CN112941154A - 一种分子信标探针及其在制备检测circBART2.2制剂中的应用和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分子信标探针及其在制备检测circBART2.2制剂中的应用和试剂盒。该分子信标探针能与circBART2.2杂交，T7Exo再对杂交复合物进行酶切，释放出来的荧光团使荧光信号增强，而释放的circBART2.2继续与分子信标探针杂交，实现循环，使荧光信号得到显著增强，从而达到检测circBART2.2的目的。该方法不需要复杂的仪器，操作简便，特异性好、灵敏度高，具有很好的应用前景。

Description

一种分子信标探针及其在制备检测circBART2.2制剂中的应 用和试剂盒

技术领域

本发明属于环状RNA检测技术领域，具体涉及一种分子信标探针及其在制备检测circBART2.2制剂中的应用和试剂盒。

背景技术

病毒编码的circRNA是近年来的研究热点，EB病毒(EBV)是疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员，基因组为DNA。EBV感染与淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌等多种癌症密切相关，对EBV编码的circRNA的灵敏检测能够为EBV相关疾病的早期诊断提供一些帮助。circBART2.2为EBV编码的一种circRNA，它在淋巴瘤等的发生发展中具有重要作用，对其灵敏、准确地检测有助于临床上更好地了解疾病的发展进程，对其诊疗具有重要意义。

目前报道的circRNA检测方法包括：实时荧光聚合酶链式反应(qRT-PCR)、northern blotting、二代测序、微阵列分析法等，但它们都存在一定的局限性。qRT-PCR需要一个必要的逆转录步骤来获得cDNA，然后是扩增步骤，这增加了实验成本和设计的复杂性，还可能有假阳性结果；Northern blotting步骤多，杂交时间长，样本量大，灵敏度不高；二代测序和微阵列技术检测步骤繁琐且所用费用高等都限制了其广泛使用。

因此，研发新的高灵敏度、高特异性、低成本、高效简洁的检测方法及配套检测工具是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题和缺陷，提供一种用于检测circBART2.2的分子信标探针MB。利用该分子信标探针能与circBART2.2特异性杂交，T7Exo能够对杂交复合物进行酶切的特性，释放的荧光团可以使荧光信号增强，而circBART2.2可以继续与MB杂交，实现杂交、酶切、释放的循环过程，使体系的荧光信号得到数倍增强，从而达到灵敏检测circBART2.2的目的。

本发明的分子信标探针，序列为：BHQ1-ACG CCG GAC CTT GCC CGT TTT TTT GTCCGG-FAM。

本发明的次要目的是提供上述的分子信标探针在制备检测circBART2.2制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供上述的分子信标探针在检测circBART2.2中的应用。将分子信标探针加入到含有T7核酸外切酶和待检测样品的体系中反应，检测荧光强度，通过标准曲线法获得circBART2.2的浓度。

上述的应用，体系中T7核酸外切酶浓度为100-200U/ul；优选100U/ul。

上述的应用，体系中分子信标探针浓度为100-300nM，优选200nM。

上述的应用，反应温度35-40℃，反应时间3-5h。

上述的应用，反应温度37℃，反应时间3h。

上述的应用，反应体系中还需要加入buffer，RNase inhibitor，无酶水。

本发明方法排除诊断目的的应用。

本发明的第四个目的是一种检测circBART2.2的试剂盒，包含上述的分子信标探针和T7核酸外切酶。

进一步地，还包括：buffer，RNase inhibitor，无酶水。

本发明分子信标探针(MB)，其5’端带猝灭基团BHQ1，3’端带荧光基团FAM，由于发夹结构的存在，荧光首先被猝灭且5’端多设计3个未杂交的碱基保护MB不被T7核酸外切酶(T7 Exo)酶切。T7 Exo能沿5′→3′方向降解RNA/DNA杂交双链上的RNA或DNA，但不能降解双链或单链RNA。此外，分子信标探针5’端包含6个T碱基，目的是为了让分子信标探针更稳定。

本发明检测原理：

本发明设计了分子信标探针(MB)作为荧光探针，其中(a’)部分可以与circBART2.2(a)的特征序列杂交，MB形成分子间发卡结构，使猝灭剂和荧光团相互靠近。因此，荧光首先被发夹结构淬灭。在5'端比3'端多了三个未杂交碱基。当系统中没有circBART2.2时，这种茎结构保护MB不被T7 Exo消化，因为T7 Exo只启动双链DNA或DNA/RNA杂交的5'端的酶切消化。在目标circBART2.2存在的情况下，circBART2.2(a)的红色区域与MB(a’)的红色区域杂交，形成完全匹配的DNA/RNA双螺旋结构，打开MB的发夹结构，恢复FAM的荧光。此外，系统中的T7 Exo开始消化MB探针5'端DNA/RNA双螺旋结构，释放目标circBART2.2，并释放FAM标记的单链DNA(信号DNA产物:SDP)。释放的目标circBART2.2触发更多与MB的杂交和T7Exo辅助消化的循环过程，从而产生更多的SDPs。通过这一扩增过程，不仅circBART2.2可以被MB特异性识别，而且一个目标circBART2.2可以产生大量的SDPs，这大大增加了荧光强度，实现了对circBART2.2的快速、灵敏的检测，见图1。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明首次设计与circBART2.2特异性互补配对杂交的分子信标探针，并将其引入circBART2.2的检测体系中，用于快速、灵敏地检测。同时利用T7 Exo的酶活性和MB的独特结构，做到高灵敏度和选择性的荧光定量检测目标circBART2.2。

(2)本发明无需对circBART2.2进行修饰，不破坏circRNA的结构，也不需要繁琐的步骤和复杂的仪器，微量的靶标就可以实现荧光信号的放大，该方法灵敏度高、特异性好，简单方便，其检测下限低至0.31pM；这是现有技术难以达到的。

(3)本发明不仅对合成的circBART2.2进行了检测，而且也成功的在细胞裂解液中检测了不同细胞系中circBART2.2的表达情况。本发明为EBV感染相关的疾病早期诊断提供了一种检测手段，具有很好的临床和医学研究价值。

附图说明

图1为本发明检测circRNA方法的原理；

图2为本发明实施例1中检测线性DNA的可行性结果；

图3为本发明实施例1中检测线性DNA时改变反应条件后的结果；

其中：A为反应温度，B为反应时间，C为MB的浓度，D为T7 Exo的浓度；

图4为本发明实施例1中线性DNA检测结果；

其中：A为本发明实施例中反应体系不同浓度的线性DNA的荧光强度；

B为本发明线性DNA浓度与荧光强度的具体关系；

图5为本发明实施例2中circDNA合成和检测结果；

其中：A为合成circDNA的示意图；

B为使用聚丙烯凝胶电泳检测circDNA合成效率；

C为检测circDNA的可行性结果；

D为反应体系不同浓度的circDNA的荧光强度；

E为circDNA浓度与荧光强度的具体关系；

图6为本发明实施例3中circRNA合成和检测结果；

其中：A为合成circRNA的示意图；

B为使用聚丙烯凝胶电泳检测circRNA合成效率；

C为检测circRNA的可行性结果；

D为反应体系不同浓度的circRNA的荧光强度；

E为circRNA浓度与荧光强度的具体关系；

图7A为本发明实施例4中使用鼻咽癌细胞系HONE1转染circBART2.2、circRNF13、circRILPL1、circPVT1、circADARB1过表达载体，对circRNA分别进行荧光检测的结果；

图7B为本发明实施例5中提取C666-1、Akata、HONE1-EBV(+)、HONE1、HNE2、CNE2细胞系的RNA的荧光检测结果。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

本发明主要试剂包括：

T7核酸外切酶、T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶2购买于New England Biolabs；

核糖核酸酶R购买于Geneseed Biotech Co.,Ltd；

核酸外切酶I购买于Takara；

核糖核酸酶抑制剂购买于Solarbio；

SuperGelRed购买于US EVERBRIGHT INC；

分子信标探针(MB)、线性DNA1(LD1)、线性DNA2(LD2)、线性RNA1(LR1)、Guide DNA(GD)、CircBART2.2其序列依次见序列表SEQ ID NO.1-6。

DEPC水购买于SangonBiotech(中国上海)。

本发明利用荧光光谱仪(SHIMADZU RF-6000Japan)采集荧光光谱，激发波长为496nm，发射波长为510-650nm，其狭缝值均为5nm。每组样品都重复三组，每个样品总体积100ul。

实施例1：检测线性DNA

由于DNA比RNA更稳定，不容易降解，首先合成了一段与MB匹配的线性DNA进行可行性和优化研究。在可行性实验中，如图2所示，当靶标线性DNA(LD1)LD1不存在时，MB会显示出较弱的背景荧光信号，这是由于荧光团与猝灭团相互靠近使荧光被猝灭了；在此基础上，添加了T7 Exo时，也没有明显的荧光值升高，这是由于MB特殊的茎部结构使其不是T7 Exo的底物；当加入LD1和MB，但没有加入T7 Exo时就会发现体系的荧光值有一定的升高，这是因为LD1能够打开MB发卡环结构，使荧光团和猝灭团分离，显示出荧光信号，但是由于没有进一步循环反应，荧光信号升高有限。当MB、LD1、T7 Exo三者共同存在于反应体系时，可以看到荧光信号得到显著升高，这是因为MB能够与LD1发生杂交反应打开发卡环结构，使荧光团和猝灭团分离，进而T7 Exo酶切杂交复合物使MB被切割为单个碱基，LD1和荧光团被释放，杂交、酶切、释放这一系列反应可以在体系中循环发生，从而使荧光信号发生明显变化。

为了使本发明检测体系达到最佳性能，对反应温度，反应时间，MB浓度，T7 Exo浓度等一系列反应条件进行了优化。首先对反应体系的温度进行优化，如图3A所示，在不同温度下(25℃,30℃,37℃,45℃,50℃)下对加LD1和不加LD1的样品进行实验，使用检测体系的荧光强度比值作为纵坐标来绘制不同温度下的荧光强度图，结果发现荧光强度比随着反应温度的升高而增加，37℃后达到平台期。因此，接下来的实验中，选择37℃作为最佳反应温度。然后对反应时间(1h，2h，3h，4h，5h)进行优化，如图3B所示，荧光强度比随着反应时间的增加而增加，在3h时达到平台，这是由于反应时间不仅影响杂交效率而且影响T7 Exo的酶切活性。因此，本实验的最佳反应时间为3h。之后以同样的方式对MB浓度(50nM,100nM,200nM,300nM,400nM)和T7 Exo浓度(0.03U/ul，0.07U/ul，0.1U/ul，0.13U/ul，0.17U/ul)进行优化，以获得最高的荧光强度比，如图3C和图3D所示，荧光强度比分别在200nM和0.1U/μL时达到最高。

在最佳的实验条件下，对LD1进行了定量检测。测量了不同浓度的LD1存在时检测体系的荧光光谱。如图4A所示，随着LD1的浓度从0nM增加到5nM时，检测体系的荧光强度不断增强并逐渐饱和。在图4B中可以看到，LD1浓度与荧光强度的具体关系，当LD1浓度从0增加到1nM时，荧光强度增大，1nM后达到平台期。如图4B中，检测体系在100fM-100pM之间有很好的线性范围，相关校准方程为Y＝57.64x+1368(R²＝0.9815)(Y为荧光强度，X为LD1浓度)。该检测体系检测LD1的检测限(LOD)计算为0.44pM(S/N＝3)。

实施例2：环状DNA的合成和检测

环状DNA是线性DNA2在guide DNA存在下通过T4 DNA连接酶环化而成。首先将5μL50μM guide DNA和1μL 50μM线性DNA2在65℃条件下孵育5min,然后缓慢降温至25℃(一分钟降1℃)。然后加入1μL(40U/μl)T4 DNA连接酶,和1μL 10xT4 DNA连接酶缓冲液,在37℃反应1h，然后80℃孵育5min；之后加入0.5μL(5U/μl)核酸外切酶I及1μl10x核酸外切酶I缓冲液在37℃孵育30min，最后70℃10min灭活酶活性。20％变性PAGE用来验证circDNA的合成效果，凝胶电泳在1XTBE缓冲液中，室温下电泳恒压150V 90min，之后使用SuperGelRed在缓慢摇动的摇床上泡染30min，使用紫外凝胶成像仪((Bio-Rad,USA))对凝胶进行显影。

合成circDNA示意图见图5A。聚丙烯凝胶电泳分析circDNA合成效率，如图5B所示，加入Exo I处理后LD2会被消化掉，而合成的circDNA不会被消化，这说明成功合成了circDNA。

2μL 10μM MB,10μL 10x NE buffer 4,1.0μL T7核酸外切酶,及1μL核糖核酸酶抑制剂与85μL无酶水混合。在上述溶液中加入1μL不同浓度的circDNA，在37℃反应3h，利用激发波长为496nm的荧光光谱仪采集荧光光谱。

采用实施例1最佳条件方法对合成的circDNA样品进行了检测，结果如图5C所示，在没有加入circDNA的情况下，MB由于荧光能量共振转移的猝灭作用，会显示出较弱的背景荧光信号；即使加入T7 Exo，荧光强度也没有变化，因为伸出的5’端并不是E7 Exo的底物；当MB与circDNA混合后，MB的荧光强度增加了2.4倍，是由于MB与目标circDNA可以发生杂交反应，使荧光团和猝灭团分开，产生一定的荧光信号；当MB、circDNA、T7 Exo三者混合时，体系的荧光强度提高了7.5倍，这是因为一个circDNA可以与多个MB进行杂交、酶切、释放的循环反应，使体系的荧光信号大大增强。

接下来在实施例1的最佳的实验条件下，对circDNA进行了定量检测，测定了不同浓度的circDNA的荧光强度并绘制了荧光光谱图与线性图。如图5D所示，从0到5nM，反应体系的荧光强度随着circDNA浓度的增加而不断增大。在图5E中可以看到circDNA在不同浓度下其荧光信号峰值的变化情况，加入100pM circDNA后，荧光强度增加了近6.4倍。如图5E所示，在1-100pM范围内，检测体系的荧光强度与circDNA浓度呈良好的线性关系。计算公式为Y＝55.22x+1068(R²＝0.9804)(Y为荧光强度，X为circDNA浓度)。以空白样品的3倍标准差计算出该检测系统对circDNA的检测限(LOD)为0.24pM。

实施例3：环状RNA的合成和检测

环状RNA是线性RNA1在guide DNA存在下通过T4 RNA连接酶2环化而成。首先将5μL50μM guide DNA和1μL 50μM线性RNA在65℃条件下孵育5min,然后缓慢降温至25℃(一分钟降1℃)。然后加入2μL(10U/μl)T4 RNA连接酶2和1μL 10xT4 RNA连接酶2缓冲液，2ul核糖核酸酶抑制剂在37℃反应3h，80℃孵育5min；之后加入0.5μL(5U/μl)核酸外切酶I、1μL核糖核酸酶R(20U/μl)及1ul10x核酸外切酶I、1ul10x核糖核酸酶R缓冲液37℃反应30min，最后70℃孵育10min灭活酶活性。20％变性PAGE用来验证circRNA的合成效果，凝胶电泳在1XTBE缓冲液中，室温下电泳恒压150V 90min，之后使用SuperGelRed在缓慢摇动的摇床上泡染30min，使用紫外凝胶成像仪((Bio-Rad,USA))对凝胶进行显影。

图6A显示了在Guide DNA的辅助作用下通过T4 RNA连接酶2的连接作用合成circRNA1。然后使用聚丙烯凝胶电泳分析了circRNA的合成效率。如图6B所示，线性RNA被RNase R快速消化，而合成的circRNA在RNase R消化后完好无损，这表明成功地制备了circRNA。

2μL 10μM MB,10μL 10x NE buffer 4,1.0μL T7核酸外切酶,及1μL核糖核酸酶抑制剂与85μL无酶水混合。在上述溶液中加入1μL不同浓度的circRNA，在37℃反应3h，利用激发波长为496nm的荧光光谱仪采集荧光光谱。

使用实施例1的最优条件和方法对合成的circRNA1样品进行检测，结果如图6C所示，MB或加入T7 Exo混合物的MB荧光强度较弱，表明体系的背景信号较低。而将5nM的circRNA1与MB混合后，MB的荧光强度增加了2.5倍。在T7 Exo的存在下，体系的荧光强度提高了7.3倍，说明了酶在检测体系中的放大过程。

随后，使用所提出的检测体系检测circRNA的灵敏度。如图6D所示，随着circRNA1的浓度从0增加到5nM，反应体系的荧光强度能够不断增强。在图6E中可以看到circRNA1浓度在1pM至100pM范围内，体系的荧光强度与其浓度呈良好的线性相关，相关方程为Y＝52.63X+1061(R²＝0.9868)(Y是相应circRNA1浓度的荧光值，X是circRNA1的浓度)。经计算，circRNA1的检测下限(LOD)为0.31pM(S/N＝3)。说明本发明设计的这种检测方法的检测效果是有显著效果的，且其操作简单，成本低。

实施例4：特异性实验

为了研究本发明方法对circRNA检测的特异性，人为过表达了其他几种不同的circRNA进行比较分析。过表达载体的构建是通过扩增和克隆目标片段到pcDNA3.1(+)CircRNA小载体中，在插入序列两端含有串联重复序列，以帮助CircRNA环化，从而实现CircRNA的过表达。在体外培养人类鼻咽癌细胞系HONE1使用1640培基含10％胎牛血清和1％双抗，这些细胞在37℃培箱(95％空气and 5％CO₂)孵育。生长到一定阶段后分别将过表达circBART2.2，circRNF13，circRILPL1，circPVT1，circADARB1载体(来自于中南大学肿瘤研究所，环状RNA序列见SEQ ID NO.6-10)瞬时转染进细胞内(经过全长测序证明过表达的确实就是这几种环状RNA)，36h后提取细胞总RNA，根据说明书使用Trizol试剂盒(Invitrogen,CA,USA)提取总RNA并使用核糖核酸酶R消化线性RNA，使用Nanodrop分光光度计(Thermo,USA)测定circRNA浓度。RNA均保存于-80℃。

在这些环状RNA中，只有circBART2.2与设计的MB有互补的RNA序列，被认为是目标环状RNA。提取总RNA，用RNase R处理得到纯化的环状RNA。如图7A所示，发现与其他组相比，只有含有circRNA1和过表达circBART2.2的提取物具有较强的荧光强度，circRNA1是根据circBART2.2的序列人工合成的，它们与探针杂交的序列是一致的。在circRNA1和circBART2.2的存在下，检测体系的荧光强度分别提高了6.1倍和4.6倍。相比之下，添加了其他circRNA的检测体系的荧光强度与对照组相比没有显著变化。因此，可以得出检测体系对目标circRNA检测具有较高的特异性。

实施例5：实际样品检测

为了验证本发明提出的circRNA检测方法的实际应用，分析了circBART2.2在不同细胞系中的表达，包括C666-1,Akata,HONE1-EBV(+),HONE1,HNE2,CNE2细胞系(来自于中南大学肿瘤研究所)。细胞培养和总RNA提取按照上面提到的方法。

为了验证该方法在实际中的应用情况，对不同细胞系中的circBART2.2进行了量化。由于circBART2.2是由EBV编码的，EBV在鼻咽癌中起重要作用，选择了C666-1、Akata、HONE1-EBV(+)、HONE1、HNE2、CNE2等多个鼻咽癌细胞系进行研究。如图7B所示，观察到circBART2.2在不同细胞系中的表达水平不同。C666-1、Akata和HONE1-EBV(+)是EBV阳性细胞系，可以编码circBART2.2。因此，检测体系在这些EBV阳性细胞系中荧光强度增强，表明circBART2.2过表达。而在EBV阴性细胞系中，包括HONE1、HNE2、CNE2细胞中，circBART2.2的表达水平较低。因此，在这些EBV阴性细胞系中观察到检测体系的荧光强度较低。综上所述，这些结果表明，本发明提出的方法可以成功应用于细胞裂解液样本的检测，并且在真实样本中对目标circRNA的敏感检测中具有可靠性。

序列表

<110> 中南大学

<120> 一种分子信标探针及其在制备检测circBART2.2制剂中的应用和试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgccggacc ttgcccgttt ttttgtccgg 30

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttacgggca aggtccggcg tggg 24

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggccatggcc ggagctcgtc gacgggcaag gtccggcgtg tccacggaga ctcggacgta 60

<210> 4

<211> 60

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggccauggcc ggagcucguc gacgggcaag guccggcgug uccacggaga cucggacgua 60

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttgccatgg cctacgtccg a 21

<210> 6

<211> 399

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

guccggcgug uccacggaga cucggacgua gcccuuaccg cggcguaugg cguugaccgg 60

acacaccuuc cccgggaaug ugugaauacg ggcguaugac uuuagaaaug ggggcgugug 120

cugcgccagc aggcugcgcg gauucaggac gcuuagcacg auguccuggu cagagugcau 180

aacgaagaag ggcuugagga auaccucguu gucuuccgcu ccaaagaaca agaacgcaac 240

cguaaaguag cggcugccgu agguggucgu guugaaggag aaagaagugg gccgcaggcg 300

gcggaggcug uuccugaacg acgagcgccg ggacgcuagu gcugcauggg cuccuccggg 360

guaagcuucg gccauggccg gagcucgucg acgggcaag 399

<210> 7

<211> 716

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

gugauuuuac aacgagaugc ugcucuccau agggaugcuc augcugucag ccacacaagu 60

cuacaccauc uugacugucc agcucuuugc auucuuaaac cuacugccug uagaagcaga 120

cauuuuagca uauaacuuug aaaaugcauc ucagacauuu gaugaccucc cugcaagauu 180

ugguuauaga cuuccagcug aagguuuaaa ggguuuuuug auuaacucaa aaccagagaa 240

ugccugugaa cccauagugc cuccaccagu aaaagacaau ucaucuggca cuuucaucgu 300

guuaauuaga agacuugauu guaauuuuga uauaaagguu uuaaaugcac agagagcagg 360

auacaaggca gccauaguuc acaauguuga uucugaugac cucauuagca ugggauccaa 420

cgacauugag guacuaaaga aaauugacau uccaucuguc uuuauuggug aaucaucagc 480

uaauucucug aaagaugaau ucacauauga aaaagggggc caccuuaucu uaguuccaga 540

auuuagucuu ccuuuggaau acuaccuaau ucccuuccuu aucauagugg gcaucugucu 600

caucuugaua gucauuuuca ugaucacaaa auuuguccag gauagacaua gagcuagaag 660

aaacagacuu cguaaagauc aacuuaagaa acuuccugua cauaaauuca agaaag 716

<210> 8

<211> 341

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

gcaugucaga gcgggagcga caggugauga agaagcugaa ggagguggug gacaaacaac 60

gcgacgagau ccgcgccaag gacagggagc ugggccugaa aaaugaggac guugaggcuu 120

uacagcagca gcagacacgg cugaugaaga ucaaccauga ccuucggcac cgggucacgg 180

ugguggaggc ccaggggaaa gcccugaucg aacagaaggu ggagcuggag gcagaccugc 240

agaccaagga gcaggagaug ggcagccugc gagcagagcu ggggaaguug cgagagaggc 300

ugcaggggga gcacagccag aauggggagg aggagccuga g 341

<210> 9

<211> 410

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

gccugaucuu uuggccagaa ggagauuaaa aagaugcccc ucaagauggc ugugccuguc 60

agcugcaugg agcuucguuc aaguauuuuc ugagccugau ggauuuacag ugaucuucag 120

uggucugggg aauaacgcug guggaaccau gcacuggaau gacacacgcc cggcacauuu 180

caggauacua aaagugguuu uaagggaggc uguggcugaa ugccucaugg auucuuacag 240

cuuggauguc caugggggac gaaggacugc agcuggcuga gaggguugag aucucuguuu 300

acuuagaucu cugccaacuu ccuuuggguc ucccuaugga auguaagacc ccgacucuuc 360

cuggugaagc aucugaugca cguuccaucc ggcgcucagc ugggcuugag 410

<210> 10

<211> 290

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

aguggagccu uucaggcugg cauggagagc uuaaggggca acugaaggag acacacuggc 60

caagcgcgga guucugcuua cuucaguccu gcugagauac ucucucaguc cgcucgcacc 120

gaaggaagcu gccuugggau cagagcagac auaaagcuag aaaaauuuca agaugaaauu 180

gaaauggcca augagcacac ccucauucau ccagcgagca uugaggaccc ccuagaggcc 240

aggcccauga gugaugaaga ucccgaggau gaagacgccu ugccagccag 290

Claims (10)

1.一种分子信标探针，其特征在于，序列为：BHQ1-ACG CCG GAC CTT GCC CGT TTT TTTGTC CGG-FAM。

2.权利要求1所述的分子信标探针在制备检测circBART2.2制剂中的应用。

3.权利要求1所述的分子信标探针在检测circBART2.2中的应用，其特征在于，将分子信标探针加入到含有T7核酸外切酶和待检测样品的体系中反应，检测荧光强度，通过标准曲线法获得circBART2.2的浓度。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，体系中T7核酸外切酶浓度为100-200U/ul；优选100U/ul。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，体系中分子信标探针浓度为100-300nM，优选200nM。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，反应温度35-40℃，反应时间3-5h。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，反应温度37℃，反应时间3h。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，反应体系中还需要加入buffer，RNaseinhibitor，无酶水。

9.一种检测circBART2.2的试剂盒，其特征在于，包含：权利要求1所述的分子信标探针和T7核酸外切酶。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括：buffer，RNase inhibitor，无酶水。

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