ES2367633T3 - Derivados de phl p 5a con alergenicidad reducida y reactividad frente a células t mantenida. - Google Patents
Derivados de phl p 5a con alergenicidad reducida y reactividad frente a células t mantenida. Download PDFInfo
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Abstract
Variantes del alérgeno Phl p 5a del grupo 5, las cuales, en comparación con los alérgenos conocidos de tipo salvaje, presentan una reactividad IgE reducida y mantienen en gran parte la reactividad con linfocitos T, caracterizadas porque en comparación con los alérgenos de tipo salvaje conocidos les falta un segmento que corresponde al segmento de la secuencia de aminoácidos 94 - 113 del PhI p 5a o los segmentos que corresponden a los segmentos de la secuencia de aminoácidos 94 - 113 y 175 - 198.
Description
La presente invención trata de la preparación y uso de variantes del alérgeno principal Phl p 5a a partir del polen de hierba timotea (Phleum pratense), las cuales, en comparación con los alérgenos conocidos de tipo salvaje, presentan una reactividad IgE reducida y mantienen en gran parte una reactividad con linfocitos T, caracterizadas porque en comparación con los alérgenos de tipo salvaje les falta un segmento que corresponde al segmento de la secuencia de aminoácidos 94 – 113 de PhI p 5a o los segmentos que corresponden a los segmentos de la secuencia de aminoácidos 94 – 113 y 175 – 198 de PhI p 5a.
Estas variantes de alérgenos hipoalergénicas pueden utilizarse para inmunoterapia específica (hiposensibilización) de pacientes con alergia al polen de gramíneas o para inmunoterapia preventiva de alergias al polen de gramíneas.
Antecedentes de la invención
Las alergias del tipo 1 tienen importancia en todo el mundo. Hasta un 20% de la población de los países industrializados sufre de dolencias como rinitis alérgica, conjuntivitis o asma bronquial. Estas alergias son provocadas por alérgenos presentes en el aire (aeroalérgenos), que son liberados por fuentes de diferente procedencia, como polen de plantas, ácaros, gatos o perros. Hasta el 40% de estos alérgicos de tipo 1 muestran además reactividad IgE específica con alérgenos del polen de gramíneas (Freidhoff y col., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78,1190-2002).
Las sustancias desencadenantes de las alergias de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. En personas sensibilizadas, tras la absorción en las mucosas estos alérgenos reaccionan con los anticuerpos IgE que están unidos a la superficie de los mastocitos. Cuando dos moléculas de IgE se enlazan a través de un alérgeno se produce la liberación de mediadores (p. ej., histamina, prostaglandinas) y citoquinas mediante las células efectoras y con ello se desencadenan los correspondientes síntomas clínicos.
Dependiendo de la frecuencia relativa con la que las moléculas de alérgeno individuales reaccionan con los anticuerpos IgE de los alérgicos, se diferencia entre alérgenos mayores y menores.
En el caso de la hierba timotea (Phleum pratense) hasta el momento se han identificado como alérgenos principales Phl p 1 (Petersen y col., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796), Phl p 5 (Mat-thiesen y Löwenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen y col., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109), Phl p 6 (Petersen y col., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54). Phl p 2/3 (Dolecek y col., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), Phl p 4 (Haavik y col., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta y col., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol.
97: 287-294, Fischer y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:189-198) y Phl p 13 (Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).
Los alérgenos principales dominantes de la hierba timotea (Phleum pratense) son Phl p 1 y Phl p 5, donde Phl p 5 se presenta en dos formas diferentes en cuanto a su masa molecular 5a y 5b, que están codificadas por genes independientes. Las secuencias de aminoácidos deducidas tanto para Phl p 5a como para Phl p 5b se pudieron determinar mediante la técnica del ADN recombinante. Phl p 5a es una proteína de aprox. 32 kDa y reacciona con los anticuerpos IgE del 85 - 90% de los alérgicos al polen de gramíneas. Phl p 5a existe en una serie de variantes homólogas que se diferencian entre sí mediante mutaciones puntuales y probablemente corresponden a diferentes formas alélicas. El polen de las especies de gramíneas empleadas como p.ej. Lolium perenne, Poa pratensis, entre otros, contienen alérgenos que son homólogos a Phl p 5a y se designan conjuntamente como alérgenos del grupo 5. La elevada homología estructural de estos alérgenos del grupo 5 del tipo gramínea condiciona una correspondiente reactividad cruzada elevada de las moléculas con los anticuerpos IgE de los alérgicos al polen de gramíneas.
La inmunoterapia específica o hiposensibilización representa una aproximación clásica al tratamiento terapéutico eficaz de las alergias (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet y col., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4): 558-562). Así, se inyectan de forma subcutánea a los pacientes extractos de alérgenos naturales en dosis crecientes. No obstante, con este método existe el peligro de reacciones alérgicas o incluso de un choque anafiláctico. Para minimizar estos riesgos se emplean preparados innovadores en forma de alergoides. Se trata de extractos de alérgenos modificados químicamente que presentan una reactividad IgE claramente reducida, aunque presentan idéntica reactividad frente a células T en comparación con el extracto no tratado (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382).
Sería posible una optimización más amplia de la terapia con alérgenos preparados de forma recombinante. Cócteles definidos, dado el caso basados en el patrón de sensibilización individual del paciente, de alérgenos recombinantes de elevada pureza podrían reemplazar a los extractos de fuentes de alérgenos naturales, ya que éstos, aparte de los diferentes alérgenos, contienen una gran cantidad de proteínas acompañantes inmunogénicas pero no alergénicas.
Perspectivas realistas, que podrían conducir a una hiposensibilización segura con productos de expresión recombinantes, ofrecen alérgenos recombinantes mutados dirigidos en los cuales se han eliminado de forma 5 específica epítopos IgE, sin perjudicar a los epítopos de células T esenciales para la terapia (Schramm y col., 1999,
J. Immunol. 162: 2406-2414).
Otra posibilidad para influenciar terapéuticamente sobre el equilibrio alterado de células T auxiliares en los alérgicos es el tratamiento con ADN capaz de expresarse que codifica para los alérgenos relevantes (vacunación con ADN inmunoterapéutico). Las primeras pruebas experimentales de la influencia alergenoespecífica de la respuesta
10 inmune mediante una vacuna de ADN de este tipo se obtuvieron en roedores mediante la inyección de ADN codificante de alérgeno (Hsu y col., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544).
Así pues, el objetivo en que se basa la presente invención consistió en la preparación de nuevas variantes de alérgenos del grupo 5 PhI p 5a a nivel de proteína y ADN, que se caracterizan por una actividad IgE reducida con un mantenimiento amplio de la reactividad frente a células T y por eso son adecuados para la inmunoterapia específica,
15 así como para la vacunación inmunoterapéutica con ADN.
Figuras
Figura 1: Alineación de fragmentos relevantes de secuencias de ADNc homólogas a Phl p 5a de la especie Pooideae: Lolium perenne (Lol p), Poa pratensis (Poa p) Triticum aestivum (Tri a) y Hordeum vulgare (Hor v) Numeración: posiciones de los nucleótidos de las entradas de ADN
20 Secuencias de Phl p 5a, Poa p 5 y Lol p 5: secuencias de ADNc de la base de datos “Gen-Bank” del centro National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, EE.UU.
Secuencias Hor v y Tri a: secuencias EST de la base de datos EST del instituto Institute for Genomic Research
(TIGR),Rockville,EE.UU.
Marco continuo: identidad de la secuencia para Phl p 5a (referido a GenBank AJ555152)
25 Marco de puntos: deleción correspondiente a los aminoácidos 94-113 (referido a GenBank AJ555152)
Línea discontinua: deleción correspondiente a los aminoácidos 175-198 (referido a GenBank AJ555152)
Figura 2: Alineación de secuencias de aminoácidos homólogas a Phl p 5a (fragmentos de secuencia relevantes deducidos a partir de secuencias de ADN) de las especies Pooideae: Lolium perenne (Lol p), Poa pratensis (Poa p) Triticum aestivum (Tri a) y Hordeum vulgare (Hor v)
30 Numeración: posiciones de los nucleótidos de las entradas de ADN Secuencias de Phl p 5a, Poa p 5 y Lol p 5: secuencias de ADNc de la base de datos “Gen-Bank” del centro National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, EE.UU.
Secuencias Hor v y Tri a: secuencias EST de la base de datos EST del instituto Institute for Genomic Research (TIGR),Rockville,EE.UU.
35 Marco continuo: identidad de la secuencia para Phl p 5a (referido a GenBank AJ555152)
Marco de puntos: deleción correspondiente a los aminoácidos 94-113 (referido a GenBank AJ555152)
Marco discontinuo: deleción correspondiente a los aminoácidos 175-198 (referido a GenBank AJ555152)
Figura 3: SDS-PAGE de mutantes de deleción puros en forma de proteínas de fusión con histidina
1) Marcador
40 2) rPhl p 5a wt (His)
3) Phl p 5a DM-D94-113 (His)
4) Phl p 5a DM-D94-113, 175-198 (His)
5) Phl p 5a DM-D175-198 (His)
6) Marcador
Figura 4: SDS-PAGE de las proteínas sin fusionar puras Phl p 5a DM-D94-113, 175-198 y rPhl p 5a wt (arriba) y
ensayo de identidad con anticuerpos aPhl p 5 (abajo)
El aPhl p 5 mAb Apha-1D11 enlaza la región 175-198 (sólo rPhl p 5a wt es positivo)
El aPhl p 5 mAb Apha-3B2 enlaza un epítopo común de ambas moléculas PhI p 5a (ambas proteínas son positivas)
(mAb: anticuerpo monoclonal)
Figura 5: Cromatografía analítica SEC del mutante de deleción Phl p 5a DM-D94-113,175-198 y del tipo salvaje Phl p
5a recombinante (proteína no fusionada pura)
Columna: Superdex 75 HR10/30 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia)
Eluyente: PBS
Flecha: volumen de exclusión
Figura 6: Isoelectroenfoque no desnaturalizante del mutante de deleción Phl p 5a DM-D94-113,175-198 y del tipo
salvaje Phl p 5a recombinante (proteína no fusionada pura)
1) Marcador IEF
2) rPhl p 5a wt
3) Phl p 5a DM-D94-113, 175-198
pl rPhl p 5a wt = 8,7
pI rPhl p 5a DM-D94-113,175-198 = 6,4
Figura 7: Ensayo con tiras reactivas para comprobar la capacidad de enlace IgE de los mutantes de deleción de Phl
p5a(nodesnaturalizante)
P: sueros de alérgicos al polen de gramíneas clínicamente definidos
Figura 8: Prueba de la reactividad IgE reducida de los mutantes de deleción de Phl p 5a mediante un ensayo de inhibición EAST con dos sueros individuales representativos (a y b) y una mezcla de sueros (c)
Phl p 5a DM-94-113 (His)
Phl p 5a DM-175-198 (His)
Phl p 5a DM-94-113, 175-198
Phl p 5a DM-94-113, 175-198 (His)
P: sueros de alérgicos al polen de gramíneas clínicamente definidos
Figura 9: Prueba de la hipoalergenicidad del mutante de deleción de Phl p 5a Phl p 5a DM-D94-113, 175-198 mediante un ensayo de activación de basófilos con basófilos de seis alérgicos al polen de gramíneas diferentes (P) Descripción detallada de la invención
Mutagénesis y clonación de secuencias de ADNc
El punto de partida para las variantes de PhI p 5a hipoalergénicas especialmente preferidas según la invención es el ADNc de una isoforma del tipo salvaje de PhI p 5a, que se aisló con ayuda de un cebador específico mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) a partir del ADNc completo del polen de hierba timotea (Phleum pratense) (NCBI (National Centrer for Biotechnology Information, Betesda, EE.UU.) GenBank número AJ555152) (SEC ID Nº 1). A partir de la secuencia de ADNc se pudo deducir la secuencia de aminoácidos según SEC ID Nº 2. El Phl p 5a, que consta de 284 aminoácidos, se expresó en el citosol de E. coli en forma de proteína soluble y a continuación se purificó. Esta forma de tipo salvaje recombinante de Phl p 5a (rPhl p 5a wt) reacciona con anticuerpos monoclonales anti-Phl p 5 y con anticuerpos IgE de alérgicos al polen de gramíneas que presentan una reactividad con Phl p 5a natural puro (nPhl p 5a).
A partir del ADNc descrito de rPhl p 5a wt, se preparó una serie de variantes de deleción diferentes (mutantes de deleción) mediante procedimientos de restricción/ligación y PCR y se ligó en un vector de expresión pProExHTa (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). Se delecionaron segmentos de 6 a 72 pares de bases de longitud distribuidos por toda la secuencia de la molécula de ADNc, por lo cual se indujeron las deleciones correspondientes en la cadena polipeptídica de las proteínas expresadas en E. coli.
La capacidad de enlace de las variantes de deleción de PhI p 5a con anticuerpos IgE de una mezcla de sueros representativa de alérgicos al polen de gramíneas se estudió mediante inmunotransferencia.
En este procedimiento se descubrieron sorprendentemente dos variantes de deleción de Phl p 5a (Phl p 5a DM-94113, deleción de los aminoácidos 94-113 y Phl p 5a DM-175-198, deleción de los aminoácidos 175-198 de rPhl p 5a wt), que presentan una unión reducida con anticuerpos IgE (mezcla de sueros representativa).
Estas dos deleciones de PhI p 5a sirvieron de punto de partida para la construcción de un mutante de deleción doble, que contiene ambas deleciones eficaces (Phl p 5a DM -94-113, 175-198).
La construcción por ingeniería genética de Phl p 5a DM-94-113, Phl p 5a DM-175-198 y Phl p 5a DM-94113,175-198, así como su caracterización bioquímica e inmunológica se describen a continuación.
Para la construcción de la variante de deleción Phl p 5a DM-94-113 (SEC ID Nº 3, secuencia ADNc (795 pares de bases), y SEC ID Nº 4, secuencia de aminoácidos (264 aa)) se prepararon en primer lugar dos fragmentos a partir del ADNc de rPhl p 5a wt. El fragmento “F1-93“, que codifica para los aminoácidos 1-93 de rPhl p 5a wt, se preparó mediante PCR con ayuda de los cebadores 1 y 5, y el fragmento “F114-284“ con ayuda de los cebadores 4 y 6 (secuencias de cebadores, ver Tab. 1). Los fragmentos "F1-93" y "F114-284" se utilizaron como matriz en otra PCR bajo el uso de los cebadores 1 y 4, lo que resultó en la amplificación del ADNc completo que codifica para la variante de deleción Phl p 5a DM-94-113. La base de la unión de los fragmentos "F1-93" y “F114-284" mediante PCR fue un fragmento de la secuencia común a ambos fragmentos. Este fragmento de la secuencia se formó porque el fragmento “F114-284” se amplificó por PCR mediante un oligonucleótido sentido especial, el cual contiene en la zona 5’ una secuencia adicional de ADN que codifica para los aminoácidos 88-93 (Tab. 1).
La secuencia de ADNc que codifica para la variante de deleción Phl p 5a DM-175-198 (SEC ID Nº 5, secuencia de ADNc (783 pares de bases), y SEC ID Nº 6, secuencia de aminoácidos (260 aa)) se generó por restricción y a continuación ligación de dos fragmentos de ADNc preparados por separado. El fragmento 5’ terminal “F1-174“ se preparó con ayuda de los cebadores 1 y 2 y el fragmento 3’ terminal “F199-284” con ayuda de los cebadores 3 y 4 mediante PCR. Los fragmentos de ADNc se digirieron con el enzima de restricción Spel y a continuación se ligaron (ver Tab. 1). El producto de ligación se multiplicó mediante el uso de los cebadores 1 y 4 mediante PCR.
El ADNc de la variante de deleción Phl p 5a DM-94-113, 175-198 (SEC ID Nº 7, secuencia ADNc (723 pares de bases), y SEC ID Nº 8, secuencia de aminoácidos (240 aa)) se preparó asimismo a partir de dos fragmentos de ADNc. El fragmento 5’ terminal se generó con los cebadores 1 y 5 y con el ADNc de rPhl p 5a wt como matriz, y el fragmento 3’ terminal con los cebadores 4 y 6 con el ADNc de Phl p 5a DM-175-198 como matriz. A través del fragmento de secuencia común correspondiente a los aminoácidos 88-93 de la proteína rPhl p 5a wt se enlazaron los fragmentos mediante una tercera PCR con los cebadores 1 y 4 y se amplificó el producto.
Los ADNc codificantes para los alérgenos modificados se ligaron sobre los sitios de corte de restricción EheI y HindIII en el vector de expresión pProExHT (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) y a continuación se secuenciaron completamente.
La reactividad cruzada inmunológica de los alérgenos del grupo 5 de Pooideae, como p.ej. Poa pratensis y Lolium perenne, se basa en una secuencia de aminoácidos muy parecida. Se considera seguro que los genes correspondientes se remontan a un gen progenitor común. Tanto para las secuencias de las deleciones 94-113 y 175-198 de la secuencia proteínica de Phl p 5a wt (referencia: GenBank AJ555152) como para los segmentos de secuencia que las acompañan, existen segmentos de secuencia homólogos en los alérgenos del grupo 5 de Pooideae. La elevada homología de los segmentos de secuencia en cuestión se puede comprobar tanto a nivel de ADN como de la secuencia de aminoácidos (Fig. 1 y Fig. 2).
Tabla 1: Lista de los cebadores PCR utilizados para la preparación de variantes de deleción
- Cebador
- SEC ID Nº Dirección Secuencia (5’→3’)
- 1
- 9 sentido gcc gat cta ggc tac ggc ccg gcc
- 2
- 10 antisentido aac ata act agt ggc agc gac ctt gaa ggc ggc gtc
- 3
- 11 sentido atc ta act agt acg ggc ggc gcc tac gaga
- 4
- 12 antisentido aac ata aag ctt tca gac ttt gta gcc acc agt
- 5
- 13 antisentido gga gct gga ttc ggc ggc gcc ctt ggg
- 6
- 14 sentido gcc gcc gaa tcc agc tcc ggc gcg acg cct gag gcc aag tac gac
5
Los sitios de restricción Spel se indican mediante subrayado.
Expresión y purificación de moléculas de PhI p 5a recombinantes
La expresión de las proteínas recombinantes se realizó como proteínas de fusión con histidina con sitios de corte de proteasa integrados (vector de expresión pProExHT; Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.) para una división opcional de la 10 parte de fusión con histidina (His) en Escherichia coli (cepa JM109). En primer lugar, rPhl p5a wt así como los mutantes de deleción se purificaron a través del enlace específico de los restos de histidina N-terminales sobre una matriz de quelato-Ni2+ (cromatografía de afinidad por ion metálico inmovilizado, IMAC, por sus siglas en inglés) y a continuación a través de una filtración en gel preparativa (cromatografía de exclusión por tamaño, SEC, por sus siglas en inglés). La pureza de las proteínas eluidas se controló a través de SDS-PAGE y SEC analítica. Los
15 resultados mostraron que rPhl p 5a wt (His), Phl p 5a DM-94-113 (His); Phl p 5a DM-175-198 (His) y Phl p 5a DM94-113, 175-198 (His) se pueden presentar con elevada pureza y en forma de monómero (Fig. 3). La identidad de las proteínas se comprobó a través de anticuerpos monoclonales específicos de PhI p 5a.
La comprobación de la reactividad IgE mediante técnicas de enlace con IgE (inmunotransferencia sobre membranas, ensayo con tiras reactivas, ensayo de inhibición EAST y ensayo de activación de basófilos) así como la investigación 20 de la reactividad frente a células T se realizó, además, con sustancias de ensayo sin la parte de fusión con histidina. En primer lugar se prepararon las variantes de deleción en paralelo con la proteína de referencia rPhl p 5a-wt, como proteína de fusión. Sin embargo, a continuación se cortó enzimáticamente la parte de fusión con histidina (proteasa TEV, Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) por lo cual únicamente quedó una glicina como resto de la secuencia de corte de la proteasa en el extremo N-terminal de la proteína objetivo. Tanto la parte de histidina dividida como la proteasa 25 utilizada para el corte se separaron completamente mediante IMAC. Tras una SEC preparativa, la pureza y la conformación de las proteínas eluidas se estudiaron mediante SDS-PAGE y SEC analítica, como se presenta para rPhl p 5a wt y los mutantes Phl p 5a DM-94-113,175-198 en las figuras 4 o 5. Todas las proteínas se presentaron puras y en forma de monómero. Un ensayo mediante isoelectroenfoque (IEF) no desnaturalizante de las proteínas no fusionadas mostró siempre una elevada homogeneidad respecto a la carga superficial (ver Fig. 6, p.ej. para Phl p
30 5a DM-94-113, 175-198).
La identidad de las proteínas recombinantes se demostró mediante los anticuerpos monoclonales Anti-Phl p 5 (Allergopharma, Reinbek, Alemania) Apha-1D11 o Apha-3B2 (ver Fig. 4, p.ej. para Phl p 5a DM-94-113,175-198) y secuenciación del extremo N-terminal.
Prueba del enlace IgE reducido de las variantes de deleción de PhI p 5a
35 Un método de ensayo simple para determinar la reactividad IgE de moléculas alergénicas es el estudio del enlace de IgE específicas de sueros de alérgicos con proteínas de ensayo unidas a membranas mediante el ensayo con tiras reactivas.
Para ello, las sustancias de ensayo se enlazan una al lado de otra en la misma concentración y cantidad sobre las tiras de membrana de nitrocelulosa en condiciones no desnaturalizantes. Una serie de estas tiras de membrana pueden incubarse en paralelo con diferentes sueros de alérgicos. Después de una etapa de lavado, los anticuerpos IgE enlazados específicamente se visualizan sobre la membrana a través de una reacción de coloración, proporcionada por un conjugado de Anti-hlgE/ fosfatasa alcalina.
La reactividad IgE de las proteínas recombinantes Phl p 5a wt (His), Phl p 5a DM-94-113 (His), Phl p 5a DM-175198 (His) y Phl p 5a DM-94-113,175-198 (His) se estudió comparativamente utilizando 43 sueros individuales de alérgicos al polen de gramíneas (Fig. 7). Todos los 43 sueros de alérgicos contenían anticuerpos IgE específicos de PhI p 5a que reaccionaron intensamente con Phl p 5a natural (nPhl p 5a, no mostrado aquí) y el equivalente recombinante rPhl p 5a wt (His). Sorprendentemente, se evidenció que los anticuerpos IgE específicos de PhI p 5a de todos los 43 sueros de pacientes no se enlazaron nada o de forma muy reducida con la variante de deleción Phl p 5a DM-94-113,175-198 (His). En enlace IgE reducido se debe atribuir tanto a la deleción 94-113 como a la deleción 175-198. La variante de deleción Phl p 5a DM-175-198 (His) muestra en este ensayo una capacidad de enlace IgE claramente reducida en 35 de los 43 sueros de alérgicos. En algunos ensayos la influencia de la deleción de los aminoácidos 175-198 fue tan elevada que se impidió casi completamente el enlace IgE (p.ej.: P3, P20, P28).
La influencia de la deleción 94-113 sobre la reactividad de enlace IgE no es tan acentuada, pero asimismo se puede observar claramente. La variante de deleción Phl p 5a DM-94-113 (His) se enlazó a IgE de forma claramente más débil que la referencia rPhl p 5a wt (His) en 19 de los 43 sueros de alérgicos (p.ej.: P31, P37, P42). Sin embargo, la reducción del enlace IgE en muchos ensayos individuales fue menos drástica que la reducción provocada por 175-198.
Por consiguiente, es evidente que ambas deleciones contribuyen a la reducción de la reactividad de enlace IgE total del mutante de deleción Phl p 5a DM-94-113,175-198 (His).
A diferencia del ensayo de tiras reactivas, las interacciones IgE / alérgenos pueden estudiarse en disolución con el ensayo de inhibición EAST (ensayo enzimático alergoabsorbente), con lo cual en principio puede excluirse un enmascaramiento molesto de los epítopos de las sustancias de ensayo por la inmovilización en la membrana. El ensayo de inhibición EAST se lleva a cabo como sigue. Las placas de microtitulación se recubren con alérgenos, en este caso el PhI p 5 natural (nPhl p 5a/b, mezcla de Phl p 5a y Phl p 5b). Tras eliminar mediante lavado las moléculas de alérgeno no enlazadas, la placa se bloquea con albúmina de suero bovino para prevenir posteriores enlaces no específicos. Los anticuerpos IgE de alérgicos, como mezcla representativa de sueros individuales (mezcla de sueros) o como suero individual, se incuban con las placas de microtitulación recubiertas de alérgenos en un diluyente adecuado. La cantidad de anticuerpos IgE enlazados a alérgenos se cuantifica fotométricamente mediante un enzima acoplado a un anticuerpo secundario (conjugado Anti-hlgE/ fosfatasa alcalina) a través de la conversión de un sustrato a un producto final coloreado. El enlace de los anticuerpos IgE se inhibe específicamente según la sustancia a través de un alérgeno soluble o la sustancia a ensayar (alérgeno recombinante modificado) dependiendo de la concentración. Sustancias idénticas inmunoquímicamente muestran curvas de inhibición idénticas.
Como moléculas de referencia en este trabajo se emplearon nPhl p 5, rPhl p 5a wt, así como la proteína de fusión con histidina rPhl p 5a wt (His). Entre otras moléculas, se ensayó el enlace IgE de las proteínas de fusión con histidina Phl p 5a DM-94-113 (His), Phl p 5a DM-175-198 (His) y Phl p 5a DM-94-113,175-198 (His) así como el de la proteína no fusionada Phl p 5a DM-94-113, 175-198 en comparación con estas referencias.
En la Fig. 8 a-c se presentan representativamente las curvas de inhibición específicas de las sustancias de ensayo, que se aplicaron con dos sueros individuales y una mezcla de sueros de alérgicos al polen de gramíneas. nPhl p 5a/b mostró en todos los ensayos el efecto de inhibición más potente (aprox. 80-95% de efecto de inhibición a una concentración de 10 g/ml). El efecto de inhibición de rPhl p 5a fue claramente menor con un 70-80% de inhibición máxima. Este efecto se origina por la combinación de nPhl p 5a/b, que junto con la isoforma Phl p 5a también contiene la isoforma Phl p 5b. Los anticuerpos IgE específicos contra PhI p 5b no pueden inhibirse mediante rPhl p 5a wt. La parte de fusión con histidina no mostró ninguna influencia sobre el enlace IgE. Esto es evidente por las curvas de inhibición idénticas de rPhl p 5a wt (His) y rPhl p 5a wt en todos los ensayos. Por consiguiente, se muestra la validez de los ensayos con proteínas de fusión con histidina.
En general se pudieron diferenciar dos grupos de sueros de pacientes respecto al enlace IgE cualitativo. El primer grupo se representa mediante el suero individual P15 (Fig. 8a). Estos sueros de alérgicos contenían anticuerpos IgE, cuyo enlace a PhI p 5a se redujo mediante ambas deleciones, 94-113 y 175-198. El mutante de deleción Phl p 5a DM-94-113 (His) aquí sólo mostró un efecto de inhibición máximo de aprox. el 50% y el mutante de deleción Phl p 5a DM-175-198 (His) un efecto de inhibición de sólo el 20-30%.
El mutante de deleción doble Phl p 5a DM-94-113, 175-198 (His) pudo inhibir sólo un 0-10% el enlace de los anticuerpos IgE incluso a la máxima concentración utilizada. El empleo de la proteína no fusionada Phl p 5a DM-94113, 175-198 confirmó este resultado (inhibición IgE máxima del 0-10%).
El segundo grupo de sueros de alérgicos, representado mediante el suero individual P44 (Fig. 8b), se diferencia del primer grupo porque los anticuerpos IgE contenidos en los sueros reaccionaron con Phl p 5a DM-94-113 igual de bien que con la referencia rPhl p 5a wt (His) (inhibición máxima del 70-80%), mientras que ninguna cantidad o una cantidad no detectable de anticuerpos IgE reaccionaron con Phl p 5a DM-175-198 (inhibición máxima de 0-10%).
Igualmente, el mutante de deleción doble Phl p 5a DM-94-113, 175-198 mostró un efecto de inhibición fuertemente reducido (0-10%) con este grupo de sueros de alérgicos, lo que se pudo demostrar tanto para la proteína de fusión como para la proteína sin parte fusionada. Evidentemente, los sueros de estos alérgicos contenían anticuerpos IgE que se dirigen principalmente contra epítopos de la parte C-terminal de la molécula.
Los datos de medición de reactividad del enlace IgE de los anticuerpos IgE de una mezcla de sueros de 20 alérgicos ponen de relieve la importancia de las deleciones 94-113 y 175-198 para la reducción del enlace IgE de Phl p 5a (Fig. 8c). Ambos mutantes de deleción única, Phl p 5a DM-94-113 (His) y Phl p 5a DM-175-198 (His), muestran con un 40-50% o. aprox. un 30% un efecto de inhibición máximo inferior a rPhl p 5a wt (aprox. 70%). El mutante de deleción doble Phl p 5a DM-94-113,175-198 se enlazó sólo muy débilmente a los anticuerpos IgE de la mezcla de sueros (inhibición máxima de 10-15%), lo que indica, coincidiendo con el ensayo de 43 alérgicos en el ensayo de tiras reactivas, una reactividad de enlace IgE muy reducida de esta variante de Phl p 5a en muchos alérgicos al polen de gramíneas, cuando no en todos.
Prueba de hipoalergenicidad de los mutantes de deleción mediante ensayo de activación de basófilos
Mediante un ensayo de activación de basófilos se investigaron los efectos de la capacidad de enlace IgE reducida de los mutantes de deleción sobre la eficacia funcional en la reticulación de IgE enlazados a la membrana de las células efectoras y su activación. Con ello se midió la reducción funcional de la alergenicidad con un ensayo in vitro sensible.
Para el ensayo de activación de basófilos se incuba sangre pura heparinizada de alérgicos al polen de gramíneas con diferentes concentraciones de las sustancias de ensayo. De este modo, las sustancias alergénicas pueden enlazarse específicamente a los anticuerpos IgE, los cuales están asociados con los receptores IgE altamente afines de los granulocitos basófilos.
La reticulación de los complejos IgE/receptor desencadenada por las moléculas de alérgeno conduce a una transducción de señales que tiene como resultado la desgranulación de las células efectoras y, por consiguiente, la activación de las reacciones alérgicas in vivo.
In vitro, la activación de inmunocitos basófilos inducida por alérgenos se puede comprobar mediante la cuantificación de la expresión de una proteína superficial (CD203c) acoplada con la transducción de señales de la reticulación del receptor IgE (Kahlert y col., Clinical Immunology and Allergy in Medicine Proceedings of the EAACI 2002 (2003) Nápoles, Italia 739-744). El número de proteínas superficiales expresadas en una célula y el porcentaje de células activadas en una mezcla celular se mide con elevada sensibilidad por el enlace de un anticuerpo monoclonal marcado con fluorescencia a la proteína superficial y posterior análisis mediante citometría de flujo activada por fluorescencia.
Como sustancias de referencia aquí se utilizaron tanto Phl p 5a natural (nPhl p 5a) purificada como rPhl p5a wt paralelamente a las sustancias de ensayo.
Los resultados del ensayo del mutante de deleción doble Phl p 5a DM 94-113, 175-198 con basófilos de seis objetos de ensayo se presentan en la figura 9 en forma de curvas. Los resultados de ensayo con basófilos de un total de 10 alérgicos clínicamente definidos se resumen en la tabla 2. Los valores A50 (A50: concentración de alérgeno a un 50% del número máximo de basófilos activados) de las moléculas de referencia varían individualmente entre 1,315 pM para rPhl p 5a wt y -0,3-10 pM para nPhl p 5a (Tab. 2). Por el contrario, los valores A50 de la variante de deleción Phl p 5a DM -94-113, 175-198 se encuentran entre ~18-8400 pM.
A partir de los valores A50 determinados de las tres sustancias utilizadas se pudo calcular la eficacia alergénica de la variante de deleción Phl p 5a DM-94-113, 175-198 en relación con las moléculas de referencia no modificadas nPhl p 5a y rPhl p5a wt en cada objeto de ensayo (Tab. 2). La eficacia alergénica relativa (Pr, potencia relativa) de la variante de deleción Phl p 5a DM-94-113, 175-198 disminuyó entre ~12-5000 veces respecto la referencia rPhl p 5a wt o ~16-32000 veces respecto la referencia nPhl p 5a (Tab. 2).
Tabla 2: Prueba de la hipoalergenicidad del mutante de deleción Phl p 5a DM-94-113,175-198 mediante ensayo de activación de basófilos.
- Sustancia de ensayo Aso [pM]a
- Valor Prb Phl p 5a DM-94-113, 175-198 Valor Prb Phl p 5a DM-94-113, 175-198
- Donantec
- nPhl p 5a rPhl p 5a wt Phl p 5a DM-94-113, 175-198 Relativo a rPhl p 5a wtd Relativo a nPhl p 5ae
- P13
- 4,08 5,34 477,2 0,0111 0,0085
- P17
- 6,44 2,68 466,6 0,0057 0,0137
- P20
- 0,26 1,68 8433,0 0,0002 f 0,00003 f
- P23
- 1,02 1,26 39,2 0,0321 0,0260
- P24
- 1,22 2,57 58,1 0,0442 0,0209
- P28
- 9,43 11,35 198,2 0,0573 0,0476
- P29
- 1,77 2,34 33,7 0,0694 0,0525
- P31
- 10,15 14,66 3967,0 0,0037 0,0026
- P34
- 3,48 2,54 165,1 0,0153 0,0211
- P40
- 1,08 1,45 17,5 0,0829 0,0617
a Concentración de alérgeno al 50 % del número máximo de basófilos activados
5 b Potencia relativa
c Alérgicos al polen de gramíneas clínicamente definidos
d Calculado de A50 rPhl p 5a wt/ A50 Phl p 5a DM-94-113, 175-198
e Calculado de A50 nPhl p 5a/ A50 Phl p 5a DM-94-113,175, 175-198
f Negrilla: valores mínimos y máximos
10 Reactividad frente a células T
Los linfocitos T auxiliares reaccionan con fragmentos peptídicos de los alérgenos (aprox. 12-25 aminoácidos) que se producen en las células presentadoras de antígeno (APC, por sus siglas en inglés) por degradación enzimática y tras el depósito de los péptidos adecuados en las moléculas MHC de clase II individuales, presentan las células T sobre la superficie de las APC. Esta activación alergenoespecífica de los linfocitos T auxiliares es la condición previa para
15 las reacciones posteriores (proliferación, anergia, apoptosis) y para la diferenciación funcional (TH1 y TH2). La influencia de los linfocitos T alergenoespecíficos mediante el tratamiento con un alérgeno o una variante alergénica en la hiposensibilización se considera clave para la eficacia terapéutica.
Para investigar la reactividad frente a células T se establecen líneas de células T (TCL, por sus siglas en inglés) de alérgicos al polen de gramíneas bajo estimulación con moléculas nPhl p 5 o rPhl p 5 según los procedimientos 20 convencionales. En un ensayo de proliferación se estimularon diferentes líneas de células T con los alérgenos de
referencia nPhl p5a y rPhl p5a wt así como con el mutante de deleción doble Phl p 5a DM 94-113,175-198. La tasa de proliferación se determinó mediante la producción de timidina-[3H] con los procedimientos convencionales.
Tabla 3: Prueba de la reactividad frente a células T del mutante de deleción Phl p 5a DM-94-113,175-198 mediante un ensayo de proliferación con líneas de células T (TCL) específicas de PhI p 5.
- Índice de estimulacióna
- Donanteb
- TCL nPhl p 5a rPhl p 5a wt Phl p 5a DM-94-133, 175-198
- A
- 3.2 9,8 4,9 4,4
- B
- 8.2 21,0 15,5 13,3
- C
- 11.2 5,2 4,7 7,2
- C
- 11.3 3,3 2,9 3,5
- C
- 11.43 3,0 3,9 2,6
- D
- 19.1 6,5 4,7 7,5
- D
- 19.2 9,6 3,3 2,6
- E
- 23.22 21,8 29,0 20,8
- E
- 23.50 7,5 8,4 6,6
- F
- 89.23 1,8 3,5 1,8
a
5 Calculado a partir de valores de medición [3H]. Valores de medición cpm de cultivos celulares estimulados con alérgeno/ valores de medición cpm de cultivos celulares no estimulados
b Donante: alérgicos al polen de gramíneas clínicamente definidos
Los resultados con diez TCL de seis alérgicos muestran que la proliferación de estas TCL se estimuló mediante Phl p 5a DM 94-113,175-198 con una fuerza comparable al alérgeno natural no modificado o al alérgeno de tipo salvaje
10 recombinante (Tab. 3).
Por consiguiente, son objeto de la presente invención variantes del alérgeno PhI p 5a del grupo 5, las cuales se caracterizan por una reactividad IgE reducida frente a los alérgenos de tipo salvaje conocidos así como una reactividad mantenida con linfocitos T.
Puesto que resulta especialmente favorable en el sentido de la presente invención que en PhI p 5a falten o se
15 eliminen fragmentos de la secuencia de aminoácidos que corresponden a los fragmentos de la secuencia de aminoácidos 94-113 y 175-198, en especial son objeto de esta invención aquellas variantes del alérgeno, en las cuales falta sólo el primer fragmento mencionado o faltan ambos fragmentos mencionados a la vez, siendo la última forma de realización, en especial, totalmente preferida.
A causa de la elevada homología de la secuencia dentro de los alérgenos del grupo 5 de Pooideae, estos segmentos
20 pueden identificarse claramente en la alineación de la secuencia de PhI p 5a con secuencias de otros alérgenos del grupo 5. Las variantes alergénicas previamente descritas provienen de PhI p 5a o corresponden preferentemente a las secuencias según SEC ID Nº 4 o 8.
Es apropiado preparar las variantes de alérgenos según la invención a partir de la secuencia de ADN clonada con ayuda de métodos de ingeniería genética. No obstante, en principio también puede tratarse de modificaciones químicas de los extractos de alérgenos nativos (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382).
De acuerdo con la naturaleza, sobre las variaciones de los alérgenos del grupo 5 descritas en la presente solicitud de patente, también son posibles otras modificaciones en otras posiciones, por ejemplo para aumentar la hipoalergenicidad. Estas modificaciones pueden tratarse de, por ejemplo, inserciones, deleciones e intercambios de aminoácidos, divisiones de la proteína en fragmentos, así como fusiones de la proteína o de sus fragmentos con otras proteínas o péptidos.
En la preparación de las variantes alergénicas aquí exactamente descritas se introdujo una etiqueta His por ingeniería genética con el fin de mejorar la purificación de las proteínas sobreexpresadas.
Además, es objeto una molécula de ADN que codifica para las variantes alergénicas previamente descritas, en especial, correspondiente a una secuencia según SEC ID Nº 3 o 7, un vector de expresión recombinante que contenga esta molécula de ADN, así como un organismo huésped no humano transformado con dicha molécula de ADN o dicho vector de expresión. Los organismos huésped adecuados pueden ser organismos procariotas o eucariotas, mono- o pluricelulares, como bacterias o levaduras. Un organismo huésped preferente según la invención es E. coli.
Además, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una variante alergénica según la invención mediante cultivo de dicho organismo huésped y obtención de la variante alergénica correspondiente a partir del cultivo.
Además, son objeto de la presente invención las variantes alergénicas, moléculas de ADN y vectores de expresión previamente descritos en calidad de medicamento.
También son objeto de la presente invención las preparaciones farmacéuticas que contienen como mínimo una de estas variantes alergénicas o una molécula de ADN correspondiente o un vector de expresión correspondiente, así como, dado el caso, otros principios activos y/o coadyuvantes para el tratamiento de alergias en cuya activación participan alérgenos del grupo 5 de Pooideae, o para la vacunación inmunoterapéutica de pacientes con alergias en cuya activación participan alérgenos del grupo 5 de Pooideae y/o para la prevención de tales alergias. Si se trata de preparaciones farmacéuticas del segundo tipo (que contienen como mínimo una molécula de ADN o un vector de expresión), estas preparaciones contienen preferentemente, además, hidróxido de aluminio, un oligonucleótido con CpG inmunoestimulador o una combinación de ambos como coadyuvantes.
En el sentido de esta invención, estas preparaciones farmacéuticas pueden utilizarse como agentes terapéuticos en medicina humana o veterinaria. Se tienen en consideración como vehículos sustancias orgánicas o inorgánicas que son apropiadas para la aplicación parenteral y que no reaccionan con las variantes alergénicas del grupo 5 según la invención. Para la aplicación parenteral se emplean en particular soluciones, preferiblemente soluciones oleosas o acuosas, y además suspensiones, emulsiones o implantes. Las variantes alergénicas según la invención también pueden someterse a liofilización y el producto liofilizado obtenido puede emplearse, por ejemplo, para la elaboración de preparaciones inyectables. Las preparaciones mencionadas pueden esterilizarse y/o contener coadyuvantes, como lubricantes, conservantes, estabilizantes y/o humectantes, emulsionantes, sales para influir sobre la presión osmótica, tampones y/o varios principios activos diferentes. Además, mediante la formulación correspondiente de las variantes alergénicas según la invención se pueden obtener preparados de depósito, por ejemplo mediante adsorción en hidróxido de aluminio.
Finalmente, es objeto de la presente invención el uso de como mínimo una variante alergénica según la invención o una molécula de ADN según la invención o un vector de expresión según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de alergias en cuya activación participan alérgenos del grupo 5 de Pooideae, o para la vacunación inmunoterapéutica de pacientes con alergias en cuya activación participan alérgenos del grupo 5 de Pooideae y/o para la prevención de tales alergias.
ADN
ADN
ADN
ADN
ADN
ADN
ADN ADN
ADN
Claims (16)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Variantes del alérgeno Phl p 5a del grupo 5, las cuales, en comparación con los alérgenos conocidos de tipo salvaje, presentan una reactividad IgE reducida y mantienen en gran parte la reactividad con linfocitos T, caracterizadas porque en comparación con los alérgenos de tipo salvaje conocidos les falta un segmento que corresponde al segmento de la secuencia de aminoácidos 94 – 113 del PhI p 5a o los segmentos que corresponden a los segmentos de la secuencia de aminoácidos 94 – 113 y 175 – 198.
-
- 2.
- Variante del alérgeno PhI p 5a según la reivindicación 1 con una secuencia de aminoácidos seleccionada de una de las secuencias según SEC ID Nº 4 y 8.
-
- 3.
- Variantes alergénicas según la reivindicación 1 o 2 caracterizadas porque se obtienen mediante métodos de ingeniería genética recombinantes.
-
- 4.
- Molécula de ADN que codifica para una variante alergénica según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 3.
-
- 5.
- Molécula de ADN que corresponde a una secuencia de ADN seleccionada de una de las secuencias según SEC ID Nº 3 y 7.
-
- 6.
- Vector de expresión recombinante que contiene una molécula de ADN según la reivindicación 4 o 5 funcionalmente unido a una secuencia de control de expresión.
-
- 7.
- Un organismo huésped no humano, transformado con una molécula de ADN según la reivindicación 4 o 5 o un vector de expresión según la reivindicación 6.
-
- 8.
- Procedimiento para la preparación de una variante alergénica según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 3 mediante cultivo de un organismo huésped según la reivindicación 7 y obtención de la variante alergénica correspondiente a partir del cultivo.
-
- 9.
- Variante alergénica según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 3 como medicamento.
-
- 10.
- Preparación farmacéutica que contiene como mínimo una variante alergénica correspondiente a una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 3 y, dado el caso, otros principios activos y/o coadyuvantes para el tratamiento de alergias en cuya activación participan alérgenos del grupo 5 de Pooideae.
-
- 11.
- Uso de como mínimo una variante alergénica según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de alergias en cuya activación participan alérgenos del grupo 5 de Pooideae.
-
- 12.
- Molécula de ADN según la reivindicación 4 o 5 como medicamento.
-
- 13.
- Vector de expresión recombinante según la reivindicación 6 como medicamento.
-
- 14.
- Preparación farmacéutica que contiene como mínimo una molécula de ADN según la reivindicación 12 o al menos un vector de expresión según la reivindicación 13 y dado el caso, otros principios activos y/o coadyuvantes para la vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 5 de Pooideae y/o para la prevención de dichas alergias.
-
- 15.
- Preparación farmacéutica según la reivindicación 14 que contiene hidróxido de aluminio, un oligonucleótido inmunoestimulador con CpG o una combinación de ambos como coadyuvantes.
-
- 16.
- Uso de al menos una molécula de ADN según la reivindicación 12 o al menos un vector de expresión según la reivindicación 13 para la preparación de un medicamento para la vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias en cuya activación participan alérgenos del grupo 5 de Pooideae y/o para la prevención de dichas alergias.
Alineación de fragmentos relevantes de secuencias de ADNc homólogas a Phl p 5a de la especie Pooideae: Lolium perenne (Lol p), Poa pratensis (Poa p) Triticum aestivum (Tri a) y Hordeum vulgare (Hor v)Numeración: posiciones de los nucleótidos de las entradas de ADN Secuencias de Phl p 5a, Poa p 5 y Lol p 5: secuencias de ADNc de la base de datos “Gen-Bank” del centro National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, EE.UU. Secuencias Hor v y Tri a: secuencias EST de la base de datos EST del instituto Institute for Genomic Research (TIGR), Rockville, EE.UU. Marco continuo: identidad de la secuencia para Phl p 5a (referido a GenBank AJ555152) Marco de puntos: deleción correspondiente a los aminoácidos 94-113 (referido a GenBank AJ555152) Línea discontinua: deleción correspondiente a los aminoácidos 175-198 (referido a GenBank AJ555152)Alineación de secuencias de aminoácidos homólogas a Phl p 5a (fragmentos desecuencia relevantes deducidos a partir de secuencias de ADN) de las especies Pooideae: Lolium perenne (Lol p), Poa pratensis (Poa p) Triticum aestivum(Tri a) y Hordeum vulgare (Hor v)Numeración: posiciones de los nucleótidos de las entradas de ADNSecuencias de Phl p 5a, Poa p 5 y Lol p 5: secuencias de ADNc de la base de datos “Gen-Bank” del centro National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, EE.UU.Secuencias Hor v y Tri a: secuencias EST de la base de datos EST del instituto Institute for Genomic Research (TIGR), Rockville, EE.UU.Marco continuo: identidad de la secuencia para Phl p 5a (referido a GenBank AJ555152) Marco de puntos: deleción correspondiente a los aminoácidos 94-113 (referido a GenBank AJ555152) Marco discontinuo: deleción correspondiente a los aminoácidos 175-198 (referido a GenBank AJ555152)imagen1 imagen2 imagen3 imagen4 imagen5 imagen6 imagen7 imagen8
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