルギー国，ベ−1330 リクサンサール，リュドゥランスティテュ 89，スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム (72)発明者コラッツァ，イボンベルギー国，ベ−1330 リクサンサール，リュドゥランスティテュ 89，スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニムＦターム(参考） 4C085 AA03 BA46 BB13 CC07 CC21 DD34 DD35 4H045 AA11 AA20 AA30 BA55 CA11 DA86 EA31 FA73 FA74 GA10 GA22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）菌のリポタンパク質ＯｓｐＡ
の精製方法であって、以下のステップ：（ａ）双極性イオン界面活性剤の存在下でリポタンパク質ＯｓｐＡを発現する
宿主細胞を溶解させて、リポタンパク質ＯｓｐＡを含有する不純溶液を作り；（ｂ）上記不純溶液を浄化して宿主細胞死骸を除去し；（ｃ）非イオン性界面活性剤の存在下で、上記溶液をアニオン交換樹脂と接触
させ；（ｄ）上記アニオン交換樹脂からの流出物を集め、そして上記流出物をカチオ
ン交換樹脂と接触させ；及び（ｅ）ＯｓｐＡを溶出させ、その後ゲル濾過工程を行う、を含み、ここで上記精製が加熱を伴わずに生じる、前記精製方法。
【請求項２】ステップａ，ｂ、及びｃが、以下の：（ｉ）双極性イオン界面活性剤の存在下で細胞を破壊して、ＯｓｐＡを含有す
る不純溶液を作り；（ii）上記不純溶液を流動床樹脂と接触させ、上記樹脂はカチオン交換樹脂を
含み；（iii ）上記樹脂からＯｓｐＡを溶出させ、そして上記溶出液をダイアフィル
トレーションにかけ、これによりＯｓｐＡが保持され；及び（iv）非イオン界面活性剤の存在下で上記保持物をアニオン交換樹脂と接触さ
せる、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記不純溶液の浄化が遠心分離を含む、請求項１に記載の方
法。
【請求項４】前記非イオン界面活性剤がポリオキシエチレン・エーテルで
ある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記ポリオキシエチレン・エーテルがＴｒｉｔｏｎＸ−１
００（商標）又はＴｒｉｔｏｎＸ−１１４（商標）である、請求項４に記載の
方法。
【請求項６】前記ポリオキシエチレン・エーテルがＴｒｉｔｏｎＸ−１
００である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】前記非イオン界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン・
エステルである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記ポリオキシエチレンソルビタン・エステルがＴｗｅｅｎ
２０（商標）〜Ｔｗｅｅｎ８０（商標）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】１mg／mlの濃度における精製されたＯｓｐＡタンパク質が、
１０００ppm （０．１％）未満の非イオン界面活性剤を含有する、請求項１に記
載の方法。
【請求項１０】前記の精製されたＯｓｐＡタンパク質が、１００ppm 未満
の非イオン界面活性剤を含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記の精製されたＯｓｐＡタンパク質が、１０ppm 未満の
非イオン界面活性剤を含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記双極性界面活性剤が、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアンモニオ−１−プロパンスルホネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ−１−プ
ロパンスルホネートが、ＳＢ８〜ＳＢ１８である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ−１−プ
ロパンスルホネートがＳＢ１２である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】１mg／mlの濃度における精製されたＯｓｐＡタンパク質が
、１０００ppb （１ppm ）未満の前記双極性イオンを含有する、請求項１に記載
の方法。
【請求項１６】前記の精製されたＯｓｐＡタンパク質が、１００ppb （０
．１ppm ）未満の前記双極性イオン界面活性剤を含有する、請求項１５に記載の
方法。
【請求項１７】前記の精製されたＯｓｐＡタンパク質が、１０ppb （０．
０１ppm ）未満の前記双極性イオン界面活性剤を含有する、請求項１６に記載の
方法。
【請求項１８】前記ゲル濾過後に滅菌濾過をさらに含む、請求項１に記載
の方法。
【請求項１９】界面活性剤を含有しない、精製リポタンパク質ＯｓｐＡ。
【請求項２０】ヒト臨床用途に好適である、請求項１９に記載のＯｓｐＡ
。