CN105112411A - 一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针及检测方法。本发明检测探针为发卡结构的DNA，包含三个部分：茎末端区、loop环状区和5ˊ、3ˊ末端标记的荧光基团、淬灭基团；环状区包含待测miRNA的互补序列。没靶标miRNA时发卡结构稳定，荧光基团和淬灭基团彼此靠近，荧光被淬灭；靶标miRNA存在时，环结构与靶标结合后发卡结构打开形成DNA-RNA杂合体，5ˊ与3ˊ端部分裸露出来，露出来的单链DNA的3ˊ端能被核酸外切酶识别降解，淬灭基团从杂合体中脱落从而使荧光恢复。根据检测标靶的不同设计相对应的探针，并且标记不同的荧光基团淬灭基团对，能实现多种miRNAs的同时检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针及检测方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是近年来在多种真核生物细胞中发现的一类来源于内源性染色体上的非编码单链RNA，长度约为20-24个核苷酸的短序列。MicroRNA是以单个基因或基因簇的形式分布在基因组上，大多数microRNA基因在RNA聚合酶II的作用下形成初级转录本(pri-miRNA)，pri-miRNA长度约为300-1000个碱基，pri-miRNA需要经过二次剪切才能形成成熟的microRNA，首先在细胞核内pri-miRNA被Dorsha酶剪切，形成约70个碱基的microRNA前体，即pre-miRNA；然后，pre-miRNA由转运蛋白Exportin-5运输到细胞质中，再次经Dicer酶识别并剪切，形成成熟microRNA。成熟microRNA结合到RNA诱导的沉默复合体中，介导转录后基因表达沉默或者抑制基因表达。
MicroRNA的生物学特性主要表现为：高度保守性，时序性和组织特异性。microRNA不仅在结构上保守，而且在物种间具有高度的进化保守性。细胞特异性和组织特异性是microRNA表达的主要特点。成熟的microRNA，5′端为磷酸基团，3′端为羟基，这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来。
目前已发现1000种以上microRNA，科学家提出在生物的整个发育过程中microRNA可能调节细胞早期发育，参与细胞分化和组织发育，最为人们关注的是调控基因的表达。下游靶基因是发现microRNA调控基因表达的最直接手段，已有研究证明Lin-4、Let-7的靶基因是ras信号通路(SignalingPathway)的蛋白；Lin-41、hbl-1、Lin-14和lin-28调控时序发育；miR-375在哺乳动物中的靶基因为Mtpn对胰岛素分泌进行调节。这些结果证实，多个microRNA可协同作用于同一个靶基因的表达，同时单个microRNA可以作用于多个靶基因的翻译，因此同时对多种microRNA的检测显得非常必要。此外，研究发现，肿瘤细胞和正常细胞的microRNA表达谱具有明显的差异，且多数microRNA位于与肿瘤形成相关性脆弱基因位点，因此推测microRNA与肿瘤形成密切相关，并且在癌症的发生发展过程中扮演重要的角色，可能作为抑癌基因或者致癌基因。相关研究发现位于染色体13q14区段的miRNA-15和miRNA-16的局部丢失与慢性淋巴性白血病相关，首次证明了microRNA的失调与肿瘤之间有着密切的关系。另外，miRNA-21位于染色体17q23.2上的空泡膜蛋白基因的3'UTR区，该区域经常发现在乳腺癌、肺癌、结肠癌和神经细胞瘤中表达增强，研究表明与正常的乳腺组织相比，miRNA-21在乳腺癌组织中高表达，并且发现anti-miRNA-21介导的细胞生长的抑制与细胞凋亡的增加和细胞增殖的降低相关，研究结果表明，miRNA-21作为癌基因通过对Bc12的调节来调控肿瘤的发生，并且可以作为治疗和诊断的靶点。对肿瘤特定microRNA表达水平的研究和序列分析不仅有利于阐明肿瘤的发生发展机制，更为肿瘤的诊断、治疗和预后提供了新的方向和策略。
随着对microRNA功能的深入研究，MicroRNA日益成为一种非常重要的肿瘤和疾病的标志物，对其检测成为科学家们研究的热点。目前检测microRNA的方法如northernblot方法、RT-PCR的方法和芯片的方法，这些方法耗时长，需要昂贵的仪器，资源成本和经济成本都较高，还有一类基于电化学和纳米颗粒的检测方法，这些方法需要前期制备电极或者纳米颗粒，耗时耗力。因此发展一种简单、快速、低成本、并且能达到同时检测多种microRNA的新方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针以及检测方法。本发明能够实现高灵敏低成本快速简单同时检测多种microRNAs。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针，为发卡结构的DNA，包含三个部分：茎末端区、loop环状区和5'、3'末端标记的荧光基团和相对应的淬灭基团；所述的loop环状区包含待测microRNA的互补序列以及在该互补序列5'和/或3'方向的小段单链序列，本发明中的小段长度是相对microRNA序列长度而言，长度为10个碱基以下为小段。
所述的茎末端区的长度优选为8-10个碱基对，以保证发卡结构稳定。
所述的小段单链序列的长度优选为4-7个碱基，以保证发卡结构的稳定。
所述的荧光基团包括6-羧基荧光素(FAM)、Cy5、6-羧基四甲基罗丹明(Tamra)、TexasRed等；所述的淬灭基团包括BHQ1和BHQ2。5'及3'末端标记的荧光基团和相对应的淬灭基团在折叠状态时能发生荧光共振能量转移(FRET)，使荧光基团的荧光被淬灭。
更优选的，所述的检测探针为：
/荧光基团/-(N)n TTACTAG -/淬灭基团/，
其中，双下划线部分为茎末端区序列，(N)n为loop环状区与待测microRNA互补的序列，单下划线部分为loop环状区的小段单链序列。
一种基于核酸外切酶同时多色检测多种microRNAs的方法，包括如下步骤：
(1)根据待测microRNA设计本发明检测探针，选取不同荧光基团和相对应的淬灭基团分别进行5'或3'末端标记。
(2)将包含待检microRNA、检测探针和核酸外切酶Ⅰ(ExoI)的体系进行孵育。
(3)通过荧光仪检测孵育后体系相应荧光基团的发射光谱，激发波长为荧光基团的最大激发波长，根据荧光信号的有无和强度来判断是否含有待测microRNA以及其浓度。
步骤(2)中所述的体系优选为50μL，检测探针的浓度为100nM，核酸外切酶Ⅰ的用量为20U。
步骤(2)中所述的孵育的条件优选为37℃孵育50min。
本发明的检测探针在不加靶标microRNA的情况下发卡结构保持稳定，5'及3'末端标记的荧光基团和相对应的淬灭基团彼此靠近，荧光被淬灭。在靶标microRNA存在的条件下，通过碱基互补配对识别，探针的环结构与靶标结合后发卡结构打开形成DNA-RNA杂合体，其5'与3'端茎末端区部分裸露出来，露出来的单链DNA的3'端能被核酸外切酶Ⅰ(ExoI)识别并被降解，ExoI从3'端到5'端方向降解单链DNA，使得3'端标记的淬灭基团从杂合体中脱落，使荧光恢复，从而可检测到灵敏的荧光信号，且荧光信号的强度和靶标microRNA的浓度成线性相关性。根据检测标靶的不同而设计相对应的探针，并且标记不同的荧光基团淬灭基团对，能实现多种microRNAs的同时检测。本发明基于核酸外切酶的3'到5'方向降解单链DNA的性质，用不同荧光基团和相应淬灭基团标记的发卡探针达到检测目的。
本发明的检测探针的特异性设计，只有靶标与探针完全互补配对时其发卡结构才会被打开从而恢复荧光。探针的末端区8-10个碱基对，环状结构24-31个碱基设计，使探针稳定性好，探针的两端能够完全互补配对，5'或3'端没有裸露出单链DNA，不能被核酸外切酶识别进而降解。这样的设计也使得在无靶标microRNA存在条件下，5'末端标记的荧光基团的荧光能够被3'末端标记的淬灭基团淬灭，检测背景低，性噪比高。本发明的设计策略具有很好的特异性，并且多个靶标和多个探针的混合体系之间并不会交叉相互影响，只需对各个探针标记不同的荧光基团和相对应的淬灭基团就能达到多色检测的目的。本发明的设计原理如图1所示。
本发明的优点和有益效果在于：
1、本发明针对每一个待检测目标microRNA，只需要设计一个相应互补配对的分子信标探针，无需其他引物设计，针对不同的待测靶标，只需要通过改变探针环状结构中与之互补配对的序列即可，基于碱基互补配对的严格规律，多靶标和多探针同时存在的体系中各组分并不会相互影响，基于此可实现microRNA多色检测。
2、本发明充分利用核酸外切酶的特性，本发明的单酶体系，利于控制反应条件，然而对于多酶体系，不同的酶需要不同的适宜反应温度以及不同的反应缓冲液以及不同的反应pH等，无疑增加了体系的复杂性和不协调性，可能达不到预期的检测效果。而本发明简单快速成本低廉操作相对简单，无需苛刻反应条件以及昂贵的仪器，且检测下限能达到我们检测的要求，更加有利于实际临床样品中的检测。
3、本发明设计的探针对临床样本中的靶标microRNA有较好响应，可用来检测实际肝癌组织及其癌旁组织中microRNA表达量的差异，且所得到的结果与传统经典的RT-PCR方法结果相一致，但本发明方法快速、反应条件温和、并且成本低。
附图说明
图1是本发明基于核酸外切酶同时多色检测多种microRNAs的工作原理图。
图2是探针P-141对不同浓度miR-141检测的荧光结果图，图中曲线由下至上依次对应miR-141浓度为0、6.4pM、32pM、160pM、800pM、4nM、20nM、100nM。
图3是探针P-141与不同浓度miR-141反应后产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图4是探针P-141对miR-141特异性检测的结果图。
图5是不同样本microRNAs的组合多色检测的结果图。
图6是本发明用于人肝癌组织及其癌旁组织microRNA表达量的检测及与RT-PCR结果的对比图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1microRNAs多色检测探针的设计
(1)探针包含三个部分：与靶microRNA互补loop区，特异性结合靶标microRNA；茎末端区序列，当没有microRNA时，两末端序列互补配对；探针的5′末端标记不同的荧光基团，3′末端标记相对应的淬灭基团，探针在通常条件下为发卡结构，末端标记的荧光基团与淬灭基团距离靠近，荧光被淬灭，如图1所示。
(2)所需达到的检测目标：对于相应靶标microRNA，探针能产生很好信号响应，荧光可以达到明显差别，并且对非靶标microRNA不产生背景，并且通过对不同的探针标记不同的荧光基团达到microRNA多色检测的效果。
以被研究较多、与疾病息息相关的miR-21、miR-155、miR-199a以及microRNA200家族的miR-141以及miR-429作为待测microRNA，设计与之对应的多色检测探针。microRNA与多色检测探针的序列(5'→3')如下：
miR-21：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，
miR-21的探针(P-21)：/TexasRed/-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATTACTAG -/BHQ2/
miR-155：UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU，
miR-155的探针(P-155)：/Cy5/-ACCCCTATCACGATTAGCATTAATTACTAG -/BHQ2/；
miR-199a：ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA，
miR-199a的探针(P-199a)：/Tamra/-TAACCAATGTGCAGACTACTGTTTACTAG -/BHQ2/；
miR-141：UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG，
miR-141的探针(P-141)：/FAM/-CCATCTTTACCAGACAGTGTTATTACTAG -/BHQ1/。
miR-429：UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU。
上述各探针中，标双下划线部分为茎末端区序列，标单下划线部分为loop区的小段单链序列，未标下划线部分为与待测microRNA互补的序列。
实施例2验证探针的灵敏性和选择性
(1)基于核酸外切酶的反应条件的优化
无靶标microRNA存在条件下，探针为发卡结构，5′末端标记的荧光基团的荧光被淬灭，当加入相应的microRNA时，microRNA可以识别并与探针的环状区配对，从而打开发卡探针，形成DNA-RNA杂合体，发卡结构互补茎端被打开形成裸露的单链DNA，之后核酸外切酶ExoI从3'端到5'端方向识别并降解单链DNA，使得3'端标记的淬灭基团脱离，从而可以检测到荧光。但当无靶标microRNA存在条件下，茎末端区互补配对，不能被ExoI识别，FRET效应使得本发明背景极低。靶标microRNA能够与探针的loop环互补配对结合而打开探针，发挥了一个构象改变的开关作用。
实验所用探针和microRNA均用无RNase/DNase污染的水溶解置所需的保存浓度，溶解后的microRNA分装并置于-80℃保存，探针置于-20℃保存。探针使用前先进行退火，退火条件为：95℃5min，然后每1min降低1℃，降至25℃。实验所用到的器材包括枪头、PCR管等需用0.1％DEPC水溶液过夜处理，然后高压灭菌后使用。
每个反应体系体积为50μL，反应在1×ExoI缓冲溶液中进行，缓冲液的成分为：67mM甘氨酸-KOH(pH9.5)、6.7mM氯化镁、10mMβ-ME(β-巯基乙醇)。反应体系的组分包括：终浓度为100nM的探针，40URNase抑制剂，ExoI，以及一系列梯度稀释的microRNA。经过条件的优化，确定该体系的最优化反应条件为37℃孵育50min，ExoI的最优化用量为20U。
(2)miR-141作为模型检测荧光信号
设计miR-141对应的探针(序列见实施例1)，其5′标记荧光基团FAM，3′标记淬灭基团BHQ1。在处理过的PCR管中，按如下组分配置50μL反应体系：5μL10×ExoI缓冲溶液，终浓度为100nM的探针，40URNase抑制剂，20UExoI，以及一系列梯度浓度的miR-141(分别为：0、6.4pM、32pM、160pM、800pM、4nM、20nM、100nM)，最后用RNase/DNasefree水补加至50μL。混匀后37℃孵育50min后测荧光。用488nm作为FAM的激发波长，518nm作为FAM的发射波长。所得结果如图2所示，随着miR-141浓度的增加，其荧光逐渐增强，且具有较好的线性关系。该方法能够达到pmol的检出限。
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法证实本发明的原理。配置体系同上述荧光检测的体系，37℃孵育50min后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果如图3所示，泳道1和泳道2分别为无ExoI和无靶标miR-141的对照实验，结果只有探针一条带；泳道3-6分别是miR-141浓度为100pM、1nM、10nM、100nM，除了探针条带以外，还增加一条被ExoI降解了3′单链末端DNA的条带。这也充分证明了ExoI在反应体系中的作用；泳道7为从3′单链末端降解17个核苷酸后的31个核苷酸的单链，泳道8为9个核苷酸的单链，这两个泳道用作参照，验证被ExoI降解的机理。
(3)对反应特异性的验证
以miR-141作为实验组，同属于miR-200家族的miR-429以及另外两种miRNA(miR-21、miR-199a)作为对照组，P-141作为探针，按照上述方法进行反应测荧光。荧光结果如图4所示，只有miR-141有很强的荧光信号响应，miR-429响应很微弱，而其他两种miRNA基本无荧光响应。结果表明本发明具有很好的选择性，可很好的区别同源家族的miRNA。
实施例3对于不同组合microRNAs的多色检测
利用四种不同的microRNAs(miR-141、miR-155、miR-199a、miR-21)进行了不同的组合检测，这些microRNA相应的探针序列见实施例1，5′端分别标记了FAM、Cy5、amra、TexasRed荧光基团，在图5中分别用A、B、C、D表示，3′端标记了BHQ淬灭基团。组合情况见表1，一共15种组合。
表1不同样本microRNAs的组合
| 样品名称 | microRNA组合(浓度均为100nM) |
| 1 | miRNA141 |
| 2 | miRNA21 |
| 3 | miRNA199a |
| 4 | miRNA155 |
| 5 | miRNA141、miRNA21 |
| 6 | miRNA141、miRNA199a |
| 7 | miRNA141、miRNA155 |
| 8 | miRNA21、miRNA199a |
| 9 | miRNA21、miRNA155 |
| 10 | miRNA199a、miRNA155 |
| 11 | miRNA141、miRNA21、miRNA199a |
| 12 | miRNA141、miRNA21、miRNA155 |
| 13 | miRNA21、miRNA199a、miRNA155 |
| 14 | miRNA141、miRNA199a、miRNA155 |
| 15 | miRNA141、miRNA21、miRNA199a、miRNA155 |
按照实施例2中的反应体系加入不同组合的microRNAs，体系中各microRNA的浓度均为100nM，完成反应后，对各组合体系的荧光进行了多色检测。检测结果如图5所示，当仅仅加入一种microRNA(样品1-4)时，只有一种相应的荧光被检测到，另外三种探针没有任何荧光的干扰；当仅加入两种microRNAs(样品5-10)时，只有两种相应的荧光被检测到，另外两种探针的荧光没有任何干扰；当加入三种microRNAs(样品11-14)时，只有三种相应的荧光被检测到，剩余的一个探针的荧光没有任何干扰；而当加入全部四种microRNAs(样品15)时，四种相应的荧光都被检测到。本发明可以在同一个体系中同时达到四种miRNA的检测，节约成本，方便快捷，且相互之间基本无干扰。
实施例4利用本发明检测人肝癌组织及癌旁组织miR-21的表达水平
选取不同肝癌患者的新鲜肝癌及癌旁组织提取microRNA，具体依照总RNA提取步骤提取总RNA，流程如下：
a.取50-100毫克新鲜组织，用刀片切成小片，放入研钵中，然后缓慢加入液氮研磨成粉末状加到1.5mLEP管中，加入1mLTrizol，然后转移至匀浆器中，充分匀浆，将匀浆样品在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
b.加入200μL氯仿，盖好管盖，用手用力震荡15min，室温孵育2-3min。
c.4℃、12000×g离心15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为500μL。小心将水相转移到新EP管中，进行下一步操作。
d.加500μL无水异丙醇，用手震荡混匀，室温放置10min，出现少许沉淀。4℃、12000×g离心10min，弃上清。
e.将得到的沉淀用1mL75％的乙醇溶液洗涤，4℃、12000×g离心5min，弃上清，再重复一次。
f.EP管室温放置5-10min，干燥RNA沉淀，不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。然后加入30μLRNase/DNaseFree水溶解，用枪头反复吹打几次，置于60℃中放置10min使RNA完全溶解。
将提取出的总RNA一部分按照实施例2的方法进行检测，另一部分用于实时荧光定量PCR(RT-PCR)，将这两种方法得到的结果对比，来验证本发明用于临床样本检测的可靠性。其中，RT-PCR是一种经典的检测miRNA的方法，使用U6作为内参。所用的逆转录引物、前引以及后引序列(5'→3')如下：
miR-21逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACAT；
miR-21前引：GAGTGTTAGCTTATCAGACTG，
miR-21后引：GCAGGGTCCGAGGTATTC；
U6-逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATGACAC；
U6前引：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，
U6后引：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。
结果如图6显示，本发明方法检测出肝癌组织中miR-21表达量上调约为其癌旁组织的3-4倍左右，而每对组织的结果与RT-PCR的结果一致，这证明了本发明用于临床样本检测的可靠性和实用性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针，其特征在于：所述的检测探针为发卡结构的DNA，包含三个部分：茎末端区、loop环状区和5'、3'末端标记的荧光基团和相对应的淬灭基团；所述的loop环状区包含待测microRNA的互补序列以及在该互补序列5'和/或3'方向的长度为10个碱基以下的小段单链序列。
2.根据权利要求1所述的检测探针，其特征在于：所述的茎末端区的长度为8-10个碱基对。
3.根据权利要求1所述的检测探针，其特征在于：所述的小段单链序列的长度为4-7个碱基。
4.根据权利要求1所述的检测探针，其特征在于：所述的荧光基团包括FAM、Cy5、Tamra、TexasRed；所述的淬灭基团包括BHQ1和BHQ2。
5.根据权利要求1所述的检测探针，其特征在于：所述的检测探针为：
/荧光基团/-CCCAACCCA(N)n TTACTAGTGGGTTGGG-/淬灭基团/，
其中，双下划线部分为茎末端区序列，(N)n为loop环状区与待测microRNA互补的序列，单下划线部分为loop环状区的小段单链序列。
6.一种基于核酸外切酶同时多色检测多种microRNAs的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)根据待测microRNA设计权利要求1所述的检测探针，选取不同荧光基团和相对应的淬灭基团分别进行5'或3'末端标记；
(2)将包含待检microRNA、检测探针和核酸外切酶Ⅰ的体系进行孵育；
(3)通过荧光仪检测孵育后体系相应荧光基团的发射光谱，根据荧光信号的有无和强度来判断是否含有待测microRNA以及其浓度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的体系为50μL，检测探针的浓度为100nM，核酸外切酶Ⅰ的用量为20U。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的孵育的条件为37℃孵育50min。
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