CN1311795A - 疏螺旋体脂蛋白ospa的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种方法,用于纯化适于人类临床应用的疏螺旋体脂蛋白OspA,该方法是将表达脂蛋白OspA的宿主细胞于存在两性离子去污剂的情况下裂解,然后在非离子去污剂中实施若干层析步骤。

Description

疏螺旋体脂蛋白OSPA的纯化方法
发明领域：
本发明涉及一种纯化疏螺旋体脂蛋白OspA的改进方法。
发明背景：
人类莱姆病是一种由博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)引起的慢性进行性疾病，博氏疏螺旋体主要由蜱虱传播给人类。该疾病可侵袭多种器官，尤其是皮肤、心脏、肝脏、中枢神经系统和周围神经系统、肾脏和肌肉骨骼系统。
博氏疏螺旋体(广义的)是一种通称，它包括若干疏螺旋体种，这些疏螺旋体种均被认为是莱姆螺旋体病(莱姆病)的病原体。博氏疏螺旋体至少包括：博氏疏螺旋体(狭义的)、B.garinii和B.afzelii。该疾病是由多种带有螺旋体的蜱虱的叮咬而加以传播。这种传染病在美国的主要储存库是白脚小鼠，它可以传播给包括人类在内的多种哺乳动物物种。
OspA是莱姆病螺旋体广义博氏疏螺旋体的一种保护性抗原。OspA全长基因在疏螺旋体或大肠杆菌中表达可产生一种蛋白，该蛋白可经信号肽酶H翻译后加工，并且含有一种附属的脂类部分。由下文可知，目前已能够对OspA脂蛋白进行适于临床应用的大规模纯化，其实施无需在纯化过程中采用热抽提或酒精抽提方法，并且产生的OspA脂蛋白基本不含去污剂。
发明概述：
首先，本发明提供一种方法，用于纯化适于人类临床应用的疏螺旋体脂蛋白OspA，该方法包括(a)将表达脂蛋白OspA的宿主细胞于存在两性离子去污剂的情况下裂解，以形成含有脂蛋白OspA的不纯溶液；(b)使含有脂蛋白OspA的不纯溶液澄清，以去除宿主细胞碎片；(c)于存在非离子去污剂的情况下将该不纯溶液与阴离子交换树脂接触；(d)收集该阴离子交换树脂的流出物并将该流出物与阳离子交换树脂接触；以及(e)洗脱OspA并实施凝胶过滤步骤，其中该纯化方法的实施无需加热。
其次，本发明还提供一种方法，用于纯化不含去污剂的疏螺旋体脂蛋白OspA。
另外，本发明提供纯净并且稳定的脂蛋白OspA，该脂蛋白OspA不含去污剂，并且适于人类的临床应用。
附图简述：
图1显示实施例1的不同纯化步骤中SB12浓度的减少。分析的样品为3批75L(OPA113、OPA114和OPA115)和3批20L(OPA013、OPA014和OPA015)。SB12的量由校准曲线得出，并考虑了相应的稀释系数。BZ5S=细胞匀浆；STC=Streamline SP柱的洗脱合并液；RD=透滤滞留物；QFT=Q-Sepharose FF柱的流出液；SPC=SP-Sepharose FF柱的流出液。
发明详述：
本发明提供一种用于从实验室规模放大至工业规模的纯化博氏疏螺旋体脂蛋白OspA的简单方法。该方法的优势在于，其纯化无需热抽提或酒精抽提或双相抽提，并且可通过单一步骤获得高水平的纯度。本发明的这一方法可产生适于人类临床应用的OspA蛋白。本发明还提供OspA脂蛋白，该脂蛋白基本不含去污剂(即只残存有痕量的去污剂)并且可长时间保持稳定(2-8℃的PBS中保持2年)。
本发明提供一种方法，用于在存在两性离子去污剂以使OspA增溶的情况下对脂蛋白OspA进行纯化，该方法在纯化过程中无需热抽提或酒精抽提。这样可有利地避免对终产物免疫原性的潜在损害(如变性、脱脂化等)。尽管并不希望终产物中含有去污剂，但只要将OspA脂蛋白溶解，则优选的是在存在去污剂的情况下进行连续纯化，这是因为脂蛋白在不存在去污剂的情况下倾向于形成脂类聚集体。在离子交换纯化过程中，优选的是加入另一种去污剂，以保持脂蛋白OspA的溶解状态和非聚集随机状态。该去污剂优选的为非离子型去污剂，如TritonTM(聚氧乙烯醚)或TweenTM(聚氧乙烯山梨糖醇酯)。脂蛋白OspA一旦被纯化，即可在不含有去污剂(表面活性剂)的PBS(磷酸缓冲盐溶液)中保持稳定。终产物中的纯化OspA脂蛋白无需去污剂，因为该脂蛋白一旦被纯化，还可通过采取微团样形式而保持稳定。
本发明提供一种用于从广义的博氏疏螺旋体菌株中纯化脂蛋白OspA的有利方法。这些菌株包括狭义的博氏疏螺旋体(如ZS7、B31、N40、JD1、297、Sh-2-82等)、B.garinii(如ZQ1、IP90、NE11H、IP3等)和B.afzelii(如ACA-1、Pko、Bo23等)。
本发明的纯化方案包含以下步骤。在存在两性离子去污剂的情况下将表达脂蛋白OspA的宿主细胞裂解，借此使脂蛋白OspA溶解；实施澄清步骤以去除宿主细胞碎片，该步骤包括流化床离子交换法，然后采用透滤法(或选用离心法)；可选的过滤步骤，以去除所有残留的微粒物质；阴离子交换；阳离子交换；以及凝胶过滤(筛分柱)以从脂化OspA中去除所有非脂化OspA。此外，优选的是在凝胶过滤之后再添加一个除菌过滤步骤。
实施例部分将对脂蛋白OspA的纯化做进一步的说明。方案Ⅰ涉及4个层析步骤和1个透滤步骤。该方法包括：细胞匀浆(破碎)，可通过，例如，高压细胞匀浆仪来实现；匀浆的稀释(如稀释到光密度(OD)约为20)及匀浆的酸化；然后在流化床上进行阳离子交换(有时称为膨胀床吸附--如StreamlineTMSP系统，Pharmacia)。把匀浆加载到流化床上，然后清洗并利用逐渐增加的离子强度和/或逐渐增加的pH进行洗脱。作为可选步骤，可将洗脱液过滤除菌并透滤。然后把含有脂蛋白OspA的样品加载到阴离子交换树脂上。再把流出物加载到另一阳离子交换树脂上。将树脂清洗并利用逐渐增加的离子强度和/或逐渐增加的pH洗脱OspA。使溶解的OspA流经筛分柱，然后过滤除菌。
膨胀床吸附法以流化床为基础。实际上，它是利用上行液流将吸收颗粒提升，以平衡向下的重力。将颗粒提升到刚刚足以使它们悬浮在液流中，借此可产生一个稳定的匀化膨胀床。在一项实施方案中，吸附使用的是StreamlineTM(一种用于阳离子交换的磺酰丙基衍生树脂)。
使用透滤法可去除两性离子去污剂，并可浓缩OspA蛋白。在存在非离子型去污剂(如TritonTMX-100)的情况下把滞留物加载到阴离子交换柱上(如Q-Sepharose)。阴离子交换步骤可去除95％以上的杂质。脂蛋白OspA不与该柱结合，从而把流出物注到阳离子交换柱中(如SP Sepharose)。将柱清洗，再洗脱脂蛋白OspA并将其注到凝胶渗透柱中(如Sephacryl S300HR)，以此来替换缓冲液并将非脂化OspA从脂化OspA中分离，同时去除去污剂。将纯化的脂蛋白OspA稀释至标准浓度，并用0.2m无菌膜进行有效的过滤以除菌。
离子交换树脂为该领域所熟知。阳离子交换剂包括CM Sephadex、SP Sephadex、CM Sepharose、S Sepharose、CM纤维素等。用于阳离子交换层析的优选树脂为SP或CM Sepharose(Pharmacia)。阴离子交换剂包括DEAE Sephadex、QAE Sephadex、DEAE Sepharose、Q Sepharose、DEAE Sephacel等。用于阴离子交换层析的优选树脂为Q Sepharose(Pharmacia)。凝胶过滤(筛分)树脂包括Sephadex、Sephacryl、Sepharose、Superdex、Superose等。优选的树脂为Sephacryl S树脂，如S-300 HR(Pharmacia)。
所得的纯化OspA蛋白即不含去污剂或表面活性剂。
方案Ⅱ涉及3个纯化步骤。在存在两性离子去污剂的情况下的细胞裂解(如冻融)步骤；离心步骤以及将含有OspA的上清液(不纯溶液)过滤的可选步骤。当实施可选的过滤步骤时，优选的是使用预滤器，如先用1.2m过滤器再用0.45m过滤器然后进行0.22m过滤。然后在存在非离子型去污剂的情况下把含有脂蛋白OspA的滤出液加载到阴离子交换树脂上。把流出物加载到阳离子交换树脂上。将树脂清洗并利用逐渐增加的离子强度和/或逐渐增加的pH洗脱OspA。使溶解的OspA流经筛分柱，然后过滤除菌。
在方案Ⅱ中，细胞裂解可在存在两性离子去污剂的情况下自动发生。而无需进行细胞破碎。也不需实施透滤步骤。与方案Ⅰ相同，阴离子交换步骤可去除95％以上的杂质。OspA在碱性条件下不与QSepharose结合。一旦在不存在去污剂(表面活性剂)的情况下被纯化，脂蛋白OspA即可在PBS(磷酸缓冲盐溶液)中保持纯净和稳定性。
两性离子去污剂包括N-烷基-N,N-二甲胺基-1-丙磺酸酯(即SB8、10、12、14、16、18)、CHAPS(3-[(3-胆氨丙基)-二甲胺基]-1-丙磺酸酯)和CHAPSO(3-[(3-胆氨丙基)二甲胺基]-2-羟基-1-丙磺酸酯)。优选的两性离子去污剂选自N-烷基-N,N-二甲胺基-1-丙磺酸酯。更优选的则为N-十二基-N,N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸酯(称为SB12，亦称作月桂基sulfobetain)。SB12在水性溶液中不形成两个相(双相)，从而更易于扩大OspA的纯化规模。
根据本发明的纯化方案，纯化脂蛋白OspA溶液(1mg/ml)中的SB12水平低于1000ppb〔十亿分率〕(1ppm)。优选的为低于100ppb(0.1ppm)。更优选的则低于10ppb(0.01ppm)，该数值已接近检出水平。
非离子型去污剂包括TritonTM(聚氧乙烯醚)、TweenTM(聚氧乙烯山梨糖醇酯)、聚氧乙烯酯和Nonidet P-40。优选的为TritonTM(X-100、X-114、X-405、N-101)或TweenTM(20-80)。更优选的则是TritonTMX-100或TritonTMX-114。由于TritonTMX-100被认为是安全的，并经过FDA认证，因此它是最优选的去污剂。
根据本发明的纯化方案，纯化脂蛋白OspA溶液(1mg/ml)中的TritonTMX-100水平低于1000ppm〔百万分率〕(0.1％)。优选的为低于100ppm。更优选的则低于10ppm。对30g剂量的脂蛋白OspA而言，每剂量的TritonTMX-100水平低于300ng/剂。
本发明的纯化脂蛋白OspA不含去污剂，适于人类临床应用，并可保持稳定。“纯化脂蛋白OspA”是指经SDS-PAGE(Coomassie染色)确定的纯度高于95％；优选的则高于98％。
“不含去污剂”是指纯化脂蛋白OspA溶液(1mg/ml)中的去污剂水平低于1000ppm〔百万分率〕(0.1％)。优选的为低于100ppm。更优选的则低于10ppm。由此，对30g剂量的脂蛋白OspA而言，每剂量的去污剂水平(非离子型或两性离子型)低于300ng/剂。
“适于人类临床应用”是指由显色LAL测试法确定的30μg脂蛋白OspA中的内毒素含量少于5EU。此外，每30μg脂蛋白OspA中的DNA水平低于100pg；优选的低于20pg；更优选的则低于2pg。而且每30μg脂蛋白OspA中的大肠杆菌杂质水平低于总蛋白含量的0.100％；优选的为低于0.050％；更优选的则低于0.025％。
“稳定”是指脂蛋白OspA不会出现明显的降解，即在2-8℃下储存一年后，经SDS-PAGE检测有95％或更多的OspA保持单一条带(优选的为98％或更多)，并且/或其脂类蛋白比率保持约为2(2.0+/0.5)，并且/或其在Balb/C小鼠中的免疫原性保持80％或更高(优选的为90％或更高，更优选的则为95％或更高)。
根据本发明，脂化OspA可从表达OspA的广义博氏疏螺旋体天然菌株中纯化，或可通过该领域熟知的适当重组表达系统来纯化。例如可构建一种重组分子或载体，将OspA全长编码区经操作与异种表达调控序列相连接，以使该蛋白得以表达。获得此类表达载体的方法已众所周知。可参考Sambrook et al.，“分子克隆。实验手册”，第2版，Cold Spring harbor Laboratory,New York(1989)。
用于转染的适当寄主细胞或细胞系包括细菌细胞。例如，可作为适当宿主细胞的多种大肠杆菌菌株(如AR58、AR68、HB101、MC1061等)已为该领域所熟知。枯草芽孢杆菌、链霉菌和其它芽孢杆菌的多种菌株也可在该方法中使用。
为了能够更好地理解本项发明而列出了以下实施例。这些实施例仅用于例证的目的，在任何情况下都不应将其理解为是要限制本发明的范围。
实施例：实施例1：脂蛋白OspA的纯化——方案Ⅰ：发酵：
在大肠杆菌(AR58菌株，参考Strickler et al.，蛋白质，6:139-154(1989))中表达全长OspA，其转化使用带有狭义博氏疏螺旋体ZS7菌株脂蛋白OspA(见美国专利号5,434,077)编码序列的pOA15(一种带有pAS1调控/表达元件(Young et al.,PNAS,80:6105-6109(1983))和卡那霉素抗性基因的大肠杆菌质粒表达载体)，该编码序列受热诱导型λpL启动子调控。在39.5℃+/-2.0℃下诱导约23小时。
利用管式离心机(Sharpless)将发酵肉汤澄清。从转筒中回收沉淀并冷冻于-70℃。该沉淀在做进一步处理前可于-70℃下保存12个月。抽提：
将细胞解冻并重悬于含有SB12去污剂的细胞裂解缓冲液中(TBRO缓冲液含有：25mM乙酸盐、4mM EDTA,pH6.0,3％SB12)，使其OD650=60(由发酵末期的OD650计算出的理论值——相当于30g干重量/升)。使细胞通过高压细胞匀浆仪(Rannie)而将其机械破碎。用TBDI缓冲液(25mM乙酸盐、4mM EDTA、pH4.8,3％SB12)将细胞匀浆稀释3倍(至OD650=20)，并把稀释的匀浆静置1小时。用乙酸把pH值调至4.8±0.1，把传导率调至3.8mS±0.2mS(所有的传导率均转换为20℃下的值)。如果需要，可通过加入NaCl来增加传导率，或加H2O以降低传导率。纯化：
纯化是通过4个层析步骤和1个透滤步骤来实现。首先，将脂蛋白-OspA吸附在膨胀床柱中的Streamline SP填料上。清洗胶体以去除细胞碎片。然后将脂蛋白-OspA洗脱并过滤以去除所有的残留大肠杆菌。第二步，利用透滤法来去除SB12去污剂并将产物浓缩。第三步，在存在Triton X-100的情况下将滞留物加载到Q Sepharose离子交换柱上。脂蛋白OspA不与该柱结合，从而把流出物注到SPSepharose柱中。将柱清洗，再洗脱脂蛋白OspA并将其注到SephacrylS300HR凝胶渗透柱中，以此来替换缓冲液并去除去污剂。将纯化的脂蛋白OspA稀释至标准浓度，并过滤除菌(0.2μm)。后面的步骤将于下文做更详细的描述。
Streamline SP之后的所有纯化步骤均在+2-+8℃的冷室中进行。Streamline SP：
发酵完后，将稀释的细胞匀浆加载到用TSTA缓冲液(25mM NaCl、25mM乙酸盐，pH4.8、3％SB12)平衡的膨胀床Streamline SP(Pharmacia,Sweden)柱上。用TSTA缓冲液清洗柱子以去除所有未结合物质。接着通过倒转流向将柱浸于相同缓冲液中。用TSTC缓冲液(25mM柠檬酸盐，pH6.0、0.25％SB12)洗脱。根据280nm下的紫外吸光谱将产物收集。
用二乙醇胺溶液将Streamline SP洗出液的pH值调至7.9±0.3，并对0.2μm滤膜(Sartobran 0.45μm+0.2μm,4500cm2)过滤以去除潜在的残留大肠杆菌。过滤后的Streamline SP洗出液可在透滤前于+2-+8℃保存过夜。透滤：
透滤使用板框式装置。滤膜则使用截留值为30Kd的FiltronOmega膜(低结合力聚醚砜)。
第一步是将含有脂蛋白OspA的洗出液浓缩约10倍，通过对至少10体积(约240L)二乙醇胺缓冲液(25mM DEA,pH8.6)的透滤而从约240L浓缩至约24L。在滞留物中加入Triton X-100(以保持脂蛋白OspA的溶解性)至终浓度为1％。
滞留物在流经Q Sepharose柱前可于+2-+8℃静置过夜。阴离子交换——Q Sepharose：
用二乙醇胺缓冲液(含有25mM DEA,pH8.6、0.1％Triton X-100的TQA)将Q Sepharose FF(Pharmacia,Sweden)柱平衡。将透滤滞留物加载到柱上，并收集流出物，包括TQA缓冲液的清洗步骤，至280nm的紫外信号返回基值。用乙酸将流出物的pH值调低至pH4.8。阳离子交换——SP Sepharose：
用TSPA缓冲液(25mM乙酸盐，pH4.8、0.1％Triton X-100)将SP Sepharose FF(Pharmacia,Sweden)柱平衡，然后将流出物和清洗组分上样。用2倍柱体积的相同TSPA缓冲液清洗柱子。用25mM柠檬酸pH5.7、0.1％Trition X-100(TSPC缓冲液)将脂蛋白OspA洗脱。凝胶过滤——Sephacryl S300HR：
将SP Sepharose洗出液注射(最多9.5L)到Sephacryl S300HR(Pharmacia,Sweden)凝胶渗透柱上。使10mM PO4、150 mM NaCl pH6.8缓冲液(THR)流经柱子。收集流出组分样品，并保存于+2-+8℃以用于在制过程控制分析，或保存于-70℃。根据HPLC的分析结果将脂蛋白OspA峰值组分合并。HPLC使用的是由200mL磷酸盐缓冲液pH7.6平衡的Zorbax GF450柱。流速为1mL/分钟，样品体积10μl。在210nm下测量光密度。当肩峰表面≤1.2％的脂蛋白-OspA峰值时开始合并；当脂蛋白-OspA的浓度＜400g/mL时结束合并。过滤除菌：
用相同的THR缓冲液将包含脂蛋白OspA峰值的SephacrylS300HR合并组分稀释至浓度为1mg蛋白/mL(目标值)，并立即过滤除菌。
通过对0.2μm滤膜过滤将稀释的纯化脂蛋白OspA除菌。回收过滤后的样品并储存于+2-+8℃，以用于在制过程和QC分析。
无菌的纯化抗原在配制前储存于+2-+8℃。
也可利用以下方法从Borrelia garinii菌株ZQ1或Borreliaafzelli菌株ACA-1中纯化脂蛋白OspA，但产量要低于ZS7 OspA的产量，这可能是由于ZQ1和ACA-1的OspA蛋白的pK值较高。去除该方法起始阶段的酸化步骤或对其进行改进可使产量提高约3倍。
表1对大肠杆菌表达的ZS7脂蛋白OspA的纯化进行了概述。表1：OspA的纯化：
    不同步骤 缓冲液成分
    细胞破碎稀释/酸化StreamlineTM SP(阳离子交换)过滤除菌透滤Q-Sepharose FF(阴离子交换)SP-Sepharose FF(阳离子交换)Sephacryl S300HR(凝胶渗透)过滤除菌     TBDITSTCTQATQATSPCTHR
TBDI:25mM乙酸，pH4.8、4mM SB12
TSTC:25mM柠檬酸，pH6.0、0.25％SB12
TQA:25mM DEA,pH8.6
TSPC:25mM柠檬酸，pH5.7、0.1％Triton X
THR:Na2HPO4/K2HPO4 10mM、NaCl 150mM实施例2：脂蛋白OspA的纯化——方案Ⅱ：发酵：
如实施例1所述在大肠杆菌(AR58菌株)中表达全长OspA，其转化使用的是带有Borrelia garinii菌株ZQ1脂蛋白OspA(见WO93/04175)编码序列的pOA15，该编码序列受热诱导型pL启动子调控。在39.5℃+/-2.0℃下诱导约23小时。
利用管式离心机(Sharpless)将发酵肉汤澄清。从转筒中回收沉淀并冷冻于-70℃。该沉淀在做进一步处理前可于-70℃下保存12个月。
将细胞解冻并重悬于含有SB12去污剂的细胞裂解缓冲液中(10mMBisTris,pH 6.5,3％SB12)，使其OD650=60(由发酵末期的OD650计算出的理论值——相当于30g干重量/升)，室温(20-25℃)下搅拌2小时。
在发酵并进行细胞裂解后，将不纯溶液离心(17000×g,30分钟)并过滤(1.2μm，然后是0.45μm和0.2μm)以去除可能残留的大肠杆菌。纯化：
纯化是通过3个层析步骤来实现。优选的是将含有脂蛋白-OspA的不纯溶液离心并过滤，以去除所有残留的大肠杆菌。然后在存在Triton X-100的情况下将不纯溶液加载到阴离子交换(Q SepharoseFF或XL)柱上。脂蛋白OspA不与该柱结合，从而把流出物注到阳离子(SP Sepharose或CM Sepharose)柱中。将柱清洗，再洗脱脂蛋白-OspA并将其注到Sephacryl S300HR凝胶渗透柱中，以此来替换缓冲液并去除Triton X-100。将纯化的脂蛋白-OspA稀释至标准浓度，并过滤除菌(0.2μm)。后面的步骤将于下文做更详细的描述。
所有纯化步骤均在+2-+8℃的冷室中进行。阴离子交换——Q Sepharose：
用二乙醇胺缓冲液(含有25mM DEA,pH8.8、0.1％Triton X-100的TQA)将Q Sepharose FF(Pharmacia,Sweden)柱平衡。将不纯溶液加载到柱上，并收集流出物，包括TQA缓冲液的清洗步骤，至紫外信号返回基值。用乙酸将流出物的pH值调低至pH4.8。阳离子交换——SP Sepharose：
用TSPA缓冲液(25mM乙酸盐，pH4.8、0.1％Triton X-100)将SP Sepharose FF(Pharmacia,Sweden)柱平衡，然后将流出物和清洗组分上样。用2倍柱体积的相同TSPA缓冲液清洗柱子。用25mM柠檬酸、0.2M NaCl,pH4.8、0.1％Trition X-100将脂蛋白OspA洗脱。凝胶过滤——Sephacryl S300HR：
将SP Sepharose洗出液注射(最多9.5L)到Sephacryl S300HR(Pharmacia,Sweden)凝胶渗透柱上。使10mM PO4、150mM NaClpH6.8的缓冲液(THR)流经柱子。收集流出组分样品，并保存于+2-+8℃以用于在制过程控制分析，或保存于-70℃。根据HPLC的分析结果将脂蛋白OspA峰值组分合并。HPLC使用的是由200mL磷酸盐缓冲液pH7.6平衡的Zorbax GF450柱。流速为1mL/分钟，样品体积10μl，在210nm下测量光密度。当肩峰表面≤1.2％的脂蛋白-OspA峰值时开始合并；当脂蛋白-OspA的浓度＜400μg/mL时结束合并。过滤除菌：
用相同的THR缓冲液将包含脂蛋白OspA峰值的SephacrylS300HR合并组分稀释至浓度为1mg蛋白/mL(目标值)，并立即过滤除菌。
通过对0.2μm滤膜过滤将稀释的纯化脂蛋白OspA除菌。回收过滤后的样品并储存于+2-+8℃，以用于在制过程和QC分析。
无菌的纯化抗原在配制前储存于+2-+8℃。实施例3：脂蛋白-OspA的纯化——方案ⅡA：发酵：
如实施例1所述在大肠杆菌(AR58菌株)中表达全长OspA，其转化使用的是带有Borrelia afzelli菌株ACA-1脂蛋白OspA(见美国专利号5,777,095)编码序列的pOA15，该编码序列受热诱导型λpL启动子调控。在39.5℃+/-2.0℃下诱导约23小时。
利用管式离心机(Sharpless)将发酵肉汤澄清。从转筒中回收沉淀并冷冻于-70℃。该沉淀在做进一步处理前可于-70℃下保存12个月。
将细胞解冻并重悬于含有SB12去污剂的细胞裂解缓冲液中(10mMBisTris,pH6.5,3％SB12)，使其OD650=60(由发酵末期的OD650计算出的理论值——相当于30g干重量/升)，室温(20-25℃)下搅拌2小时。
在发酵并进行细胞裂解后，将不纯溶液离心(17000×g,30分钟)并过滤(1.2μm，然后是0.45μm和0.2μm)以去除可能残留的大肠杆菌。纯化：
如实施例2所述，纯化是通过3个层析步骤来实现，其中有某些微小的变动。阴离子交换——Q Sepharose：
用二乙醇胺缓冲液(含有25mM DEA,pH9.1、0.1％Triton X-100的TQA)将Q Sepharose XL(Pharmacia,Sweden)柱平衡。将不纯溶液加载到柱上，并收集流出物，包括TQA缓冲液的清洗步骤，至280nm下的紫外信号返回基值。用乙酸将流出物的pH值调低至pH4.8。阳离子交换——CM Sepharose：
用TSPA缓冲液(25mM乙酸盐，pH4.8、0.1％Triton X-100)将CM Sepharose FF(Pharmacia,Sweden)柱平衡，然后将流出物和清洗组分上样。用2倍柱体积的相同TSPA缓冲液清洗柱子。用50mM柠檬酸，pH6.2、0.1％Trition X-100将脂蛋白OspA洗脱。凝胶过滤——Sephacryl S300HR：
将CM Sepharose洗出液注射(最多9.5L)到Sephacryl S300HR(Pharmacia,Sweden)凝胶渗透柱上。使10mM PO4、150mM NaClpH6.8的缓冲液(THR)流经柱子。收集流出组分样品，并保存于+2-+8℃以用于在制过程控制分析，或保存于-70℃。根据HPLC的分析结果将脂蛋白OspA峰值组分合并。HPLC使用的是由200mL磷酸盐缓冲液pH7.6平衡的Zorbax GF450柱。流速为1mL/分钟，样品体积10μl。在210nm下测量光密度。当肩峰表面≤1.2％的脂蛋白-OspA峰值时开始合并；当脂蛋白-OspA的浓度＜400μg/mL时结束合并。过滤除菌：
用相同的THR缓冲液将包含脂蛋白-OspA峰值的SephacrylS300HR合并组分稀释至浓度为1mg蛋白/mL(目标值)，并立即过滤除菌。
通过对0.2μm滤膜过滤将稀释的纯化脂蛋白OspA除菌。回收过滤后的样品并储存于+2-+8℃，以用于在制过程和QC分析。
无菌的纯化抗原在配制前储存于+2-+8℃。
利用方案Ⅱ也曾从狭义博氏疏螺旋体ZS7菌株中纯化出脂蛋白OspA。
实施例4：杂质分析：4.1．E.利用ELISA和蛋白印记方法分析大肠杆菌杂质：
多克隆抗体的制备和使用方法如下所述。4.1.1．抗大肠杆菌多克隆抗体的产生：
产生抗体使用的是经过热诱导的野生型大肠杆菌亲本AR58菌株的粗提物。该菌株不含编码脂-OspA的质粒。用100μg与弗氏完全佐剂混合的粗提物对三只新西兰大白兔进行皮下注射。通过3次注射，即在第21天注射100μg与弗氏不完全佐剂(IFA)混合的抗原、在第42天注射100μg溶于PBS(磷酸盐缓冲液)的抗原和在第109天注射100□g与IFA混合的抗原，对动物进行促升。于第123天(最后一次促升后14天)分别收集个体的免疫血清，并通过蛋白印记(WB)进行测试。这些血清显示出的识别模式为200-20kDa的约20条不同的带。由于3批免疫血清之间显示出轻微的差异，因此将3批血清合并以优化识别模式。将该合并血清用于蛋白印记分析。通过对蛋白A琼脂糖柱(p-Rb-IgG)的亲和层析将部分抗大肠杆菌特异抗体纯化，并利用SDS-PAGE进行检定，以确定其中不含有兔血清白蛋白杂质。利用标准方法(Amersham试剂盒)将小部分纯化抗体标记上生物素(生物素标记的p-Rb-IgG)，并以1/200的稀释度用于ELISA测定。4.1.2．抗大肠杆菌多克隆抗体的鉴定：
利用WB和SDS-PAGE分析方法对纯化多克隆抗体(p-Rb-IgG)做进一步鉴定。为了测定可能的交叉反应，而将大肠杆菌蛋白提取物的特异性多克隆抗体和抗lipo-OspA(LA-2和LA-31，见美国专利号5,780,030)的单克隆抗体对大肠杆菌蛋白提取物(EPE)、疫苗抗原(lipo-OspA)和lipo-OspA与EPE的混合物的抗性情况均进行了测试。
该多克隆抗体确实对大肠杆菌蛋白具有特异性，并且在EPE与lipo-OspA混合或不混合的情况下显示出相似的识别模式，这表明lipo-OspA不会对大肠杆菌蛋白的检测造成干扰。因此，利用该兔抗大肠杆菌多克隆抗体可特异检测出大肠杆菌蛋白。4.1.3．蛋白印记分析：
通过蛋白印记分析对来源于宿主细胞的蛋白水平进行定性评定。在存在β-巯基乙醇的情况下将蛋白样品还原，并置SDS样品缓冲液中变性，再以20g/泳道上样于12.5％的SDS-PAGE凝胶中。同时将一系列稀释度的EPE(20、10、5和1g/道)上样。电泳完毕后，利用转移缓冲液(Tris 0.025M,pH8.3、甘氨酸0.192M并含有20％甲醇和0.1％SDS)将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。然后把膜置于孵育缓冲液(含有0.1％吐温20的PBS)中阻断，并在加有稀释了250倍的抗大肠杆菌多克隆抗血清的孵育缓冲液中保温1小时。所有步骤均于室温下在摇动平台上进行。膜与抗体保温后，将其置孵育缓冲液中清洗3次(每次5分钟)，然后与1/500稀释于孵育缓冲液的生物素标记的种特异性驴抗兔全抗体共保温1小时。将膜清洗，然后加入抗生蛋白链菌素-生物素标记的辣根过氧化物酶试剂(1/1000稀释于孵育缓冲液)，通过加入4-氯-l-萘酚/甲醇/H2O2溶液使抗原-抗体复合物显色，加入水使该反应终止。4.1.4．ELISA测定：
利用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法对来源于宿主细胞的样品中的蛋白水平进行定量评定。
在37℃下用溶于碳酸氢盐缓冲液(pH=9.6)的纯化兔抗大肠杆菌IgG组分(p-Rb-IgG)将微量滴定板包被2小时。在不同步骤之间均用含有0.1％吐温20的PBS清洗滴定板。用溶于PBS的1％BSA(牛血清白蛋白)阻断滴定板。将测试样品(或对照样品)逐次稀释(于含有0.2％BSA的PBS)，并在37℃下保温90分钟。然后在37℃下将滴定板与稀释的生物素标记p-Rb-IgG保温1小时。每孔中加入抗生蛋白链菌素-生物素标记的过氧化物酶试剂(溶于0.2％BSA-PBS),并将滴定板于室温下保温30分钟。然后加入底物(TMB=3,3’,5,5’-四甲联苯胺)溶液将抗体-抗原复合物显色，再加入H2SO4以终止反应。在405nm下测定吸光度。
相对于由4参数逻辑方程(Karpinski KF et al.,1987,J.Immunology Methods 103∶189)建立的EPE参照曲线计算出样品中的大肠杆菌浓度。上下渐进OD值部分则使用一种20％-80％的计算程序(SOFTmaxPRO)。所有样品都是从200μg蛋白/ml(由Lowry测定法确定)开始进行2倍稀释。计算出由不同稀释度获得的浓度的平均值，其中考虑到所有OD值都属于参照曲线的线性部分(20％-80％的截至值)。结果亦利用线性回归方法进行了证实。
已知ELISA测定法的检测极限(空白样品〔含有0.2％BSA的PBS〕的平均OD450+3标准偏差)为50ng大肠杆菌蛋白提取物/ml。假设样品是在200g/ml(第一次稀释)这一最高浓度下进行测试，那么可被检测的最低大肠杆菌蛋白水平为总蛋白含量的0.025％。4.1.5结论：
根据上述实验，蛋白印记分析和ELISA测定的结果表明，在实施例1的SPC(SP Sepharose FF(阳离子交换)柱)步骤之后几乎完全将大肠杆菌蛋白杂质从发酵产物中去除。根据ELISA的结果，估计残留的大肠杆菌杂质少于0.025％。该纯化方法具有可重复性，由20L规模和75L规模获得的结果均证明了这一点。实施例2和3也得到类似的结果。4.2．DNA定量：4.2.1：
对不同样品进行DNA定量所使用的方法均为ThresholdTM系统(Molecular Devices Corp.)。该系统包括一个半自动工作站、一台读出器、一台个人电脑、软件、进行DNA测定所需的所有试剂和可置换件以及一套进行测试的方法。
DNA检测是以蛋白酶K处理并经热变性后获得的单链DNA的识别为基础，它是通过用抗生蛋白链菌素进行夹层测定中所使用的两种DNA结合蛋白来实现。其中一种蛋白，来源于大肠杆菌的单链DNA结合蛋白(SSB)，与生物素相结合，可将DNA复合物特异性捕获到膜上，另一蛋白则是与脲酶结合的一种抗DNA单克隆抗体，用于产生信号。
这两种蛋白与单链DNA均有很高的亲和力，但序列特异性很低，并且能够与DNA和抗生蛋白链菌素形成一种抗生蛋白链菌素-生物素-SSB-DNA-抗体-脲酶复合物。
该复合物能够在真空下通过过滤作用被捕获到生物素标记的膜上。未结合的试剂则可通过清洗而去除。
由于被捕获的脲酶的量与DNA的量成正比，因此可利用脲酶活性来将DNA定量。脲转变成氨和二氧化碳的速率可利用对pH敏感的半导体来测定。
样品中的DNA量可相对于2pg-200pg的小牛胸腺DNA校准器来进行测定。因此，可确定的最小量为2pg。4.2.2样品处理：
于55℃下用蛋白酶K(0.1mg/ml)和SDS(0.1％)将终体积500μl的各测试样品处理16小时，然后于100℃下变性20分钟，并根据厂商说明对反应进行标记。
为了对预处理进行验证并监控与样品相关的所有抑制作用而进行峰值回收测试，方法是在各样品中加入50pg外源DNA(根据厂商说明)，并与含有50pg小牛胸腺DNA的对照样品进行比较，以证明回收量。
峰值样品中的DNA回收量采用以下公式进行计算：
回收百分率=(样品峰值信号-样品信号)/(缓冲液峰值信号-缓冲液信号)×100
对一个有效的测试而言，峰值样品的DNA回收量必须为80-120％。4.2.3．结果：
Q-Sepharose柱是DNA取出中最有效的处理步骤。
在实施例1的纯化OspA样品中，100μl未稀释样品中的DNA残留量接近于系统的检测极限(2pg)。把大批量纯化样品的蛋白浓度(约1mg/ml)考虑在内，则相当于每100μg抗原含2pg。因而相当于30μg剂量lipo-OspA疫苗中的DNA浓度小于2pg。利用实施例2和3的样品亦得到类似结果。4.3 lipo-OspA纯化方法的SB12清除率评定：纯化蛋白中的SB12残留水平：4.3.1．前言：
大肠杆菌细胞的lipo-OspA提取物使用一种含有N-十二烷基-N,N-二甲基-3-氨基(ammonio)-1-丙磺酸酯(月桂基sulfobetain或SB12)的缓冲液。在细胞提取物中加入3％(w/v)的该去污剂可保持lipo-OspA的可溶性，以便于随后的纯化步骤。
通过实验来评定不同纯化步骤对产品中SB12的清除程度，并确定大批量纯化产品阶段的SB12残留量。4.3.2．测定SB12的分析方法：4.3.2.1．方法的原理：
通过C18柱的反相HPLC将SB12与缓冲液组分(磷酸盐)分离，并将洗出液注入ESMS(电喷射质谱仪)。利用SIM(单离子监测)于m/z336下检测物质的SB12分子离子。4.3.2.2.实验条件：
带有Applied Biosystems 140溶剂输送系统的HPLC系统、VydacC18柱(250×2.1mm)、ESMS和214nm下的Applied Biosystems 759A吸光度检测器。按90/10的比率将柱洗出液分离：10％用于ESMS,90％用于紫外检测器。柱后安装有旁通系统，以去除含盐的注射峰。使用该系统可提高此方法的可重复性，并可避免供应源的堵塞。流动相(流速为200l/分钟)含有74∶10的甲醇∶水，并含有0.1％的三氟乙酸。注射量为20μl。
ESMS(VG Platform II,Micromass)的实施采用阳离子方式(ES+)，并且将SB12分子离子(m/z336)作为单离子进行监控，以取代尽可能最高的敏感性。ESMS的调节参数如下：离子源：毛细管3.5kV,HV透镜0.5kV，锥体45V，离子源温度60-120℃MS：离子能量1V,LM分辨率10,HM分辨率10，放大器650VSIR：平均质量336，停留时间0.2秒，通道间延搁0.02秒质量标度的校准使用NaI簇。4.3.2.3．标准曲线：
用含有10ppm SB12的储液稀释成浓度为5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.100、0.05、0.025和0.01ppm。标准曲线的数据列于表2。表2：由ESMS获得的SB12校准曲线数据：
浓度(ppm)    平均面积(n=3)     SD  RSD(％)
    10.0     2384603.7  236593.3     9.9
    5.0     1186395.3  2381 5.5     2.0
    2.5     509954.0  11285.7     2.2
    1.0    278388(n=1)     n=1     n=1
    0.500     110229.0     8318.0     7.5
    0.250     62111.7     3797.4     6.1
    0.100     32615.3     2518.6     7.7
    0.050     12902.7     1627.6     12.6
    0.025     591 5.7     1066.5     18.0
    0.01     1736.3     477.5     27.5
4.3.2.4．样品制备：
在可能的情况下将不加稀释的样品注射，这样可获得尽可能最高的敏感性。在该纯化过程的第一步中SB12的浓度较高，进行适当的稀释(1000×、100×或10×)是为了获得处在校准曲线范围内的应答。4.3.3．利用该纯化方法对SB12的去除进行估价：
对纯化过程中不同批次产物的不同样品进行SB12含量分析。表3显示由纯化过程的不同阶段的75L序批产物获得的结果。表3：不同纯化步骤的SB12浓度(ppm)：75L批量：
纯化阶段 OPA113批次 OPA114批次 OPA115批次
    BZ5S     28102     29683     35759
    STC     31 53     2680     4120
    RD     100     60     90
    QFT     29     21     31
    SPC     ＜0.025     0.07     0.06
由表可见，75L与20L批次的相同纯化阶段的SB12浓度相一致。SP-Sepharose步骤以后的SB12水平低于100ppb(0.1ppm)。
除Q-Sepharose步骤(该步骤中SB12未去除)之外，其余所有步骤的清除率均在90％以上。该步骤的浓度较低仅仅是由于处理体积较大(稀释作用)。
图1以图表方式说明了不同纯化步骤对SB12浓度降低的作用。研究的75L和20L批次的所有产品的清除率均保持一致。4.3.4结论：
通过使用一种极为敏感并且精确的检测SB12的方法，说明大批量纯化lipo-OspA中的SB12残留水平低于10ppb。对20L和75L生产规模的不同纯化阶段产物的分析结果表明，该纯化方法可一贯地将SB12从初始提取物中清除。4.4利用比色法确定Triton X-100的含量：4.4.1．前言：
该部分叙述确认实验的结果，以证实大批量纯化lipo-OspA中Triton含量的测定结果。
比色方法如下所述：4.4.2分析方法：
该方法以Huddleston,R.L.和Allred,R.C.发表的出版物(J.Am.Oil Chemist Soc.,1965,42,983)为基础。
该测定所基于的方法也可用于非离子型表面活性剂的检测。表面活性剂能够与硫氰酸钴复合。可利用二氯乙烯抽提着色的复合物，并在320nm下测量吸光度。试剂和标准溶液：1．试剂：
二氯乙烯、6 H2O合硝酸钴、硫氰酸铵、98％甲酸。2．硫氰酸钴试剂：
将12.7g硫氰酸铵和2.0g六水合硝酸钴溶于100ml纯水中并充分混匀。3．标准溶液：
在100ml容量瓶中精确称量100mg Triton X100。用二氯乙烯溶解并定容。方法：A．标定：
制备一系列将Triton X100以0、2.5、5、10、15、20、25、30和40g/ml的浓度溶于二氯乙烯的标准溶液。在每1ml的各标准溶液中加入100l甲酸和1ml硫氰酸钴试剂。充分混合约20分钟。
在约5000rpm下离心约15分钟，取出上层(水性)部分并抛弃。将下层(二氯乙烯)部分置微量比色池中测定320nm下的吸光度。
将浓度(Triton X100的g/ml数)对吸光度(校准曲线)作图。B．样品处理：
将1ml样品转移到试管中，一式两份，并在Savant Speed Vac浓缩仪中脱水干燥。
在残留物中加入100μl甲酸和1ml二氯乙烯。通过超声使残留物悬浮。在1号管中加入1ml硫氰酸钴试剂(测试管)。在2号管中加入1ml纯水(空白管)。充分混合约20分钟。
在约5000rpm下离心约15分钟，取出上层(水性)部分并抛弃。将下层(二氯乙烯)部分置微量比色池中测定320nm下的吸光度。
计算测试管O.D.值与空白管O.D.值之间的差。由校准曲线确定样品的Triton含量。检测极限：
2μg/ml。4.4.3．分析方法的确认：4.4.3.1．检测极限(LOD)：
根据校准曲线进行计算
校准曲线已在不同的4天里(每天做3-5次重复稀释)确定出来。确定每天所得回归线的y轴截距的平均值和标准偏差(SD)，并计算出平均值+3 SD。根据每天的平均值和该天的平均校准曲线计算出LOD。这4天的结果均列于表4。这4天所获得的结果的平均值为1.8μg/ml。4.4.3.2根据标准偏差和斜率进行计算：LOD=3.3 SD/SSD=y轴截距的标准偏差S=平均校准曲线的斜率
这4天所获得的结果列于表4。由该表可看出，这4个值的平均值为1.9μg/ml，非常接近于由4.4.3.1．的方法所获得的值。
根据这些实验结果，可断定LOD为2μg/ml。4.4.3.3定量极限(LOQ)：定量极限可根据4.4.3.1．所述实验获得的结果计算得出。LOQ=10 SD/S1SD=y轴截距的标准偏差S=平均校准曲线的斜率
结果分别列于表4。由该表可断定LOQ为6μg/ml。表4：检测极限和定量极限：
    天1234平均     检测极限(ug/ml)    定量极限(ug/ml)
    均值+3 SD(y-intercept)231.311.8  LOD=3.3 SD/S2.33.41.30.71.9  LOQ=10 SD/S6.810.342.25.8
4.4.3.4线性度和范围：
为了评定比色法的线性度，并以精密而又准确的方式测定Triton含量的浓度范围，而在每毫升0-40μg Triton的范围上建立了3条校准曲线。并利用线性回归对这些数据进行分析。
可以断定，在测试的浓度范围内(0-40μg/ml)，比色法呈线性，并且精密而又准确。假设LOQ为6μg/ml，那么可获得精密而又准确的结果的范围为6-40μg/ml。所含Triton浓度在40μg/ml以上的样品则应稀释后再进行重复测试。4.4.3.5特异性：
由于无法获得不含Triton的完全“纯净的”lipo-OspA，因此通过检验是否产物中存在该物质会影响其测定的方法不能对该测定方法的特异性进行验证。但是，如前所述，通过在各样品分析中减去由空白样品(不含钴试剂的样品)获得的结果而将大批量产物中在相同波长(320nm)下具有吸收的所有干扰成分均考虑在内。
由两种不同浓度的峰值获得的回收率均很理想，这也表明除Triton以外的其它成分均不造成重大干扰。4.4.3.6结论：
根据以上数据可以断定，用于测定大批量lipo-OspA中的Triton的该测试方法适用于其预期用途：测定大批量lipo-OspA中的残留Triton，其规格极限最大为10μg/ml。
比色法可在6-40μg/ml的范围内给出精密而又准确的结果。应该指出的是，两次测定的最终实验结果之间有所不同，因此该值可公布为低于6μg/mL。检测极限为2μg/mL。通过使用空白而消除了可在320nm下具有吸收的样品成分所造成的所有干扰。Triton-钴复合物的颜色至少在2小时内可保持稳定。实施例5：脂蛋白OspA的特性：内毒素：利用显色LAL方法进行常规测试：
利用规格≤5EU每30μg的显色LAL(鲎变形细胞裂解物)试验对纯化OspA抗原进行内毒素含量的常规测试。该试验是根据《FDA有关人类与动物医疗品及生物制剂的动力学LAL技术暂行指南》来实施并验证，该技术指南在《用于人类和动物非肠道药物、生物制剂及医疗设备的终产物内毒素试验的鲎变形细胞裂解物试验验证准则(1987年12月)》中有所描述。Triton X-100：利用比色法进行常规测试：
由于在纯化过程的中间步骤(Q-Sepharose柱之前)加入了TritonX-100，因此利用比色法对其在大批量纯化抗原中的含量进行常规测试。1mg/ml脂蛋白OspA溶液中的Triton X-100的量不高于10μg/ml(10ppm或更低)。以30μg剂量的OspA而言，终产物中的残留量低于300ng/剂(接受标准为低于10g/ml)。
对Triton毒性研究进行文献检索未见有肌肉毒性的研究。据报导小鼠在Triton X-100静脉内给药后的LD50为1200mg/kg。大肠杆菌杂质：利用ELISA和蛋白印记方法进行清除率研究：
利用两种分析技术进行清除率研究，以评定该纯化方法对大肠杆菌杂质的去除效率。蛋白印记和ELISA试验的结果表明，该纯化方法可一贯地去除杂质蛋白，并且在该纯化过程结束时只残留有极少量的大肠杆菌杂质。利用ELISA试验可估计出大肠杆菌蛋白的残留量(＜0.025％)。DNA：利用阀值法进行清除率研究：
针对大肠杆菌杂质，通过一项研究来评定不同纯化步骤的DNA清除率，并确定大批量纯化抗原中的DNA残留量。可以断定，利用该纯化方法可有效并一贯地将DNA去除(减少量约为5个log)。DNA的残留量非常低，使得每30μg剂量(OspA)疫苗中的DNA少于2pg。该数值大大低于WHO咨询委员会的推荐水平，即100pg细胞DNA/剂(WHO技术报告丛书，747,1987)。SB12：利用HPLC-ESMS方法进行清除率研究：
该清除率研究的结果表明，该纯化方法可一贯地将SB12从所得流体中清除(清除系数约为7个log)，使得纯化产品中的SB12少于10ppb。该数值远远低于参考文献中描述的不具有毒理学作用的值(37.5μg/ml)〔Speijers et al.，疫苗，7∶364,1989；Speijerset al.，疫苗，6∶419,1988；Ernst and Arditti，毒理学，15:233,1980〕。实施例6：脂蛋白OspA的纯度和稳定性：SDS-PAGE：
利用SDS-PAGE对若干批次(2×75L,3×20L)的ZS7 OspA进行了分析。各批次的分析结果均显示出一条表观分子量为31kD的主要条带。仅检测到单一的主要条带可表明OspA的纯度和同质性。将75L批次的样品于37℃下保温1周，该处理没有对其SDS-PAGE模式造成影响，这表明了该蛋白的稳定性。利用来源于ZQ1和ACA1菌株的OspA获得了类似的结果，但来源于这两种菌株的OspA蛋白的表观分子量为30kD。另外这两种蛋白在60kD处还观测到了一条较小的二聚体条带。蛋白印记：
用单克隆抗体LA2，一种OspA特异性抗体，通过蛋白印记方法对若干批次(2×75L,2×20L)的ZS7 OspA进行了分析。各批次的分析结果均显示出一条表观分子量为31kD的主要条带。仅出现单一的主要条带可表明OspA的纯度和同质性。将75L批次的样品于37℃下保温1周，该处理没有对其蛋白印记模式造成影响。N端序列分析：
对储存于4℃并已在37℃下保温7天的2批20L和2批75L来源于ZS7菌株的OspA以及3批来源于ACA-1菌株的OspA进行了N端序列分析。未修饰脂蛋白OspA(即带有信号序列的原脂蛋白)的N端序列的检测信号非常微弱。另外也检测出非脂化OspA的序列，但其水平非常低。利用该技术得出的结果是未修饰OspA和非脂化(不完全修饰)OspA的水平非常低(即少于总量的1％)，并且未发现产物的裂解片段和其它蛋白杂质，这证明了OspA的高纯净度。由所有批次获得的数据均一致，这进一步支持了该纯化方法的连贯性和同质性。激光散射分析：
激光散射检测器可测量大分子溶液的15度角散射光的强度。由这些强度可测定溶液中大分子的大小和形状。将检测器与洗出脂蛋白的HPLC分子排阻柱相连接。通过在线安装一台干涉折光仪可测量洗脱的脂蛋白量。把所有种类的重量乘以其各自分子量的总和除以所有种类的总重量定义为平均分子量(Mw)。
将2批75L来源于ZS7菌株的OspA在37℃保温7天前和保温7天后分别进行测试，计算出的平均分子量均约为500kD(411-581kD)。由3批来源于ACA-1的OspA计算出的平均分子量均为约450kD。37℃保温0和7天的样品之间没有明显的区别。
另外还对已于4℃储存12个月的3批来源于ZS7菌株的脂蛋白OspA做了进一步的研究。储存12个月后的主要OspA的分子量为450-550kD，这表明了OspA微团结构的稳定性。质谱测定法：
通过电喷射电离作用(PlatformⅡ设备)对已于4℃储存12个月的3批脂蛋白OspA(来源于ZS7菌株)的分子质量进行了测定。主峰的平均分子量为28523.13+/-0.52道尔顿，这与28523.1道尔顿的预期值非常吻合。另外在28284.81+/-1.32道尔顿位置还有一较小的峰，它相应于失去了一条棕榈酰脂链。于4℃储存1年后，未观测到相对于其它降解产物的其它质量，这表明了OspA的稳定性。脂含量测定：
在碱解后利用气相色谱法测定已于4℃储存1年的3批脂蛋白OspA(ZS7菌株)的脂含量。将释放的脂肪酸进行甲醇酸解，然后将其作为FAME(脂肪酸甲酯)进行分析。数据分析使用的是配有HP7673自动注射器和HP3365 chemstation模块的HP5890系列Ⅱ型气相色谱仪。计算4℃储存1年前和储存1年后的脂与蛋白的比率。在实验误差范围内，碱解使0和1年的脂蛋白OspA均释放出2条脂链。这与脂蛋白OspA的脂链连接有2分子酯的预测相一致。附加稳定性研究：
对0、6、12和24个月(2-8℃下)的2批临床样品进行SDS-PAGE、蛋白印记、在Balb/C小鼠中的体内效能(12月时的相对效能为90％或更高，0与24个月样品之间的相对效能为80％或更高)等测试。结论是OspA的稳定性可于2-8℃下保持多达2年。
该说明书引用的所有出版物，其中包括但不局限于专利和专利申请，在此均引入作为参考，如同各出版物分别特定指出可被完全引入作为参考。

Claims (20)

1．一种纯化疏螺旋体脂蛋白OspA的方法，该方法包括：
(a)将表达脂蛋白OspA的宿主细胞于存在两性离子去污剂的情况下裂解，以形成含有脂蛋白OspA的不纯溶液；
(b)使不纯溶液澄清，以去除宿主细胞碎片；
(c)于存在非离子去污剂的情况下将该不纯溶液与阴离子交换树脂接触；
(d)收集该阴离子交换树脂的流出物并将该流出物与阳离子交换树脂接触；以及
(e)实施凝胶过滤步骤洗脱OspA，
其中该纯化方法的实施无需加热。
2．权利要求1的方法，其中步骤a、b和c包括：
(ⅰ)于存在两性离子去污剂的情况下将细胞破碎，以形成含有OspA的不纯溶液；
(ⅱ)将该不纯溶液与流化床树脂接触，该树脂含有阳离子交换树脂；
(ⅲ)将OspA从该树脂上洗脱并将洗出液透滤，借此将OspA滞留；以及
(ⅳ)于存在非离子去污剂的情况下将滞留物与阴离子交换树脂接触。
3．权利要求1的方法，其中不纯溶液的澄清方法包括离心。
4．权利要求1的方法，其中非离子去污剂为一种聚氧乙烯醚。
5．权利要求4的方法，其中聚氧乙烯醚为Triton X-100或Triton X-114。
6．权利要求4的方法，其中聚氧乙烯醚为Triton X-100。
7．权利要求1的方法，其中非离子去污剂为一种聚氧乙烯山梨糖醇酯。
8．权利要求7的方法，其中聚氧乙烯山梨糖醇酯为吐温20至吐温80。
9．权利要求1的方法，其中纯化OspA蛋白在1mg/ml的浓度下包含的非离子去污剂少于1000ppm(0.1％)。
10．权利要求9的方法，其中纯化OspA蛋白包含的非离子去污剂少于100ppm。
11．权利要求10的方法，其中纯化OspA蛋白包含的非离子去污剂少于10ppm。
12．权利要求1的方法，其中两性离子去污剂为一种N-烷基-N,N-二甲胺基-1-丙磺酸酯。
13．权利要求12的方法，其中N-烷基-N,N-二甲胺基-1-丙磺酸酯为SB8-SB18。
14．权利要求12的方法，其中N-烷基-N,N-二甲胺基-1-丙磺酸酯为SB12。
15．权利要求1的方法，其中纯化OspA蛋白在1mg/ml的浓度下包含的所述两性离子去污剂少于1000ppb(1ppm)。
16．权利要求15的方法，其中纯化OspA蛋白包含的所述两性离子去污剂少于100ppb(0.1ppm)。
17．权利要求16的方法，其中纯化OspA蛋白包含的所述两性离子去污剂少于10ppb(0.01ppm)。
18．权利要求1的方法，其中该方法在凝胶过滤后额外包括过滤除菌。
19．不含去污剂的纯化脂蛋白OspA。
20．权利要求19的OspA，该OspA适于人类临床应用。
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