CN111471749A - 一种atp检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种ATP检测方法和试剂盒。该方法是基于DNA酶辅助滚环扩增进行信号放大的荧光传感器对ATP的含量进行高灵敏和高特异性检测的新方法。实验结果表明，该ATP检测方法的检测范围为0.05nM‑200nM，检测下限为0.035nM(S/N＝3)。这种新的ATP检测新方法既不需要复杂的仪器，也没有繁琐的检测步骤。因此，它将在医学领域具有广泛的应用前景。

Description

一种ATP检测方法和试剂盒

技术领域

本发明属于ATP检测技术领域，具体涉及一种基于DNA酶(DNAzyme) 辅助滚环扩增进行信号放大的荧光传感器对ATP的含量进行高灵敏和高特异性检测的新方法及其配套试剂盒。

背景技术

三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)作为生物体内重要的能量储存和供给物质，参与生物体内包括物质合成、DNA复制、信号传导和代谢等多种生命活动。另外，生物体内ATP的异常表达也经常被用作细胞损伤和许多疾病的指标，特别是缺氧、肿瘤和帕金森病的发生等疾病。因此，寻找一种灵敏的 ATP检测方法在生物医学研究和临床诊断方面都具有重要意义。

目前已经有很多的ATP的检测方法被报道出来了，主要包括高效液相色谱法、化学发光法、电化学法和比色法等。但由于这些方法存在灵敏度低、操作复杂和成本高等缺点，因此它们在实际中的应用受到了限制。例如，Mao等人提出了一种检测下限为7.2nM的电化学法对ATP进行检测分析[1]。这种检测方法具有很强的特异性，但在检测时需要昂贵仪器，因此无法在实际中得到广泛应用。Zhang和其同事报告了一种用比色法对ATP进行检测的方法[2]。尽管该方法的灵敏度很高，但耗时长是其一大缺点。因此，开发一种灵敏度高、特异性强的 ATP检测方法仍然是一个亟待解决的问题。荧光法作为一种新型的生物检测方法，以其简单、灵敏度高、耗时短、成本低等优点越来越受到人们的重视。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种ATP检测方法。该方法具备高灵敏度、高选择性和高性价比的特点，且操作简单，极具应用价值。本发明方法排除诊断目的的检测，可以适用于科研。

本发明ATP检测方法，具体包括以下步骤：

(1)设计和合成PL链、HP链和MB链三种DNA探针：PL链和HP链用于环状DNA的形成；MB链为同时标记荧光基团和淬灭基团的taqman探针；

(2)在ATP存在的情况下，PL链和HP链被T4 DNA连接酶链接形成环状 DNA；

(3)形成的环状DNA作为下一步RCA扩增的模板参与扩增反应；同时， HP链也作为启动RCA的引物链参与RCA过程，再向反应体系中添加phi29 DNA 聚合酶和dNTPs后，HP链作为引物沿着圆形模板进行延伸，会产生大量的 DNAzyme；

(4)新形成的DNAzyme序列在金属离子的辅助下会对含有切割位点的底物链MB进行切割，导致同时含有淬灭基团和荧光基团的MB链被裂解，其所标记的荧光基团和淬灭基团分离，从而产生荧光信号；制作标准曲线，依据荧光信号的强弱来反映待测体系中ATP的含量；

在ATP不存在的情况下，HP链和PL链不会发生链接反应，导致环状DNA 不会形成，无法进行RCA的扩增，反应体系的荧光值不会有变化。

进一步的，所述的方法，PL链由核心序列和两端序列连接而成，核心序列为金属离子辅助的DNAzyme酶序列的互补序列，连接在核心序列两端的序列碱基随机排列，长度分别为5-75个碱基，优选5-15个碱基；HP链能与连接在PL 链核心序列的两端序列末端互补，互补的总长度范围为10-150个碱基，优选10-30 个碱基。

本发明不仅仅限于以下优选序列。

HP链序列为：TACAATGTCACACGGATTCA；见SEQ ID NO.1。

PL链序列为：

P-TGACATTGTACCTCAGACCAACTATTCGACCGGCTCGGAGAAGAGAT GCAGCTTGAATCCGTG(P代表磷酸基团)；见SEQ ID NO.2；

PL链中斜体部分为DNAzyme酶序列的互补序列，HP链为环形模板PL链下划线部分的互补序列。

MB链序列为：

FAM-CCACCATCACCAACTATAGGAAGAGATGTTTGGTGG-BHQ₁，见 SEQ ID NO.3，加粗下划线的A是代表腺嘌呤核糖核苷酸，是DNAzyme的切割位点。

进一步的，所述的方法，DNAzyme包括：Pb²⁺辅助的DNAzyme、Cu²⁺辅助的DNAzyme或Mg²⁺辅助的DNAzyme。

进一步的，优选Mg²⁺辅助的DNAzyme的序列如下： CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAA，见SEQ ID NO.4。

进一步的，所述的方法具体如下：

将不同浓度的ATP，75-125nM的HP链和30-70nM PL链添加到18μL Tris-HCl缓冲液中，在80-100℃间变性，变性时间至少10min，缓慢冷却至室温；然后，向上述溶液中加入15-25U T4 DNA ligase并于30-40℃水浴锅中水浴，水浴时间至少30min；随后，添加至少2.5Uphi29 DNA聚合酶,至少250μM dNTPs，2-4ng/mL BSA和28μL 1×phi29 DNA聚合酶缓冲液到反应体系中，并于25-37℃孵育至少4h；最后添加50μL H₂O和70-150nM MB链到上述反应溶液中，并于25-37℃的条件下反应，反应时间至少30min。

进一步优选：将不同浓度的ATP，100nM的HP链和50nM PL链添加到 18μLTris-HCl缓冲液中，在95℃下变性10min，缓慢冷却至室温；然后，向上述溶液中加入20U T4 DNAligase并于37℃水浴锅中水浴30min；随后，添加 2.5U phi29DNA聚合酶,3ng/mL BSA,250μMdNTPs和28μL1×phi29DNA聚合酶缓冲液到反应体系中，并于30℃孵育4h；最后添加50μLH₂O和100nM MB 链到上述反应溶液中，并于30℃的条件下反应30min；整个反应溶液的最终体积为100μL。

本发明的第二个目的是提供上述的方法配套的试剂盒，包括：PL链、HP链和MB链三种DNA探针、T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、dNTPs。

进一步的，上述的试剂盒中PL链由核心序列和两端序列连接而成，核心序列为金属离子辅助的DNAzyme酶序列的互补序列，连接在核心序列两端的序列碱基随机排列，长度分别为5-75个碱基，优选5-15个碱基；HP链能与连接在 PL链核心序列的两端序列末端互补，互补的总长度范围为10-150个碱基，优选 10-30个碱基。

进一步的，上述的试剂盒，优选但不限于以下具体序列：

HP链序列为：TACAATGTCACACGGATTCA；

PL链序列为：

P-TGACATTGTACCTCAGACCAACTATTCGACCGGCTCGGAGAAGAGAT GCAGCTTGAATCCGTG(P代表磷酸基团)；

PL链中斜体部分为DNAzyme酶序列的互补序列，HP链为环形模板PL链下划线部分的互补序列。

MB链序列为：

FAM-CCACCATCACCAACTATAGGAAGAGATGTTTGGTGG-BHQ₁，加粗下划线的A是代表腺嘌呤核糖核苷酸，是DNAzyme的切割位点。

进一步的，所述的试剂盒还包括：含Pb²⁺、Cu²⁺或Mg²⁺的Tris-HCl缓冲液、 BSA、phi29DNA聚合酶缓冲液。

Tris-HCl缓冲液配方：50mMTris-HCl,10mM MgCl₂,10mM DTT,pH7.5，

由于Tris-HCl缓冲液本身含有镁离子，因此不需要额外添加镁离子。若是 Pb²⁺或Cu²⁺辅助的DNA酶，则需要额外添加10-100mM的Pb²⁺或Cu²⁺。

本发明检测方法中出现的DNA酶(DNAzyme)是一种具有酶切活性的单链寡核苷酸序列，近年来在生物医学检测中受到广泛关注。这种单链寡核苷酸序列可以在特定金属离子的辅助下，对含有一个核糖核苷酸的寡核苷酸底物进行切割。目前，已开发出多种类型的DNA酶，如Pb²⁺辅助的DNAzyme、Cu²⁺辅助的DNAzyme和Mg²⁺辅助的DNAzyme。与传统蛋白酶相比，DNAzyme不仅合成简单，热稳定性好，而且成本低，反应效率高。此外，金属离子辅助的DNAzyme 可以在不丧失其结合能力和活性的前提下通过高温的条件与切割底物分离。因此，DNAzyme可与信号放大策略相结合用于生物分子检测。

滚环扩增信号放大方法(Rolling circle amplification，RCA)是一种简单有效的由DNA聚合酶介导的等温扩增方法。RCA的产物是一个非常长且具有许多重复序列的单链DNA，它是由DNA聚合酶在无限循环和恒温条件下连续延伸引物获得的产物。与链取代信号放大策略相比，RCA方法不需要大量复杂的发夹探针设计。并且人们可以通过圆形扩增模板序列来获得特定的DNA序列，这种方法非常适合用于获得大量的DNAzyme。RCA由于具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点，已被广泛应用于DNA、RNA、蛋白质和生物小分子的检测中。

本发明关于ATP检测的实验原理如原理图1所描述。首先，设计和合成了三种用于实验研究的DNA探针：Padlock probe(PL)和Helper(HP)用于环状 DNA的形成,MB链是一种同时标记荧光基团和淬灭基团的taqman探针。在ATP 存在的情况下，PL链和HP链易被T4DNA连接酶链接形成环状DNA，所形成的环状DNA作为下一步RCA扩增的模板，参与扩增反应。同时，HP链也作为启动RCA的引物链参与RCA过程，所以在向反应体系中添加phi29和dNTPs后，HP链作为引物沿着圆形模板进行延伸，将会产生大量的DNAzyme。新形成的DNAzyme序列在Mg²⁺的辅助下将会对含有切割位点(rA)的底物链MB进行切割。一旦同时含有淬灭基团和荧光基团的MB链被裂解，其所标记的荧光基团和淬灭基团将会分离，从而产生强烈的荧光信号。与此相反的，在ATP不存在的情况下，HP链和PL链将不会发生链接反应，导致环状DNA不会形成，进而无法进行RCA的扩增。所以反应体系的荧光值不会有任何变化。因此，本发明可以通过反应体系中荧光信号的变化来反应ATP的含量变化。

在本发明中，以T4 DNA连接酶和phi29 DNA聚合酶(phi 29)辅助滚环扩增信号放大的策略，提出了一种高灵敏度和高选择性的ATP检测新方法。这种检测方法主要基于ATP在环状DNA形成中发挥的重要作用，并进一步通过RCA 和DNAzyme进行荧光信号的放大。总之，本发明提出了一种高灵敏度、高选择性和高性价比的荧光传感器用于ATP检测，这种荧光检测方法有望应用于临床检测分析中，并会满足精准医学和肿瘤学日益增长的需求。

附图说明

图1：本发明ATP检测的实验原理图。

图2：(A)实验可行性分析：曲线a(MB),曲线b(HP+PL+phi 29+dNTP+ MB),曲线c(HP+PL+T4 DNA ligase+ATP+MB),曲线d(HP+PL+T4 DNA ligase+phi 29+dNTP+MB)和曲线e(HP+PL+ATP+T4 DNA ligase+phi 29 +dNTP+MB)；(B)环状DNA形成的琼脂糖电泳结果：条带1:100pb mark；条带2:HP；条带3:PL；条带4:HP+PL+ATP+T4 DNA ligase+Exo 1+Exo 3；条带5:HP+PL+T4 DNA ligase+Exo 1+Exo 3；(C)RCA扩增的琼脂糖电泳结果：条带1:1000pb mark；条带2:HP+PL+T4 DNA+phi29+dNTP；条带3:HP +PL+ATP+T4 DNA+phi29+dNTP。实验所用HP,PL,ATP,T4 DNA ligase, phi 29,dNTP和MB链的浓度分别为100nM,50nM,1mM,50U,2.5U,200μM 和100nM。

图3：实验条件优化结果：(A)T4 DNA ligase反应浓度优化(5,10,15,20, 25,30U)；(B)phi 29DNA聚合酶反应浓度优化(1,1.5,2,2.5,3.3.5U)；(C)dNTP 反应浓度优化(100,150,200,250,300,400μM)；(D)phi 29聚合酶反应时间优化 (1,2,3,4,5h)；(E)HP链反应浓度优化(25,50,75,100,125,150nM)；(F)PL链反应浓度优化(nM)；(G)MB链反应浓度优化(nM).图中纵坐标设置为F/F₀,其中 F和F₀分别代表添加和不添加ATP的实验组和对照组的荧光值，每组实验重复 3次。

图4：ATP定量检测：(A)不同ATP浓度(0,0.05,1,20,50,100,150,200,300, 400,500nM)样品的荧光光谱图；(B)不同浓度ATP在520nm处的荧光值和浓度之间的线性图；每组实验重复3次。

图5：(A)ATP检测方法的特异性分析：Blank,ADP,AMP,CTP,GTP,UTP 和ATP均为200nM；(B)ATP检测方法的重复性；每组实验重复3次。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

1材料和方法

1.1、实验材料

三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(Adenosinediphosphate，ADP)、一磷酸腺苷(Adenosine monophosphate，AMP)、三磷酸胞苷(Cytidinetriphosphate，CTP)、三磷酸鸟苷(Guanosine triphosphate，GTP)、三磷酸尿苷(Uridinetriphosphate，UTP)、tris base和氯化镁(MgCl₂)均购买于Solarbio(Beijing,China)。T4DNA连接酶(T4 DNAligase),phi29 DNA聚合酶(phi 29)and deoxyribonucleoside 5’-triphosphate mixture(dNTP)购买于New England Biolabs(Beverly,MA,USA)。实验中所用的DNA链(表1)是由Shanghai Sangon Biological Engineering Technology andServices Co.,Ltd.(Shanghai,China) 合成。在本实验中所使用的两种反应缓冲液成分分别为：(1)Tris-HCl buffer(50 mMTris-HCl,10mM MgCl₂,10mM DTT,pH7.5)；(2)1×phi29DNA聚合酶 buffer(购买于New England Biolabs(Beverly,MA,USA))。

表1实验所用DNA链的序列

1.2、实验仪器

用荧光分光光度计RF-6000(日本岛津)来测量荧光信号，实验参数中激发波长设置为490nm，发射波长范围设置为505-645nm。激发和发射狭缝分别设置为5nm和5nm。每次测量时反应体系的最终体积为100μL。

1.3、ATP检测

首先，将不同浓度的ATP，100nM的HP链和50nM PL，链添加到18μL Tris-HCl缓冲液中，在95℃下变性10min，然后缓慢冷却至室温。然后，向上述溶液中加入20U T4 DNA，ligase并于37℃水浴锅中水浴30min。随后，2.5U phi29DNA聚合酶,3ng/mL BSA,250μMdNTP和28μL 1×phi29 DNA聚合酶缓冲液被添加到上述反应体系中，并于30℃孵育4h。最后50μL H₂O和100nM MB 链被添加到上述反应溶液中，并于30℃的条件下反应30min。整个反应溶液的最终体积大约为100μL。

为了进一步探究该检测方法的实用性，我们采用稀释的人血清(5％)作为生物样品。首先将5μL健康人血清和13μLTris-HCl buffer混合作为生物样品。然后，在生物样品中加入0.5μL不同浓度的ATP(40nM,100nM和150nM)，100nM HP 链和50nM PL，并于95℃变性10min后，再缓慢降温到室温。随后继续添加 20U T4 DNA ligase并于37℃条件下反应30min。下一步，2.5U phi29,3ng/mL BSA,250μMdNTP和28μL 1×phi29 buffer被添加到上述反应溶液中并于30℃反应4h。接下来，再将50μL H₂O和100nM MB链添加后于30℃反应30min，反应体系的最终体积大约为100μL。最终，用荧光仪记录520nm处的荧光值，用于计算回收率，每组实验重复3次。

1.4、琼脂糖凝胶电泳

采用琼脂糖电泳法确定和分析环状DNA和RCA扩增产物的形成。在环状 DNA形成的实验中，首先将4.5μL的样品和0.5μL 10x loading buffer充分混匀. 再将该混合物添加到4％琼脂糖凝胶上，加入1×TAE缓冲液后以100V为恒定电压进行40min的电泳分析。最后使用凝胶记录系统拍摄凝胶。与此类似，RCA 反应缓冲液(4.5ul)和1x loading buffer相混合后，加入到0.8％琼脂糖凝胶上，并使用凝胶记录系统拍摄凝胶。

2、实验结果和分析

2.1、可行性分析

进行了一系列的实验来评估该检测方法的可行性，实验结果如图2所示。由于荧光基团和淬灭基团是标记在MB链上，所以每个实验组都包含MB链。在图2A中，曲线a(仅含有MB链)观察到很微弱的荧光信号，说明当荧光基团和淬灭基团同时标记于MB链时，会形成很好的荧光淬灭效果。其次，向反应溶液中添加PL链,HP链和phi 29后，曲线b和曲线a相比，荧光没有明显变化，说明环状DNA模板链的形成需要T4DNA连接酶的参与,故而Phi 29无法诱导DNAzyme的形成，所以无明显荧光信号产生。同理，当反应体系中存在HP,PL, T4 DNAligase,ATP和MB时，反应体系同样无法产生荧光，说明RCA扩增的过程需要phi 29DNA聚合酶和dNTP的参与。此外，当除了ATP以外的T4连接反应和RCA扩增所需的原料被加入到反应体系时，曲线d和上述曲线表现出相似的荧光信号。通过曲线a到曲线d的结果可以说明，反应体系中没有ATP 时，无法产生荧光信号。而在加入ATP后，曲线e的荧光信号显著高于之前的4 条曲线，说明环状DNA的形成需要ATP的参与。

为了更近一步验证环状DNA形成和RCA扩增过程，我们采用琼脂糖凝胶电泳法对实验设计进行了进一步分析。实验结果如图2B所示，当反应体系中只存在HP链或PL链时，都在凝胶上只能看到一条清晰的条带(条带2和条带3)。在Exo 1和Exo 3(Exo 1是核酸外切酶1，切割DNA单链成单核苷酸，Exo 3 是核酸外切酶3，该酶作用于双链DNA，沿3'→5'方向逐步催化去除单核苷酸) 存在的前提下，含有HP链,PL链,ATP和T4 DNA连接酶的样品(条带4)相比于条带2或者条带3显示多了一条更高的条带,这就说明了环状DNA的形成。在此基础上，如果去除反应体系中的ATP，就会发现样品不会显示出任何条带(条带5)。综合以上结果可知，环状DNA确实形成了。图2C的结果验证了 RCA的扩增过程。HP,PL,T4 DNA ligase,phi29和dNTP的混合样品没有显示出任何的条带(条带2)。与此相反，加入ATP后，条带3显示出了一条清晰的条带 (条带3)，说明RCA扩增过程顺利进行。综合以上所有的实验结果可知，本发明所提出的ATP检测方法在原理上是可行的。

2.2、优化反应条件

为了获得最佳的反应条件，对实验条件进行了优化。根据实验原理和实验设计，主要对以下几个主要的反应条件进行了优化：HP链的反应浓度，PL链的反应浓度，T4DNA连接酶的浓度，phi 29聚合酶的浓度，dNTP的反应浓度，phi 29 聚合酶的反应时间和MB链的反应浓度。

图3A为T4 DNA连接酶的浓度优化结果。从图中可以看出，T4 DNA连接酶的浓度优化结果呈阶梯状，当T4 DNA连接酶的浓度为20U时，曲线达到饱和点。在此之后，随着T4 DNA连接酶的浓度的增加，含ATP的实验组和不含 ATP的对照组之间的荧光比变化不大，说明此时，连接反应几乎反应完全了。也就是说，20UT4 DNA连接酶已经足够用于连接反应。因此，为了确保连接反应具有很好的高效性和性价比，选择20U T4 DNA连接酶用于之后的实验。基于同样的理由，另外几个参数的最优条件分别为：phi 29聚合酶的最佳反应浓度为2.5U(图3B)，dNTP的最佳反应浓度为250μM(图3C)，phi 29聚合酶的最佳反应时间为4h(图3D)，HP链的最佳反应浓度为100nM(图3E)，PL的最佳反应浓度为50nM(图3F)。

和上述反应条件的结果不同，可以发现当MB的浓度在20-200nM时，可以发现F/F₀的比值出现了一个明显的峰值(图3G)。这表明，无论MB含量的过高或过低都不适合ATP的检测。当MB的含量过高时，就会产生较高的荧光背景，导致现象变弱。而较低的MB含量却又会造成反应不完全，所以选择100nM作为MB链的最佳反应浓度。

2.3、ATP含量检测

在最优的反应条件下，对不同ATP浓度(0,0.05,1,20,50,100,150,200,300, 400和500nM)的荧光光谱进行了检测分析。如图4所示,ATP的浓度和荧光强度之前存在明显的相关性。随着ATP浓度的增加，整个反应体系的荧光值也逐渐增加，并在500nM左右达到最高值(图4A)。图4B显示出了一条很好的关于 0.05到200nM处ATP浓度和荧光强度之间的线性关系，该线性曲线的回归方程为Y＝26.344X+1243.8，R2＝0.9925(Y和X分别代表反应体系在520nm处的荧光强度和ATP浓度)。结果表明，该检测方法的检测下限为0.035nM(S/N＝3),和已报道的ATP检测文章相比，本发明的检测方法的检测下限更低。

2.4、特异性和重复性

通过比较ATP及其类似物的荧光变化来评估本检测方法的特异性。根据以往的文献，选择了以下几种物质来进行验证：二磷酸腺苷(ADP)，一磷酸腺苷 (AMP)，三磷酸胞苷(CTP)，三磷酸鸟苷(GTP)，三磷酸尿苷(UTP)。如图5A所示，和空白对照组相比，除了加入ATP的实验组外，其他的实验组的荧光值没有明显变化，这种现象是由于T4 DNA连接酶对辅酶物质具有较高的特异性的原因导致的。由于其它的类似物和ATP的结构不同，因此无法提供连接反应所需的能量。所以，除了加入ATP的实验组外，其它的实验组无法产生强烈的荧光信号。这说明本发明所提出的新的检测方法对ATP的检测具有高度的特异性。

为了验证该检测方法的可重复性，五组一样的荧光传感器在相同条件下分别对200nM ATP进行了检测分析(图5B)。相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)约为8.74％,说明该检测方法具有良好的稳定性和再现性。

另外，在实际样品中进一步分析该方法的日间和日内精密度。通过在一天内对3组不同的样品分别进行3次独立分析来获得日内精密度，通过连续3天对相同样品进行两次分析来获得日间精密度。日内和日间的RSD值分别为4.41％至 6.81％和2.03％至9.13％(表2)，表明本发明方法具有良好的重复性。

2.5、实际样品分析

为了进一步评估本发明所提出的ATP检测方法在生物样品中的实用性，我们对5％人血清样品进行了ATP检测分析。构建生物样品的方法是将3种已知浓度的ATP(40，100和150nM)加入到5％健康人血清中，每种浓度的生物样品分别配制了15例，并用本发明所提出的方法来测定回收率，下表中的结果均是平均值。40，100和150nM ATP实验组的回收率分别为100.99％,95.05％和 103.78％(表2)。结果表明，本发明方法具有很好的实用价值。

表2ATP检测的实际样品分析

总结

基于DNAzyme辅助的滚换扩增信号放大技术，本发明提出了一种高灵敏和高特异性的ATP检测新方法。这种新检测方法由于是基于荧光传感器而建立的，所以不需要昂贵的成本和复杂的仪器。此外，和传统的检测方法相比，该检测方法不仅具有极低的检测下限(0.035nM,S/N＝3)，还具有较宽的检测范围(0.05nM 到200nM)。此外，特异性和实验样品实验也证明了这种新的检测方法在实际应用中的巨大潜力。综上所述，这种新的荧光传感器在检测ATP方面具有良好的应用前景。

参考文献：

[1]Y.Mao,J.Liu,D.He,X.He,K.Wang,H.Shi,L.Wen,Aptamer/target binding-induced triple helix forming for signal-on electrochemical biosensing,Talanta143(2015)381-387.

[2]S.Zhang,K.Wang,J.Li,Z.Li,T.Sun,Highly efficient colorimetricdetection of ATP utilizing a split aptamer target binding strategy andsuperior catalytic activity of graphene oxide–platinum/gold nanoparticles,RSCAdvances 5(92)(2015)75746-75752。

序列表

<110> 中南大学

<120> 一种ATP检测方法和试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tacaatgtca cacggattca 20

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgacattgta cctcagacca actattcgac cggctcggag aagagatgca gcttgaatcc 60

gtg 63

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_signal

<222> (18)..(18)

<223> 第18位碱基A为腺嘌呤核糖核苷酸

<400> 3

ccaccatcac caactatagg aagagatgtt tggtgg 36

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catctcttct ccgagccggt cgaa 24

Claims (10)

1.一种ATP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计和合成PL链、HP链和MB链三种DNA探针：PL链和HP链用于环状DNA的形成；MB链为同时标记荧光基团和淬灭基团的taqman探针；

(2)在ATP存在的情况下，PL链和HP链被T4 DNA连接酶连接形成环状DNA；

(3)形成的环状DNA作为下一步RCA扩增的模板参与扩增反应；同时，HP链也作为启动RCA的引物链参与RCA过程，再向反应体系中添加phi29 DNA聚合酶和dNTPs后，HP链作为引物沿着圆形模板进行延伸，会产生大量的DNAzyme；

(4)新形成的DNAzyme序列在金属离子的辅助下会对含有切割位点的底物链MB进行切割，导致同时含有淬灭基团和荧光基团的MB链被裂解，其所标记的荧光基团和淬灭基团分离，从而产生荧光信号；制作标准曲线，依据荧光信号的强弱来反映待测体系中ATP的含量；

在ATP不存在的情况下，HP链和PL链不会发生连接反应，导致环状DNA不会形成，无法进行RCA的扩增，反应体系的荧光值不会有变化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PL链由核心序列和两端序列连接而成，核心序列为金属离子辅助的DNAzyme酶序列的互补序列，连接在核心序列两端的序列碱基随机排列，长度分别为5-75个碱基，优选5-15个碱基；HP链能与连接在PL链核心序列的两端序列末端互补，互补的总长度范围为10-150个碱基，优选10-30个碱基。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

HP链序列为：TACAATGTCACACGGATTCA；

PL链序列为：

P-TGACATTGTACCTCAGACCAACTATTCGACCGGCTCGGAGAAGAGATGCAGCTTGAATCCGTG，P代表磷酸基团；

MB链序列为：

FAM-CCACCATCACCAACTAT

GGAAGAGATGTTTGGTGG-BHQ₁，加粗下划线的A是代表腺嘌呤核糖核苷酸，是DNAzyme的切割位点。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，DNAzyme包括：Pb²⁺辅助的DNAzyme、Cu²⁺辅助的DNAzyme或Mg²⁺辅助的DNAzyme。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，Mg²⁺辅助的DNAzyme的序列如下：CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAA。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将不同浓度的ATP，75-125nM的HP链和30-70nM PL链添加到18μL Tris-HCl缓冲液中，在80-100℃间变性，变性时间至少10min，缓慢冷却至室温；然后，向上述溶液中加入15-25U T4 DNA ligase并于30-40℃水浴锅中水浴，水浴时间至少30min；随后，添加至少2.5U phi29 DNA聚合酶,至少250μM dNTPs，2-4ng/mLBSA和28μL1×phi29 DNA聚合酶缓冲液到反应体系中，并于25-37℃孵育至少4h；最后添加50μL H₂O和70-150nM MB链到上述反应溶液中，并于25-37℃的条件下反应，反应时间至少30min。

7.权利要求1-6任一项所述的方法配套的试剂盒，其特征在于，包括：PL链、HP链和MB链三种DNA探针、T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、dNTPs。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，PL链由核心序列和两端序列连接而成，核心序列为金属离子辅助的DNAzyme酶序列的互补序列，连接在核心序列两端的序列碱基随机排列，长度分别为5-75个碱基，优选5-15个碱基；HP链能与连接在PL链核心序列的两端序列末端互补，互补的总长度范围为10-150个碱基，优选10-30个碱基。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，

HP链序列为：TACAATGTCACACGGATTCA；

PL链序列为：

P-TGACATTGTACCTCAGACCAACTATTCGACCGGCTCGGAGAAGAGATGCAGCTTGAATCCGTG，P代表磷酸基团；

MB链序列为：

FAM-CCACCATCACCAACTAT

GGAAGAGATGTTTGGTGG-BHQ₁，加粗下划线的A是代表腺嘌呤核糖核苷酸，是DNAzyme的切割位点。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括：含Mg²⁺的Tris-HCl缓冲液、BSA、phi29DNA聚合酶缓冲液。

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