CN111378741B - 血液中环状rna的检测方法及其应用 - Google Patents
血液中环状rna的检测方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111378741B CN111378741B CN202010209038.5A CN202010209038A CN111378741B CN 111378741 B CN111378741 B CN 111378741B CN 202010209038 A CN202010209038 A CN 202010209038A CN 111378741 B CN111378741 B CN 111378741B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- circular rna
- nucleic acid
- exonuclease
- group
- rna molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 37
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims abstract description 33
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 8
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 7
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 7
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 claims description 4
- 238000013517 stratification Methods 0.000 claims description 4
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 claims description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 claims description 3
- YMZMTOFQCVHHFB-UHFFFAOYSA-N 5-carboxytetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C([O-])=O YMZMTOFQCVHHFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 2
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 claims description 2
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 abstract 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 15
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 15
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 15
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 8
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 8
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 101100537532 Rattus norvegicus Tnni3 gene Proteins 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 238000002586 coronary angiography Methods 0.000 description 2
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 description 2
- 208000037891 myocardial injury Diseases 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- HZNVUJQVZSTENZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(C#N)=C(C#N)C1=O HZNVUJQVZSTENZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZODKRWQWUWGCD-UHFFFAOYSA-N 2,5-di-tert-butylbenzene-1,4-diol Chemical compound CC(C)(C)C1=CC(O)=C(C(C)(C)C)C=C1O JZODKRWQWUWGCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 206010006580 Bundle branch block left Diseases 0.000 description 1
- 206010008479 Chest Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 201000009267 bronchiectasis Diseases 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000004963 pathophysiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012205 qualitative assay Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 210000000596 ventricular septum Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种血液中环状RNA的检测方法及其应用。具体地,本发明提供了一种用于检测环状RNA分子的检测体系,所述体系包含:(a)一核酸探针;(b)一核酸外切酶;和(c)任选的待检测环状RNA分子;其中,当所述(a)中的核酸探针与所述(c)中的待检测环状RNA分子形成双链结构时,所述(b)中的核酸外切酶特异性地切割所述(a)中的Z4区域。本发明的检测体系和方法可以灵敏地检测出血液样品中是否含有目的环状RNA,并且可以准确地计算出血液中特定环状RNA的浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地,本发明涉及一种血液中环状RNA的检测方法及其应用。
背景技术
环状RNA是一种广泛存在于动植物体内的小分子非编码RNA,主要由线性RNA通过反向剪切拼接而成,其拼接后形成的特异性碱基序列是环状RNA区别与线性RNA的关键序列。
近年来,随着高通量测序及核酸分子技术的不断革新,越来越多的研究资料显示环状RNA在机体的生长、发育、代谢、凋亡以及衰老等中发挥着重要的作用。
在心血管领域,大量的基础研究提示环状RNA在多种心血管疾病如:高血压、急性心肌梗死、动脉粥样硬化及慢性心功能衰竭的发生、发展中发挥着重要的作用。并且,某些环状RNA在血液中的含量的改变可以作为心血管疾病诊断、危险分层及临床预后的生物标志物。
相较于与他非编码RNA,环状RNA被作为心血管疾病诊断、危险分层及预后的分子标记物与其特殊的生物学特性有着密切的联系。所述的特殊的生物学特性包括:1)环状RNA分子缺乏3’端帽子及5’端多聚腺苷酸尾巴结构,可以耐受血液及环境中RNA酶的降解,因而具有较长的半衰期;2)环状RNA分子在不同的组织器官及细胞类型中,其种类及表达丰度具有显著的组织及细胞特异性。
然而,目前国内外对于血液中环状RNA的检测方法涉及RNA的提取、纯化、逆转录等多个环节。传统的方法操作复杂,耗时冗长,因而大大限制了环状RNA在临床上的应用。
因此,本领域迫切需要开发一种更加快速、准确、灵敏,并且操作简便的检测环状RNA分子的检测方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种更加快速、准确、灵敏,并且操作简便的检测环状RNA分子的检测方法。
在本发明的第一方面,提供了一种用于检测环状RNA分子的检测体系,所述体系包含:
(a)一核酸探针,所述的核酸探针为单链核酸探针,并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构,
5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’ (式I)
其中,
Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列;
Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列;
Z3为第一基团携带区;
Z4为核酸外切酶识别区;
Z5为第二基团携带区;
(b)一核酸外切酶,所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列;和
(c)任选的待检测环状RNA分子;
其中,当所述(a)中的核酸探针与所述(c)中的待检测环状RNA分子形成双链结构时,所述(b)中的核酸外切酶特异性地切割所述(a)中的Z4区域。
在另一优选例中,所述(a)中的核酸探针的长度为15-30bp,较佳地16-26bp,更佳地18-22bp。
在另一优选例中,所述Z2的长度为15-35bp,较佳地18-30bp,更佳地20-24bp。
在另一优选例中,所述Z2中,与待检测的环状RNA分子反向互补的区域优选为构成环状RNA闭环结构的两个不连续外显子(内含子)与外显子(内含子)之间互相连接的区域。
在另一优选例中,所述Z2的核苷酸序列与互补包括完全反向互补,或基本上反向互补。
在另一优选例中,所述的基本上反向互补是指:所述Z2的序列与所述完全反向互补的序列具有≥80%的序列同一性,较佳地≥90%,更佳地≥95%。
在另一优选例中,所述核酸外切酶选自下组:5’-3’端核酸外切酶。
在另一优选例中,所述核酸外切酶不切割完全单链形式的核酸分子。
在另一优选例中,所述核酸外切酶特异性地切割具有部分双链结构的核酸分子。
在另一优选例中,所述Z4为回文对称序列。
在另一优选例中,所述Z3序列所携带的第一基团是荧光基团,并且所述Z5序列所携带的第二基团是淬灭基团。
在另一优选例中,所述Z3序列所携带的第一基团是淬灭基团,并且所述Z5序列所携带的第二基团是荧光基团。
在另一优选例中,所述荧光基团选自下组:FAM、HEX、CY5、CY3、VIC、JOE、TET、5-TAMRA、ROX、Texas Red-X,或其组合。
在另一优选例中,所述淬灭基团选自下组:BHQ、TAMRA、DABCYL、DDQ,或其组合。
在另一优选例中,所述Z3中,在所携带的第一基团的两侧可分别包含长度为15-30bp的核苷酸序列。
在另一优选例中,所述Z5中,在所携带的第二基团的两侧可分别包含长度为15-30bp的核苷酸序列。
在另一优选例中,所述的待检测环状RNA分子是疾病的诊断、危险分层和/或预后的分子标志物,所述的疾病选自下组:高血压、急性心肌梗死、动脉粥样硬化、慢性心功能衰竭、肿瘤、肾小球肾炎、肝炎、炎性肠病、系统性红斑狼疮、风湿系统疾病,或其组合。
在本发明的第二方面,提供了一种用于检测环状RNA分子的试剂盒,所述试剂盒包括:
(I)第一容器以及位于第一容器中的核酸探针,所述的核酸探针为单链核酸探针,并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构,
5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’ (式I)
其中,
Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列;
Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列;
Z3为第一基团携带区;
Z4为核酸外切酶识别区;
Z5为第二基团携带区;
(II)第二容器以及位于第二容器中的核酸外切酶,所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列;和
(III)任选的第三容器以及位于第三容器中的缓冲液。
在另一优选例中,所述第一容器、第二容器和第三容器中的任何两个或三个(或全部)可以是相同或不同容器。
在本发明的第三方面,提供了一种检测样品中是否存在待检测环状RNA分子的方法,包括步骤:
(i)提供如本发明第一方面所述的检测体系,所述检测体系中包括疑似含有待检测环状RNA分子的样品;和
(ii)检测所述体系中,所述第一基团或第二基团的信号强度。
在另一优选例中,所述的方法包括定性检测和定量检测。
在另一优选例中,所述的样品可来源于:血液、胸腔积液或腹腔积液。
在另一优选例中,所述步骤(i)之前,还包括样品预处理步骤。
在另一优选例中,所述样品预处理步骤中,包括将样品在室温下离心处理,优选地,所述离心处理为:在室温下,2500-3500rpm(较佳地3000rpm),离心2-5分钟(较佳地3分钟)。
在另一优选例中,所述样品预处理步骤中,还包括向所述样品中加入RNA酶和/或DNA酶并反应,所述反应的条件优选为37℃下20-40分钟(较佳地30分钟),其中,所述RNA酶和DNA酶分别特异性地切割线性RNA和双链DNA。
在另一优选例中,所述RNA酶时RNA-R酶。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明检测体系的实验反应原理。
图2显示了检测血液中的环状RNA的传统方法与本发明方法的各自的流程图及步骤对比。
图3显示了心梗患者血液中circ-Ttc3与心肌坏死标志物cTNI的相关性分析结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,经过大量的筛选,首次开发了一种线性RNA分子的检测方法。具体地,发明人在靶向环状RNA的核酸探针上耦合一段含有荧光报告基团及淬灭基团的分子标签。
实验结果表明,正常情况下,荧光报告基团所发射的荧光信号会被淬灭基团所吸收,故而当靶向环状RNA的核酸探针保持完整时不会发出任何荧光信号;而当血液中含有待检测的环状RNA时,其与所述环状RNA发生碱基互补配对时,形成双链的核酸基团会被反应液中的5’-3’外切酶识别,从而切割核酸探针上的荧光报告基团与淬灭基团之间的核苷酸序列,使荧光报告基团从靶向环状RNA的核酸探针上游离到反应液中,继而发出荧光信号。
在临床实践中,通过检测单位体积血液中的荧光强度,可以灵敏地检测出血液样品中是否含有目的环状RNA,并且可以准确地计算出血液中特定环状RNA的浓度。
在此基础上,本发明人完成了本发明。
术语
如本文所用,术语“环状RNA”、“待检测环状RNA分子”、“目的环状RNA”、“靶标环状RNA分子”可互换使用,是指本发明中可作为疾病的诊断、危险分层和/或预后的分子标志物的待检测环状RNA分子。
如本文所用,术语“核酸探针”、“靶向环状RNA的核酸探针”、“靶向探针”等可互换使用,是指本发明中具有式I结构的可用于检测样品中的待检测环状RNA分子的探针。
本发明的检测体系
如本文所用,术语“检测体系”、“本发明检测体系”、“反应体系”等可互换使用,是指本发明中用于特异性检测目的环状RNA分子的检测体系。
在本发明中,所述的检测体系包含:
(a)一核酸探针,所述的核酸探针为单链核酸探针,并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构,
5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’ (式I)
其中,
Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列;
Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列;
Z3为第一基团携带区;
Z4为核酸外切酶识别区;
Z5为第二基团携带区;
(b)一核酸外切酶,所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列;和
(c)任选的待检测环状RNA分子;
其中,当所述(a)中的核酸探针与所述(c)中的待检测环状RNA分子形成双链结构时,所述(b)中的核酸外切酶特异性地切割所述(a)中的Z4区域。
在本发明中,所述核酸探针的设计的关键在于将一段含有荧光标签的分子耦合到环状RNA特异性靶向探针上,利用靶标与环状RNA的接头位置的互补配对触发核酸外切酶将带有荧光标签信号基团游离到反应液中,进而通过单位体积血液的荧光强度计算出血液中环状RNA的浓度。
本发明检测方法
在本发明中,提供了一种检测样品中是否存在待检测环状RNA分子的方法,包括步骤:
(i)提供如本发明第一方面所述的检测体系,所述检测体系中包括疑似含有待检测环状RNA分子的样品;和
(ii)检测所述体系中,所述第一基团或第二基团的信号强度。
特别值得注意的是,本发明所述的检测包括定性检测或定量检测。
在本发明的一个优选的实施方式中,包括以下具体的检测步骤:
1)血液样品室温3000转离心3min,以去除血液中的血细胞对检测的干扰;
2)将含有RNA-R酶及DNA酶的反应A液与1ml血浆在37度孵育30min,以去除血液中线性RNA及DNA的影响;
3)将含有环状RNA靶向探针的反应B液加入反应体系,室温孵育20min,利用荧光检测系统读取反应体系中的荧光强度;
4)根据荧光强度计算出单位体积血液内环状RNA的含量。
备注:实际操作过程中,可以将反应A液和反应B液混合后同时加入到反应体系中。
在本发明的一个实施方式中,所述的方法还包括建立心血管疾病相关的环状RNA数据库:该项目的顺利开展有赖于对疾病特异性环状RNA的前期筛选,故需要对正常人及心血管疾病患者的血液样品进行高通量测序,并结合自身的临床知识,对血液中不同浓度环状RNA患者进行追踪回访,绘制ROC曲线,从而建立一个心血管疾病相关的具有较高特异性及灵敏度的环状RNA数据库。
本发明的主要优点包括:
1)本发明方法省去了传统RNA提取、RNA浓度测定、定量PCR检测等多个环节,较传统检测方法,更加快速,便捷。
2)本发明适用于对疾病的早期筛查,以及对疾病严重程度的评估,可以指导临床的诊断与治疗。
3)本发明是一种相对广谱性的发明,并且基于环状RNA组织、细胞特异性表达的生物学特性,该方法对于某些特殊疾病的诊断又具有较高的特异性。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1:血液中环状RNA-对急性心肌梗死严重程度的评估
在本实施例中,本发明人设计了靶向环状RNA-Ttc3(circ-Ttc3)接头的特异性荧光探针。
对此,利用Varioskan LUX全波长荧光酶标仪对25例急性心肌梗死患者的血液样本进行了检测,并结合患者发病时间、心电图、冠脉造影结果、心肌损伤标志物cTNI等结果,分析circ-Ttc3在血液中的浓度与心梗患者的心肌损伤标志物的关系。
实施步骤
1.选取就诊我院心内科的急性心肌梗死患者25例
1.1.入组标准:
2008年中华心血管杂志,推荐的我国急性心肌梗死诊断标准。心肌损伤标准物升高大于上限+以下临床或者心电图指标的任意一项
(i)心肌缺血症状:心前区压榨样疼痛或者持续胸闷;
(ii)新出现的缺血性ECG改变,包括ST-T改变/完全性左束支传导阻滞;
(iii)新出现的病理性Q波;
(iv)影像提示节段性室壁运动异常;
1.2.排除标准:
精神疾病患者;肝硬化、肾衰或伴有血液系统疾病的患者;恶性肿瘤患者;伴有严重哮喘,支气管扩张,慢阻肺及特发性肺间质纤维化者;既往有吸毒或感染艾滋,梅毒等传染性疾病者。
1.3.检测步骤:
(1)血液样品室温3000转离心3min,以去除血液中的血细胞对检测的干扰;
(2)将含有RNA-R酶及DNA酶的反应A液与1ml血浆在37度孵育30min,以去除血液中线性RNA及DNA的影响;
(3)将含有环状RNA靶向探针的反应B液加入反应体系,室温孵育20min,利用荧光检测系统读取反应体系中的荧光强度;
(4)根据荧光强度计算出单位体积血液内环状RNA的含量。
1.4.实验结果
对25例患者血液中心肌坏死标志物、冠脉造影结果以及血液中circ-Ttc3荧光值进行检测汇总,见表(1),在此基础上,利用graphpad prism进行相关性分析,结果如图(1)所示,血液中circ-Ttc3含量与心肌坏死标志物呈正相关联系,R=0.72,P<0.01,具有统计学差异。
表1. 25例心梗患者心肌损伤标志物、犯罪血管以及circ-Ttc3荧光值
序号 | cTNI(ng/ml) | 犯罪血管 | circ-Ttc3荧光值 |
1 | 0.32 | 前降支远端80%狭窄 | 643. |
2 | 0.33 | 前降支远端80%狭窄 | 700. |
3 | 0.64 | 回旋支中断85%狭窄 | 654. |
4 | 0.72 | 前降支D2开口75%狭窄 | 1000. |
5 | 0.86 | 回旋支中断85%狭窄 | 810. |
6 | 0.92 | 回旋支远端75%狭窄 | 800. |
7 | 1.10 | 右侧冠脉85%狭窄 | 1100. |
8 | 1.23 | 右室侧支85%狭窄 | 860. |
9 | 1.82 | 钝圆支85%狭窄 | 950. |
10 | 2.40 | 锐圆支90%狭窄 | 980. |
11 | 2.39 | 左室间隔支次全闭塞 | 1300. |
12 | 3.50 | 钝圆支闭塞 | 806. |
13 | 3.89 | 前降支远端95%狭窄 | 845. |
14 | 4.40 | 前降支中段85%狭窄 | 950. |
15 | 4.60 | 前降支D1中段80%狭窄 | 945. |
16 | 5.60 | 前降支中段85%狭窄 | 1365. |
17 | 5.78 | 前降支中段次全闭 | 1620. |
18 | 7.84 | 回旋支近端90%狭窄 | 1576. |
19 | 8.63 | 前降支中段80%狭窄 | 1230. |
20 | 10.30 | 前降支中段次全闭 | 2456. |
21 | 10.36 | 前降支D2开口95%狭窄 | 1806. |
22 | 11.00 | 前降支近端85%狭窄 | 1596. |
23 | 16.00 | 回旋支中端90%狭窄 | 1890. |
24 | 16.50 | 前降支中段次全闭 | 1980. |
25 | 24.00 | 前降支中段次全闭 | 1300. |
讨论
本发明的检测体系和检测方法具有巨大的市场前景。
首先,本发明可用于临床治疗评估。目前越来越多的研究资料显示,环状RNA在血液中的异常表达与多种心血管疾病,如高血压,动脉粥样硬化,慢性心功能不全发生发展具有密切的联系,因此本发明的方法将大大有利于加强对该类患者的诊断与预后的评估。
其次,本发明可用于高危人群筛选。血液中某些特定环状RNA的表达改变可以反应疾病早期的病理生理状态,因此本发明的方法可以加强临床医师对某些高危心血管风险人群的早期识别。
众所周知,环状RNA对于疾病的诊断、疗效以及预后的评估具有重要的临床意义。然而,目前对血液中环状RNA的检测方法涉及RNA提取、纯化、浓度检测、反转录以及实时定量PCR等多道工序。其耗时、费力且效率低下,不符合临床上快节奏的工作要求。因此本发明的方法具有非常广阔的临床应用前景,对于心血管疾病的诊断、治疗以及预后的评估均具有重要的推动作用。
另外,由于环状RNA普遍存在于动植物以及微生物体内,因此本发明的技术方案在动物医学,农学及植物培育等方面同样适用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (19)
1.一种用于检测环状RNA分子的检测体系,其特征在于,所述体系包含:
(a) 一核酸探针,所述的核酸探针为单链核酸探针,并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构,
5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’ (式I)
其中,
Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列;
Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列;
Z3为第一基团携带区;
Z4为核酸外切酶识别区;
Z5为第二基团携带区;
所述Z3所携带的第一基团是淬灭基团,并且所述Z5所携带的第二基团是荧光基团;
(b) 一核酸外切酶,所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列;和
(c) 任选的待检测环状RNA分子;
其中,所述Z2中,与待检测的环状RNA分子反向互补的区域源自构成环状RNA闭环结构的两个不连续外显子与外显子之间互相连接的区域,或者源自构成环状RNA闭环结构的两个不连续内含子与内含子之间互相连接的区域;
所述Z4为回文对称序列;
当所述(a)中的核酸探针与所述(c)中的待检测环状RNA分子形成双链结构时,所述(b)中的核酸外切酶特异性地切割所述(a)中的Z4区域;
并且,所述核酸外切酶不切割完全单链形式的核酸分子,且所述核酸外切酶特异性地切割具有部分双链结构的核酸分子。
2.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述(a)中的核酸探针的长度为15-30bp。
3.如权利要求2所述的检测体系,其特征在于,所述(a)中的核酸探针的长度为16-26bp。
4.如权利要求2所述的检测体系,其特征在于,所述(a)中的核酸探针的长度为18-22bp。
5.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述核酸外切酶为5’-3’端核酸外切酶。
6.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述荧光基团选自下组:FAM、HEX、CY5、CY3、VIC、JOE、TET、5-TAMRA、ROX、Texas Red-X,或其组合。
7.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述Z3中,在所携带的第一基团的两侧分别包含长度为15-30bp的核苷酸序列。
8.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述的待检测环状RNA分子是疾病的诊断、危险分层和/或预后的分子标志物,所述的疾病选自下组:高血压、急性心肌梗死、动脉粥样硬化、慢性心功能衰竭、肿瘤、肾小球肾炎、肝炎、炎性肠病、系统性红斑狼疮、风湿系统疾病,或其组合。
9.一种用于检测环状RNA分子的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
(I)第一容器以及位于第一容器中的核酸探针,所述的核酸探针为单链核酸探针,并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构,
5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’ (式I)
其中,
Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列;
Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列;
Z3为第一基团携带区;
Z4为核酸外切酶识别区;
Z5为第二基团携带区;
所述Z3所携带的第一基团是淬灭基团,并且所述Z5所携带的第二基团是荧光基团;
其中,所述Z2中,与待检测的环状RNA分子反向互补的区域源自构成环状RNA闭环结构的两个不连续外显子与外显子之间互相连接的区域,或者源自构成环状RNA闭环结构的两个不连续内含子与内含子之间互相连接的区域;
所述Z4为回文对称序列;
(II) 第二容器以及位于第二容器中的核酸外切酶,所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列;
当所述核酸探针与所述待检测的环状RNA分子形成双链结构时,所述核酸外切酶特异性地切割所述Z4区域;
并且,所述核酸外切酶不切割完全单链形式的核酸分子,且所述核酸外切酶特异性地切割具有部分双链结构的核酸分子;和
(III) 任选的第三容器以及位于第三容器中的缓冲液。
10.一种非诊断目的地检测样品中是否存在待检测环状RNA分子的方法,其特征在于,包括步骤:
(i) 提供如权利要求1所述的检测体系,所述检测体系中包括疑似含有待检测环状RNA分子的样品;和
(ii) 检测所述体系中,所述第二基团的信号强度;
所述步骤(i)之前,还包括样品预处理步骤;所述样品预处理步骤中,还包括向所述样品中加入RNA酶和/或DNA酶并反应,其中,所述RNA酶和DNA酶分别特异性地切割线性RNA和双链DNA。
11.如权利要求10所述的方法,其特征在于,包括定性检测和定量检测。
12.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述的样品来源于:血液、胸腔积液或腹腔积液。
13.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述样品预处理步骤中,包括将样品在室温下离心处理。
14.如权利要求13所述的方法,其特征在于,所述离心处理为:在室温下,2500-3500rpm,离心2-5分钟。
15.如权利要求14所述的方法,其特征在于,所述离心处理为:在室温下,3000rpm。
16.如权利要求14所述的方法,其特征在于,所述离心处理为:离心3分钟。
17.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述反应的条件为37℃下20-40分钟。
18.如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述反应的条件为37℃下30分钟。
19.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述RNA酶是RNA-R酶。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010209038.5A CN111378741B (zh) | 2020-03-23 | 2020-03-23 | 血液中环状rna的检测方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010209038.5A CN111378741B (zh) | 2020-03-23 | 2020-03-23 | 血液中环状rna的检测方法及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111378741A CN111378741A (zh) | 2020-07-07 |
CN111378741B true CN111378741B (zh) | 2024-04-02 |
Family
ID=71215466
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010209038.5A Active CN111378741B (zh) | 2020-03-23 | 2020-03-23 | 血液中环状rna的检测方法及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111378741B (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103555838A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-02-05 | 深圳先进技术研究院 | 一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒 |
CN105112411A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-12-02 | 武汉顺可达生物科技有限公司 | 一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针及检测方法 |
CN106995840A (zh) * | 2017-03-20 | 2017-08-01 | 山东师范大学 | 一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的方法 |
CN107254553A (zh) * | 2017-06-30 | 2017-10-17 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 用于检测多种病原体的荧光实时检测方法及应用 |
-
2020
- 2020-03-23 CN CN202010209038.5A patent/CN111378741B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103555838A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-02-05 | 深圳先进技术研究院 | 一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒 |
CN105112411A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-12-02 | 武汉顺可达生物科技有限公司 | 一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针及检测方法 |
CN106995840A (zh) * | 2017-03-20 | 2017-08-01 | 山东师范大学 | 一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的方法 |
CN107254553A (zh) * | 2017-06-30 | 2017-10-17 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 用于检测多种病原体的荧光实时检测方法及应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Jiao J, Gao T, Shi H等.A method to directly assay circRNA in real samples.《Chem Commun.》.2018,第54卷摘要、第13451页右栏第2段、第13453页右栏第2段、Scheme 1、图1-2. * |
Xuehong Min等.Live Cell MicroRNA Imaging Using Exonuclease III-Aided Recycling Amplification Based on Aggregation-Induced Emission Luminogens.《ACS Publications》.2016,第8卷第8999页左栏第2段和右栏第2段、第9000页右栏第1段、第9001页左栏第1段、图1-6、表S1. * |
高勤学等.《基因操作技术》.2007,第250-255页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111378741A (zh) | 2020-07-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6180349B1 (en) | Quantitative PCR method to enumerate DNA copy number | |
CN107058472B (zh) | 一种通过四种血浆microRNA联合诊断急性高山病的诊断试剂盒 | |
CN101619346B (zh) | 人冠心病易感基因-脂蛋白a基因拷贝数变异检测方法和试剂盒 | |
CN105671181B (zh) | 用于检测肺癌的基因标志物、引物、探针及试剂盒 | |
CN103146692A (zh) | 一种用于快速检测华法林个体化用药相关基因snp位点的试剂盒及其检测方法 | |
CN113136429A (zh) | Idh1或idh2基因突变的检测试剂盒与检测方法 | |
CN111518883A (zh) | 一种用于冠心病诊断的血浆miRNA标志物及其应用 | |
CN103642914A (zh) | 与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用 | |
CN1987462B (zh) | 检测母系遗传线粒体耳聋基因a1555g突变的试剂盒 | |
CN109355406B (zh) | 一种基于血液游离核酸的检测结核分枝杆菌的试剂盒 | |
CN108531627A (zh) | 一种用于检测b族链球菌的rpa荧光定量引物对、探针、试剂盒及检测方法 | |
CN113999901B (zh) | 心肌特异性甲基化标记物 | |
CN111733227B (zh) | 特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用 | |
TWI758670B (zh) | 健康風險評估方法 | |
CN111378741B (zh) | 血液中环状rna的检测方法及其应用 | |
CN114438238B (zh) | 检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字pcr试剂盒 | |
Moreira et al. | Elevated transrenal DNA (cell-free urine DNA) in patients with urinary tract infection compared to healthy controls | |
CN112609002B (zh) | 一种外周血miRNA结肠癌诊断标志物组合及其检测试剂盒 | |
CN114807416A (zh) | 热带念珠菌的rpa-lfs检测引物探针组合及其应用 | |
US20220403448A1 (en) | Primer, probe and kit for tuberculosis diagnosis using urine sample, and uses thereof | |
CN107385093A (zh) | 引物组合物及其应用和应用其的产品及产品的使用方法 | |
CN114250302B (zh) | 用于宫颈上皮内瘤变检测的组合物、试剂盒及用途 | |
CN118685526A (zh) | 用于诊断肺癌基因甲基化的pcr引物探针组合、试剂盒及其应用 | |
CN107988355A (zh) | 用于检测与有机磷农药相关的ⅱ型糖尿病易感基因试剂盒 | |
CN107058473B (zh) | 一种联合miR-676、miR-181b和miR-3591诊断急性高山病的试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |