CN110714052A - RNase作用底物和RNase污染检测方法及应用 - Google Patents

RNase作用底物和RNase污染检测方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110714052A
CN110714052A CN201911154378.6A CN201911154378A CN110714052A CN 110714052 A CN110714052 A CN 110714052A CN 201911154378 A CN201911154378 A CN 201911154378A CN 110714052 A CN110714052 A CN 110714052A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rnase
sample
detected
detection
contamination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911154378.6A
Other languages
English (en)
Inventor
赵斯斯
张中娜
王雅欣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotechnology Bioengineering Shanghai Co Ltd
Original Assignee
Biotechnology Bioengineering Shanghai Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotechnology Bioengineering Shanghai Co Ltd filed Critical Biotechnology Bioengineering Shanghai Co Ltd
Priority to CN201911154378.6A priority Critical patent/CN110714052A/zh
Publication of CN110714052A publication Critical patent/CN110714052A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，提供了一种RNase作用底物和RNase污染检测方法及应用。本发明提供的RNase作用底物为荧光探针，该荧光探针为具有茎环结构的单链RNA，其中，环部的序列长度为3‑8bp，茎部的序列长度为3‑9bp，5’端和3’端具有0‑2bp的不对称碱基，以及，5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。应用本申请提供的RNAse作用底物来检测待检测样本是否含有RNase污染或污染量时，可简单快捷的得到结果，对于实验物料的质控和实验室环境的监控有较准确的指导意义。

Description

RNase作用底物和RNase污染检测方法及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种RNase作用底物和RNase污染检测方法及应用。
背景技术
RNA酶即核糖核酸酶(RNase)，是一类能够催化RNA水解的核酸内切酶，在RNA的种类和表达调控、基因表达以及蛋白合成等生命活动中扮演着重要角色，除了本身的水解活性外，还有杀菌、抗病毒、抗肿瘤、血管生成等功能，在生物体内普遍存在。
RNA酶家族包括RNase A、RNase T1、RNase I等。其中，RNase A是一种使用最为广泛的核糖核酸酶，最初是从牛胰腺中发现，它可以特异性地攻击RNA上胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)残基，其在多种条件下均有活性，可用来切割单链RNA、双链RNA、RNA-DNA杂交形成的RNA链。RNase T1来源于米曲霉，它可以特异性地作用于鸟嘌呤(G)3’端磷酸，切割位点在鸟嘌呤的3’磷酸和相邻核苷酸的5’羟基之间的磷酸二酯键，反应终产物为3’鸟苷酸和末端带3’鸟苷酸的寡核苷酸片段，其催化活性类似于RNase A。RNase I可以切割RNA的所有磷酸二酯键，优先降解单链RNA。同时，大多数的RNA酶具有反应条件极广，性质稳定，极难失活等特点，即使在高温高压苛刻的条件下也不能使其完全失活。
尽管许多核酸酶已成为有价值的实验室试剂，但实际上，它们也是所有分子生物学实验室都非常关注的质控问题。RNase的存在会降解与其接触的任何RNA分子，导致有价值的样品丢失或干扰实验。由生物体表达制成的生物制品，或者实验环境、平台中易存在RNase残留污染，RNase会迅速降解芯片研究、实时荧光定量PCR、Northern Blots、cDNA克隆等实验中的重要样品，导致实验数据的丢失，以及时间或金钱的浪费。因此，RNase污染检测是生物制品，试剂以及分子生物学实验室环境等的关键质控点。
目前对于RNase污染的检测主要通过如下两个方法进行：一是以RNase的活力单位Kunitz U定义为基础，通过检测单位时间内吸光度OD300的变化值来检测是否有RNase污染。二是通过与RNA孵育的方法，电泳检测RNA条带是否降解来判断是否存在RNase污染。该两种方法均存在灵敏度偏低，检测操作繁琐，检测通量偏低等缺陷。另外目前国外市场上有RNase污染检测的相关商品，但其价格普遍昂贵，并不适合于大批量的生物检测领域，且仅是定性检测方案，并不包括定量检测方案。鉴于以上技术问题，本领域亟需能够经济，简便，高效进行RNA酶污染检测的更优方案。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种RNase作用底物，以缓解现有技术中RNase检测手段单一，灵敏度偏低同时通量低的问题。
本发明的第二目的在于提供上述RNase作用底物的应用。
本发明的第三目的在于提供一种RNase污染检测方法，以缓解现有技术中检测RNase操作复杂、准确性差并且成本高的问题。
本发明的第四目的在于提供上述RNase污染检测方法的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种RNase作用底物，所述RNase作用底物为荧光探针，该荧光探针具有茎环结构，环部的序列长度为3-8bp，茎部的序列长度为3-9bp，5’端和3’端具有0-2bp的不对称碱基；
所述荧光探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。
进一步地，所述RNase作用底物序列为如下SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3任一种：
5’-GCUACCUCAUGGUAGC-3’(SEQ ID NO.1)，其中，环部序列为5’-UCAU-3’；
5’-GCUACCUCAUAGUAGC-3’(SEQ ID NO.2),其中，环部序列为5’-CUCAUA-3’；
5’-UCUCACUGUAUUGAGA-3’(SEQ ID NO.3),其中，环部序列为5’-CUGUAU-3’。
进一步地，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、ROX或Cy5，优选为FAM；
优选地，所述淬灭基团包括BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3，优选为BHQ-1。
上述RNase作用底物在RNase检测或制备RNase检测的产品中的应用。
进一步地，所述RNase检测为RNase活力检测或RNase污染检测；
优选地，所述产品包括试剂或试剂盒。
一种RNase污染检测方法，将上述RNase作用底物加入待检测样本进行反应，检测反应物中的荧光信号值，根据荧光信号值得到待检测样本中RNase的含量。
进一步地，检测反应物中的荧光信号值的方法包括如下a)、b)或c)：
a)荧光定量PCR检测方法检测；
b)RNase作用底物和待检测样本混匀后35-39℃反应25-35min后，微量荧光分光光度计检测；
c)RNase作用底物和待检测样本混匀后35-39℃反应25-35min后，特定光照肉眼可视观察检测。
进一步地，还包括构建标准曲线的步骤，将待检测样本的荧光信号值与标准曲线进行比对，得到待检测样本中RNase的含量；
所述标准曲线包括RNase标准品的浓度与RNase标准品荧光信号值的关系。
进一步地，RNase作用底物的工作浓度为0.1-5μmol/L；
优选地，所述RNase污染检测方法还包括负对照的荧光信号值检测，负对照为无酶水；
优选地，检测标准为待检测样品的荧光信号值比负对照的荧光信号值高2倍以上判定为待检测样品中含有RNase污染。
上述RNase污染检测方法在比较多个待检测样本中RNase含量或相对含量的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的RNase作用底物为荧光探针，该荧光探针为具有茎环结构的单链RNA，其中，环部的序列长度为3-8bp，茎部的序列长度为3-9bp，5’端和3’端具有0-2bp的不对称碱基，以及，5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。根据筛选探针对比灵敏度发现，环部和茎部序列均不能过长。随着环部序列的增加，探针灵敏度会下降，且随着茎部序列长度的增加，探针灵敏度亦会受影响。茎环结构不仅可以提高RNase作用底物的稳定性，更能提高该底物的灵敏度，即微量的RNase作用的信号也可以被采集到。此外，该RNAse作用底物完整时，茎环结构使得5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团靠的很近，此时无荧光信号的产生，当该底物被RNase降解时，又会立即产生荧光信号，提高检测的灵敏度和准确性。所以，应用本申请提供的RNAse作用底物来检测待检测样本是否含有RNase污染或污染量时，可简单快捷的得到结果，可检测酶的种类较多，可检测出微量RNase A，RNase T1，RNase I等的污染；应用场景也较为广泛，可以检测生物制品，试剂，缓冲液，表面环境(实验台，仪器，耗材表面等)的RNase污染水平，对于实验物料的质控和实验室环境的监控有较准确的指导意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是检测RNA酶污染的反应机理图；
图2是实施例1中Probe-1灵敏度检测结果图；
图3是实施例1中Probe-2灵敏度检测结果图；
图4是实施例1中Probe-3灵敏度检测结果图；
图5是实施例1中Probe-4灵敏度检测结果图；
图6是实施例1中定性检测RNA酶污染的蓝光下探针显色图；
图7是实施例2中定性检测RNA酶污染的蓝光下探针显色图；
图8是实施例3中定性检测RNA酶污染的蓝光下探针显色图；
图9是实施例3中相对定量检测RNA酶污染的标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
一种RNase作用底物，为荧光探针，该荧光探针具有茎环结构，环部的序列长度为3-8bp，茎部的序列长度为3-9bp，5’端和3’端具有0-2bp的不对称碱基；此外，荧光探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。
本发明提供的荧光探针为可以形成茎环结构的单链RNA，茎环结构是指单链RNA两侧的序列可以互补配对，即单链RNA回折配对的碱基形成双链结构，中间部分存在不能配对的碱基，所以形成单链环部结构，在本发明中5’端和3’端可以完全对齐，两端完全配对，也可以5’端或3’端存在1-2bp的碱基与3’端或5’端不能配对，形成不对称结构。根据筛选探针对比灵敏度发现，环部和茎部序列均不能过长。随着环部序列的增加，探针灵敏度会下降，且随着茎部序列长度的增加，探针灵敏度亦会受影响。茎环结构不仅可以提高RNase作用底物的稳定性，更能提高该底物的灵敏度，即微量的RNase作用的信号也可以被采集到。此外，该RNAse作用底物完整时，茎环结构使得5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团靠的很近，此时无荧光信号的产生，当该底物被RNase降解时，又会立即产生荧光信号，提高检测的灵敏度和准确性。所以，应用本申请提供的RNAse作用底物来检测待检测样本是否含有RNase污染或污染量时，可简单快捷的得到结果，可检测酶的种类较多，可检测出微量RNase A，RNaseT1，RNase I等的污染；应用场景也较为广泛，可以检测生物制品，试剂，缓冲液，表面环境(实验台，仪器，耗材表面等)的RNase污染水平，对于实验物料的质控和实验室环境的监控有较准确的指导意义。
在优选地实施方式中，RNase作用底物序列为如下SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3任一种：
5’-GCUACCUCAUGGUAGC-3’(SEQ ID NO.1)，其中，环部序列为5’-UCAU-3’；
5’-GCUACCUCAUAGUAGC-3’(SEQ ID NO.2),其中，环部序列为5’-CUCAUA-3’；
5’-UCUCACUGUAUUGAGA-3’(SEQ ID NO.3),其中，环部序列为5’-CUGUAU-3’。
在优选地实施方式中，荧光基团包括FAM、HEX、VIC、ROX或Cy5，优选为FAM。
在优选地实施方式中，淬灭基团包括BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3，优选为BHQ-1。
在本发明中，荧光基团和淬灭基团可以采用本领域常用的技术方案，在此不做特定的限定，不同的荧光基团和淬灭基团直接决定后期检测的手段，可以根据本领域常用的技术手段进行。进一步地，荧光基团优选采用FAM，最大激发光波长为495nm，最大发射光波长为520nm；荧光探针的淬灭基团优选为BHQ-1。
本发明提供的RNase作用底物在RNase检测或制备RNase检测的产品中的应用。其中，RNase检测可以是指RNase活力检测或RNase污染检测。产品可以是指试剂或试剂盒。
一种RNase污染检测方法，将本发明提供的RNase作用底物加入待检测样本进行反应，检测反应物中的荧光信号值，根据荧光信号值得到待检测样本中RNase的含量。
该检测方法的反应机理如图1所示，是利用本发明上述提供的RNase作用底物作为底物，如果待检测样本中存在RNase，会将该底物降解，降解的底物从而会发出荧光，再根据荧光信号值就可以得到RNase的含量，即待检测样本中RNase的酶活力值。该方法由于应用了RNase作用底物，检测较为简便，灵敏度和准确性好，在1小时左右即可完成检测，同时适合高通量的检测。
在优选地实施方式中，检测反应物中的荧光信号值的方法包括如下a)、
b)或c)：
a)荧光定量PCR检测方法检测；
b)RNase作用底物和待检测样本混匀后35-39℃反应25-35min后，微量荧光分光光度计检测；
c)RNase作用底物和待检测样本混匀后35-39℃反应25-35min后，特定光照肉眼可视观察检测。
本发明提供了三种采集荧光信号值的方式，但是并不局限于这三种，本领域其他的常用的检测手段也可用于本发明中，上述三种方式也可以根据检测精密度要求的不同采用相应的手段。a)中的反应程序优选为以36℃10s和37℃5s为1cycle，共循环60cycles。c)中特定光照是指根据荧光基因的不同，给予样本不同波长的激发光，激发荧光基团发光，实现肉眼观察的目的。
在优选地实施方式中，RNase污染检测方法中还包括构建标准曲线的步骤，将待检测样本的荧光信号值与标准曲线进行比对，得到待检测样本中RNase的含量，其中，标准曲线包括RNase标准品的浓度与RNase标准品荧光信号值的关系。
在优选地实施方式中，具体技术方案如下：
设置反应组，分别为正对照(RNaseA标准品)，负对照(无酶水)，检测组。加入RNA酶探针(工作浓度为10μmol/L)，10×Reaction Buffer(100mmol/L Tris-HCl，25mmol/LMgCl2，1mmol/L CaCl2，pH 7.5)配制检测反应体系；
用无酶水将RNaseA标准品稀释为五个的活性浓度梯度，配制检测反应体系；37℃条件下反应30min，微量荧光分光光度计采集并记录荧光信号数据；以荧光值RFU为纵坐标，标准品的活性U为横坐标建立散点图，并得到趋势线及标准曲线方程。
在建立标准曲线方程的同时，对待测样品进行检测。每个样品进行两个浓度梯度的检测。把待测样品的荧光值RFU代入方程中计算得到相应活力单位U值。
RNA酶污染程度以每mg样品中残留的RNA酶酶活来表示，即RNA酶污染程度(U/mg)＝计算得到的RNA酶活力单位U/反应体系中所用样品质量mg。
在优选地实施方式中，RNase作用底物的工作浓度为0.1-5μmol/L；
在优选地实施方式中，RNase污染检测方法还包括负对照的荧光信号值检测，负对照为无酶水。
在优选地实施方式中，检测标准为待检测样品的荧光信号值比负对照的荧光信号值高2倍以上判定为待检测样品中含有RNase污染。
本发明提供的RNase污染检测方法在比较多个待检测样本中RNase含量或相对含量的应用。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
不同长度序列探针的检测灵敏度对比
1.1材料准备
分别合成下表中不同环部长度和茎部长度的探针。下划线代表环部结构。
Figure BDA0002284355020000091
Figure BDA0002284355020000101
上述探针1-4均用无酶水稀释至10μmol/L的工作浓度；荧光定量PCR仪器型号为ABI 7500。
1.2反应条件
在无酶的PCR管中按照下表体系加入：
Figure BDA0002284355020000102
阴性对照为不加入RNaseA的反应组。
将反应体系置于荧光定量PCR仪器中，按照如下程序运行，
Figure BDA0002284355020000103
运行结束后，导出其原始荧光值数据。
1.3对比结果
结果如图2-图5所示，依次分别为探针1到探针4的检测结果，可以看出，随着环部序列长度的增加，荧光信号值会降低，即灵敏度会降低；且随着茎部序列长度的增加，灵敏度也会有所降低。此外，本发明又筛选得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的RNase作用底物。后续实施例中，以SEQ ID NO.1的RNase作用底物的技术效果为例说明本发明的有益效果。
定性检测蛋白酶K中的RNA酶污染
反应体系
1.1.1材料准备
RNA酶探针，用无酶水稀释至10μmol/L的工作浓度；
10×Reaction Buffer配制方法：向容器中加入500mL无酶水，分别称取三羟甲基氨基甲烷12.114g，六水合氯化镁5.083g，氯化钙0.111g，加入到容器中，搅拌至溶解，调节pH至7.5，加入无酶水定容至1L，然后过滤除菌备用；
RNaseA标准品购自Thermo(RNaseA,DNase-free Cat.No.EN0531)；
Nanodrop3300微量荧光分光光度计；蓝光透射仪。
1.1.2配制反应体系
Figure BDA0002284355020000111
为了避免RNaseA加入之后就迅速消化探针，反应操作要迅速，在加酶之后立即置于冰上进行操作。
检测结果
1.2.1蓝光下显色结果见图6。分别为负对照，样品，正对照，每组设置三个平行重复。结果显示，检测样品和负对照一样，不发出荧光，表示蛋白酶K样品无RNA酶污染。
1.2.2 RFU测定
Figure BDA0002284355020000112
Figure BDA0002284355020000121
样品蛋白酶K的荧光值与负对照基本相当，表示样品中无RNA酶污染。
实施例2
定性检测实验室耗材离心管中的RNA酶污染
检测样品为2.0ml离心管。
2.1.1处理一：为了检测整个管子是否存在污染，用无酶水将若干样品浸泡40min，再吸取40μl浸泡液，加入到反应体系中，37℃，静置30min，蓝光灯下观察，并且使用Nanodrop3300测定RFU值。
2.1.2处理二：为了检测管子内部是否存在污染，向离心管中加入500μl无酶水，振荡一分钟使管内壁接触到液体，再吸取40μl浸泡液，加入到反应体系中，37℃，静置30min，蓝光灯下观察，并且使用Nanodrop3300测定RFU值。
2.2反应体系
组分 正对照 实验组 负对照
10×Reaction Buffer 2.5μl 2.5μl 2.5μl
RNA酶探针(10μM) 1.25μl 1.25μl 1.25μl
RNaseA标准品 1μl / /
待测样品 / 40μl /
无酶水 To 50μl To 50μl To 50μl
为了避免RNaseA加入之后就迅速消化探针，反应操作要迅速，在加酶之后立即置于冰上进行操作。
2.3检测结果
2.3.1蓝光下显色结果见图7。分别为正对照，负对照，检测样品外，检测样品内，每组设置三个平行重复。结果显示，检测样品内外均和负对照一样，不发出荧光，表示离心管样品无RNA酶污染。
2.3.2RFU测定
正对照 负对照 样品外 样品内
重复1 8787.3 181.1 219.6 251.8
重复2 8857.3 160.2 274.2 242.2
重复3 9047.6 127.4 198.8 189.2
离心管样品的荧光值与负对照基本相当，表示离心管样品无RNA酶污染。
实施例3
相对定量检测DNaseI酶中的RNA酶污染
3.1反应体系
在无酶的PCR管中按照下表体系加入：
Figure BDA0002284355020000131
加好后混匀瞬时离心，37℃孵育30min。在蓝光下观察并且检测荧光值(RFU)，根据。根据对照和检测样品的荧光值判断是否存在RNA酶污染。
若存在则进一步定量存在污染的酶活，以RNaseA作为标准品建立标准曲线，计算样品中RNA酶污染程度。
3.2定性检测结果
3.2.1蓝光下显色结果见图8。分别为负对照，样品和正对照。每组设置三个平行重复。结果显示，检测样品发出绿色荧光，表示DNaseI样品存在RNA酶污染。
3.2.2 RFU测定
Figure BDA0002284355020000141
样品的RFU值大于负对照的2倍以上，表示DNaseI样品存在明显的RNA酶污染。
3.3定量检测结果
3.3.1绘制标准曲线
以RNaseA标准品(Thermo Cat No.EN0531)构建标准曲线，对DNaseI样品中RNA酶污染程度进行相对定量。RNaseA标准品设置五个用量梯度，分别为0.00001U、0.00002U、0.00004U、0.00008U、0.0001U。RFU测定结果如下表。
绘制标准曲线，见图9。曲线方程：y＝28851000x+4.689，R2＝0.992。y值代表RFU值，x值代表酶活U值。
3.3.2计算样品污染程度
DNaseI样品设置两个用量梯度，分别为0.0002mg和0.0001mg。RFU测定结果如下表。
Figure BDA0002284355020000151
将RFU平均值代入标准曲线方程，计算得，0.0002mg样品中含有9.4203e-5U的RNA酶活性，即0.47U/mg的RNA酶污染水平；0.0001mg样品中含有3.9664e-5U的RNA酶活性，即0.40U/mg的RNA酶污染水平。
所以，DNaseI样品中RNA酶污染的相对定量结果为0.44U/mg。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 生工生物工程（上海）股份有限公司
<120> RNase作用底物和RNase污染检测方法及应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcuaccucau gguagc 16
<210> 2
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcuaccucau aguagc 16
<210> 3
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
ucucacugua uugaga 16
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcuaccugcc augauguagc 20
<210> 5
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcuacucuca cugccaugau ugagaguagc 30
<210> 6
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcuacucuca gacugccaug augcuugaga guagc 35

Claims (10)

1.一种RNase作用底物，其特征在于，所述RNase作用底物为荧光探针，该荧光探针具有茎环结构，环部的序列长度为3-8bp，茎部的序列长度为3-9bp，5’端和3’端具有0-2bp的不对称碱基；
所述荧光探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的RNase作用底物，其特征在于，所述RNase作用底物的序列为如下SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3任一种：
5’-GCUACCUCAUGGUAGC-3’(SEQ ID NO.1)，其中，环部序列为5’-UCAU-3’；
5’-GCUACCUCAUAGUAGC-3’(SEQ ID NO.2),其中，环部序列为5’-CUCAUA-3’；
5’-UCUCACUGUAUUGAGA-3’(SEQ ID NO.3),其中，环部序列为5’-CUGUAU-3’。
3.根据权利要求1所述的RNase作用底物，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、ROX或Cy5，优选为FAM；
优选地，所述淬灭基团包括BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3，优选为BHQ-1。
4.根据权利要求1-3任一项所述的RNase作用底物在RNase检测或制备RNase检测的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述RNase检测为RNase活力检测或RNase污染检测；
优选地，所述产品包括试剂或试剂盒。
6.一种RNase污染检测方法，其特征在于，将权利要求1-3任一项所述的RNase作用底物加入待检测样本进行反应，检测反应物中的荧光信号值，根据荧光信号值得到待检测样本中RNase的含量。
7.根据权利要求6所述的RNase污染检测方法，其特征在于，检测反应物中的荧光信号值的方法包括如下a)、b)或c)：
a)荧光定量PCR检测方法检测；
b)RNase作用底物和待检测样本混匀后35-39℃反应25-35min后，微量荧光分光光度计检测；
c)RNase作用底物和待检测样本混匀后35-39℃反应25-35min后，特定光照肉眼可视观察检测。
8.根据权利要求6所述的RNase污染检测方法，其特征在于，还包括构建标准曲线的步骤，将待检测样本的荧光信号值与标准曲线进行比对，得到待检测样本中RNase的含量；
所述标准曲线包括RNase标准品的浓度与RNase标准品荧光信号值的关系。
9.根据权利要求6-8任一项所述的RNase污染检测方法，其特征在于，RNase作用底物的工作浓度为0.1-5μmol/L；
优选地，所述RNase污染检测方法还包括负对照的荧光信号值检测，负对照为无酶水；
优选地，检测标准为待检测样品的荧光信号值比负对照的荧光信号值高2倍以上判定为待检测样品中含有RNase污染。
10.权利要求6-9任一项所述的RNase污染检测方法在比较多个待检测样本中RNase含量或相对含量的应用。
CN201911154378.6A 2019-11-22 2019-11-22 RNase作用底物和RNase污染检测方法及应用 Pending CN110714052A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911154378.6A CN110714052A (zh) 2019-11-22 2019-11-22 RNase作用底物和RNase污染检测方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911154378.6A CN110714052A (zh) 2019-11-22 2019-11-22 RNase作用底物和RNase污染检测方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110714052A true CN110714052A (zh) 2020-01-21

Family

ID=69216355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911154378.6A Pending CN110714052A (zh) 2019-11-22 2019-11-22 RNase作用底物和RNase污染检测方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110714052A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101328498A (zh) * 2008-06-11 2008-12-24 北京大学 一种通用、实时的核酸酶荧光检测方法
CN105112411A (zh) * 2015-08-26 2015-12-02 武汉顺可达生物科技有限公司 一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针及检测方法
CN105525010A (zh) * 2016-01-28 2016-04-27 陕西师范大学 一种茎环结构组合探针及其应用
CN105567841A (zh) * 2016-02-03 2016-05-11 广州市锐博生物科技有限公司 一种检测核糖核酸酶的方法及其试剂盒
CN105648062A (zh) * 2016-02-03 2016-06-08 广州市锐博生物科技有限公司 检测脱氧核糖核酸酶的dna探针、试剂盒和方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101328498A (zh) * 2008-06-11 2008-12-24 北京大学 一种通用、实时的核酸酶荧光检测方法
CN105112411A (zh) * 2015-08-26 2015-12-02 武汉顺可达生物科技有限公司 一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针及检测方法
CN105525010A (zh) * 2016-01-28 2016-04-27 陕西师范大学 一种茎环结构组合探针及其应用
CN105567841A (zh) * 2016-02-03 2016-05-11 广州市锐博生物科技有限公司 一种检测核糖核酸酶的方法及其试剂盒
CN105648062A (zh) * 2016-02-03 2016-06-08 广州市锐博生物科技有限公司 检测脱氧核糖核酸酶的dna探针、试剂盒和方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7276337B2 (en) Compositions and methods for visual ribonuclease detection assays
US11608519B2 (en) Specific detection of deoxyribonucleic acid sequences using novel CRISPR enzyme-mediated detection strategies
Gong et al. Ag nanocluster-based label-free catalytic and molecular beacons for amplified biosensing
CN109439735B (zh) 一种脱碱基核酸内切酶1的荧光检测探针、试剂盒及应用
CN104293917B (zh) 用于具有3’-5’外切活性的核酸酶检测的硫代探针
CN109576342B (zh) 一种用于检测碱性磷酸酶的荧光化学方法与应用
JP2017136086A (ja) 標的核酸の検出方法及びキット
CN112986551B (zh) 一种检测混合体系内目标分子浓度的方法及试剂盒
Lu et al. Rapid and highly specific detection of communicable pathogens using one-pot loop probe-mediated isothermal amplification (oLAMP)
CN115820934A (zh) 一种基于CRISPR/Cas13a的核酸检测试剂盒、检测方法及应用
US20220106647A1 (en) Solution-phase, trans-activated reporter systems for use in crispr-based nucleic acid sequence detections
CN110747253A (zh) Dna酶检测荧光探针与dna酶活力检测方法及应用
CN110714052A (zh) RNase作用底物和RNase污染检测方法及应用
CN113652473B (zh) 单分子检测dna损伤位点的荧光化学传感器及方法和应用
JPWO2003035864A1 (ja) 標的核酸の検出方法及び核酸プローブ
CN110055305B (zh) 一种利用RNase H检测(CAG)n重复序列的方法
CN112980844A (zh) 针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒和使用方法
CN114085892B (zh) 用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系、试剂或试剂盒及检测方法
CN112608913B (zh) 一种基于C2c2的基因表达调控系统及其应用
CN114965412A (zh) 一种基于CRISPR/Cas12a与DNAzyme的碱性磷酸酶活性检测方法
CN108646014A (zh) 基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子的方法
Kurbatov et al. Standardization of Recombinant CRISPR/Cas13a-nuclease Preparations by Using RNase A of Known Activity
Hu et al. Cleavable DNA-protein hybrid molecular beacon: A novel efficient signal translator for sensitive fluorescence anisotropy bioassay
CN110157777B (zh) 一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器及制备方法
Zhu et al. CRISPR/Cas12a-mediated entropy-driven electrochemical biosensor for detection of genetically modified maize Mon810

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200121

RJ01 Rejection of invention patent application after publication