CN111378741A - 血液中环状rna的检测方法及其应用 - Google Patents

血液中环状rna的检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血液中环状RNA的检测方法及其应用。具体地，本发明提供了一种用于检测环状RNA分子的检测体系，所述体系包含：(a)一核酸探针；(b)一核酸外切酶；和(c)任选的待检测环状RNA分子；其中，当所述(a)中的核酸探针与所述(c)中的待检测环状RNA分子形成双链结构时，所述(b)中的核酸外切酶特异性地切割所述(a)中的Z4区域。本发明的检测体系和方法可以灵敏地检测出血液样品中是否含有目的环状RNA，并且可以准确地计算出血液中特定环状RNA的浓度。

Description

血液中环状RNA的检测方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种血液中环状RNA的检测方法及其应用。
背景技术
环状RNA是一种广泛存在于动植物体内的小分子非编码RNA，主要由线性RNA通过反向剪切拼接而成，其拼接后形成的特异性碱基序列是环状RNA区别与线性RNA的关键序列。
近年来，随着高通量测序及核酸分子技术的不断革新，越来越多的研究资料显示环状RNA在机体的生长、发育、代谢、凋亡以及衰老等中发挥着重要的作用。
在心血管领域，大量的基础研究提示环状RNA在多种心血管疾病如：高血压、急性心肌梗死、动脉粥样硬化及慢性心功能衰竭的发生、发展中发挥着重要的作用。并且，某些环状RNA在血液中的含量的改变可以作为心血管疾病诊断、危险分层及临床预后的生物标志物。
相较于与他非编码RNA，环状RNA被作为心血管疾病诊断、危险分层及预后的分子标记物与其特殊的生物学特性有着密切的联系。所述的特殊的生物学特性包括：1)环状RNA分子缺乏3’端帽子及5’端多聚腺苷酸尾巴结构，可以耐受血液及环境中RNA酶的降解，因而具有较长的半衰期；2)环状RNA分子在不同的组织器官及细胞类型中，其种类及表达丰度具有显著的组织及细胞特异性。
然而，目前国内外对于血液中环状RNA的检测方法涉及RNA的提取、纯化、逆转录等多个环节。传统的方法操作复杂，耗时冗长，因而大大限制了环状RNA在临床上的应用。
因此，本领域迫切需要开发一种更加快速、准确、灵敏，并且操作简便的检测环状RNA分子的检测方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种更加快速、准确、灵敏，并且操作简便的检测环状RNA分子的检测方法。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测环状RNA分子的检测体系，所述体系包含：
(a)一核酸探针，所述的核酸探针为单链核酸探针，并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构，
5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’ (式I)
其中，
Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列；
Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列；
Z3为第一基团携带区；
Z4为核酸外切酶识别区；
Z5为第二基团携带区；
(b)一核酸外切酶，所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列；和
(c)任选的待检测环状RNA分子；
其中，当所述(a)中的核酸探针与所述(c)中的待检测环状RNA分子形成双链结构时，所述(b)中的核酸外切酶特异性地切割所述(a)中的Z4区域。
在另一优选例中，所述(a)中的核酸探针的长度为15-30bp，较佳地16-26bp，更佳地18-22bp。
在另一优选例中，所述Z2的长度为15-35bp，较佳地18-30bp，更佳地20-24bp。
在另一优选例中，所述Z2中，与待检测的环状RNA分子反向互补的区域优选为构成环状RNA闭环结构的两个不连续外显子(内含子)与外显子(内含子)之间互相连接的区域。
在另一优选例中，所述Z2的核苷酸序列与互补包括完全反向互补，或基本上反向互补。
在另一优选例中，所述的基本上反向互补是指：所述Z2的序列与所述完全反向互补的序列具有≥80％的序列同一性，较佳地≥90％，更佳地≥95％。
在另一优选例中，所述核酸外切酶选自下组：5’-3’端核酸外切酶。
在另一优选例中，所述核酸外切酶不切割完全单链形式的核酸分子。
在另一优选例中，所述核酸外切酶特异性地切割具有部分双链结构的核酸分子。
在另一优选例中，所述Z4为回文对称序列。
在另一优选例中，所述Z3序列所携带的第一基团是荧光基团，并且所述Z5序列所携带的第二基团是淬灭基团。
在另一优选例中，所述Z3序列所携带的第一基团是淬灭基团，并且所述Z5序列所携带的第二基团是荧光基团。
在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：FAM、HEX、CY5、CY3、VIC、JOE、TET、5-TAMRA、ROX、Texas Red-X，或其组合。
在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：BHQ、TAMRA、DABCYL、DDQ，或其组合。
在另一优选例中，所述Z3中，在所携带的第一基团的两侧可分别包含长度为15-30bp的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述Z5中，在所携带的第二基团的两侧可分别包含长度为15-30bp的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的待检测环状RNA分子是疾病的诊断、危险分层和/或预后的分子标志物，所述的疾病选自下组：高血压、急性心肌梗死、动脉粥样硬化、慢性心功能衰竭、肿瘤、肾小球肾炎、肝炎、炎性肠病、系统性红斑狼疮、风湿系统疾病，或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测环状RNA分子的试剂盒，所述试剂盒包括：
(I)第一容器以及位于第一容器中的核酸探针，所述的核酸探针为单链核酸探针，并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构，
5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’ (式I)
其中，
Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列；
Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列；
Z3为第一基团携带区；
Z4为核酸外切酶识别区；
Z5为第二基团携带区；
(II)第二容器以及位于第二容器中的核酸外切酶，所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列；和
(III)任选的第三容器以及位于第三容器中的缓冲液。
在另一优选例中，所述第一容器、第二容器和第三容器中的任何两个或三个(或全部)可以是相同或不同容器。
在本发明的第三方面，提供了一种检测样品中是否存在待检测环状RNA分子的方法，包括步骤：
(i)提供如本发明第一方面所述的检测体系，所述检测体系中包括疑似含有待检测环状RNA分子的样品；和
(ii)检测所述体系中，所述第一基团或第二基团的信号强度。
在另一优选例中，所述的方法包括定性检测和定量检测。
在另一优选例中，所述的样品可来源于：血液、胸腔积液或腹腔积液。
在另一优选例中，所述步骤(i)之前，还包括样品预处理步骤。
在另一优选例中，所述样品预处理步骤中，包括将样品在室温下离心处理，优选地，所述离心处理为：在室温下，2500-3500rpm(较佳地3000rpm)，离心2-5分钟(较佳地3分钟)。
在另一优选例中，所述样品预处理步骤中，还包括向所述样品中加入RNA酶和/或DNA酶并反应，所述反应的条件优选为37℃下20-40分钟(较佳地30分钟)，其中，所述RNA酶和DNA酶分别特异性地切割线性RNA和双链DNA。
在另一优选例中，所述RNA酶时RNA-R酶。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明检测体系的实验反应原理。
图2显示了检测血液中的环状RNA的传统方法与本发明方法的各自的流程图及步骤对比。
图3显示了心梗患者血液中circ-Ttc3与心肌坏死标志物cTNI的相关性分析结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种线性RNA分子的检测方法。具体地，发明人在靶向环状RNA的核酸探针上耦合一段含有荧光报告基团及淬灭基团的分子标签。
实验结果表明，正常情况下，荧光报告基团所发射的荧光信号会被淬灭基团所吸收，故而当靶向环状RNA的核酸探针保持完整时不会发出任何荧光信号；而当血液中含有待检测的环状RNA时，其与所述环状RNA发生碱基互补配对时，形成双链的核酸基团会被反应液中的5’-3’外切酶识别，从而切割核酸探针上的荧光报告基团与淬灭基团之间的核苷酸序列，使荧光报告基团从靶向环状RNA的核酸探针上游离到反应液中，继而发出荧光信号。
在临床实践中，通过检测单位体积血液中的荧光强度，可以灵敏地检测出血液样品中是否含有目的环状RNA，并且可以准确地计算出血液中特定环状RNA的浓度。
在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“环状RNA”、“待检测环状RNA分子”、“目的环状RNA”、“靶标环状RNA分子”可互换使用，是指本发明中可作为疾病的诊断、危险分层和/或预后的分子标志物的待检测环状RNA分子。
如本文所用，术语“核酸探针”、“靶向环状RNA的核酸探针”、“靶向探针”等可互换使用，是指本发明中具有式I结构的可用于检测样品中的待检测环状RNA分子的探针。
本发明的检测体系
如本文所用，术语“检测体系”、“本发明检测体系”、“反应体系”等可互换使用，是指本发明中用于特异性检测目的环状RNA分子的检测体系。
在本发明中，所述的检测体系包含：
(a)一核酸探针，所述的核酸探针为单链核酸探针，并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构，
5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’ (式I)
其中，
Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列；
Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列；
Z3为第一基团携带区；
Z4为核酸外切酶识别区；
Z5为第二基团携带区；
(b)一核酸外切酶，所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列；和
(c)任选的待检测环状RNA分子；
其中，当所述(a)中的核酸探针与所述(c)中的待检测环状RNA分子形成双链结构时，所述(b)中的核酸外切酶特异性地切割所述(a)中的Z4区域。
在本发明中，所述核酸探针的设计的关键在于将一段含有荧光标签的分子耦合到环状RNA特异性靶向探针上，利用靶标与环状RNA的接头位置的互补配对触发核酸外切酶将带有荧光标签信号基团游离到反应液中，进而通过单位体积血液的荧光强度计算出血液中环状RNA的浓度。
本发明检测方法
在本发明中，提供了一种检测样品中是否存在待检测环状RNA分子的方法，包括步骤：
(i)提供如本发明第一方面所述的检测体系，所述检测体系中包括疑似含有待检测环状RNA分子的样品；和
(ii)检测所述体系中，所述第一基团或第二基团的信号强度。
特别值得注意的是，本发明所述的检测包括定性检测或定量检测。
在本发明的一个优选的实施方式中，包括以下具体的检测步骤：
1)血液样品室温3000转离心3min，以去除血液中的血细胞对检测的干扰；
2)将含有RNA-R酶及DNA酶的反应A液与1ml血浆在37度孵育30min，以去除血液中线性RNA及DNA的影响；
3)将含有环状RNA靶向探针的反应B液加入反应体系，室温孵育20min，利用荧光检测系统读取反应体系中的荧光强度；
4)根据荧光强度计算出单位体积血液内环状RNA的含量。
备注：实际操作过程中，可以将反应A液和反应B液混合后同时加入到反应体系中。
在本发明的一个实施方式中，所述的方法还包括建立心血管疾病相关的环状RNA数据库：该项目的顺利开展有赖于对疾病特异性环状RNA的前期筛选，故需要对正常人及心血管疾病患者的血液样品进行高通量测序，并结合自身的临床知识，对血液中不同浓度环状RNA患者进行追踪回访，绘制ROC曲线，从而建立一个心血管疾病相关的具有较高特异性及灵敏度的环状RNA数据库。
本发明的主要优点包括：
1)本发明方法省去了传统RNA提取、RNA浓度测定、定量PCR检测等多个环节，较传统检测方法，更加快速，便捷。
2)本发明适用于对疾病的早期筛查，以及对疾病严重程度的评估，可以指导临床的诊断与治疗。
3)本发明是一种相对广谱性的发明，并且基于环状RNA组织、细胞特异性表达的生物学特性，该方法对于某些特殊疾病的诊断又具有较高的特异性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：血液中环状RNA-对急性心肌梗死严重程度的评估
在本实施例中，本发明人设计了靶向环状RNA-Ttc3(circ-Ttc3)接头的特异性荧光探针。
对此，利用Varioskan LUX全波长荧光酶标仪对25例急性心肌梗死患者的血液样本进行了检测，并结合患者发病时间、心电图、冠脉造影结果、心肌损伤标志物cTNI等结果，分析circ-Ttc3在血液中的浓度与心梗患者的心肌损伤标志物的关系。
实施步骤
1.选取就诊我院心内科的急性心肌梗死患者25例
1.1.入组标准：
2008年中华心血管杂志，推荐的我国急性心肌梗死诊断标准。心肌损伤标准物升高大于上限+以下临床或者心电图指标的任意一项
(i)心肌缺血症状：心前区压榨样疼痛或者持续胸闷；
(ii)新出现的缺血性ECG改变，包括ST-T改变/完全性左束支传导阻滞；
(iii)新出现的病理性Q波；
(iv)影像提示节段性室壁运动异常；
1.2.排除标准：
精神疾病患者；肝硬化、肾衰或伴有血液系统疾病的患者；恶性肿瘤患者；伴有严重哮喘，支气管扩张，慢阻肺及特发性肺间质纤维化者；既往有吸毒或感染艾滋，梅毒等传染性疾病者。
1.3.检测步骤：
(1)血液样品室温3000转离心3min，以去除血液中的血细胞对检测的干扰；
(2)将含有RNA-R酶及DNA酶的反应A液与1ml血浆在37度孵育30min，以去除血液中线性RNA及DNA的影响；
(3)将含有环状RNA靶向探针的反应B液加入反应体系，室温孵育20min，利用荧光检测系统读取反应体系中的荧光强度；
(4)根据荧光强度计算出单位体积血液内环状RNA的含量。
1.4.实验结果
对25例患者血液中心肌坏死标志物、冠脉造影结果以及血液中circ-Ttc3荧光值进行检测汇总，见表(1)，在此基础上，利用graphpad prism进行相关性分析，结果如图(1)所示，血液中circ-Ttc3含量与心肌坏死标志物呈正相关联系，R＝0.72,P<0.01,具有统计学差异。
表1. 25例心梗患者心肌损伤标志物、犯罪血管以及circ-Ttc3荧光值
序号 cTNI(ng/ml) 犯罪血管 circ-Ttc3荧光值
1 0.32 前降支远端80％狭窄 643.
2 0.33 前降支远端80％狭窄 700.
3 0.64 回旋支中断85％狭窄 654.
4 0.72 前降支D2开口75％狭窄 1000.
5 0.86 回旋支中断85％狭窄 810.
6 0.92 回旋支远端75％狭窄 800.
7 1.10 右侧冠脉85％狭窄 1100.
8 1.23 右室侧支85％狭窄 860.
9 1.82 钝圆支85％狭窄 950.
10 2.40 锐圆支90％狭窄 980.
11 2.39 左室间隔支次全闭塞 1300.
12 3.50 钝圆支闭塞 806.
13 3.89 前降支远端95％狭窄 845.
14 4.40 前降支中段85％狭窄 950.
15 4.60 前降支D1中段80％狭窄 945.
16 5.60 前降支中段85％狭窄 1365.
17 5.78 前降支中段次全闭 1620.
18 7.84 回旋支近端90％狭窄 1576.
19 8.63 前降支中段80％狭窄 1230.
20 10.30 前降支中段次全闭 2456.
21 10.36 前降支D2开口95％狭窄 1806.
22 11.00 前降支近端85％狭窄 1596.
23 16.00 回旋支中端90％狭窄 1890.
24 16.50 前降支中段次全闭 1980.
25 24.00 前降支中段次全闭 1300.
讨论
本发明的检测体系和检测方法具有巨大的市场前景。
首先，本发明可用于临床治疗评估。目前越来越多的研究资料显示，环状RNA在血液中的异常表达与多种心血管疾病，如高血压，动脉粥样硬化，慢性心功能不全发生发展具有密切的联系，因此本发明的方法将大大有利于加强对该类患者的诊断与预后的评估。
其次，本发明可用于高危人群筛选。血液中某些特定环状RNA的表达改变可以反应疾病早期的病理生理状态，因此本发明的方法可以加强临床医师对某些高危心血管风险人群的早期识别。
众所周知，环状RNA对于疾病的诊断、疗效以及预后的评估具有重要的临床意义。然而，目前对血液中环状RNA的检测方法涉及RNA提取、纯化、浓度检测、反转录以及实时定量PCR等多道工序。其耗时、费力且效率低下，不符合临床上快节奏的工作要求。因此本发明的方法具有非常广阔的临床应用前景，对于心血管疾病的诊断、治疗以及预后的评估均具有重要的推动作用。
另外，由于环状RNA普遍存在于动植物以及微生物体内，因此本发明的技术方案在动物医学，农学及植物培育等方面同样适用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于检测环状RNA分子的检测体系，其特征在于，所述体系包含：
(a)一核酸探针，所述的核酸探针为单链核酸探针，并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构，
5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’ (式I)
其中，
Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列；
Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列；
Z3为第一基团携带区；
Z4为核酸外切酶识别区；
Z5为第二基团携带区；
(b)一核酸外切酶，所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列；和
(c)任选的待检测环状RNA分子；
其中，当所述(a)中的核酸探针与所述(c)中的待检测环状RNA分子形成双链结构时，所述(b)中的核酸外切酶特异性地切割所述(a)中的Z4区域。
2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述(a)中的核酸探针的长度为15-30bp，较佳地16-26bp，更佳地18-22bp。
3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述Z2中，与待检测的环状RNA分子反向互补的区域源自构成环状RNA闭环结构的两个不连续外显子(内含子)与外显子(内含子)之间互相连接的区域。
4.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述核酸外切酶不切割完全单链形式的核酸分子。
5.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述核酸外切酶特异性地切割具有部分双链结构的核酸分子。
6.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述Z4为回文对称序列。
7.一种用于检测环状RNA分子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(I)第一容器以及位于第一容器中的核酸探针，所述的核酸探针为单链核酸探针，并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构，
5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’ (式I)
其中，
Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列；
Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列；
Z3为第一基团携带区；
Z4为核酸外切酶识别区；
Z5为第二基团携带区；
(II)第二容器以及位于第二容器中的核酸外切酶，所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列；和
(III)任选的第三容器以及位于第三容器中的缓冲液。
8.一种检测样品中是否存在待检测环状RNA分子的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供如权利要求1所述的检测体系，所述检测体系中包括疑似含有待检测环状RNA分子的样品；和
(ii)检测所述体系中，所述第一基团或第二基团的信号强度。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括定性检测和定量检测。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的样品可来源于：血液、胸腔积液或腹腔积液。
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