ES2561588T3 - Péptidos derivados del alérgeno principal de ambrosía (Ambrosia artemisiifolia) y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Formulación de vacuna que comprende un péptido que consiste en SEQ ID No. 52.

Description

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DESCRIPCIÓN

Péptidos derivados del alérgeno principal de ambrosía (Ambrosia artemisiifolia) y usos de los mismos La presente invención se refiere a péptidos derivados de Amb a 1.

Ambrosía (Ambrosia artemisiifolia) y la artemisa (Artemisia vulgaris) son malas hierbas alergénicas importantes que pertenecen a la familia de plantas Asteraceae o Compositae. El polen de artemisa es una de las principales causas de reacciones alérgicas a finales del verano y otoño en Europa y afecta a aproximadamente el 10-14% de los pacientes que padecen polinosis. El polen de ambrosía representa la fuente principal de proteína alergénica en los Estados Unidos, con una prevalencia de aproximadamente el 50% en individuos atópicos 27.10. En Europa, la alergia a ambrosía está aumentando en la actualidad rápidamente, en particular en determinadas zonas de Francia, Italia, Austria, Hungría, Croacia y Bulgaria. Amb a 1, el alérgeno principal de ambrosía y Art v 1, el alérgeno principal de artemisa, respectivamente, son proteínas no relacionadas. Amb a 1 es una proteína no glicosilada de 38 kDa ácida. Amb a 1 natural experimenta proteólisis durante la purificación y se escinde dando dos cadenas designadas como cadena alfa y beta. Se notificó que la cadena alfa de 26-kDa se asociaba de manera no covalente con la cadena beta de 12-kDa (King et al. Immunochem 11:83-92, 1974). La forma de dos cadenas de Amb a 1 parece ser indistinguible inmunológicamente de la molécula de longitud completa (King et al. Arch Biochem Biophys 212:127- 135, 1981).

Amb a 1 natural (nAmb a 1) de ambrosía fue el primer alérgeno descrito y aislado (King et al. Biochem 3:458-468, 1964). El ADNc que codifica para Amb a 1 se aisló de polen de ambrosía en 1991 por Rafnar et al. (J. Biol. Chem. 266:1229-1236). Pero hasta ahora, no se ha notificado ningún método para expresar y purificar grandes cantidades de Amb a 1 recombinante (rAmb a 1).activa y correctamente plegada

El documento WO 96/13589 se refiere a péptidos aislados que se derivan de Amb a 1 y comprenden al menos un

epítopo de células T.

En el documento WO 90/11293 se describe la secuencia de aminoácidos de Amb a 1. En el mismo, también se han identificado péptidos de Amb a 1 que comprenden epítopos de células T y que pueden desencadenar una respuesta ¡nmunitaria específica de ambrosia.

El documento WO 99/34826 se refiere a métodos y medios para la desensibilización de pacientes mediante la administración de un péptido derivado de un alérgeno, péptido que puede desencadenar una respuesta de células T en un individuo.

En Michael J.G. et al. (J.Br.Soc.Aller.Clin.lmmunol. 20(6) (1990):669-674) se ha examinado la respuesta de células T de péptidos que se obtienen mediante una digestión por proteasas de Amb a 1.

Cardinale E.J. et al. (J.AIIer.Clin.lmmunol. 107(2001 ):pág. 19) se refiere al uso de espectrometría de masas MALDI- TOF para identificar y caracterizar alérgenos.

El documento US 6.335.019 se refiere, entre otros, a péptidos de Amb a 1 que pueden provocar una respuesta de células T contra Amb a 1 en un individuo. Griffith et al. (Int.Arch.Aller.Appl.lmmunol. 96(1991 ):296-304) se refiere a los polimorfismos de secuencia de los miembros de la familia Amb a 1 y Amb a 2.

Un objeto de la presente invención es proporcionar péptidos y moléculas derivados del alérgeno de polen de ambrosía Amb a 1 que pueden emplearse en el tratamiento, la prevención o el diagnóstico de alergias, en particular alergias provocadas por alérgenos de polen de ambrosía.

Por tanto, la presente invención se refiere a formulaciones de vacuna, péptidos, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, vectores y usos de los mismos tal como se define en las reivindicaciones.

Los péptidos derivados del alérgeno de polen de ambrosía Amb a 1, en particular de Amb a 1.3, pueden consistir en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 48,

SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 61,

SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78, SEQ ID No. 79, SEQ ID No. 80,

SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 83, SEQ ID No. 86, SEQ ID No. 87, SEQ ID No. 88, SEQ ID No. 89, SEQ ID No. 90,

SEQ ID No. 91, SEQ ID No. 93, SEQ ID No. 94, SEQ ID No. 96, SEQ ID No. 97, SEQ ID No. 98, SEQ ID No. 99,

SEQ ID No. 100, SEQ ID No. 101, SEQ ID No. 102, SEQ ID No. 107, SEQ ID No. 108, SEQ ID No. 109, SEQ ID No. 110, SEQ ID No. 111, SEQ ID No. 112, SEQ ID No. 114, SEQ ID No. 115, SEQ ID No. 118, SEQ ID No. 119, SEQ ID No. 120, SEQ ID No. 121, SEQ ID No. 122, SEQ ID No. 123, SEQ ID No. 124, SEQ ID No. 125, SEQ ID No. 126, SEQ ID No. 127, SEQ ID No. 128, SEQ ID No. 129, SEQ ID No. 130, SEQ ID No. 131, SEQ ID No. 132, SEQ ID No. 133, SEQ ID No. 134, SEQ ID No. 135, SEQ ID No. 136, SEQ ID No. 137, SEQ ID No. 138 y SEQ ID No. 139.

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Resultó que los péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 59,

SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78,

SEQ ID No. 79, SEQ ID No. 80, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 83, SEQ ID No. 86, SEQ ID No. 87, SEQ ID No. 88,

SEQ ID No. 89, SEQ ID No. 90, SEQ ID No. 91, SEQ ID No. 93, SEQ ID No. 94, SEQ ID No. 96, SEQ ID No. 97,

SEQ ID No. 98, SEQ ID No. 99, SEQ ID No. 100, SEQ ID No. 101, SEQ ID No. 102, SEQ ID No. 107, SEQ ID No. 108, SEQ ID No. 109, SEQ ID No. 110, SEQ ID No. 111, SEQ ID No. 112, SEQ ID No. 114, SEQ ID No. 115, SEQ ID No. 118, SEQ ID No. 119, SEQ ID No. 120, SEQ ID No. 121, SEQ ID No. 122, SEQ ID No. 123, SEQ ID No. 124, SEQ ID No. 125, SEQ ID No. 126, SEQ ID No. 127, SEQ ID No. 128, SEQ ID No. 129, SEQ ID No. 130, SEQ ID No. 131, SEQ ID No. 132, SEQ ID No. 133, SEQ ID No. 134, SEQ ID No. 135, SEQ ID No. 136, SEQ ID No. 137, SEQ ID No. 138 y SEQ ID No. 139, muestran reactividad con células T aisladas de individuos alérgicos y, en consecuencia, pueden emplearse en la producción de vacunas, especialmente vacunas para alergias provocadas por alérgenos de polen de ambrosía y alergias que reaccionan de manera cruzada con alérgenos de polen de ambrosía. En particular los péptidos que tienen SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 86, SEQ ID No. 91 y SEQ ID No. 126 a SEQ ID No. 139 muestran alta reactividad de células T con muestras obtenidas de individuos que padecen alergia al polen de ambrosía.

Una ventaja adicional de los péptidos de la presente invención es que todos ellos carecen de actividad de unión a IgE. Por tanto, las moléculas que comprenden estos péptidos no provocan reacciones alérgicas (por ejemplo aumento de la liberación de histamina) cuando se administran a un individuo.

Para fines terapéuticos, los péptidos derivados de los alérgenos no se unen a IgE específica para Amb a 1 o se unen a tal IgE en un grado sustancialmente menor (por ejemplo al menos 100 veces menos y más preferiblemente al menos 1000 veces menos de unión) que el correspondiente Amb a 1 nativo purificado o la cadena beta de Amb a 1 producida de manera recombinante. Si un péptido de la invención va a usarse como reactivo de diagnóstico, no es necesario que el péptido o la proteína tenga actividad de unión a IgE reducida en comparación con el alérgeno Amb a 1 nativo. La actividad de unión a IgE de los péptidos puede determinarse, por ejemplo, mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) usando, por ejemplo, sueros obtenidos de un individuo (es decir un individuo alérgico) que se ha expuesto previamente al Amb a 1 nativo. En resumen, los pocilios de una placa de microtitulación se recubren con un péptido que va a someterse a prueba. Tras lavar y bloquear los pocilios, se incuba en los pocilios una disolución de anticuerpo que consiste en el suero o plasma de un individuo alérgico que se ha expuesto al péptido que está sometiéndose a prueba o a la proteína de la que se derivó. Generalmente se agota la IgG del plasma antes de la incubación. Sin embargo, el agotamiento no es necesario si se usan anticuerpos anti-lgE altamente específicos. Además, los individuos alérgicos que no se han sometido a immunoterapia específica en algunos casos casi no tienen anticuerpos IgG detectables específicos para el alérgeno en cuestión. Se añade un anticuerpo secundario marcado a los pocilios y se incuba. Se cuantifica entonces la cantidad de unión a IgE y se compara con la cantidad de IgE a la que se une una proteína Amb a 1 nativa purificada. Alternativamente, la actividad de unión de un péptido puede determinarse mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Por ejemplo, un péptido que va a someterse a prueba se procesa sobre un gel de poliacrilamida usando SDS-PAGE. El péptido se transfiere entonces a nitrocelulosa y se incuba posteriormente con sueros de un sujeto alérgico. Tras la incubación con el anticuerpo secundario marcado, se determina entonces y se cuantifica la cantidad de IgE unida.

Otro ensayo que puede usarse para determinar la actividad de unión a IgE de un péptido es un ensayo ELISA de competición. En resumen, se genera una reserva de anticuerpo IgE combinando plasma o suero de individuos alérgicos al polen de ambrosía que se ha mostrado mediante ELISA directo que tienen IgE reactiva con Amb a 1 nativo. Esta reserva se usa en ensayos ELISA de competición para comparar la unión de IgE a Amb a 1 nativo con el péptido sometido a prueba. Se determina y se cuantifica la unión a IgE para la proteína Amb a 1 nativa y el péptido que está sometiéndose a prueba.

Además, los péptidos de la presente invención preferiblemente no dan como resultado la liberación de mediadores (por ejemplo histaminas) a partir de mastocitos o basófilos. Para determinar si un péptido que se une a IgE da como resultado la liberación de mediadores, puede realizarse un ensayo de liberación de histamina usando reactivos y protocolos convencionales. En resumen, se combina una disolución tamponada de un péptido que va a someterse a prueba con un volumen igual de sangre heparinizada completa de un sujeto alérgico. Tras el mezclado y la incubación, se sedimentan las células y se procesan los sobrenadantes y se analizan usando, por ejemplo, un radioinmunoanálisis para determinar la cantidad de histamina liberada.

La molécula descrita en el presente documento puede comprender en cualquier combinación más de un péptido de la presente invención. Estos péptidos pueden conjugarse químicamente o fusionarse entre sí mediante tecnología recombinante. Una molécula de este tipo puede comprender al menos dos, tres, cuatro, cinco, siete, diez, 15, 20, péptidos.

Los péptidos de la invención pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante en una célula huésped

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transformada con un ácido nucleico que tiene una secuencia que codifica para tal péptido. Los péptidos aislados de la invención también pueden producirse mediante síntesis química. Por supuesto, también es posible producir los péptidos mediante escisión química o enzimática del alérgeno proteico.

Cuando se produce un péptido mediante técnicas recombinantes, se cultivan células huésped transformadas con un ácido nucleico de la invención (o el equivalente funcional del ácido nucleico que tiene una secuencia que codifica para el péptido (o equivalente funcional del péptido) en un medio adecuado para las células. Pueden purificarse péptidos del medio de cultivo celular, células huésped o ambos usando técnicas conocidas en la técnica para purificar péptidos y proteínas incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis o inmunopurificación con anticuerpos específicos para el péptido. Péptidos aislados de la invención están sustancialmente libres de material celular o medio de cultivo cuando se producen mediante técnicas de ADN recombinante o sustancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente o libres de otros materiales y reactivos cuando se producen mediante escisión química o enzimática.

Los péptidos descritos en el presente documento también pueden modificarse mediante sustitución, deleción o adición de aminoácidos. Por tanto, estos péptidos pueden comprender al menos 7 residuos de aminoácido de las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 1 a 139. Los péptidos pueden tener más de 12 residuos de aminoácido, por lo cual estos residuos adicionales pueden derivarse de la molécula Amb a 1 nativa y encontrándose adyacentes al péptido en la molécula de Amb a 1 nativa, aminoácidos al azar u otros péptidos o proteínas. Sin embargo, estos péptidos modificados (variantes) presentan propiedades similares o incluso idénticas que los péptidos no modificados. En particular las propiedades inmunogénicas tienen que ser sustancialmente idénticas. Esto significa que los anticuerpos dirigidos a estos péptidos modificados también pueden unirse a péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 1 a 139.

Tal como se usa en el presente documento, un “péptido” se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene menos residuos de aminoácido que la secuencia de aminoácidos completa de la proteína de la que se derivó el péptido. El término “péptido” también se refiere a cualquier equivalente funcional o variantes de un péptido o a cualquier fragmento o porción de un péptido. Los “equivalentes funcionales” de un péptido incluyen péptidos que tienen la misma capacidad o una capacidad potenciada para unirse a MHC, péptidos que pueden estimular las mismas subpoblaciones de células T, péptidos que tienen la misma capacidad o una capacidad aumentada para inducir respuestas de células T tales como estimulación (proliferación o secreción de citocina), péptidos que tienen al menos el mismo nivel de unión a IgE reducida, y péptidos que provocan al menos el mismo nivel mínimo de actividad estimulante de la síntesis de IgE que los péptidos derivados directamente de Amb a 1. Actividad estimulante de IgE mínima se refiere a una actividad estimulante de la síntesis de IgE que es menor que la cantidad de producción de IgE provocada por un alérgeno de polen de ambrosía nativo purificado. Los péptidos descritos en el presente documento pueden consistir en de 6 a 50, preferiblemente de 7 a 45, más preferiblemente de 8 a 40, incluso más preferiblemente de 9 a 35, en particular de 10 a 30, residuos de aminoácido. Los “equivalentes funcionales” de péptidos pueden comprender además en el extremo C- y/o N-terminal de dichos péptidos al menos un residuo de aminoácido adicional, que puede servir como grupo de unión (por ejemplo cisterna) o que puede encontrarse adyacente al péptido en Amb a 1 de tipo natural.

El término “vahante” tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de aminoácidos que difiere en uno o más residuos de aminoácido de otro péptido habitualmente relacionado. La variante puede tener cambios “conservativos”, en la que un aminoácido sustituido tiene propiedades químicas o estructurales similares. Un tipo de sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas-de hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es Usina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisterna y metionina. Grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina- valina y asparagina-glutamina. Más raramente, una vahante puede tener cambios “no conservativos” (por ejemplo, sustitución de una glicina por un triptófano). Variaciones menores similares también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Las variantes de los péptidos y las moléculas descritas en el presente documento tienen menos del 10%, y preferiblemente menos del 5%, y todavía más preferiblemente menos del 2% de cambios (ya sean sustituciones, deleciones e inserciones).

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un péptido derivado del alérgeno de polen de ambrosía Amb a 1 y que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 52 y variantes de la misma que difieren en un residuo de aminoácido.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una proteína de fusión tal como se define en las reivindicaciones 5 y 6 que comprende al menos un péptido de la presente invención y al menos un segundo péptido derivado de un inmunógeno distinto de Amb a 1.

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Una proteína de fusión de este tipo puede emplearse, por ejemplo, como vacuna que induce una respuesta inmunitaria contra un péptido de alérgeno de polen de ambrosía de la presente invención y dicho segundo inmunógeno.

Con el fin de obtener anticuerpos contra moléculas pequeñas (hapteno) como los péptidos de la presente invención, estas moléculas pequeñas pueden unirse (por ejemplo conjugarse) a un portador. Esta unión hace que el hapteno sea inmunogénico, esto significa que se generan anticuerpos tras la inyección en un individuo. La unión del hapteno a una proteína portadora es a menudo covalente, pero puede ser iónica o efectuarse a través de un componente químico que forma un puente entre el hapteno y el portador. El portador es normalmente una proteína, pero también puede contener azúcar y grasa en forma de polímero o monomérica.

El inmunógeno según la presente invención es un alérgeno seleccionado del grupo que consiste en Amb a 2, Amb a 3, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 8, Amb a 9, Amb a 10, Amb t 5, Art v 1, Art v 2, Art v 3, Art v 4, Art v 5, Art v 6, Hel a 1, Hel a 2, Hel a 3, Mer a 1, Che a 1, Che a 2, Che a 3, Sal k 1, Cat r 1, Pía 1 1, Hum j 1, Par j 1, Par j 2, Par j

3, Par o 1, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 12, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 5, Fes p 4w, Hol 1 1, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 5, Lol p 11, Pha a 1, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 11, Phl p 12, Phl p 13, Poa p 1, Poa p 5, Sor h 1, Pho d 2, Aln g 1, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Car b 1, Cas s 1, Cas s 5, Cas s 8, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Que a 1, Fra e 1, Lig v 1, Ole e 1, Ole e 2, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Syr v 1, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3w, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1, Pía a 1, Pía a 2, Pía a 3, Acá s 13, Blo t 1, Blo t 3, Blo t 4, Blo t 5, Blo t 6, Blo 110, Blo t 11, Blo t 12, Blo t 13, Blo 119, Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der f 7, Der f 10, Der f 11, Der f 14, Der f 15, Der f 16, Der f 17, Der f 18w, Der m 1, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 6, Der p 7, Der p 8, Der p 9, Der p 10, Der p 11, Der p 14, Der p 20, Der p 21, Eur m 2, Eur m 14, Gly d 2,Lep d 1, Lep d 2, Lep d 5, Lep d 7, Lep d 10, Lep d 13, Tyr p 2, Tyr p 13, Bos d 2, Bos d 3, Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Can f 1, Can f 2, Can f 3, Can f 4, Equ c 1, Equ c 2, Equ c 3, Equ c 4, Equ c 5, Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d

4, Fel d 5w, Fel d 6w, Fel d 7w, Cav p 1, Cav p 2, Mus m 1, Rat n 1, Alt a 1, Alt a 3, Alt a 4, Alt a 5, Alt a 6, Alt a 7, Alt a 8, Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13, Cía h 2, Cía h 5, Cía h 6, Cía h 7, Cía h 8, Cía h 9, Cía h 10, Cía h 12, Asp fl 13, Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5, Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f 9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 15, Asp f 16, Asp f 17, Asp f 18, Asp f 22w, Asp f 23, Asp f 27, Asp f 28, Asp f 29, Asp n 14, Asp n 18, Asp n 25, Asp o 13, Asp o 21, Pen b 13, Pen b 26, Pen ch 13, Pen ch 18, Pen ch 20, Pen c 3, Pen c 13, Pen c 19, Pen c 22w, Pen c 24, Pen o 18, Fus c 1, Fus c 2, Tri r 2, Tri r 4, Tri t 1, Tri t 4, Cand a 1, Cand a 3, Cand b 2, Psi c 1, Psi c 2, Cop c 1, Cop c 2, Cop c 3, Cop c 5, Cop c 7, Rho m 1, Rho m 2, Mala f 2, Mala f 3, Mala f 4, Mala s 1, Mala s 5, Mala s 6, Mala s 7, Mala s 8, Mala s 9, Mala s 10, Mala s 11, Mala s 12, Mala s 13, Epi p 1, Aed a 1, Aed a 2, Api m 1, Api m 2, Api m 4, Api m 6, Api m 7, Bom p 1, Bom p 4, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Bla g 6, Bla g 7, Bla g 8, Per a 1, Per a 3, Per a 6, Per a 7, Chi k 10, Chi 11-9, Chi 11.01, Chi 11.02, Chi t 2.0101, Chi t 2.0102, Chi t 3, Chi t 4, Chi t 5, Chi t 6.01, Chi t 6.02, Chi t 7, Chi t 8, Chi t 9, Cte f 1, Cte f 2, Cte f 3, Tha p 1, Lep s 1, Dol m 1, Dol m 2, Dol m 5, Dol a

5, Pol a 1, Pol a 2, Pol a 5, Pol d 1, Pol d 4, Pol d 5, Pol e 1, Pol e 5, Pol f 5, Pol g 5, Pol m 5, Vesp c 1, Vesp c 5, Vesp m 1, Vesp m 5, Ves f 5, Ves g 5, Ves m 1, Ves m 2, Ves m 5, Ves p 5, Ves s 5, Ves vi 5, Ves v 1, Ves v 2, Ves v 5, Myr p 1, Myr p 2, Sol g 2, Sol g 4, Sol i 2, Sol i 3, Sol i 4, Sol s 2, Tria p 1, Gad c 1, Sal s 1, Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Gal d 1, Gal d 2, Gal d 3, Gal d 4, Gal d 5, Met e 1, Pen a 1, Pen i 1, Pen m 1, Pen m 2, Tod p 1, Hel as 1, Hal m 1, Ran e 1, Ran e 2, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Bra r 2, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Sec c 20, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 25, Tri a 26, Zea m 14, Zea m 25, Ory s 1, Api g 1, Api g 4, Api g 5, Dau c 1, Dau c 4, Cor a 1.04, Cor a 2, Cor a 8, Fra a 3, Fra a 4, Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Mal d 4, Pyr c 1, Pyr c 4, Pyr c 5, Pers a 1, Pru ar 1, Pru ar 3, Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru av 4, Pru d 3, Pru du 4, Pru p 3, Pru p 4, Aspa o 1, Cro s 1, Cro s 2, Lac s 1, Vit v 1, Mus xp 1, Ana c 1, Ana c 2, Cit 1 3, Cit s 1, Cit s 2, Cit s 3, Lit c 1, Sin a 1, Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Vig r 1, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Len c 1, Len c 2, Pis s 1, Pis s 2, Act c 1, Act c 2, Cap a 1 w, Cap a 2, Lyc e 1, Lyc e 2, Lyc e 3, Sola 11, Sola t 2, Sola t 3, Sola 14, Ber e 1, Ber e 2, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Ric c 1, Ses i 1, Ses i 2, Ses i 3, Ses i 4, Ses i 5, Ses i 6, Cuc m 1, Cuc m 2, Cuc m 3, Ziz m 1, Ani s 1, Ani s 2, Ani s 3, Ani s 4, Arg r, Ase s 1, Car p 1, Den n 1, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6.01, Hev b 6.02, Hev b 6.03, Hev b 7.01, Hev b 7.02, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Hom s 1, Hom s 2, Hom s 3, Hom s 4, Hom s 5 y Trip s 1.

Se prefiere particularmente fusionar los péptidos de la presente invención derivados del alérgeno de polen de ambrosía Amb a 1 con péptidos derivados de otros alérgenos. Una proteína de fusión/polipéptido/péptido de este tipo es útil cuando se usa en una vacuna o en diagnóstico. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica para un péptido o una proteína de fusión según la presente invención.

La molécula de ácido nucleico de la presente invención puede emplearse, por ejemplo, para la producción recombinante de los péptidos/polipéptidos/proteínas codificados por dicha molécula de ácido nucleico. Además, también pueden usarse para aspectos terapéuticos (por ejemplo terapia génica, terapia celular).

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la presente invención.

La molécula de ácido nucleico de la presente invención puede introducirse en un vector. El vector puede usarse para

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la producción recombinante de los péptidos y moléculas de la presente invención o para aspectos terapéuticos.

“Vector”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un plásmido, cósmido y ADN viral y de fago. Un plásmido que comprende una molécula de ácido nucleico según la presente invención puede contener próximo a dicha molécula, por ejemplo, un origen de replicación, marcadores de selección (por ejemplo marcadores de resistencia a antibióticos, marcadores auxotróficos), un sitio de clonación múltiple, una región promotora unida operativamente a dicha molécula y/o tramos de secuencia para la integración homologa del vector o partes del mismo en el genoma de un huésped.

Preferiblemente, el vector de la presente invención comprende además un promotor operativamente unido a dicha molécula de ácido nucleico, dando como resultado así un casete de expresión.

El casete de expresión de la presente invención comprende un promotor y una molécula de ácido nucleico que codifica para un péptido de la presente invención. El promotor está situado preferiblemente en el extremo 5’ (en el sentido de 5’) de la molécula de ácido nucleico de la presente invención. El promotor que va a usarse en el casete de expresión puede ser uno cualquiera, siempre que el promotor pueda controlarse por el huésped respectivo.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una formulación de vacuna que comprende al menos una proteína de fusión y/o un péptido según la presente invención.

El péptido y/o proteína de fusión de la presente invención que comprende al menos un péptido derivado del alérgeno de polen de ambrosía Amb a 1 y que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 52 puede usarse en una formulación de vacuna. Puesto que estos péptidos pueden provocar una respuesta de células T contra el alérgeno de polen de ambrosía Amb a 1, la formulación de vacuna puede usarse para la desensibilización, la prevención o el tratamiento de alergias al polen de ambrosía y alergias que reaccionan de manera cruzada con alérgenos de polen de ambrosía (por ejemplo polen de artemisa). Debido a la falta de actividad de unión a IgE, los péptidos son en particular ventajosos cuando se usan en una vacuna, porque dicha vacuna no provoca o sustancialmente no provoca una reacción alérgica. La formulación de vacuna de la presente invención puede comprender al menos uno, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, péptidos tal como se dan a conocer en el presente documento.

La administración de las composiciones terapéuticas de la presente invención a un individuo que va a desensibilizarse puede llevarse a cabo usando procedimientos conocidos a dosificaciones y durante periodos de tiempo eficaces para reducir la sensibilidad (es decir reduce la respuesta alérgica) del individuo al alérgeno. Las cantidades eficaces de las composiciones terapéuticas variarán según factores tales como el grado de sensibilidad del individuo a Amb a 1, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad de la proteína o el fragmento de la misma para provocar una respuesta antigénica en el individuo. El compuesto activo (es decir proteína o fragmento de la misma) puede administrarse de una manera conveniente tal como mediante inyección (subcutánea, intravenosa, etc.), administración oral, inhalación, aplicación transdérmica o administración rectal. Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo puede recubrirse con un material para proteger el compuesto frente a la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto (véase a continuación). Por ejemplo, preferiblemente pueden administrarse mediante inyección aproximadamente 0,05 pg- 1000 pg, más preferiblemente desde aproximadamente 0,1-100 pg de compuesto activo (es decir proteína o fragmento de la misma) por unidad de dosificación. El régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse diariamente varias dosis divididas o la dosis puede reducirse proporcionalmente tal como indiquen las exigencias de la situación terapéutica.

La formulación de vacuna de la presente invención comprende además al menos un adyuvante, excipiente y/o portador farmacéutico aceptable.

Portadores farmacéuticamente aceptables usados preferiblemente son solución salina fisiológica, aceites vegetales, aceite mineral, caroboximetilcelulosa de sodio acuosa o polivinilpirrolidona acuosa. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a: sustancias activas de superficie, por ejemplo, hexadecilamina, octadecilamina, ásteres de aminoácido de octadecilo, lisolecitina, bromuro de dimetil-dioctadecilamonio, metoxihexadecilgilcerol y polioles plurónicos; poliaminas, por ejemplo, pirano, sulfato de dextrano, poli IC, carbopol; péptidos, por ejemplo, dipéptido de muramilo, dimetilglicina, tuftsina; emulsiones de aceite; y geles minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc. y complejos inmunoestimulantes. El adyuvante puede ser, por ejemplo, alumbre o una composición que contiene un aceite vegetal, monooleato de isomanida y monoestearato de aluminio. Otros adyuvantes preferidos incluyen micropartículas o perlas de materiales de matriz biocompatibles. Las moléculas de la presente invención pueden incorporarse en micropartículas o microcápsulas para prolongar la exposición del material antigénico al individuo y por tanto proteger a dicho individuo frente a la infección durante largos periodos de tiempo. El inmunógeno puede incorporarse también en liposomas o conjugarse con polisacáridos y/u otros polímeros para su uso en una formulación de vacuna.

También parte de esta invención es una composición que comprende las moléculas, en particular los péptidos, de esta invención y un portador, preferiblemente un portador biológicamente aceptable, y más preferiblemente un

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portador farmacéuticamente aceptable. Portadores típicos son portadores acuosos tales como agua, disoluciones acuosas tamponadas, mezclas alcohólicas acuosas, y similares. Composiciones que comprenden portadores que son para uso farmacéutico, particularmente para su uso en seres humanos, comprenden un portador que es farmacéuticamente aceptable. En la técnica se conocen ejemplos de tales portadores.

Normalmente, tales vacunas se preparan como formulaciones inyectables: o bien como disoluciones líquidas o bien como suspensiones, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, líquido antes de su inyección. La vacuna puede administrarse a un animal objetivo por cualquier vía conveniente, tal como por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, por vía intradérmica, por vía intravenosa, por vía oral, por vía intranasal o por vía intramamaria, en presencia de un diluyente fisiológicamente aceptable. Los antígenos pueden administrarse en una única dosis o en una pluralidad de dosis. La vacuna de la presente invención puede almacenarse con refrigeración o en forma congelada o liofilizada. La vacuna se administra a un individuo en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria protectora en comparación con un control. La cantidad eficaz variará, por ejemplo, con la edad y el tamaño y puede determinarla fácilmente el experto en la técnica. Los regímenes adecuados para la administración inicial y administraciones de refuerzo también serán variables, pero pueden tipificarse mediante una administración inicial seguida por inoculaciones posteriores u otras administraciones.

La formulación de vacuna de la presente invención contiene al menos una molécula que comprende un péptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51,

SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68,

SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78, SEQ ID No. 79, SEQ ID No. 80, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 83,

SEQ ID No. 86, SEQ ID No. 87, SEQ ID No. 88, SEQ ID No. 89, SEQ ID No. 90, SEQ ID No. 91, SEQ ID No. 93,

SEQ ID No. 94, SEQ ID No. 96, SEQ ID No. 97, SEQ ID No. 98, SEQ ID No. 99, SEQ ID No. 100, SEQ ID No. 101, SEQ ID No. 102, SEQ ID No. 107, SEQ ID No. 108, SEQ ID No. 109, SEQ ID No. 110, SEQ ID No. 111, SEQ ID No. 112, SEQ ID No. 114, SEQ ID No. 115, SEQ ID No. 118, SEQ ID No. 119, SEQ ID No. 120, SEQ ID No. 121, SEQ ID No. 122, SEQ ID No. 123, SEQ ID No. 124, SEQ ID No. 125, SEQ ID No. 126, SEQ ID No. 127, SEQ ID No. 128, SEQ ID No. 129, SEQ ID No. 130, SEQ ID No. 131, SEQ ID No. 132, SEQ ID No. 133, SEQ ID No. 134, SEQ ID No. 135, SEQ ID No. 136, SEQ ID No. 137, SEQ ID No. 138 y SEQ ID No. 139.

La formulación de vacuna de la presente invención puede comprender al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 86, SEQ ID No. 91 y SEQ ID No. 126-SEQ ID No. 139, en la que una realización adicional preferida de la formulación comprende al menos un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 137 a 139. En particular, estas moléculas muestran una alta reactividad frente a células T en pacientes que padecen alergia a ambrosía (los péptidos se reconocen por más del 90% de los individuos alérgicos sensibilizados a alergias a ambrosía). Además, estas moléculas/péptidos pueden formularse solos o en cualquier combinación en una única formulación. Por tanto la formulación de vacuna puede comprender al menos dos, preferiblemente al menos tres, de los péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 86, SEQ ID No. 91 y SEQ ID No. 126-SEQ ID No. 139, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID No. 52 y SEQ ID No. 137 a 139. Combinaciones preferidas particulares de los péptidos son: SEQ ID No. 52 y SEQ ID No. 137; SEQ ID No. 52 y SEQ ID No. 138; SEQ ID No. 52 y SEQ ID No. 139; SEQ ID No. 137 y SEQ ID No. 138; SEQ ID No. 137 y SEQ ID No. 139; SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 137 y SEQ ID No. 138; SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 138 y SEQ ID No. 139; SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 137 y SEQ ID No. 139; SEQ ID No. 137, SEQ ID No. 138 y SEQ ID No. 139; SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 137, SEQ ID No. 138 y SEQ ID No. 139.

Aún otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un péptido y/o una proteína de fusión según la presente invención para la fabricación de una formulación de vacuna tal como se explicó de manera resumida anteriormente.

La formulación de vacuna se usa para prevenir o tratar una alergia al polen de ambrosía en un individuo, en particular una alergia provocada por Amb a 1, o una alergia que reacciona de manera cruzada con una alergia al polen de ambrosía.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de una molécula tal como se da a conocer en el presente documento para diagnosticar in vitro una alergia a ambrosía o la sensibilidad de un individuo a un alérgeno de polen de ambrosía, en particular a Amb a 1.

Las moléculas de la presente invención, en particular los péptidos de la presente invención, pueden usarse también para fines de diagnóstico. Pueden usarse moléculas y péptidos de la presente invención para detectar y diagnosticar in vitro alergia a ambrosía o una alergia que reacciona de manera cruzada con Amb a 1. Por ejemplo, esto podría realizarse combinando sangre o productos sanguíneos obtenidos de un individuo que va a examinarse para detectar sensibilidad a alergia a ambrosía con un péptido o péptidos antigénicos aislados de Amb a 1 o cadena alfa o beta de Amb a 1 aislada, en condiciones apropiadas para la unión de componentes en la sangre (por ejemplo, anticuerpos,

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células T, células B) con el/los péptido(s) o proteína y determinando el grado en que se produce tal unión. Otros métodos de diagnóstico para enfermedades alérgicas con los que pueden usarse los péptidos de la presente invención incluyen prueba radioalergosorbente (RAST), prueba radioinmunosorbente sobre papel (PRIST), ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA), inmunoanálisis radiométricos (IRMA), inmunoensayos de luminiscencia (LIA), ensayos de liberación de histamina e inmunotransferencias de IgE.

Un método para diagnosticar la sensibilidad de un individuo a un alérgeno de polen de ambrosía, en particular a Amb a 1, puede comprender las etapas:

- proporcionar una muestra de un individuo que contiene mastocitos o basófilos y/o anticuerpos, en particular anticuerpos de la clase IgE,

- poner en contacto dicha muestra con una proteína de fusión/péptido según la presente invención

- determinar la cantidad de histamina liberada desde los mastocitos o basófilos tras el contacto con dicha molécula y/o determinar la cantidad de anticuerpos específicos para alérgeno de polen de ambrosía en la muestra, y

- diagnosticar la sensibilidad de un individuo a un alérgeno de polen de ambrosía, en particular a Amb a 1, si la cantidad de histamina liberada y/o la cantidad de anticuerpos específicos para alérgeno de polen de ambrosía en la muestra aumenta en comparación con una muestra obtenida de un individuo que no padece una alergia al polen de ambrosía o una alergia que presenta reactividad cruzada con alergia al polen de ambrosía.

La muestra usada en el método según la presente invención es preferiblemente una muestra de sangre, lágrimas,

saliva o secreción nasal.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos, sin embargo, sin restringirse a los mismos.

La figura 1 muestra la purificación de rAmb a 1.3 con cromatografía de quelato de níquel (NCC) en urea 8 M. Se analizaron muestras con SDS-PAGE/tinción de Coomassie. Las fracciones purificadas mostraron una agregación extensa.

La figura 2 muestra el análisis de transferencia puntual de IgE de Amb a 1.3 recombinante. Se purificó rAmb a 1.3 producido en E. coli tal como se describió anteriormente y se transfirió en puntos sobre membranas de nitrocelulosa. Se sometieron a prueba sueros de 17 pacientes alérgicos al polen de ambrosía (1-17) y mostraron una reactividad de IgE muy débil o ausente con rAmb a 1.3. Los mismos pacientes mostraron una reactividad de IgE fuerte con nAmb a 1.

La figura 3 muestra TCL estimuladas con Amb a 1 natural purificado o rAmb a 1.3 a diferentes concentraciones. Se muestran los valores de las concentraciones óptimas. N=13; coeficiente de correlación de Pearson: 0,979 ** (p<0,01) o rho de Spearman: 0,912**.

La figura 4 muestra ejemplos de titulaciones de alérgenos en ensayos de proliferación de TCL - alérgenos naturales frente a recombinantes (lotes diferentes de rAmb a 1.3, lotes L1-L4). STA y OPO son TCL de 2 pacientes alérgicos a ambrosía diferentes, respectivamente.

La figura 5 muestra una producción de citocina similar inducida por extracto de ambrosía y rAmb a 1.3 en TCL.

La figura 6 muestra una producción de citocina comparable inducida por Amb a 1.3 natural y rAmb a 1.3 en TCL y TCC.

La figura 7 muestra que TCL inducidas con Amb a 1.3 natural o rAmb a 1.3 reconocen epítopos de células T similares.

La figura 8 muestra regiones de activación de células T relevantes de Amb a 1.3. Se analizó por separado el porcentaje de pacientes que reconocen cada epítopo para índices de estimulación superiores a 3 (Sl>3) y 5 (Sl>5), respectivamente.

La figura 9 muestra una inmunotransferencia de IgE de nAmb a 1 purificado. Se separó nAmb a 1 mediante SDS- PAGE, y se sometió a electrotransferencia sobre una membrana de PVDF. Se incubaron tiras de la membrana con sueros de pacientes alérgicos al polen de ambrosía (carriles 1-29) o con suero de un donante no alérgico (carril C). Se detectó la IgE unida con anticuerpo de cabra anti-lgE humana marcado con 125l. Se reclutaron pacientes sensibilizados al polen de ambrosía en Austria (carriles 1-13) o en Italia (carriles 14-29).

La figura 10 muestra una tinción de Coomassie de Amb a 1 natural purificado tras SDS-PAGE y electrotransferencia sobre una membrana de PVDF. Las bandas correspondientes a nAmb a 1 no procesado, cadenas alfa y beta se

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sometieron a degradación de Edman para obtener las secuencias N-terminales.

La figura 11 muestra la secuencia N-terminal de Amb a 1 natural no procesado (nAmb a 1, véase la figura 10) y su alineación con secuencias de aminoácidos deducidas de isoformas de Amb a 1.

La figura 12 muestra la secuencia N-terminal de la cadena alfa de Amb a 1 natural (nAmb a 1, véase la figura 10) y su alineación con secuencias de aminoácidos deducidas de isoformas de Amb a 1.

La figura 13 muestra la secuencia N-terminal de la cadena beta de Amb a 1 natural (nAmb a 1, véase la figura 10) y su alineación con secuencias de aminoácidos deducidas de isoformas de Amb a 1.

La figura 14 muestra secuencias de aminoácidos deducidas de isoformas de Amb a 1 y sus cadenas alfa y beta supuestas. Las isoformas Amb a 1.1, Amb a 1.2, Amb a 1.3, Amb a 1.4 y Amb a 2 se publicaron (Rafnar et al., J. Biol. Chem. 266: 1229-1236, 1991) y patentaron (patente estadounidense 5.776.761). El clon R2 se aisló en el laboratorio mediante examen inmunológico de un ADNc de polen de ambrosía con anticuerpos de conejo anti-Amb a 1 purificados por afinidad y es idéntico a Amb a 1.3 al nivel proteico. Letras subrayadas, el péptido señal predicho usando el algoritmo SignalP (
http://www.cbs.dtu.dk/services/SiqnalP/). En cursiva, la secuencia de cadena beta supuesta basada en secuenciación N-terminal y medición de masa de Amb a 1 natural. En cursiva y subrayada, la secuencia de cadena alfa supuesta basada en secuenciación N-terminal y medición de masa de Amb a 1 natural (figuras 10-13; tabla 4). El análisis de la secuencia N-terminal mostró que las secuencias en negrita se eliminaron proteolíticamente en la preparación de Amb a 1 natural purificado.

La figura 15 muestra una alineación de secuencia de isoformas de Amb a 1. Amb a 1.1, Amb a 1.2, Amb a 1.3 y Amb a 2 se clonaron, se secuenciaron y se publicaron previamente (Rafnar et al., J. Biol. Chem. 266: 1229-1236, 1991). Se generó la alineación de secuencia usando el software Clustalw (
http://npsa-pbil.ibcp.fr/cai-bin/npsa automat.pl?paae=npsa clustalw.html). Para la alineación se usaron las secuencias de aminoácidos deducidas completas (incluyendo el péptido señal) proporcionadas en la figura 14.

La figura 16 muestra la secuencia de aminoácido deducida de Amb a 1.3 (clon R2) y las cadenas, (a) Cadenas alfa y beta supuestas basadas en la información de la secuenciación N-terminal y la espectrometría de masas de Amb a 1 natural purificado (véanse las figuras 10-13; tabla 4). (b) El primer constructo preparado en el laboratorio para producir las cadenas alfa y beta recombinantes de Amb a 1.3. La expresión de las cadenas fue mejor que Amb a 1.3 de longitud completa pero se obtuvieron bajos rendimientos. Además, la cadena alfa excluía un dominio reactivo con células T importante (en recuadro, aa 178-189). (c) Cadenas alfa y beta modificadas (versión 1) de Amb a 1.3 diseñadas para incluir en la cadena alfa el epítopo de células T correspondiente a los aminoácidos 178-189. (d) Cadenas alfa y beta modificadas (versión 2) de Amb a 1.3 diseñadas para incluir en la cadena alfa el epítopo de células T correspondiente a los aminoácidos 178-189 y para excluir en la cadena beta los primeros 20 aminoácidos en el extremo N-terminal, que se mostró que se eliminaban proteolíticamente en Amb a 1 natural.

La figura 17 muestra la expresión de las cadenas alfa y beta modificadas de Amb a 1.3 (versión 1) en las cepas de E. coli BL21 y Rosetta-gami B (DE3)pLysS.

La figura 18 muestra SDS-PAGE y tinción de Coomassie de las cadenas alfa y beta de Amb a 1.3 modificadas (versión 1) tras la purificación por afinidad en una columna de níquel. Se obtuvieron altos rendimientos de cadenas alfa y beta modificadas usando la cepa de E. coli Rosetta-gami B (DE3)pLysS (Novagen). Las cadenas purificadas eran solubles y no mostraron tendencia a agregarse, lo que era un grave problema con el alérgeno Amb a 1.3 de longitud completa.

La figura 19 muestra el ELISA de IgE humana Amb a 1 natural purificado y la cadena alfa modificada (versión 1) de Amb a 1.3

La figura 20 muestra la proliferación de una TCL específica de Amb a 1 con cadenas alfa y beta modificadas (versión 1) de Amb a 1.3. Se usaron como estimulantes Amb a 1 natural, diferente concentraciones de rAmb a 1.3 de longitud completa, rAlpha y cadenas beta. Se inició TCL con rAmb a 1.3 (Amb).

La figura 21 muestra respuestas proliferativas de 2 TCL específicas de Amb a 1 usando rAmb a 1.3 de longitud completa, y cadenas alfa y beta modificadas (versión 1) de Amb a 1.3. Se iniciaron TCL o bien con rAmb a 1.3 (Amb) o bien con extracto de polen de ambrosía (RW).

La figura 22 muestra 26 regiones de activación de células T relevantes identificadas en Amb a 1.3. 17/26 epítopos están ubicados en la región C-terminal de Amb a 1. Por tanto las cadenas alfa y beta se diseñaron para incluir estos epítopos de células T relevantes.

Ejemplos:

Ejemplo 1: Aislamiento de un ADNc que codifica para Amb a 1

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Ejemplo 1.1: Purificación por afinidad de anticuerpos de conejo anti-Amb a 1

Pueden obtenerse sueros de conejos inmunizados con Amb a 1 natural mediante métodos generales conocidos en la técnica. Para examinar la biblioteca de ADNc de polen de ambrosía, se purificaron anticuerpos específicos de Amb a 1 mediante cromatografía de afinidad. Se acoplaron 5 mg de Amb a 1 natural purificado de polen de ambrosía a CNBr-Sepharose activada (GE Healthcare Life Sciences). Tras la unión de los sueros de conejo, se lavó la resina y se eluyeron anticuerpos específicos de Amb a 1 altamente específicos con glicina 0,2 M, pH 2,8. Los anticuerpos se neutralizaron inmediatamente y se dializaron frente a 1 x PBS pH 7,4 (8 g de NaCI, 0,2 g de KCI, 1,44 g de Na2HP04, 0,24 g de KH2PO4, ajustar con HCI a pH 7,4). Entonces se usaron los anticuerpos purificados para experimentos de examen de bibliotecas e inmunotransferencia.

Ejemplo 1.2: Construcción y examen inmunológico de una biblioteca de ADNc de polen de ambrosía

Se construyó una biblioteca de ADNc de polen de ambrosía en el vector lambda ZAP II (Stratagene). Se usaron anticuerpos de conejo anti-Amb a 1 purificados para examinar 400.000 placas de la biblioteca de ADNc de polen de ambrosía. Se aislaron cuatro clones de Amb a 1 positivos y se usaron para la escisión in vivo del fagémido pBluescript del vector Uni-ZAP XR. Los clones designados R1, R2, R3 y R4 se seleccionaron para el análisis de la secuencia de ADN, que se llevó a cabo mediante la técnica de “paseo con cebador” usando 4 y 5 cebadores incluyendo los cebadores flanqueantes T7 y T3. R1 y R4 estaban truncados en sus extremos 3’ y 5’, respectivamente, y por tanto no se usaron adicionalmente en los presentes experimentos. Ambas hebras de R2 y R3 se secuenciaron dos veces. Se usaron las secuencias para búsquedas de similitud en la base de datos.

Ejemplo 1.3: Clonación en el vector de expresión pHis-parallel-2

Se ligó el ADNc de R2 (Amb a 1.3) en el vector pHis-parallel-2. Para el procedimiento de clonación, se construyeron dos cebadores de clonación flanqueantes. La secuencia de ADNc completa estaba truncada en el extremo 5’ en 75 nucleótidos que codifican para el péptido señal supuesto. Se usaron los siguientes cebadores: Rag-Nco-forward: 5’- GAGAGAGACCATGGCCGAAGGGGTCGG-AGAAATCTTACCTTCAG-3’ (SEQ ID No. 140) y Rag-Xho-reverse: 5’- GAGAGAGACTCGAGTTAGCAAGGTGCTCCAGGACGGCATGAG-3’ (SEQ ID No. 141). Se introdujeron los sitios de restricción Neo I y Xho I en los extremos 5’ y 3’. Se digirieron los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con las enzimas de restricción Neo I y Xho I (New England Biolabs) y se ligaron en los sitios respectivos del vector pHis-parallel-2. Se secuenció el constructo pHis-parallel-2/R2 resultante según el protocolo de secuenciación de ciclo de terminación con colorante (Applied Biosystems).

Ejemplo 1.4: Expresión de R2 recombinante (Amb a 1.3) en Escherichia coli

Se realizó la expresión de proteína recombinante usando la cepa de Escherichia coli competente BL21 DE3 (Stratagene) que albergaba el constructo pHis-Parallel-2/R2 (para Amb a 1.3). Se seleccionaron los transformantes en placas de LB que contenían ampicilina 100 mg/l y se recogieron colonias transformantes individuales. Se llevaron a cabo varios experimentos de expresión a pequeña escala y se optimizaron antes de intentar una producción de proteína a gran escala. Se inoculó el medio de cultivo (peptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, glicerol 10 g/l, NaCI 5 g/l, (NH4)2S04 2,5 g/l, MgS04.7H20 0,5 g/l y Na2HP04.2H20 1,8 g/l, pH ajustado a 7,4) con el 3% de un cultivo durante la noche, hecho crecer en medio de cultivo con penicilina G 150 pg/ml (Biochemie). Se llevó a cabo la fermentación en un termentador Bioflow 3000 de 10 I (New Brunswick Scientific Co.) a 372C con saturación de oxígeno del 7%, agitación a 200 - 400 rpm e inducción con IPTG 0,4 mM a una DO600 de 1,0. Se recogieron células bacterianas (60-80 g de peso de células húmedas del cultivo de 10 I) mediante centrifugación 3 horas tras la inducción y se resuspendieron en 100 mi de base Tris 50 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 0,1% (pH no ajustado, 5 ml/g de células). Tras la adición de lisozima recién disuelta (100 pg/g de células) e incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, se Usaron las células mediante 3 ciclos de congelación-descongelación. Se realizó la separación de la fracción soluble mediante centrifugación y se lavaron los cuerpos de inclusión sin procesar de dos a tres veces con Tritón X-100 al 1%, Tris-HCI 20 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, seguido por 2 lavados con etanol al 50%, Tris-HCI 20 mM, pH 8,0. Se disolvieron los cuerpos de inclusión purificados en 500 mi de urea 8 M, NaCI 0,5 M, Tris- HCI 20 mM, pH 8,0.

Ejemplo 1.5: Purificación de alérgeno R2 (Amb a 1.3) recombinante

Se cargó la disolución sobre una columna Cellufine de quelación de 150 mi (Millipore) preequilibrada con el tampón descrito en la última etapa, tras cargarla con NiCI2 según las instrucciones del fabricante. Se llevaron a cabo todas las etapas de la cromatografía en un sistema Biopilot FPLC (GE Healthcare Life Sciences). La proteína unida eluyó con un gradiente de imidazol lineal que oscilaba entre 0-300 mM. Se analizó la pureza de las fracciones mediante SDS-PAGE convencional. Las fracciones que contenían Amb a 1.3 casi puro se estabilizaron con EDTA 2 mM y se prepararon para la siguiente etapa de filtración en gel mediante concentración hasta un volumen de 50 mi en una célula de ultrafiltración Vivaflow 50 (Vivascience). Se realizó la filtración en gel en urea 8 M, NaCI 0,5 M, Tris-HCI 20 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM en una columna Sephacryl S-200 HR (GE Healthcare Life Sciences) (dimensiones 50 x 1000 mm). Se concentraron de nuevo las fracciones de Amb a 1 puras hasta una concentración de proteína de

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aproximadamente 3 mg/ml mediante ultrafiltración. Antes de la liofilización, se realizó un procedimiento de replegamiento, en el que se redujeron los enlaces disulfuros mediante la adición de mercaptoetanol 10 mM y se reoxidaron durante la diálisis posterior frente al volumen de 1.000-2.000 veces de NH4HCO3 5 mM a 42C.

Ejemplo 1.6: Análisis de SDS-PAGE e inmunotransferencia de! Amb a 1.3 recombinante purificado

Se analizaron las proteínas por medio de SDS-PAGE usando geles de acrilamida al 15% y tinción de Coomassie al 0,1% con un patrón de peso molecular RPN 756 (GE Healthcare Life Sciences). Se sometieron a prueba los sueros de pacientes alérgicos para detectar una reactividad de IgE positiva. Se separaron rAmb a 1 y rArt v 6 en geles de poliacrilamida al 15% (p/p) y se sometieron a electrotransferencia sobre una membrana de PVDF. Tras bloquear los sitios de unión de proteína no específica con tampón de bloqueo (por I: 7,5 g de Na2HP04, 1 g de NaH2P04, 5 g de BSA y 5 mi de Tween 20), se incubó la membrana con sueros de los pacientes (diluidos 1:10 en tampón de bloqueo) durante más de 6 horas a temperatura ambiente. Se lavó la membrana durante al menos 30 minutos con tampón de bloqueo antes de incubarla con anticuerpo anti-lgE humana radiomarcado [125l] (RAST, 5 dCÍ, MedPro) diluido en tampón de bloqueo (1:40) durante la noche a temperatura ambiente. Tras un segundo lavado de 30 minutos, se colocó la membrana sobre una placa de obtención de imágenes. Se expuso la pantalla durante al menos 24 horas y se reveló usando un escáner Fosfolmager Bas-1800 II para la detección y el software de ayuda del instrumento (Fujifilm).

Ejemplo 1.7: Clones de ADNc que codifican para isoformas de Amb a 1

Los clones R2 y R3 aislados de la biblioteca de polen de ambrosía estaban completos y codificaban para isoformas de Amb a 1. La secuencia de aminoácido deducida de R3 difería de la isoforma Amb a 1.1 madura en un aminoácido: la glicina en la posición 50 de Amb a 1.1 madura se intercambia por una alanina en R3. La secuencia de aminoácido deducida de R2 es idéntica a la isoforma Amb a 1.3. Se usó el clon R2 para todos los experimentos descritos en el presente documento y se denominará Amb a 1.3.

Ejemplo 1.8: Producción recombinante y actividad de unión a IgE de Amb a 1.3

En cuanto a la actividad de unión a IgE, los primeros intentos para producir rAmb a 1.3 de longitud completa en E. coli no fueron alentadores. Lo primero de todo, se producía escisión proteolítica durante la purificación de rAmb a 1.3 producido en E. coli. El rendimiento de rAmb a 1.3 era de aproximadamente 15 mg de rAmb a 1.3 a partir de 10 I de cultivo de fermentación. rAmb a 1.3 se encontraba exclusivamente en cuerpos de inclusión y por tanto eran necesarios los protocolos para el replegamiento. Sin embargo, el replegamiento correcto de rAmb a 1.3 de longitud completa resultó ser un obstáculo. Tras usar diferentes procedimientos convencionales para el replegamiento, las mejores preparaciones consistían principalmente en agregados insolubles (véase la figura 1).

Diversos cambios en el protocolo de purificación y la adición de diferentes agentes estabilizantes no dieron como resultado una proteína soluble y correctamente plegada. En ensayos no desnaturalizantes (por ejemplo, transferencia puntual, ELISA) rAmb a 1.3 no pudo unirse a IgE humana (figura 2). Sólo tras reducción y tratamiento térmico (procedimiento convencional para SDS-PAGE/inmunotransferencia) rAmb a 1.3 reaccionó con IgE de pacientes. Estos resultados demuestran claramente que rAmb a 1.3 producido tal como se describió anteriormente no es un reactivo adecuado para el diagnóstico y la terapia de la alergia. Por tanto, se buscó otro enfoque para producir reactivos recombinantes con actividad de unión a IgE completa, tal como se describe en la sección 4. A pesar de su baja actividad de unión a IgE, rAmb a 1.3 se usó satisfactoriamente in vitro para los ensayos de proliferación y mapeo de epítopos de células T, ya que no es esencial un plegamiento correcto para el reconocimiento de células T (véase el ejemplo 2).

Ejemplo 2: Reconocimiento de células T de Amb a 1

Ejemplo 2.1: Pacientes

Se caracterizó en detalle la respuesta de células T a Amb a 1 usando el sistema de cultivo in vitro establecido (Jahn- Schmid et al., J. Inmunol. 169: 6005-11, 2002; Jahn-Schmid et al, J. Allergy Clin. Inmunol., 115: 399-404, 2005). En total, se incluyeron 85 pacientes bien definidos clínicamente (75 de Viena / 10 de Milán) con una historia clínica típica, prueba de punción cutánea positiva y pruebas de CAP/RAST para extracto de ambrosía.

Ejemplo 2.2: PBMC, líneas de células T (TCL) y clones de células T (TCC) específicos de Amb a 1

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre heparinizada de pacientes alérgicos mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll. Para generar líneas de células T (TCL) y clones de células T (TCC) específicos de alérgeno, se estimularon 1,5 x 106 PBMC con doses óptimas de extracto de ambrosía o artemisa (4 pg/ml) o rAmb a 1.3 (10 pg/ml) en placas de cultivo celular de fondo plano de 24 pocilios (Costar, EE.UU.). Tras 5 días, se añadió rlL-2 humana (10 U/ml, Boehringer, Mannheim, Alemania) se continuaron los cultivos durante 7 días adicionales. Entonces, se aislaron los blastos de células T mediante centrifugación en densidad. La mayoría de los blastos de células T se expandieron adicionalmente con IL-2 y PBMC irradiadas. Se

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usó un pequeño número de blastos de células T para establecer cultivos de células T monoclonales mediante dilución limitante: se sembraron 0,3 células T/pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocilios (Nunclone) en presencia de 2 x 105 PBMC irradiadas (60 Gy), PHA al 0,25% v/v (Gibco, EE.UU.) y rlL-2 (4 U/pocillo) en el medio mencionado anteriormente. Tras 14-21 días, se expandieron microcultivos en crecimiento a intervalos semanales con PBMC irradiadas y rlL-2. Se evaluó la especificidad de TCC en ensayos de proliferación usando PBMC de HLA coincidiente o alogénicas irradiadas o células B alogénicas transformadas con VEB irradiadas y 5 pg/ml de Amb a 1.3. Tras 48 horas, se realizó la captación celular de (3H)-timidina tritiada para medir la proliferación en cuentas por minuto (cpm). Cuando el índice de estimulación (SI; razón entre las cpm obtenidas en cultivos que contenían TCC más APC autólogas más antígeno, y las cpm obtenidas en cultivos que contenían TCC y APC solos) era >10, se consideró que las respuestas eran positivas. Se expandieron TCC específicos de alérgeno alternando turnos de estimulación con APC irradiadas autólogas y alérgeno o con células alimentadoras alogénicas y rlL-2. Para PBMC y TCL, que mostraron diferentes grados de proliferación de fondo debido a autorreactividad, un SI de >3 o respectivamente 10.000 dpm se consideraron como un punto de corte para la especificidad de antígeno.

Se usaron TCL y TCC específicos de Amb a 1 para identificar epítopos de células T de Amb a 1.3. Se estimularon cultivos de células T con un panel de 121 péptidos de 12 meros sintéticos y un péptido de 13 meros que representa el péptido C-terminal de Amb a 1.3 (Pepset, Biotrend, Alemania). Los péptidos se habían sintetizado según la secuencia de aminoácidos de Amb a 1.3 y se solapaban en 9 residuos de aminoácido con los péptidos vecinos (tabla 1). Se usaron los péptidos a una concentración de 5 pg/ml para la estimulación y se determinó la proliferación de cultivos de células T tras 48 h mediante la captación de sH-timidina. Debido al alto fondo frecuentemente observado provocado por la autorreactividad en TCL, se usó la media de las cpm observadas con los diez péptidos menos estimulantes (ninguno de los péptidos era tóxico) como control negativo en los cálculos de SI. A lo largo de todo este documento, un péptido comprendía un epítopo de células T cuando el índice de estimulación era de al menos 3,0. También se indican en las tablas 2 y 3 péptidos estimulantes más fuertes con SI > 5,0.

Tabla 1. Péptidos sintéticos usados para el mapeo de epítopos de células T de Amb a 1.3. Se usó la secuencia de aminoácidos deducida de Amb a 1.3 maduro (sin péptido señal) como molde para diseñar 120 péptidos de 12 meros más 1 péptido de 13 meros (correspondiente al extremo C-terminal de Amb a 1.3).

Pos. de aa

Pept. n.fi (= SEQ ID No.) Secuencia Pos. de aa Pept. n.fi (= SEQ ID No.) Secuencia

25-36

1 SAEGVGEILPSV 205-216 61 QIWIDHCSLSKS

28-39

2 GVGEILPSVNET 208-219 62 IDHCSLSKSFDG

31-42

3 EILPSVNETRSL 211-222 63 CSLSKSFDGLVD

34-45

4 PSVNETRSLQAC 214-225 64 SKSFDGLVDVTL

37-48

5 NETRSLQACEAY 217-228 65 FDGLVDVTLGST

40-51

6 RSLQACEAYNII 220-231 66 LVDVTLGSTHVT

43-54

7 QACEAYNIIDKC 223-234 67 VTLGSTHVTISN

46-57

8 EAYNIIDKCWRG 226-237 68 GSTHVTISNCKF

49-60

9 NIIDKCWRGKAD 229-240 69 HVTISNCKFTQQ

52-63

10 DKCWRGKADWEN 232-243 70 ISNCKFTQQSKA

55-66

11 WRGKADWENNRQ 235-246 71 CKFTQQSKAILL

58-69

12 KADWENNRQALA 238-249 72 TQQSKAILLGAD

61-72

13 WENNRQALADCA 241-252 73 SKAILLGADDTH

64-75

14 NRQALADCAQGF 244-255 74 ILLGADDTHVQD

67-78

15 ALADCAQGFAKG 247-258 75 GADDTHVQDKGM

70-81

16 DCAQGFAKGTYG 250-261 76 DTHVQDKGMLAT

73-84

17 QGFAKGTYGGKW 253-264 77 VQDKGMLATVAF

76-87

18 AKGTYGGKWGDV 256-267 78 KGMLATVAFNMF

79-90

19 TYGGKWGDVYTV 259-270 79 LATVAFNMFTDN

82-93

20 GKWGDVYTVTSN 262-273 80 VAFNMFTDNVDQ

85-96

21 GDVYTVTSNLDD 265-276 81 NMFTDNVDQRMP

88-99

22 YTVTSNLDDDVA 268-279 82 TDNVDQRMPRCR

91-102

23 TSNLDDDVANPK 271-282 83 VDQRMPRCRFGF

94-105

24 LDDDVANPKEGT 274-285 84 RMPRCRFGFFQV

97-108

25 DVANPKEGTLRF 277-288 85 RCRFGFFQVVNN

100-111

26 NPKEGTLRFAAA 280-291 86 FGFFQVVNNNYD

103-114

27 EGTLRFAAAQNR 283-294 87 FQVVNNNYDRWG

106-117

28 LRFAAAQNRPLW 286-297 88 VNNNYDRWGTYA

109-120

29 AAAQNRPLWIIF 289-300 89 NYDRWGTYAIGG

112-123

30 QNRPLWIIFKND 292-303 90 RWGTYAIGGSSA

115-126

31 PLWIIFKNDMVI 295-306 91 TYAIGGSSAPTI

118-129

32 IIFKNDMVINLN 298-309 92 IGGSSAPTILCQ

121-132

33 KNDMVINLNQEL 301-312 93 SSAPTILCQGNR

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124-135

34 MVINLNQELVVN 304-315 94 PTILCQGNRFLA

127-138

35 NLNQELVVNSDK 307-318 95 LCQGNRFLAPDD

130-141

36 QELVVNSDKTID 310-321 96 GNRFLAPDDQIK

133-144

37 VVNSDKTIDGRG 313-324 97 FLAPDDQIKKNV

136-147

38 SDKTIDGRGVKV 316-327 98 PDDQIKKNVLAR

139-150

39 TIDGRGVKVEII 319-330 99 QIKKNVLARTGT

142-153

40 GRGVKVEIINGG 322-333 100 KNVLARTGTGAA

145-156

41 VKVEIINGGLTL 325-336 101 LARTGTGAAESM

148-159

42 EIINGGLTLMNV 328-339 102 TGTGAAESMAWN

151-162

43 NGGLTLMNVKNI 331-342 103 GAAESMAWNWRS

154-165

44 LTLMNVKNIIIH 334-345 104 ESMAWNWRSDKD

157-168

45 MNVKNIIIHNIN 337-348 105 AWNWRSDKDLLE

160-171

46 KNIIIHNINIHD 340-3-51 106 WRSDKDLLENGA

163-174

47 IIHNINIHDVKV 343-354 107 DKDLLENGAIFV

166-177

48 NINIHDVKVLPG 346-357 108 LLENGAIFVTSG

169-180

49 IHDVKVLPGGMI 349-360 109 NGAIFVTSGSDP

172-183

50 VKVLPGGMIKSN 352-363 110 IFVTSGSDPVLT

175-186

51 LPGGMIKSNDGP 355-366 111 TSGSDPVLTPVQ

178-189

52 GMIKSNDGPPIL 358-369 112 SDPVLTPVQSAG

181-192

53 KSNDGPPILRQA 361-372 113 VLTPVQSAGMIP

184-195

54 DGPPILRQASDG 364-375 114 PVQSAGMIPAEP

187-198

55 PILRQASDGDTI 367-378 115 SAGMIPAEPGEA

190-201

56 RQASDGDTINVA 370-381 116 MIPAEPGEAAIK

193-204

57 SDGDTINVAGSS 373-384 117 AEPGEAAIKLTS

196-207

58 DTINVAGSSQIW 376-387 118 GEAAIKLTSSAG

199-210

59 NVAGSSQIWIDH 379-390 119 AIKLTSSAGVLS

202-213

60 GSSQIWIDHCSL 382-393 120 LTSSAGVLSCRP

385-397 121 SAGVLSCRPGAPC

Ejemplo 2.3: Medición de citocinas

Se lavaron células T y se incubaron APC autólogas irradiadas en presencia del estimulante (5 pg/ml) durante 48 horas. Se midieron los niveles de citocina en los sobrenadantes resultantes en ELISA usando pares de anticuerpos emparejados (Endogen, EE.UU.) (límites de sensibilidad: IL-4: 9 pg/ml, IFN-y: 9 pg/ml). Cultivos que contenían TCC y APC solas sirvieron como controles negativos. Se clasificaron TCC con una razón de IFN-'y/IL-4>10 como Th1,0,1- 10 como ThO y <0,1 como Th2.

Ejemplo 2.4: Citometría de flujo

Se analizó el fenotipo de TCC mediante citometría de flujo, usando un instrumento FACScan y los anticuerpos monoclonales marcados con FITC anti-Leu 4/CD3, anti-Leu 3a/CD4, anti-Leu 2a/CD8, anti-TCR a(5 WT 31, anti-TCR 78 y CRTh2 más anticuerpo de cabra anti-rata-PE (todos los anticuerpos se obtuvieron de BD Bioscience, EE.UU.).

Ejemplo 2.5: Comparación de rAmb a 1.3 con Amb a 1 natural

Para confirmar que la isoforma Amb a 1.3 recombinante estimulaba células T de manera comparable a Amb a 1 natural (mezcla de isoformas), se estimularon PBMC y TCL y TCC específicos de Amb a 1 con diferentes concentraciones de Amb a 1.3 natural o rAmb a 1.3. Se determinaron las respuestas de citocina y proliferación. La capacidad estimuladora de ambos alérgenos era relativamente estable a lo largo de un intervalo de concentraciones y en general Amb a 1.3 natural y rAmb a 1.3 indujeron proliferaciones de células T (figuras 3 y 4) y producción de citocina (figuras 5 y 6) comparables. Al nivel clonal 1/6 TCC específicos de Amb a 1 sometidos a prueba que reconocían diferentes epítopos de rAmb a 1.3 no respondieron a Amb a 1 natural (epítopo: aa 265-276). TCL inducidas con extracto de ambrosía o Amb a 1.3 recombinante mostraron patrones de epítopos de células T similares (figura 7).

Ejemplo 2.6: Epítopos de células Tde Amb a 1.3

Se realizó el mapeo de epítopos de células T de Amb a 1.3 evaluando 48 TCL de diferentes pacientes (37 de Viena y 9 de Italia), que se habían iniciado con extracto de ambrosía (que contiene el alérgeno natural) o rAmb a 1.3 (tabla 2). TCL inducidas o bien con extracto de ambrosía o bien con rAmb a 1.3 del mismo individuo reconocieron epítopos de células T similares (tabla 2; figura 7). Los pacientes austríacos e italianos mostraron un perfil de reconocimiento de epítopos similar. Por tanto, se combinaron sus datos para análisis adicionales (tabla 3). De manera típica para muchos alérgenos inhalantes, se detectaron múltiples regiones de activación de células T en Amb a 1.3. El número de péptidos reconocidos por células T de un único individuo osciló entre 2 y un máximo de 60 péptidos con una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

media de 17,8 péptidos (mediana=16 / para Sl>3; resp. 0-36/11,9 /12 para SI >5) (véase la tabla 3). En total, se

identificaron 26 regiones de activación de células T relevantes (es decir reconocidas por §10% de los pacientes

estudiados) que comprendían 12-18 aa. Se dividieron estas regiones que contenían epítopos en clases de prevalencia (en referencia a SI >5):

11 regiones eran positivas en el 10-20% de los pacientes:

Péptido 20 (aa 82-93), GKWGDVYTVTSN (SEQ ID No. 20), reconocido por el 14,6%

42; (aa 148-159), EIINGGLTLMNV (SEQ ID No. 42), reconocido por el 10,4%

44 (aa 154-165), LTLMNVKNIIIH (SEQ ID No. 44), reconocido por el 18,8 %

78; (aa 256-267), KGMLATVAFNMF (SEQ ID No. 78), reconocido por el 12,5%

80-81 (aa 262-276), VAFNMFTDNVDQRMP (SEQ ID No. 122), reconocido por el 12,5%

83; (aa 271-282), VDQRMPRCRFGF (SEQ ID No. 83), reconocido por el 16,7%

88-89: (aa 286-300), VNNNYDRWGTYAIGG (SEQ ID No. 123), reconocido por el 12,5%

94 (aa 304-315), PTILCQGNRFLA (SEQ ID No. 94), reconocido por el 18,8%

98-99; (aa 316-330), PDDQIKKNVLARTGT (SEQ ID No. 124), reconocido por el 16,7%

100; (aa 322-333). KNVLARTGTGAA (SEQ ID No. 100), reconocido por el 10,4%

101/102 (aa 325-339), LARTGTGAAESMAWN (SEQ ID No. 125), reconocido por el 14,6%

9 regiones eran positivas en el 21-30% de los pacientes:

Péptido 27-28 (aa 103-117), EGTLRFAAAQNRPLW (SEQ ID No. 126), reconocido por el 22,9%

30-31 (aa 112-126), QNRPLWIIFKNDMVI (SEQ ID No. 127), reconocido por el 20,8%

33-34 (aa 121-135), KNDMVINLNQELVVN (SEQ ID No. 128), reconocido por el 27,1%

36-37 (aa 130-144), QELVVNSDKTIDGRG (SEQ ID No. 129), reconocido por el 25,0%

46-48 (aa 160-177), KNIIIHNINIHDVKVLPG (SEQ ID No. 130), reconocido por el 20,8%

86 (aa 280-291), FGFFQVVNNNYD (SEQ ID No. 86), reconocido por el 20,6%

91 (aa 295-306), TYAIGGSSAPTI (SEQ ID No. 91), reconocido por el 22,9%

109-111; (aa 349-366), NGAIFVTSGSDPVLTPVQ (SEQ ID No. 131), reconocido por el 22,9%

118-120 (aa 376-393); GEAAIKLTSSAGVLSCRP (SEQ ID No. 132), reconocido por el 20,8%

3 regiones eran positivas en el 31-49% de los pacientes:

Péptido 38-40 (aa 136-153), SDKTIDGRGVKVEIINGG (SEQ ID No. 133), reconocido por el 33,3%

68 (aa 226-237), GSTHVTISNCKF (SEQ ID No. 68), reconocido por el 33,3%

114-115 (aa 364-378), PVQSAGMIPAEPGEA (SEQ ID No. 134), reconocido por el 35,4%

3 regiones eran positivas en > 50% de los pacientes:

Péptido 52 (aa 178-189), GMIKSNDGPPIL (SEQ ID No. 52), reconocido por el 56,3%

59-61 (aa 199-216), NVAGSSQIWIDHCSLSKS (SEQ ID No. 135), reconocido por el 58,3%

5

10

15

20

25

30

35

40

107-108 (aa 343-357), DKDLLENGAIFVTSG (SEQ ID No. 136), reconocido por el 56,3%

Las tres regiones de activación de células T que inducían respuestas proliferativas en más del 50% de los pacientes alérgicos se definieron como epítopos inmunodominantes (figura 8; tabla 3).

En general, la capacidad de activación de células T de un determinado péptido no se correlacionaba con la frecuencia de reconocimiento. Por tanto, también se calculó un “índice de positividad” (Pl; % de pacientes positivos x SI medio) para revelar otros epítopos importante. El Pl osciló entre 98-2300 e identificó las tres regiones inmunodominantes mencionadas anteriormente y 4 regiones adicionales como regiones fuertemente inmunogénicas (Pl>700; el 27% de los valores más altos) en Amb a 1.3:

46-48: aa 160-177: KNIIIHNINIHDVKVLPG (SEQ ID No. 130)

109-111: aa 349-366: NGAIFVTSGSDPVLTPVQ (SEQ ID No. 131)

114-115: aa 364-378: PVQSAGMIPAEPGEA (SEQ ID No. 134)

118-120: aa 376-393: GEAAIKLTSSAGVLSCRP (SEQ ID No. 132)

Además de TCL, se establecieron más de 100 TCC específicos para Amb a 1 a partir de 10 pacientes alérgicos al polen de ambrosía diferentes. Con la excepción de un TCC CD8+, se mostró que estos TCC eran células T CD4+TCR a(3+. La investigación de la producción de citocinas en 108 TCC específicos para Amb a 1 (n=10 pacientes) reveló un perfil de citocinas de tipo Th2 en la mayoría (50%) de estos TCC (Th1: 11%; ThO 39%). Además, el 74% de 68 TCC investigados (pacientes n=8) expresó CRTh2, un marcador de superficie para células T Th2, lo que también indica que las células T específicas para Amb a 1 en el cultivo representan células T alergénicas relevantes. El mapeo de epítopos de células T de Amb a 1.3 usando TCC específicos para Amb a 1 reflejó los datos obtenidos a partir de TCL. Los resultados muestran que la presentación de péptidos de Amb a 1 es diversa, implicando HLA-DR, -DP o -DQ como elementos de restricción.

En el documento US 6.335.020 (Allergenic peptides from ragweed pollen) se han notificado 4 regiones principales de reactividad con células T: aa 57-101, 182-215, 280-322 y 342-377 (figura 6). Esta distribución de epítopos difiere en algún grado de los epítopos de la presente invención, por ejemplo en contraposición a la región aa 57-101, se encontró que los epítopos dentro de aa 109-180 se reconocen mucho más frecuentemente. Otros han descrito epítopos de células T de alérgenos de polen de árboles relacionados Cha o 1 (ciprés japonés), Cry j 1 (cedro japonés) (Soné et al., Clin Exp Allergy, 35: 664-71, 2005). Los epítopos principales de estos alérgenos se ubican en regiones que son homologas con respecto a epítopos de células T minoritarios en Amb a 1.

Tabla 2. Epítopos de células T de TCL específicas para Amb a 1 de 48 pacientes alérgicos al polen de ambrosía diferentes. Se iniciaron TCL o bien con rAmb a 1.3 o bien con extracto de polen de ambrosía. Para cada paciente se enumeran los péptidos que proporcionan índices de estimulación (SI) mayores de 3 y 5.

Paciente n.2

Péptido n.2 (SI > 3) Péptido n.2 (SI > 5)

1

112, 114 8, 31, 33, 36, 44, 52, 59, 60, 61, 68, 78, 102, 108, 109, 110, 111, 115, 116, 117, 118, 119, 120

2

29, 30, 42, 64, 67, 79, 88, 89, 93, 98, 101, 103 27, 28, 33, 52, 60, 61, 68, 94, 107, 108, 111, 114, 115, 116, 118, 119, 120

3

120 107

4

41,42, 60, 90, 98 52, 83, 91, 107, 108

5

39, 78, 85, 99, 101, 102, 107, 108 28, 36, 37, 44, 52, 60, 61, 86, 100, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 119, 120

6

34 83, 91, 107, 108, 115

7

11, 58, 68, 78, 82, 84, 86, 88, 89, 99, 108 33, 39, 47, 48, 51,52, 59, 60, 61, 107

8

34, 44, 45, 72, 79, 80 33, 39, 40, 50, 71,83, 107

9

50, 76, 83, 87, 101, 112, 113, 119, 121 39, 69, 91,93, 107, 117

10

47, 96, 97, 110, 119 44, 46, 60, 61,69, 89, 101, 107, 108, 115

11

110 33, 38, 39, 46, 52, 60, 69, 83, 90, 91, 107, 108, 115

12

59 36, 37, 52, 60, 61,68, 86, 96, 97, 98

13

14, 37, 44, 61,71,77, 108, 111, 121 20, 28, 36, 47, 101, 109, 110, 118

14

30, 31, 111, 120 119

15

8, 20, 46, 47,71,77, 107, 108

16

87 21,46, 47, 54, 55, 63, 86

17

14, 23, 29, 34, 53, 58, 69, 76, 80, 82, 85, 99, 102, 107, 115 20, 22, 28, 31, 33, 36, 37, 44, 52, 60, 61, 68, 77, 81,84, 88, 98, 108, 109, 110, 111, 118, 119, 120

18

33, 104 38, 39, 52, 60, 61, 68, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 112

19

20, 28, 36, 37, 44, 47, 48, 52, 59, 60, 67, 77, 78

20

60, 61

21

29, 34, 47, 61 30, 33, 38, 39, 42, 43, 46, 49, 52, 60, 91, 94, 107, 108, 114, 115

22

20, 39, 44, 52, 53, 64, 69, 85, 94 28, 37, 38, 40, 60, 61,68, 86

23

23, 51, 53, 54, 55, 59, 116, 117, 120 9, 30, 31, 32, 33, 34, 38, 39, 46, 47, 48, 52, 60, 61, 68, 81, 88, 89, 98, 99, 107, 108, 111, 115, 118, 119

24

28, 114 11, 34, 37, 38, 52, 68, 83, 89, 91, 100, 101, 102, 107, 108, 109, 110, 115

25

44, 111, 119, 120 60, 61, 77, 92, 93, 94107, 108, 109, 110

26

28, 29, 30, 36, 44, 68, 83, 84, 118, 121 12, 15, 22, 23, 31, 33, 52, 60, 61, 73, 74, 78, 82, 86, 107, 108, 111, 113, 115, 119, 120

27

43, 107 10, 22, 28, 30, 33, 36, 37, 48, 52, 60, 61,86, 87

28

33, 39, 61,73, 93, 94, 99, 118 36, 52, 60, 77, 88, 102, 107, 108, 109, 110, 111, 119, 120

29

28, 81, 83, 86, 87, 91, 100 31, 39, 52, 59, 60, 61, 67, 68, 69, 80, 107, 108, 111, 115, 118, 119, 120

30

4, 78 20, 27, 28, 29, 30, 36, 37, 44, 52, 60, 61, 68, 80, 93, 94, 108, 117

31

11,32, 77 29, 30, 38, 39, 40, 42, 46, 47, 48, 61, 79, 89, 94, 108, 115

32

1,77 4, 20, 22, 28, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 50, 52, 60, 61, 62, 66, 68, 78, 83, 86, 90, 91, 96, 97, 98, 105, 107, 108, 115

33

12, 61 52, 60, 68, 108

34

28, 30, 42, 91 24, 27, 29, 94, 108, 114

35

37, 38, 69, 72 20, 28, 33, 36, 39, 42, 44, 48, 52, 58, 60, 61, 68, 94, 114

36

7, 9, 12, 15, 16, 28, 33, 37, 39, 43, 47 30, 52, 60, 61,68, 96, 97, 98, 107

37

5, 12, 29, 55, 59

38

19, 37, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 51,98, 107, 109, 113 20, 22, 28, 31, 36, 44, 52, 78, 82, 86, 89, 90, 101, 102, 110, 111,118, 119, 120

39

4, 52 33, 42, 47, 48, 59, 60, 78, 98, 99, 107

40

24, 25, 33, 52, 73, 78, 98, 109, 111, 119 31, 66, 68, 71, 80, 81, 83, 102, 107, 108, 110, 112, 115, 120

41

2, 17, 20, 28, 30, 36, 37, 38, 44, 61, 92 27, 31,39, 52, 83, 91,94

42

67, 80 91,93, 101

43

28, 62, 68, 76, 88, 89 38, 39, 51, 52, 59, 60, 61, 80, 81, 86, 92, 100, 101, 102, 109, 110

44

35, 80, 88, 90, 119 30, 31, 38, 39, 46, 47, 48, 51, 52, 59, 60, 94, 100, 107, 108, 111, 112, 115, 121

45

5, 39, 41, 42, 48, 51, 52, 53, 54, 65, 67, 68, 74, 78, 79, 84, 89, 106, 109, 112 47, 60, 61, 63, 64, 66, 72, 73, 75, 76, 80, 85, 86, 87, 88, 101, 107, 108, 115, 116

46

88 27, 91, 107

47

3, 4, 5, 6, 13, 14, 16, 23, 28, 41, 49, 61, 74, 89, 98, 102, 108, 112, 113, 114, 116, 119, 120, 121 2, 9, 15, 30, 50, 56, 62, 91, 99, 100, 103, 105, 107, 110, 111, 115, 117

48

1, 5, 8, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 25, 32, 36, 42, 53, 65, 67, 69, 88, 97, 105, 106, 111 10, 11, 18, 30, 31, 33, 38, 39, 40, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 59, 60, 61, 66, 68, 70, 72, 79, 80, 81, 89, 98, 99, 107, 108, 109, 114, 115, 116, 118, 121

Tabla 3. Epítopos de células T de líneas de células T (TCL) específicas para Amb a 1 de 48 pacientes alérgicos al polen de ambrosía diferentes (véase la tabla 2). Se usaron 121 péptidos sintéticos solapantes (12 meros) para el mapeo de epítopos. Se evaluó por separado la relevancia de cada epítopo para índices de estimulación mayores de 5 3 (Sl>3) y mayores de 5 (Sl>5).

Péptido (=SEQ ID No.)

Posición de AA Secuencia de AA N.° de pacientes positivos % N.° de pacientes positivos %

SI>3 SI>5

1

25-36 SAEGVGEILPSV 2 4,2 0 0,0

2

28-39 GVGEILPSVNET 2 4,2 1 2,1

3

31-42 EILPSVNETRSL 1 2,1 0 0,0

4

34-45 PSVNETRSLQAC 4 8,3 1 2,1

5

37-48 NETRSLQACEAY 4 8,3 0 0,0

6

40-51 RSLQACEAYNII 1 2,1 0 0,0

7

43-54 QACEAYNIIDKC 1 2,1 0 0,0

8

46-57 EAYNIIDKCWRG 3 6,3 1 2,1

9

49-60 NIIDKCWRGKAD 3 6,3 2 4,2

10

52-63 DKCWRGKADWEN 2 4,2 2 4,2

11

55-66 WRGKADWENNRQ 4 8,3 2 4,2

12

58-69 KADWENNRQALA 5 10,4 1 2,1

13

61-72 WENNRQALADCA 2 4,2 0 0,0

14

64-75 NRQALADCAQGF 4 8,3 0 0,0

15

67-78 ALADCAQGFAKG 4 8,3 2 4,2

16

70-81 DCAQGFAKGTYG 2 4,2 0 0,0

17

73-84 QGFAKGTYGGKW 2 4,2 1 2,1

18

76-87 AKGTYGGKWGDV 1 2,1 0 0,0

19

79-90 TYGGKWGDVYTV 2 4,2 0 0,0

20

82-93 GKWGDVYTVTSN 9 18,8 7 14,6

21

85-96 GDVYTVTSNLDD 2 4,2 1 2,1

22

88-99 YTVTSNLDDDVA 4 8,3 4 8,3

23

91-102 TSNLDDDVANPK 2 4,2 1 2,1

24

94-105 LDDDVANPKEGT 2 4,2 1 2,1

25

97-108 DVANPKEGTLRF 2 4,2 0 0,0

26

100-111 NPKEGTLRFAAA 0 0,0 0 0,0

27

103-114 EGTLRFAAAQNR 5 10,4 5 10,4

28

106-117 LRFAAAQNRPLW 15 31,3 11 22,9

29

109-120 AAAQNRPLWIIF 4 8,3 3 6,3

30

112-123 QNRPLWIIFKND 11 22,9 9 18,8

31

115-126 PLWIIFKNDMVI 11 22,9 10 20,8

32

118-129 IIFKNDMVINLN 2 4,2 1 2,1

33

121-132 KNDMVINLNQEL 15 31,3 13 27,1

34

124-135 MVINLNQELVVN 2 4,2 2 4,2

35

127-138 NLNQELVVNSDK 1 2,1 1 2,1

36

130-141 QELVVNSDKTID 14 29,2 12 25,0

37

133-144 VVNSDKTIDGRG 14 29,2 9 18,8

38

136-147 SDKTIDGRGVKV 13 27,1 11 22,9

39

139-150 TIDGRGVKVEII 19 39,6 16 33,3

40

142-153 GRGVKVEIINGG 3 6,3 4 8,3

41

145-156 VKVEIINGGLTL 5 10,4 1 2,1

42

148-159 EIINGGLTLMNV 11 22,9 5 10,4

43

151-162 NGGLTLMNVKNI 4 8,3 1 2,1

44

154-165 LTLMNVKNIIIH 15 31,3 9 18,8

45

157-168 MNVKNIIIHNIN 2 4,2 0 0,0

46

160-171 KNIIIHNINIHD 10 20,8 8 16,7

47

163-174 IIHNINIHDVKV 14 29,2 10 20,8

48

166-177 NINIHDVKVLPG 10 20,8 9 18,8

49

169-180 IHDVKVLPGGMI 3 6,3 2 4,2

50

172-183 VKVLPGGMIKSN 5 10,4 4 8,3

51

175-186 LPGGMIKSNDGP 6 12,5 3 6,3

52

178-189 GMIKSNDGPPIL 31 64,6 27 56,3

53

181-192 KSNDGPPILRQA 5 10,4 0 0,0

54

184-195 DGPPILRQASDG 4 8,3 2 4,2

55

187-198 PILRQASDGDTI 3 6,3 1 2,1

56

190-201 RQASDGDTINVA 1 2,1 1 2,1

57

193-204 SDGDTINVAGSS 0 0,0 0 0,0

58

196-207 DTINVAGSSQIW 3 6,3 1 2,1

59

199-210 NVAGSSQIWIDH 11 22,9 8 16,7

60

202-213 GSSQIWIDHCSL 30 62,5 28 58,3

61

205-216 QIWIDHCSLSKS 29 60,4 24 50,0

62

208-219 IDHCSLSKSFDG 3 6,3 2 4,2

63

211-222 CSLSKSFDGLVD 2 4,2 2 4,2

64

214-225 SKSFDGLVDVTL 3 6,3 1 2,1

65

217-228 FDGLVDVTLGST 2 4,2 1 2,1

66

220-231 LVDVTLGSTHVT 4 8,3 4 8,3

67

223-234 VTLGSTHVTISN 6 12,5 2 4,2

68

226-237 GSTHVTISNCKF 20 41,7 16 33,3

69

229-240 HVTISNCKFTQQ 8 16,7 4 8,3

70

232-243 ISNCKFTQQSKA 1 2,1 1 2,1

71

235-246 CKFTQQSKAILL 4 8,3 2 4,2

72

238-249 TQQSKAILLGAD 4 8,3 2 4,2

73

241-252 SKAILLGADDTH 4 8,3 2 4,2

74

244-255 ILLGADDTHVQD 3 6,3 1 2,1

75

247-258 GADDTHVQDKGM 1 2,1 1 2,1

76

250-261 DTHVQDKGMLAT 4 8,3 1 2,1

77

253-264 VQDKGMLATVAF 7 14,6 4 8,3

78

256-267 KGMLATVAFNMF 11 22,9 6 12,5

79

259-270 LATVAFNMFTDN 5 10,4 2 4,2

80

262-273 VAFNMFTDNVDQ 10 20,8 6 12,5

81

265-276 NMFTDNVDQRMP 7 14,6 6 12,5

82

268-279 TDNVDQRMPRCR 3 6,3 2 4,2

83

271-282 VDQRMPRCRFGF 10 20,8 8 16,7

84

274-285 RMPRCRFGFFQV 3 6,3 1 2,1

85

277-288 RCRFGFFQVVNN 4 8,3 1 2,1

86

280-291 FGFFQVVNNNYD 12 25,0 10 20,8

87

283-294 FQVVNNNYDRWG 5 10,4 2 4,2

88

286-297 VNNNYDRWGTYA 10 20,8 4 8,3

89

289-300 NYDRWGTYAIGG 11 22,9 6 12,5

90

292-303 RWGTYAIGGSSA 5 10,4 3 6,3

91

295-306 TYAIGGSSAPTI 13 27,1 11 22,9

92

298-309 IGGSSAPTILCQ 3 6,3 2 4,2

93

301-312 SSAPTILCQGNR 6 12,5 4 8,3

94

304-315 PTILCQGNRFLA 11 22,9 9 18,8

95

307-318 LCQGNRFLAPDD 0 0,0 0 0,0

96

310-321 GNRFLAPDDQIK 5 10,4 4 8,3

97

313-324 FLAPDDQIKKNV 6 12,5 4 8,3

98

316-327 PDDQIKKNVLAR 13 27,1 8 16,7

99

319-330 QIKKNVLARTGT 8 16,7 4 8,3

100

322-333 KNVLARTGTGAA 6 12,5 5 10,4

101

325-336 LARTGTGAAESM 10 20,8 7 14,6

102

328-339 TGTGAAESMAWN 9 18,8 6 12,5

103

331-342 GAAESMAWNWRS 2 4,2 1 2,1

104

334-345 ESMAWNWRSDKD 2 4,2 1 2,1

105

337-348 AWNWRSDKDLLE 4 8,3 3 6,3

106

340-351 WRSDKDLLENGA 3 6,3 1 2,1

107

343-354 DKDLLENGAIFV 30 62,5 27 56,3

108

346-357 LLENGAIFVTSG 27 56,3 24 50,0

109

349-360 NGAIFVTSGSDP 12 25,0 9 18,8

110

352-363 IFVTSGSDPVLT 13 27,1 11 22,9

111

355-366 TSGSDPVLTPVQ 16 33,3 11 22,9

112

358-369 SDPVLTPVQSAG 7 14,6 3 6,3

113

361-372 VLTPVQSAGMIP 4 8,3 1 2,1

114

364-375 PVQSAGMIPAEP 8 16,7 5 10,4

115

367-378 SAGMIPAEPGEA 18 37,5 17 35,4

116

370-381 MIPAEPGEAAIK 6 12,5 4 8,3

117

373-384 AEPGEAAIKLTS 4 8,3 3 6,3

118

376-387 GEAAIKLTSSAG 10 20,8 8 16,7

119

379-390 AIKLTSSAGVLS 16 33,3 10 20,8

120

382-393 LTSSAGVLSCRP 14 29,2 9 18,8

121

385-397 SAGVLSCRPGAPC 6 12,5 2 4,2

5

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65

Ejemplo 3: Caracterización de las cadenas alfa v beta de Amb a 1

nAmb a 1 experimenta proteólisis espontáneamente durante la purificación y se escinde en dos cadenas, cadena alfa y beta, respectivamente. Los datos usando sueros recogidos de pacientes en diversos países (Italia, Canadá y Austria) mostraron que la mayoría de los pacientes (90%) reconocían fuertemente la cadena beta de 12 kDa. En cambio, la cadena alfa se unía débilmente a anticuerpos IgE de sólo el 65% de los pacientes sometidos a prueba (figura 9).

En experimentos dirigidos a la identificación de epítopos de células T (descritos en el ejemplo 2) se encontró que las tres regiones de activación de células T inducían respuestas proliferativas en más del 45% de los pacientes alérgicos y se definieron por tanto como epítopos inmunodominantes (tabla 3, figura 8). De manera interesante, estas y otras regiones de activación de células T están agrupadas en la región C-terminal de Amb a 1, que corresponde a la cadena alfa. Por tanto, al contrario que la investigación publicada anteriormente (King et al. Arch. Biochem. Biophys. 212: 127-135, 1981), los presentes datos en conjunto muestran que las propiedades inmunológicas de las dos cadenas de Amb a 1 difieren. Estos hallazgos incitaron a investigar la posibilidad de producir por separado las cadenas en E. coli y usarlas como vacuna candidata para el diagnóstico y la inmunoterapia de la alergia. La cadena alfa con la capacidad de unión a IgE inferior pero con alta inmunogenicidad (activación de células T) es una herramienta perfecta para la inmunoterapia específica mientras que la cadena beta altamente reactiva con IgE es un candidato para el diagnóstico de la alergia al polen de ambrosía.

Para este fin, se realizaron experimentos para determinar el sitio de escisión exacto para la generación de las cadenas alfa y beta, lo que se describió para Amb a 1 durante su extracción y purificación a partir de polen de ambrosía (King ef al. Inmunochem. 11: 83-92, 1974). Además de la estimación de su peso molecular mediante SDS- PAGE, no se han publicado datos estructurales referentes a las cadenas de Amb a 1. Se analizó Amb a 1 natural purificado (véase King et al. Inmunochem. 11: 83-92, 1974) mediante espectrometría de masas Maldi-TOF y se sometieron las bandas correspondientes a Amb a 1 intacto y cadenas alfa y beta de Amb a 1 a degradación de Edman tras SDS-PAGE/electrotransferencia/tinción de Coomassie. De este modo, fue posible determinar las masas exactas y las secuencias N-terminales de Amb a 1 natural procesado y no procesado (figuras 10-13; tabla 4).

Ejemplo 3.1: Análisis de la secuencia N-terminal

Se separó Amb a 1 natural mediante SDS-PAGE al 15% y se sometió a electrotransferencia sobre membranas de poli(difluoruro de vinilo) (PVDF) (Millipore). Se escindieron las bandas correspondientes a Amb a 1 y sus fragmentos, y se eluyeron las proteínas mediante incubación en ácido trifluoroacético al 30% (v/v) y acetonitrilo al 40% (v/v) acuoso durante 1 hora a temperatura ambiente. Se secaron las muestras a vacío, se resuspendieron en agua y se secuenciaron con el sistema de secuenciación de proteínas HP G1005A (Agilent Technologies).

Ejemplo 3.2: Espectrometría de masas por desorción/ionización por láser asistida por matriz y tiempo de vuelo (MALDI-TOF)

Se usaron los picos moleculares de ácido sinapínico y tripsina de páncreas bovino para la calibración. Se disolvieron 0,5 pl (~ 0,7 pg) de disolución de proteína Amb a 1 natural purificada en presencia de DTT 100 mM y 0,5 pl de una matriz de ácido sinapínico en una disolución saturada de acetonitrilo al 50% (v/v) y ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% (v/v), se mezclaron y se aplicaron al portaobjetos objetivo. Se analizaron las muestras con el espectrómetro de masas Kompact MALDI-TOF IV (Shimadzu) en el modo de vuelo lineal.

Ejemplo 3.3: Resultados

Tomados conjuntamente, los datos (figuras 10-13; tabla 4) permitieron el mapeo exacto de las cadenas alfa y beta en la secuencia de aminoácidos deducida de Amb a 1 e indicaron que varias etapas proteolíticas están implicadas en su generación:

(i) La secuenciación N-terminal del Amb a 1 no procesado mostró que se eliminan 17-20 aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína.

(ii) La cadena beta tiene 138 aminoácidos de longitud y corresponde a la parte N-terminal de Amb a 1 (posición de aminoácido 18 a 155 de la proteína madura, tomando la isoforma Amb a 1.1 como molde).

(iii) La cadena alfa tiene 207 aminoácidos de longitud y corresponde a la parte C-terminal de Amb a 1 (posición de aminoácido 165 a 371 de la proteína madura, tomando la isoforma Amb a 1.1 como molde).

(iv) Se eliminan nueve aminoácidos entre el extremo C-terminal de la cadena beta y el extremo N-terminal de la cadena alfa.

La figura 14 muestra las secuencias de aminoácidos deducidas de isoformas de Amb a 1 con las cadenas alfa y beta supuestas mapeadas sobre sus secuencias.

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Tabla 4: Análisis de espectrometría de masas de Amb a 1 natural

Amb a 1 no procesado Cadena alfa de Amb a 1 Cadena beta de Amb a 1

Calculado Medido Calculado Medido Calculado Medido

nAmb a 1

37.832,14 21.808,54 15.086,31

22.323,24

Amb a 1.1

37.864,43 21.999,50 15.017,04

Amb a 1.2

38.625,71 22.425,10 15.268,56

Amb a 1.3

38.255,30 22.036,77 15.286,49

Amb a 1.4

38.008,93 21.953,62 15.130,29

Amb a 2

39.392,56 22.921,76 15.638,88

Ejemplo 4: Producción recombinante de las cadenas alfa v beta de Amb a 1.3

Ejemplo 4.1: Construcción de plásmidos de expresión y purificación de las cadenas alfa y beta de Amb a 1.3 diseñadas según cadenas procesadas de manera natural

Se realizaron la construcción de plásmidos y la purificación de cadenas tal como se describe en el ejemplo 4.2. Las diferencias en las cadenas se representan en la figura 16. La tabla 5 resume los diferentes constructos para la producción recombinante de cadenas alfa y beta.

Ejemplo 4.2: Producción recombinante de cadenas alfa y beta modificadas (versión 1) de Amb a 1.3

Los presentes experimentos demostraron que la producción separada de las cadenas modificadas es mucho más eficaz que la producción de la molécula de Amb a 1.3 de longitud completa. El rendimiento de producción de la cadena alfa fue de aproximadamente 100 mg/1 I de cultivo de fermentación. Además, no se observó formación significativa de agregados para cadenas tanto alfa como beta (figura 18).

Ejemplo 4.2.1: Construcción de plásmidos

A partir del clon R2 original, se realizó una PCR convencional de 100 pl con cebadores diseñados según las cadenas modificadas. Se eluyeron los productos de PCR del gel de agarosa con el sistema de limpieza Wizard Gene (Promega). Ambos conjuntos de cebadores (para beta y alfa) incluían un sitio Ncol en el extremo 5’ y un codón de terminación más un sitio Xhol en el extremo 3’. Con estas enzimas, se digirieron los fragmentos de PCR y el vector pHisparallel-2 durante la noche a 372C. Tras la elución del gel de agarosa (sistema de limpieza Wizard Gene, Promega), se ligaron los fragmentos de PCR en el vector usando un protocolo de ligamiento convencional con ADN ligasa de T4 (Invitrogen). Se usó la reacción de ligamiento para transformar la cepa bacteriana TG1 (K12, D(lac-pro), supE, thi, hsdD5/F’[traD36, proA+B+, laclq, lacZDM15j) por medio de electroporación. Tras la siembra en placa de 100 pl de la transformación, se incubaron las placas de agar de LBamp durante la noche a 372C. Se usó el examen de colonias por PCR para seleccionar clones positivos. (Se usa una pequeña cantidad de colonia bacteriana como molde para la PCR convencional con cebador de clonación). Se usaron clones seleccionados para cultivos en SB de 50 mi y purificación de plásmidos. Se secuenciaron los insertos con el kit de secuenciación ABI. Se usaron plásmidos con la secuencia correcta para transformar las cepas bacterianas BL21 y Rosetta-gami B (DE3)pLysS (Novagen). Los experimentos preliminares mostraron que se lograban niveles de expresión superiores con la cepa de E. coli Rosetta-gami B (DE3)pLysS (figura 17).

Ejemplo 4.2.2: Expresión y purificación de cadenas alfa y beta de Amb a 1.3 modificadas (versión 1)

Se hicieron crecer 10-20 clones de bacterias recién transformadas en SB hasta una DOsoo de 0,5-0,7 y luego se indujeron con IPTG 0,4 mM. Se realizó la expresión durante 4-5 h y entonces se sedimentó el cultivo mediante centrifugación (5.000 g). Se resuspendió el sedimento bacteriano en tampón de inicio (fosfato de Na 25 mM pH 8,0; NaCI 1 M). Se lisaron las células mediante congelación 3x en nitrógeno líquido y descongelación a 252C. Se trató la suspensión con lisozima (5 mg/ml), ADNasa (0,5 pg/ml) y se sonicó durante 5 minutos. Tras la centrifugación (15.000 g) se resuspendieron los sedimentos en tampón de inicio con urea (tampón de inicio + urea 6 M + imidazol 10 mM). Tras la centrifugación (15.000 g), se cargó el sobrenadante sobre una columna HisTrap N¡2+ (Amersham). Se realizó la elución mediante gradiente con tampón de elución (tampón de inicio con urea + imidazol 400 mM). Se reunieron las fracciones y se dializaron 3 veces frente a L-Arg 500 mM pH 8,5. Después de eso, se dializaron las proteínas frente a PBS. Se usaron cadenas alfa y beta de Amb a 1.3 purificadas (figura 18) para los ensayos de unión a IgE y proliferación de células T.

Ejemplo 4.2.3: Respuestas de células T a cadenas alfa y beta de Amb a 1.3 modificadas (versión 1)

En comparación con los resultados del reconocimiento de epítopos de células T en la tabla 3, 45/46 pacientes (98%) reconocieron uno o más epítopos en la cadena alfa de Amb a 1. Por tanto, se sometieron a prueba las respuestas de

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células T a cadenas alfa y beta de Amb a 1.3 modificadas (versión 1) en ensayos de proliferación usando TCL (n=6) y TCC (n=2) reactivos con Amb a 1 disponibles, descritos en el ejemplo 2.

Ejemplo 4.3: Producción recombinante

La producción de cadenas alfa y beta diseñadas según Amb a 1 procesado de manera natural no fue muy alentadora, con rendimientos muy bajos. Sin embargo, los datos obtenidos a partir de experimentos de mapeo de epítopos de células T indicaron que no se incluyó un epítopo importante en la cadena alfa, que alberga la mayoría de los dominios reactivos con células T (figura 16; aa 178-189). Por tanto, se diseñaron nuevas cadenas para incluir este epítopo de células T (tabla 5, figura 16).

Ejemplo 4.4: Unión a IgE

Tal como se muestra en el ejemplo 3, las cadenas alfa y beta de Amb a 1 procesadas de manera natural tienen propiedades inmunológicas diferenciadas. La cadena alfa muestra baja reactividad con IgE mientras que la cadena beta contiene la mayoría de los epítopos de IgE de Amb a 1. Por tanto, para someter a prueba la actividad de unión a IgE de la cadena alfa purificada, se realizó un ELISA con sueros de pacientes alérgicos a ambrosía. Los resultados de 12 pacientes confirmaron que la cadena alfa muestra baja / ninguna actividad de unión a IgE in vitro (figura 19). Están llevándose a cabo experimentos para la purificación y caracterización de la cadena beta.

Ejemplo 4.5: Reactividad con células T

De 6 TCL sometidas a prueba, en la figura 20 se muestran 2 TCL con fuerte reactividad frente a Amb a 1. La cadena alfa era mucho más eficaz en la estimulación de la proliferación que la cadena beta (el 82% y el 84% frente al 38 y el 19% de la respuesta a Amb a 1). Este hallazgo puede explicarse por el patrón de reconocimiento de epítopos de estas 2 TCL (véase la tabla 2). Otras dos TCL (figura 21) también reaccionaron con la cadena alfa y/o beta según su perfil de epítopos.

2 TCC específicos para epítopos dentro de Amb a 1-alfa reaccionaron con la cadena alfa pero no con la cadena beta, aunque no tan fuertemente como con Amb a 1.3.

Tabla 5. Cadenas de Amb a 1.3

Cadenas de Amb a 1.3

Posición de aminoácido Longitud

Procesadas de manera natural

alfa 191 -397 207 aminoácidos

beta

44-181 138 aminoácidos

Diseño según el procesamiento de manera natural

alfa 191 -397 208 aminoácidos

beta

26-190 164 aminoácidos

Modificadas (versión 1)

alfa 174-397 224 aminoácidos

beta

26-173 148 aminoácidos

Modificadas (versión 2)

alfa 174-397 224 aminoácidos

beta 46-173 128 aminoácidos

Resumen:

En resumen, se identificaron 26 regiones de activación de células T relevantes de Amb a 1 tomando un Sl>5 como umbral para la positividad (figuras 8 y 22).

En el análisis de epítopos de células T reconocidos por líneas de células T de 48 pacientes diferentes, se encontró que 17/26 epítopos se ubican en la región C-terminal de Amb a 1.3 (cadena alfa) mientras que la cadena beta sólo contiene unos cuantos epítopos de células T que se reconocieron principalmente por sólo el 10-30% de los pacientes (figura 8, tabla 3).

Sin embargo, una secuencia de epítopo de células T relevante/inmunodominante reconocida por más del 50% de los pacientes se elimina por escisión en las cadenas que se producen de manera natural (estaría sólo parcialmente representada en la cadena alfa). Con el fin de cubrir esta importante región de activación de células T, la invención incluye la modificación de la cadena alfa añadiendo 16 residuos de aminoácido del extremo C-terminal de la cadena beta al extremo N-terminal de la cadena alfa (versión modificada 1; figura 16, tabla 5). Por tanto, el constructo modificado (versión 1) de la cadena alfa de Amb a 1.3 incluye los 3 epítopos de células T más frecuentemente reconocidos de Amb a 1 (figura 22).

El uso de la cadena alfa completa de Amb a 1.3 (versión modificada 1) como vacuna para la alergia al polen de ambrosía cubriría al 100% de los pacientes sometidos a prueba (n=48).

El uso de una combinación de los tres epítopos de células T inmunodominantes identificados en el presente

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   Formulación de vacuna que comprende un péptido que consiste en SEQ ID No. 52.

   Formulación de vacuna según la reivindicación 1, que comprende los péptidos SEQ ID No. 52 y SEQ ID No. 137; SEQ ID No. 52 y SEQ ID No. 138; SEQ ID No. 52 y SEQ ID No. 139; SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 137 y SEQ ID No. 138; SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 138 y SEQ ID No. 139; SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 137 y SEQ ID No. 139; o SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 137, SEQ ID No. 138 y SEQ ID No. 139.

   Formulación de vacuna según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la formulación comprende además al menos un adyuvante, excipiente y/o portador farmacéutico aceptable.

   Péptido derivado del alérgeno de polen de ambrosía Amb a 1 y que consiste en una secuencia de aminoácido que consiste en SEQ ID No. 52 y variantes de la misma que difieren en un residuo de aminoácido.

   Proteína de fusión que consiste en un péptido según la reivindicación 4 y al menos un segundo péptido derivado de un inmunógeno, caracterizada porque el inmunógeno es un alérgeno seleccionado del grupo que consiste en Amb a 2, Amb a 3, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 8, Amb a 9, Amb a 10, Amb t 5, Art v 1, Art v 2, Art v 3, Art v 4, Art v 5, Art v 6, Fiel a 1, Fiel a 2, Fiel a 3, Mer a 1, Che a 1, Che a 2, Che a 3, Sal k 1, Cat r 1, Pía 1 1, Hum j 1, Par j 1, Par j 2, Par j 3, Par o 1, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 12, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 5, Fes p 4w, Hol 1 1, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 5, Lol p 11, Phaa 1, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phlp 11, Phlp 12, Phlp 13, Poap 1, Poap 5, Sor h 1, Pho d 2, Aln g 1, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Car b 1, Cas s 1, Cas s 5,

   Cas s 8, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Que a 1, Fra e 1, Lig v 1, Ole e 1, Ole e 2,

   Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Syr v 1, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3w, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1, Pía a 1, Pía a 2, Pía a 3, Acá s 13, Blo 11, Blo t 3, Blo t 4, Blo t 5, Blo t 6, Blo 110, Blo 111, Blo 112, Blo 113, Blo 119, Derf 1, Derf 2, Derf 3, Derf 7, Der f 10, Der f 11, Der f 14, Der f 15, Der f 16, Der f 17, Der f 18w, Der m 1, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 6, Der p 7, Der p 8, Der p 9, Der p 10, Der p 11, Der p 14, Der p 20, Der p 21, Eur m 2, Eur m 14, Gly d 2,Lep d 1, Lep d 2, Lep d 5, Lep d 7, Lep d 10, Lep d 13, Tyr p 2, Tyr p 13, Bos d 2, Bos d 3,

   Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Can f 1, Can f 2, Can f 3, Can f 4, Equ c 1, Equ c 2, Equ c 3,

   Equ c 4, Equ c 5, Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d 4, Fel d 5w, Fel d 6w, Fel d 7w, Cav p 1, Cav p 2, Mus m 1, Rat n 1, Alt a 1, Alt a 3, Alt a 4, Alt a 5, Alt a 6, Alt a 7, Alt a 8, Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13, Cía h 2, Cía h 5, Cía h 6, Cía h 7, Cía h 8, Cía h 9, Cía h 10, Cía h 12, Asp fl 13, Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5, Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f 9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 15, Asp f 16, Asp f 17, Asp f 18, Asp f 22w, Asp f 23, Asp f 27, Asp f 28, Asp f 29, Asp n 14, Asp n 18, Asp n 25, Asp o 13, Asp o 21, Pen b 13, Pen b 26, Pen ch 13, Pen ch 18, Pen ch 20, Pen c 3, Pen c 13, Pen c 19, Pen c 22w, Pen c 24, Pen o 18, Fus c 1, Fus c 2, Tri r 2, Tri r 4, Tri 11, Tri t 4, Cand a 1, Cand a 3, Cand b 2, Psi c 1, Psi c 2, Cop c 1, Cop c 2, Cop c 3, Cop c 5, Cop c 7, Rho m 1, Rho m 2, Mala f 2, Mala f 3, Mala f 4, Mala s 1, Mala s 5, Mala s 6, Mala s 7, Mala s 8, Mala s 9, Mala s 10, Mala s 11, Mala s 12, Mala s 13, Epi p 1, Aed a 1, Aed a 2, Api m 1, Api m 2, Api m 4, Api m 6, Api m 7, Bom p 1, Bom p 4, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Bla g 6, Bla g

   7, Bla g 8, Pera 1, Per a 3, Per a 6, Per a 7, Chi k 10, Chi t 1-9, Chi t 1.01, Chi t 1.02, Chit 2.0101, Chi t
2. 2.0102, Chi t 3, Chi 14, Chi t 5, Chi t 6.01, Chi t 6.02, Chi t 7, Chi t 8, Chi t 9, Cte f 1, Cte f 2, Cte f 3, Tha p

   1, Lep s 1, Dol m 1, Dol m 2, Dol m 5, Dol a 5, Pol a 1, Pol a 2, Pol a 5, Pol d 1, Pol d 4, Pol d 5, Pol e 1, Pol

   e 5, Pol f 5, Pol g 5, Pol m 5, Vesp c 1, Vesp c 5, Vesp m 1, Vesp m 5, Ves f 5, Ves g 5, Ves m 1, Ves m 2, Ves m 5, Ves p 5, Ves s 5, Ves vi 5, Ves v 1, Ves v 2, Ves v 5, Myr p 1, Myr p 2, Sol g 2, Sol g 4, Sol i 2, Sol i 3, Sol i 4, Sol s 2, Tria p 1, Gad c 1, Sal s 1, Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Gal d 1, Gal d 2, Gal d 3, Gal d 4, Gal d 5, Met e 1, Pen a 1, Pen i 1, Pen m 1, Pen m 2, Tod p 1, Fiel as 1, Hal m 1, Ran e 1, Ran e 2, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Bra r 2, Flor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Flor v 21, Sec c 20, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 25, Tri a 26, Zea m 14, Zea m 25, Ory s 1, Api g 1, Api g 4, Api g 5, Dau c 1, Dau c 4, Cor a 1.04, Cor a 2, Cor a 8, Fra a 3, Fra a 4, Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Mal d 4, Pyr c 1, Pyr c 4, Pyr c 5, Pers a 1, Pru ar 1, Pru ar 3, Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru av 4, Pru d 3, Pru du 4, Pru p 3, Pru p 4, Aspa o 1, Cro s 1, Cro s 2, Lac s 1, Vit v 1, Mus xp 1, Ana c 1, Ana c 2, Cit 1 3, Cit s 1, Cit s 2, Cit s 3, Lit c 1, Sin a 1, Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Vig r 1, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Len c 1, Len c 2, Pis s 1, Pis s 2, Act c 1, Act c 2, Cap a 1 w, Cap a 2, Lyc e 1, Lyc e 2, Lyc e 3, Sola t 1, Sola t 2, Sola t 3, Sola 14, Ber e 1, Ber e 2, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Ric c 1, Ses i 1, Ses i 2, Ses i 3, Ses i 4, Ses i 5, Ses i 6, Cuc m 1, Cuc m 2, Cuc m 3, Ziz m 1, Ani s 1, Ani s 2, Ani s 3, Ani s 4, Arg r, Ase s 1, Car p 1, Den n 1, Flev b 1, Flev b 2, Flev b 3, Flev b 4, Flev b 5, Flev b 6.01, Hev b 6.02, Hev b 6.03, Hev b 7.01, Hev b 7.02, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Flom s 1, Flom s 2, Flom s 3, Flom s 4, Flom s 5 y Trip s 1.

   Proteína de fusión según la reivindicación 5, que comprende además al menos un péptido derivado del alérgeno de polen de ambrosía Amb a 1 y que consiste en una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 39, SEQ ID

   10
3. 7.
4. 8.
5. 9.

   20
6. 10.

   25 11.

   30 12.

   35 13.

   No. 41, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78, SEQ ID No. 79, SEQ ID No. 80, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 83, SEQ ID No. 86, SEQ ID No. 87, SEQ ID No. 88, SEQ ID No. 89, SEQ ID No. 90, SEQ ID No. 91, SEQ ID No. 93, SEQ ID No. 94, SEQ ID No. 96, SEQ ID No. 97, SEQ ID No. 98, SEQ ID No. 99, SEQ ID No. 100, SEQ ID No. 101, SEQ ID No. 102, SEQ ID No. 107, SEQ ID No. 108, SEQ ID No. 109,

   
   SEQ ID No. 110, SEQ ID No. 111, SEQ ID No. 112, SEQ ID No. 114, SEQ ID No. 115, SEQ ID No. 118,

   
   SEQ ID No. 119, SEQ ID No. 120, SEQ ID No. 121, SEQ ID No. 122, SEQ ID No. 123, SEQ ID No. 124,

   
   SEQ ID No. 125, SEQ ID No. 126, SEQ ID No. 127, SEQ ID No. 128, SEQ ID No. 129, SEQ ID No. 130,

   
   SEQ ID No. 131, SEQ ID No. 132, SEQ ID No. 133, SEQ ID No. 134, SEQ ID No. 135, SEQ ID No. 136,

   SEQ ID No. 137, SEQ ID No. 138 y SEQ ID No. 139.

   Molécula de ácido nucleico que codifica para un péptido según la reivindicación 4 o una proteína de fusión según la reivindicación 5 ó 6.

   Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7.

   Vector según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho vector comprende además un promotor operativamente unido a dicha molécula de ácido nucleico.

   Formulación de vacuna que comprende al menos una proteína de fusión según la reivindicación 5 ó 6, que comprende preferiblemente además al menos un adyuvante, excipiente y/o portador farmacéutico aceptable.

   Uso de al menos un péptido según la reivindicación 4 y/o de una proteína de fusión según la reivindicación 5 ó 6 para la fabricación de una formulación de vacuna, preferiblemente para prevenir o tratar una alergia al polen de ambrosía en un individuo, en particular una alergia provocada por Amb a 1, o una alergia que reacciona de manera cruzada con una alergia al polen de ambrosía.

   Uso de al menos un péptido según la reivindicación 4 y/o al menos una proteína de fusión según la reivindicación 5 ó 6 para diagnosticar in vitro una alergia a ambrosía o la sensibilidad de un individuo a un alérgeno de polen de ambrosía, en particular a Amb a 1, o una alergia que reacciona de manera cruzada con una alergia al polen de ambrosía.

   Péptido según la reivindicación 4 o proteína de fusión según la reivindicación 5 ó 6, para su uso en la prevención o el tratamiento de una alergia al polen de ambrosía en un individuo, en particular una alergia provocada por Amb a 1, o una alergia que reacciona de manera cruzada con una alergia al polen de ambrosía.