CN106011235A - 一种基于dna分子级联信号放大的膜蛋白分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物蛋白质分子分析技术领域，具体涉及一种基于DNA分子级联信号放大的膜蛋白分析方法。本发明所述膜蛋白分析方法由合成的分子探针特异识别并共价连接到膜蛋白上，由此在膜蛋白上引入DNA扩增引物，加入扩增成分后，利用DNA分子的等温扩增反应，原位扩增出长单链DNA产物，随后加入荧光分子信标，最终通过对荧光的观察和检测实现膜蛋白在质膜表面的原位分析。本发明操作快速、简单、灵敏，避免了传统膜蛋白分析中分离和纯化的繁琐步骤，无需复杂仪器，操作者无需特别训练即可完成。
Description
技术领域
本发明属于生物蛋白质分子分析技术领域，具体涉及一种基于DNA分子级联信号放大的膜蛋白分析方法。
背景技术
根据人类蛋白质组计划预测，多于30％的蛋白质分子存在于质膜上。他们可以控制细胞的物质转运、能量转换、细胞间通讯和信号转导等功能，其中细胞分子运作信号的60％～70％由这些膜蛋白产生。当前，市场上有30％～40％的药物都是瞄准质膜蛋白的。因此，对质膜蛋白的定量和定位分析将有助于更加深入地理解这些蛋白质是如何发挥功能并最终影响细胞活动，而且有助于人们设计更加特异性的药物分子。
目前，对于膜蛋白的检测主要存在两方面问题。首先，膜蛋白的结构通常为两亲结构，即同时存在亲水部分和疏水部分，加上其所处的复杂质膜环境，对膜蛋白的分离和纯化极为困难。其次，与核酸分子不同，蛋白质分子本身不能够进行有效地扩增，蛋白分子检测的灵敏度还有待进一步提升。因此，目前膜蛋白分析技术的提升主要集中于膜蛋白的标记、分离和纯化过程，随后对标记的蛋白分子进行免疫分析(如免疫印迹、流式细胞分析)或质谱分析。但是，这些过程十分繁琐且耗时耗力，往往需要对蛋白质进行基因工程改造，还需要使用复杂的仪器设备和大量的样品。因此，开发一种简单、准确和灵敏的膜蛋白分析方法显得极为重要，这将极大地促进膜蛋白在生物医学领域中的应用。
为解决上述问题，实现对膜蛋白的原位分析可以有效避免膜蛋白的分离和纯化过程。近年来，DNA分子扩增技术的快速发展为膜蛋白的原位分析方法提供新的机遇。比如，免疫—聚合酶链式反应(immuno—PCR，专利号：201010192503.5)和免疫滚环扩增技术(immuno—RCA，专利号：200480001922.9)充分利用抗体的高选择性和DNA分子扩增的高灵敏性，实现了生物分子的高效检测。然而，上述方法并不适用于膜蛋白的分析。因为膜蛋白的检测需要一个有利于蛋白活性和膜完整性的恒温环境，PCR技术并不适用。另外，上述基于抗体的膜蛋白识别需要通过位点选择性地标记技术对抗体进行标记，这增加了探针制备的复杂性。因此，开发一种基于简单识别探针和等温扩增反应的原位分析技术是实现膜蛋白分析的重要发展方向。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种通用的，并且可以定位和定量检测质膜蛋白的荧光分析方法，以填补现有技术的空白。从而实现对膜蛋白简单、快速而灵敏地原位分析。
本发明所述一种基于DNA分子级联信号放大的膜蛋白分析方法的原理是：首先合成了一种新型的多功能光敏分子探针，探针3’末端是DNA扩增引物。探针在特异性识别与标记膜蛋白之后，DNA扩增引物就被引入到相应膜蛋白上。随后，利用DNA分子扩增技术，包括滚环扩增和切刻内切酶级联反应，将上述识别事件转化为相应的荧光信号，由此建立起膜蛋白和荧光信号之间的定量关系。最终实现对膜蛋白的原位成像、定量分析或者它们的组合。
本发明所述一种基于DNA分子级联放大的膜蛋白原位分析方法，其特征在于，合成的分子探针特异识别并共价连接到膜蛋白上，由此在膜蛋白上引入DNA扩增引物，加入扩增成分后，利用DNA分子的等温扩增反应，原位扩增出长单链DNA产物，随后加入荧光分子信标，最终通过对荧光的观察和检测实现膜蛋白在质膜表面的原位分析。
本发明所述的一种基于DNA分子级联信号放大的膜蛋白分析方法，由以下步骤构成：
1.多功能光敏分子探针的制备及膜蛋白的标记方法
(1)设计多功能光敏分子探针，使其对靶标膜蛋白特异性识别与标记功能，并且引入DNA扩增需要的引物；
(2)将光敏分子双吖丙啶(succinimidyl 6-(4,4’-azipentanamido)hexanoate,Sulfo-LC-SDA)修饰到5’端修饰有氨基(-NH2)的DNA序列上；
(3)上述合成的多功能光敏分子探针经过葡萄糖柱(葡聚糖G-25)进行分离纯化，并使用HPLC进行表征；
(4)在连接缓冲液中，将纯化的探针与细胞孵育，离心洗去没有结合的探针分子，在365nm的光照条件下，探针分子共价交联到靶标膜蛋白分子上。
所述步骤(1)中的多功能光敏分子探针由3部分组成，见附图1，包括用于共价连接的光敏分子(双吖丙啶)，5’端与膜蛋白亲和识别的DNA适体，以及3’端DNA扩增引物；
所述步骤(1)中的被分析的靶标蛋白为质膜蛋白或细胞器膜蛋白；
所述步骤(1)中的具有识别功能的分子为DNA适体序列；序列详见表1；
所述步骤(1)中的引物为DNA适体序列3’端之后的一段DNA序列，用作
后续DNA滚环扩增的引物；序列详见实施例；
所述步骤(2)中的应体系中包括：2mM 5’端氨基(-NH2)修饰的DNA，10mM磺基琥珀酰亚胺6-(4,4′-双吖丙啶)六己烷酸盐(sulfosuccinimidyl6-(4,4′-azipentanamido)hexanoate,Sulfo-LC-SDA)，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.0；
所述步骤(3)中的分离纯化后的探针以100μM的储存浓度置于TE溶液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0)中保存；
所述步骤(4)中的连接缓冲液为1×PBS，3mM MgCl2，pH 7.4。
2.一种基于DNA分子扩增的膜蛋白成像分析方法：
(1)分子探针的设计与制备；
(2)基于分子探针与膜蛋白的亲和识别作用，并在紫外光照条件下，将探针分子共价连接到靶标膜蛋白上；
(3)以探针3’端的DNA序列为引物，加入滚环扩增成分，以环状单链DNA为模板，扩增出长单链DNA；
(4)加入荧光分子标签，利用DNA间的互补配对作用，使扩增出的长单链DNA被标记上荧光分子。由此，质膜蛋白就可以在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下被直接观察和定位。
所述步骤(1)中的分子探针设计与制备同1中所述；
所述步骤(3)中的滚环扩增成分“RCA mix”包括200μM dNTPs,100nM cDNA和0.1Uμl-1Φ29DNA聚合酶。滚环扩增反应液为50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,10mM(NH4)SO4,4mM DTT,pH 7.5@25℃；
所述步骤(3)中的单链环状DNA的制备方法参考专利201310440023.X并做适当修改；序列长度80–85bp，序列详见实施例；
所述步骤(4)中的荧光分子标签为5’端标记有荧光分子的寡核苷酸序列，针对不同的膜蛋白，标记的荧光分子和序列不同，这样可以实时对不同的蛋白进行原位成像，具体序列和荧光分子标记见实施例。
3.基于DNA分子扩增的质膜蛋白成像分析方法：
(1)操作方法同2中的步骤(1)—(3)；
(2)加入‘RTA mix’反应液，其中包含荧光分子信标和切刻内切酶。切刻内切酶没有切割荧光分子信标时，荧光信号被探针末端的猝灭基团猝灭，不能检测到荧光信号；当切刻内切酶以扩增出的长单链DNA为模板，循环切割荧光分子信标，就可以获得相应的荧光信号。建立起荧光信号强度和膜蛋白之间的定量关系；
(3)将上述溶液在酶标仪下进行定量分析。
所述步骤(2)中的荧光分子信标为5’端标记有荧光分子ROX和3’端标记有猝灭基团BHQ2的寡核苷酸序列(5’-ROX-TAGCTTGCTGAGGCTG-BHQ2-3’)；
所述步骤(2)中的切刻内切酶为Nb.BbvCl；
所述步骤(2)中的‘RTA mix’反应液包括：5×反应液(1μl),10μM荧光分子信标(3μl)和10Uμl-1Nb.BvCl切刻内切酶(1μl)；
所述步骤(3)中的酶标仪为Infinite M200Pro,Tecan；参数为：激发波长500nm，发射波长530nm，激发和发射缝宽12nm。
综上所述，本发明基于蛋白分子标记技术、DNA分子扩增技术和荧光分析技术，实现了对膜蛋白质分子的成像与原位检测。与传统的基于膜蛋白分离纯化的分析方法相比，本发明免去了膜蛋白分离纯化的繁琐步骤，为膜蛋白的成像和分析提供了全新的方法。同时，基于DNA分子操作技术和级联放大技术，该方法可以实现高灵敏的膜蛋白分析，对低丰度表达的膜蛋白也可实现分析。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
1、本发明基于多功能光敏分子探针的制备，利用“靶标—配体”特异性识别和光催化的共价连接，使探针对膜蛋白的识别具有高度选择性。通过替换探针上的识别元件(适体序列)理论上可以标记任何目标蛋白。同时，该种多功能光敏分子探针的制备方法简单，使用方便。
2、本发明可以将检测蛋白的过程转化为核酸分析的过程，使膜蛋白的分析变得更易于操作。
3、本发明基于DNA级联放大的等温扩增过程提供了相当高的检测灵敏度，可以实现微量表达膜蛋白的分析。同时，操作简单，避免了复杂的实验步骤，操作者无需特别训练。
附图说明
下面的附图构成了本说明书的一部分,将它们引入说明书是为了进一步说明本发明的某些实施方案。通过参考其中一个或多个附图，并结合本文提供的具体实施方案的详细描述，这些实施方案可以被更好的理解。
图1为分子探针的制备流程和结构示意图；
图2为对分子探针HPLC纯化与表征；a、c和e为纯化前反应产物的混合物，b、d、f为纯化后的分子探针；这三种探针(AP1、AP2和AP3)分别靶向三种膜蛋白MUC1、EpCAM和HER2；
图3为基于分子探针的膜蛋白共价标记示意图和SDS-PAGE(10％)电泳验证；将分子探针与膜蛋白反应后的产物进行电泳验证，泳道M为蛋白分子量标准，泳道1、3和5是没有共价连接情况下的电泳情况，泳道2、4和6是交联后的电泳情况；可见这种基于分子探针的膜蛋白共价标记方法是可行的；
图4为上述基于DNA分子扩增的质膜蛋白成像分析方法的原理示意图；
图5为对几个细胞株(MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231)上几种膜蛋白分子(5、6和7)的实时原位成像分析；每种膜蛋白使用了不同的荧光分子标签(8、9和10)进行标记，分别呈现绿、蓝、红小亮点，代表相应膜蛋白所处的位置；图中标尺长度为20μm；
图6为上述基于DNA分子级联信号放大的质膜蛋白原位定量分析方法的原理示意图；经过分子探针的连接、滚环扩增和循环酶切放大，质膜蛋白的表达量可与荧光强度建立起间接的联系；
图7为使用不同浓度的探针分子进行DNA级联扩增反应的荧光定量曲线；
图8为对几种细胞株(MCF-10A,MCF-7,MDA-MB-453,MDA-MB-231,SK-BR-3和T-47D)上的三种膜蛋白(MUC1，EpCAM和HER2)的定量分析结果；
图9是基于膜标志蛋白定量分析的细胞分型结果。左表为膜蛋白定量数据，基于定量数据归一化的RGB编码；右图为基于RGB编码的细胞株在色域图中的分布。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应说明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：一种基于DNA分子扩增的质膜蛋白成像分析方法
本实施例以MUC1、EpCAM和HER2这几种膜蛋白为例叙述一种基于DNA分子扩增的质膜蛋白成像分析方法的建立
(1)多功能光敏分子探针的制备
分别取三种2.0nmol 5’端修饰有氨基(-NH2)的单链DNA(cDNA)(表1)
溶于0.1M NaHCO3/Na2CO3缓冲液，该缓冲液中含有10mM Sulfo-LC-SDA，pH 9.0。上述溶液置于棕色Eppendorf管中，在振荡器上振荡，37℃孵育2.0h。未反应的Sulfo-LC-SDA分子通过葡聚糖(G-25)柱子进行洗脱。随后，LC-SDA修饰的探针分子进一步通过HPLC进行纯化和表征(图2)。HPLC纯化时使用安捷伦EC-18柱子(2.7μm,4.6×100mm)，线性洗脱缓冲液B(0.1M醋酸三乙胺，40％乙腈，pH 7.0)在洗脱液A(0.1M醋酸三乙胺，5％乙腈，pH 7.0)浓度从10％提升到80％。根据HPLC的峰面积，对应于三种光敏分子探针(AP1、AP2和AP3)的转化效率分别为64.7％,67.9％和54.2％。获得的探针分子通过QIAquick的寡核苷酸试剂盒脱盐处理。最后，获得的探针分子冻干-20℃保存。
(2)单链环状DNA(cDNA)的制备
在T4连接酶的反应溶液中(66mM Tris-HCl,6.6mM MgCl2,10mM DTT and0.1mMATP,pH 7.6)，50pmol cDNA与250pmol连接DNA混合。随后在90℃孵育5min钟后缓慢降温到室温，使连接DNA连接磷酸根修饰的单链DNA的两端，形成环状DNA。随后，加入0.5μl T4DNA连接酶(350Uμl-1)。上述混合液在16℃孵育16h，使单链DNA转化成cDNA。反应完成后，加入8μl Exo I(5Uμl-1)和2μl Exo III(200Uμl-1)，在16℃条件下孵育2h，以切除其它杂DNA序列。获得的cDNA经过QIAquick的寡核苷酸试剂盒进行脱盐和纯化。最后，环化的单链模板cDNA通过12％PAGE进行验证。
(3)质膜蛋白的标记
细胞系MCF-10A、MCF-7、T-47D以及SK-BR-3用含10％血清(Gibco，Invitrogen)的DMEM培养基在含5％CO2的细胞培养箱(Thermo 3111)中培养，MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞系用含10％血清的L-15培养基培养。在35mm玻底培养皿中的生长的细胞被4％多聚甲醛固定，并被BSA和小牛胸腺DNA封闭。用含0.05％吐温20的PBS(PBST)缓冲液洗涤细胞两次后，加入含100nM每种分子探针的连接反应缓冲液，于37℃培养30分钟。被固定的细胞用PBST温和清洗，重悬到96孔板后置于内冰浴中。使用紫外灯(8watt，0.32W cm-2)于365nm波段下照射20分钟。
(4)DNA滚环扩增反应与荧光分子标签的标记
如图4，在质膜蛋白标记有探针分子后，相应的质膜蛋白就被连接上扩增引物，后续就可以进行DNA滚环扩增反应与荧光分子标签的标记。接着步骤(3)，用PBST清洗细胞后，再加入反应缓冲液，其中含200μM dNTPs、100nM的cDNA分子11、12和13，以及0.1Uμl-1Φ29DNA聚合酶(分子14)，置于培养箱中孵育1小时。然后，用足量的PBST清洗细胞，加入含250nM荧光分子标签(分子8、9和10)的PBS缓冲液并于37℃孵育30分钟。如图4，由于扩增后的长单链DNA连接在质膜蛋白上，可利用扩增产物与荧光分子标签的杂交反应，给相应膜蛋白打上荧光标签。
(5)荧光显微镜成像
我们以几种膜蛋白分子(5、6和7)为研究对象，观察它们在几个细胞株(MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231)上分布的情况。每种膜蛋白使用不同的荧光分子标签(8、9和10)进行标记，可显示相应膜蛋白所处的位置，荧光图片中(图5)分别呈现绿、蓝、红的小亮点。在进行荧光观察前，用PBST洗涤细胞三次。样品在荧光显微镜(IX73，Olympus，Japan)或共聚焦显微镜(C2plus，Nikon，Japan)下成像。
实施例2：一种基于DNA分子级联信号放大的质膜蛋白原位定量分析方法
本实施例以MUC1、EpCAM和HER2这几种膜蛋白为例叙述一种基于DNA分子级联信号放大的质膜蛋白原位定量分析方法的建立。图6是基于DNA分子级联信号放大的质膜蛋白原位定量分析方法的示意图。
(1)所述步骤同实施例1(1)
(2)所述步骤同实施例1(2)
(3)所述步骤同实施例1(3)
(4)级联扩增反应及验证
反应体系(25μl)由如下成分构成：5×反应缓冲液(5μl)，适体探针(2.5μl)，1μMcDNA(2.5μl)，10mM的各类dNTPs(0.5μl)，10Uμl-1Φ29DNA聚合酶(1μl)(分子14)，以及水(11.5μl)。混合物在37℃反应1h完成一个热循环(C1000，Bio-Rad)，经移液器重悬浮反应混合产物，并与5μl含5×反应缓冲液(1μl)，10μM荧光分子信标(3μl)(分子15)，10Uμl- 1Nb.BvCl切刻酶(1μl)(分子16)的溶液进一步混合。然后，混合物于37℃反应1h完成一个热循环，信号每3分钟被记录一次。
(5)荧光检测标准曲线的建立
实验中使用不同浓度的分子探针进行DNA级联扩增反应。通过此耦合的DNA等温扩增反应，可以建立分子探针量与荧光信号强度的定量关系。如图7所示，使用不同浓度分子探针0，102，103，104，105，106，107和108aM进行DNA级联扩增反应，可得到不同的荧光信号，由此建立起蛋白表达量的定量曲线。在102到106aM范围内，荧光信号强度与探针浓度呈现线性关系，最低检测限可达到100aM(S/N＝3)。
(6)荧光检测与膜蛋白的定量分析
探针分子被加热到95℃后缓慢降至室温以在连接缓冲液中形成适体构象。细胞被收集并加入含100nM探针分子的连接缓冲液中，于37℃共同孵育30分钟。重复的离心和重悬后，转移沉淀的细胞至96孔板中，并在冰上用365nm波长照射20分钟。然后，细胞被收集、计数并转移至反应缓冲液中以获得一定浓度的细胞悬液。在384孔NBS板(Corning 3575)中，5μl细胞悬液与反应缓冲液混合以形成“RCA混合液”，其中包括5×反应缓冲液(5μl)，1μM的各cDNA(2.5μl)(分子11、12和13)，10mM的各dNTPs(0.5μl)，10Uμl-1Φ29DNA聚合酶(1μl)(分子14)，以及H2O(11μl)。将板用铝箔盖住并于37℃孵育1小时，然后加入“RTA混合液”：5μl含5×反应缓冲液(1μl)，10μM荧光分子信标(3μl)(分子15)和10Uμl-1Nb.BvCl切刻酶(1μl)(分子16)。用热循环仪(C1000，Bio-Rad)记录荧光信号，实时监测获得的荧光信号。实验中对6株细胞的三种膜蛋白(分子5、6和7)进行定量分析，如图8所示。
实施例3：一种基于细胞膜蛋白原位定量分析的细胞分型方法
由于细胞膜标志蛋白的表达量以及它们的组合可以准确反映细胞的类型，因此，基于实施例2构建的细胞膜蛋白的原位定量分析方法，本发明进一步构建了细胞分型方法。基于膜蛋白标志物的细胞分型方法简单、快速，而且操作简便，可以为细胞学研究提供一种新的研究方法。
在本实施例中，本发明使用实施例2中的方法对细胞膜标志蛋白进行定量分析。以细胞株MCF-10A,MCF-7,MDA-MB-453,MDA-MB-231,SK-BR-3和T-47D为研究对象，获得几种标志蛋白(分子5、6和7)的表达量后(如图9)，本发明对数据进行了如下的处理：由于使用了三种标志蛋白作为细胞的身份标签，这三种蛋白的表达量被归一化为RGB三原色编码，即三种蛋白的表达量分别使用三原色中的一种从0到255进行编码。由此，每种细胞都被分配到三元色构成的RGB编码，它们各自的编码可以被放入到CIE1931色域图中。因此，基于这三种标志蛋白的细胞分类可以在色域图中直观地被区分开来。在这个方法中，本发明还可以使用其它的标志蛋白对细胞进行分类。由此，一种基于细胞膜蛋白原位定量分析的细胞分型方法可以被构建。这为细胞学研究提供了一种高效的研究方法。
Claims (6)
1.一种基于DNA分子级联放大的膜蛋白原位分析方法，其特征是合成的分子探针特异识别并共价连接到膜蛋白上，由此在膜蛋白上引入DNA扩增引物，加入扩增成分后，利用DNA分子的等温扩增反应，原位扩增出长单链DNA产物，随后加入荧光分子信标，最终通过对荧光的观察和检测实现膜蛋白在质膜表面的原位分析。
2.根据权利要求1所述基于DNA分子级联放大的膜蛋白原位分析方法，其特征在于细胞膜蛋白成像分析的步骤是：
(1)分子探针的设计；5’末端以光敏交联分子修饰，5’端为识别细胞膜蛋白的DNA适体序列，3’端为后续级联扩增所需要的DNA引物序列，分子探针序列为：
AP1：GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGGTTTTTTTCAGCCTCAGCAAG；
AP2：CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTGTTTTTTTTTTAGACACTATATGACA；
AP3：GCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGTTTTTTTCCATAATACTGCGT；
(2)通过核酸适体与细胞膜蛋白的特异性结合作用，并经过光敏分子交联到细胞膜蛋白表面；
(3)加入滚环扩增成分，以3’末端的序列为引物，以环状单链DNA(cDNA)为模板进行等温扩增，产生大量连接在膜蛋白上的长单链DNA；
(4)加入荧光分子标签，通过荧光分子标签与扩增产物的杂交，实现对细胞膜蛋白的原位成像分析；
其中，所述的膜蛋白指细胞或组织相关的质膜蛋白，EpCAM、MUC1、HER2；其它所述的滚环扩增是指线性滚环扩增或指数滚环扩增；所述的荧光分子标签为寡核苷酸序列，5’端修饰有荧光基团；所述的适体为与膜蛋白结合的核酸适体或为结合EpCAM、MUC1、HER2膜蛋白的适体；所述的细胞为MCF-10A或MCF-7或MDA-MB-231或MDA-MB-453或T-47D或SK-BR-3；所述的光敏交联分子为双吖丙啶(diazirine)或重氮甲烷(diazomethane)具有光催化链接功能的分子。
3.根据权利要求1所述基于DNA分子级联放大的膜蛋白原位分析方法，其特征在于细胞膜蛋白定量分析的步骤是：
(1)分子探针的设计：5’末端以光敏交联分子修饰，5’端为识别细胞膜蛋白的DNA适体序列，3’端为后续级联扩增所需要的DNA引物序列，分子探针序列为：
AP1：GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGGTTTTTTTCAGCCTCAGCAAG；
AP2：CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTGTTTTTTTTTTAGACACTATATGACA；
AP3：GCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGTTTTTTTCCATAATACTGCGT；
(2)通过适体与细胞膜蛋白的特异性结合作用，将分子探针固定到细胞膜蛋白表面；
(3)加入滚环扩增成分，以分子探针3’末端的序列为引物，以环状单链DNA(cDNA)为模板进行等温扩增，产生大量连接在膜蛋白上的长单链DNA；
(4)加入荧光分子信标和切刻内切酶；切刻内切酶以扩增产物为模板，切割荧光分子信标，产生荧光信号，通过对产生的荧光信号的定量检测达到对细胞膜蛋白的定量分析；
其中，所述的膜蛋白指细胞和组织相关的质膜蛋白；所述的滚环扩增是指线性滚环扩增或指数滚环扩增；所述的适体为与膜蛋白结合的核酸适体，EpCAM或MUC1或HER2膜蛋白的适体；所述的细胞为MCF-10A或MCF-7或MDA-MB-231或MDA-MB-453或T-47D或SK-BR-3；所述的光敏交联分子为双吖丙啶(diazirine)或重氮甲烷(diazomethane)具有光催化链接功能的分子；所述的荧光分子信标为DNA寡核苷酸序列见表1，5’端修饰荧光基团ROX，3’端修饰淬灭基团BHQ2；所述的切刻内切酶为Nb.BbvCl；所述的荧光信号检测是指加入切割酶后，酶切荧光信标，将荧光基团和淬灭基团分开，通过荧光信号的产生，以间接检测出细胞膜蛋白的含量。
4.根据权利要求2或3所述基于DNA分子级联放大的膜蛋白原位分析方法，其特征在于cDNA为模板进行等温扩增的步骤为：
(1)细胞膜蛋白表面分子探针的标记：基于分子探针与细胞膜蛋白的亲和识别作用，并在紫外光照射件下，将探针分子共价连接到靶标膜蛋白上；
(2)线性模板DNA的环化：在T4连接酶的反应溶液中(66mMTris-HCl,6.6mM MgCl2,10mMDTT and 0.1mM ATP,pH 7.6)，50pmol ssDNA与250pmol连接DNA混合；随后在90℃孵育5min后缓慢降温到室温，使连接DNA连接ssDNA的两端，形成环状DNA，随后加入0.5μL T4DNA连接酶(350UμL-1)，上述混合液在16℃孵育16h，使单链DNA转化成cDNA，反应完成后，加入8μLExo I(5UμL-1)和2μL Exo III(200UμL-1)，在16℃条件下孵育2h，以切除其它杂DNA序列；
(3)滚环扩增：加入‘RCA mix’反应液25μl：含滚环扩增反应液(50mMTris-HCl,10mMMgCl2,10mM(NH4)SO4,4mM DTT,pH 7.5)，200μM dNTPs、100nM cDNA分子，以及0.1Uμl-1Φ29DNA聚合酶，置于37℃条件下孵育1h。
5.根据权利要求2所述基于DNA分子级联放大的膜蛋白原位分析方法，其特征在于荧光信号的检测步骤为：
(1)加入荧光分子标签：利用DNA间的互补配对作用，使扩增出的长单链DNA被标记上荧光分子，由此细胞膜蛋白就可以在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下被直接观察和定位，具体步骤为加入含250nM荧光分子标签的PBS缓冲液并于37℃孵育30min；随后用含有吐温20的PBS缓冲液PBST洗涤细胞；
(2)荧光信号的检测，细胞膜蛋白成像。
6.根据权利要求3所述基于DNA分子级联放大的膜蛋白原位分析方法，其特征在于荧光信号的检测步骤为：
(1)加入‘RTA mix’反应液5μl：含5×反应缓冲液1μl，10μM荧光分子信标3μl(分子15)和10Uμl-1Nb.BvCl切刻酶1μl，切刻内切酶没有切割荧光分子信标时，荧光信号被探针末端的猝灭基团猝灭，不能检测到荧光信号；当切刻内切酶以扩增出的长单链DNA为模板，循环切割荧光分子信标，就可以获得相应的荧光信号，由此建立起荧光信号强度和膜蛋白之间的定量关系；
(2)荧光信号的检测，细胞膜蛋白的定量检测：将PCR管置于热循环仪上，实时记录荧光信号，每3min记录一次，共20次，监测产生荧光信号，获得的荧光值与标准曲线比较，获得对应蛋白的定量信号。
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