CN107282149A - 一种用于评价细胞损伤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用多种聚合物材料或者组合制备的微流控芯片，实现对丙二醛的微量生物化学反应，产生的终产物固定到载体上并装载于微芯片中，通过光化学原理测定其靶分子的浓度。这些方法以及多种组合的方法及其制成品所属的系统可以用于评估2型糖尿病并发症等引起的细胞损伤程度的评估。

Description

一种用于评价细胞损伤的方法
技术领域：本发明属于生物医药技术领域，涉及一种利用微流芯片方式测定糖尿病并发症相关的标志分子的含量的方法描述以及相应的装置的制备工艺等。
背景技术：机体老化过程在生物学认为是属于正常的生物学程序设定的进程，但是自从开创了自由基的研究领域之后，逐步认识到在所谓的“老化”进程与许多的“疾病”之间存在在于各个层面的化学的共通的联系。这些方面的进展与积累的知识，提高了对人类衰老流程的理解。在理解本发明的工作之前有必要说明的是，利用遗传学，生物学方法进行个体的“老化”的判定与本发明所涉及的“老化相关的疾病”(age-associated diseases)不在同一个范畴。需要指出的是，我们所关注的老化以及老化性性疾病，举例如，老年心血管病，中风，癌症，器官功能衰退，骨关节、肌肉劳损，糖尿病并发症等，估计这个名单还会继续扩大，这一类别的“老化”是我们关注的范畴。具体的是，我们在这个申请例子中只集中在糖尿病有关的老化的应用与说明，而更具体的在于，在本工作与知识产权有关的说明中，本申请披露与糖尿病性质的老化进程相关的老化的指标的微流控芯片检测的技术细节。
近年的一种理论认为，慢性病相关的老化是由许许多多的意外的，随机的，无可避免的“错误”所产生，这方面的数学模型都试图定量地说明老化的这个原理，医学实验工作的贡献在于对于这个产生“错误”的原因和发生源提供了生物医学方面的知识积累，帮助人们理解如何设计出来控制、干预老化的进程。
1956年至今，哈曼(Harman，1956，2006)的研究发现，“老化”其实是一种自由基介导的慢性损害，可以列入疾病的范畴，这种疾病有多个病因包括由活性氧(ROS)以及一系列ROS参与的的继发的损害所造成。例如，其中之一，线粒体DNA(mtDNA的)是一个多拷贝染色体外遗传组件，暴露于高稳态水平ROS和由呼吸链产生的线粒体自由基，它很容易被氧化损伤并造成基因的突变，超过20％报道的在人类线粒体DNA上的突变已经确认是老年性损伤相关联的。
在上述的过程发生之中，需要密切关注的应该是不饱和脂肪酸的作用。不饱和脂肪酸是细胞、组织等生物单位膜的基本组分，含量在不同的组织里面都具有比较大的差异，它与ROS和由呼吸链中产生的自由基接触后随即会产生链的断裂，氧化，释放丙二醛(Malonicdialdehyde alchol，MDA)，作为一种活性的中间物，该醛是一种剧毒分子，MDA通过对细胞内的功能蛋白质，酶，因子，DNA等进行修饰，形成加合物。这类物质可以在各种体液里面出现，例如，当组织出现微小的病变后，组织的MDA的水平增加，随即在尿液中MDA也会出现增加，同时增加的还有几个MDA的衍生物从尿液排泄，表现为尿中的该类物质水平增加。有MDA的主要尿代谢物已被确定为N-ε-(2-丙烯醛)赖氨酸，以及其N-α乙酰酯。
Rio(2005)的研究工作说明，上述的氧化应激是多种慢性疾病和衰老过程中一个极其重要的底层的过程。脂类尤其是多不饱和脂肪酸，是这类氧化应激的主要的攻击靶标，并产生复杂的生物化学反应以及脂质氧化引起的一些次级产品。这些产品主要是醛，与加剧氧化损伤的能力，它们存在于整个机体组织，与生物大分子如核酸、蛋白质等相互作用，不可逆的损坏细胞以及细胞器的生理功能。
值得注意的是，多不饱和脂肪酸作为氧化应激的攻击靶标，具有重大的意义，因为多不饱和脂肪酸存在于机体组织，细胞，细胞器，单位膜上面，分布非常广泛，含量与分布的范围很大；尤其是在检测方面的意义在于，不同的组织，细胞种类，不同的部位，其多不饱和脂肪酸的含量，分布都具有各自的特点，在受到氧化损坏释放的时候，会出现与组织、细胞种类、器官部位关联的特殊的释放的时间、量的模式，可以解释为，这种时候检测到的信号是具有时间与空间编码意义的特异信号。
自20世纪60年代以来，在量化评估氧化应激的水平的体内和体外研究方面，丙二醛(MDA)是主要的和研究最多的的多不饱和脂肪酸过氧化产物分子。因为认识MDA的意义不仅仅在于它是一个表征氧化应激程度的公认的分子标记物，它与DNA和蛋白质的相互作用造成的致突变、损伤在多种慢性病损研究的毒理作用方面也是具有重要的意义。
PUFA脂质氧化的体内过程简单描述是这样的：多不饱和脂肪酸遇到自由基之后，主要通过多级自由基反应先期形成前列腺素样或者甲基亚油酸的前体物质，这些前体物质进一步通过β剪切过程作为前一级物质继而转变为毒性分子MDA。
生物样品中的丙二醛的主要来源是多不饱和脂肪酸参与的过氧化过程，参与的结构有两个或更多的亚甲基间隔的双键。MDA前体属于一类非挥发性的性质，前体的结构类似于一类二环内过氧化物，类似前列腺素样的物质，以及亚油酸甲酯样的结构等，接着转化为MDA，体内外的过程是类似的.。丙二醛也可在体内通过酶促生成。各种前列腺素合成过程的知识表明，血栓素A2(TXA2)的合成导致丙二醛和12(S)-羟基8，10(E，E)-heptadecadienoic酸(HHT)以高收率产生所述的中间体分子以及MDA。
生理状态的中性pH下，MDA是一种烯醇阴离子，具有相对低的化学反应性能，然而，这种分子能够与核酸碱基相互作用，以形成几种不同结构的加合物，已知的嘧啶，嘌呤，2-脱氧核糖等，其中比较重要的有M1G，在细菌和哺乳动物体内的细胞里发现了M1G能够诱导序列依赖性移码突变和碱基对取代。另一方面，丙二醛可以造成NDA链间交联并产生突变，同时也发现，DNA和组蛋白之间存在MDA引发的交联，这些都是造成肿瘤发生的原因。
丙二醛与伯胺反应形成Nε-(2-丙烯醛)赖氨酸以及赖氨酸-赖氨酸交联体。这些反应产物被检测在氧化的脂蛋白(LDL)和载脂蛋白B被认为是参与受损相互作用的变性脂蛋白，这种化学反应是器官血管内壁或者组织微循环损坏的基础，在糖尿病很早期的发展过程中就会出现。
对于胶原蛋白的情形比较特殊，胶原蛋白作为血管内壁以及细胞间组织的基本结构性物质，生理功能的维持要借助正确的结构。即使在没有发生Nε-(2-丙烯醛)赖氨酸以及赖氨酸-赖氨酸交联体的时候，一样会发生MDA介导的肽链之间的交联，造成分子活性的失能。所以用MDA的产物交联赖氨酸作为标志物来检测，监控毒性发展的时相，相对于监控MDA的水平变化量或者累计量还要晚一些。
MDA能够诱导蛋白质交联，MDA的水平升高与阿尔茨海默氏(AD)的关联关系已经逐渐被确认。按照目前的理解，虽然AD有着复杂的营养和遗传危险因素和倾向，早期营养干预现在证明具有非常确定的重要性，通过在膳食补充剂补充含有硫辛酸的混合物，乙酰基-L-肉碱，磷脂酰甘油，十二碳六烯酸，和磷脂酰丝氨酸等自由基消除剂，可以明显地延缓AD的进展与认知能力的下降，但是对于是否目前的自由基清除药物的使用是否正确也出现了一些争议，许多研究者建议通过严密的监控MDA的水平，来指导合理使用自由基清除剂、抗氧化剂是比较完善的方式。
发生在核糖体上的蛋白质合成普遍受所有与老化相关的生物学过程的影响。有一个关于该机制没有明确的，但是已经取得共识的发现，即随着老化的发展，机体组织细胞的蛋白质翻译机能出现了相应的下降。延伸步骤是特别是受影响的老化的改变的结果延伸因子-2(eEF-2)中，单体蛋白的那在催化沿着mRNA的核糖体的移动蛋白质的合成。eEF-2似乎是特别受脂质过氧化物的化合物，其伴随产生毒性醛，如MDA。这可以通过产生破坏蛋白质价加合物的累积参与组织老化过程中损坏。
现在已经知道，体内胰岛素的分泌是受到线粒体的呼吸链上的呼吸作用控制的。一般情况下，激活β细胞释放胰岛素的过程和胰高血糖素的合成与释放降低是相对进行的，肾上腺素则可以通过刺激α细胞胞浆内质网Ca++释放激活胰高血糖素的分泌。正是这种由α细胞，β细胞协调控制的过程保证了糖代谢的稳定。如果发展到糖尿病阶段，经常出现的高血糖症通过线粒体上的电子传递链，产生持续的氧化应激，产生并造成单位膜的脂质损坏，进一步相应的蛋白质分子零件和DNA分子零件被氧化性中间物MDA损坏，一般而言，就会导致β细胞功能的逐步丧失，并加剧糖尿病的病理发展进程，接着就出现大量的变性损坏的内皮细胞，脂肪细胞和其他细胞等，体现为糖尿病的一系列的并发症状。
Dandona报道(1996)的12例胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和15例非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的测试结果，发现和对照相比，这些病人的单核细胞都具有显著地高水平的氧化应激反应，进一步测定发现他们的由于氧化应激造成的DNA损伤的标志物8-OHdG也相应的处于很高的水平，这也正是氧化应激如何通过一种类似于上述描述的“老化”的方式，逐步造成了糖尿病人并发症状逐步严重的原因。所以如何控制这种不适当的氧化应激过程显然对于防治糖尿病的并发症是一种明智的策略。
在这些生物学标志的出现的时相上，高血糖症一旦出现，随即发生的就是MDA的水平的升高，接着就是MDA等氧化应激产物参与的微小血管的损伤，这时候有可能可以检测到糖化血红蛋白的水平的增高，再接着就是尿中可以检测到微球蛋白，表现为器官损伤。其中，MDA的水平(2-12umol/L)的增高与糖化血红蛋白的水平的增高在很宽泛的一个范围(4％-14％)内都具有一定的关联关系；同时MDA水平的增高也与之后出现的尿中的微球蛋白的水平的增高具有一定的线性关联，但是许多临床数据表明糖化血红蛋白的水平的增高与尿微球蛋白的水平的增高没有发现有确定的线性关系。由于MDA水平的增高可以出现在糖尿病发生发展比较早的时期，甚至出现在并未确诊的早期，之后，MDA的水平也随着病程一直在持续地升高，每一次升高都提示着病情出现了新的发展与程度的加重，具体的内涵已经有大量的研究报道。
例如罹患糖尿病后，随着病损的发展，血管内壁以及外周神经末梢等受到影响，这个时候，病人会出现糖尿病的并发症之一勃起功能障碍。Latif(2006)比较了几个指标：NO、糖化血红蛋白(HbAlc)、血清脂蛋白含量(LP)、MDA等在病情进展中的关联性，虽然这时期的病人都表现为NO水平低下、糖化血红蛋白(HbAlc)、血清脂蛋白含量以及脂蛋白含量都偏高，但是如果采用实际功能的异常指标来分析，把海绵体动脉收缩期峰值＜25厘米/秒(PSV)定义为并发症阳性，就发现，在糖尿病勃起功能障碍的病人里面，脂蛋白指标具有91％的灵敏度和78％的特异性，MDA有91％的灵敏度和89％特异性，糖化血红蛋白有91％的灵敏度，44％的特异性，几乎没有线性关系。说明采用MDA的指标来推测糖尿病的并发症之一勃起功能障碍的进展程度，相对于使用糖化血红蛋白的指标，明显具有更好的临床价值。
鉴于MDA的出现是在氧化应激一旦产生就会出现，所以是一个非常早期，敏感的指标，它的含量的升高，从代谢与功能的角度可以理解为，代表了损伤性的代谢过程与细胞、组织的损伤的出现，相比于糖化血红蛋白的含量的指标，MDA的水平，以及MDA水平的变化，如果作为2类糖尿病并发症相关的老化与损伤的生物医学标志与临床诊断的判据，具有更加灵敏、定量、早期预警的价值。
就MDA在临床医学方面已经申请的专利、文献的情况大致是：在Draper，H.H(1993，Free Radic.Biol.Med，1993，15，353)发表了MDA的TBA检测方法之后，已经有大量的有关MDA的检测分析，应用等文献发表，同时也公开了多个相关的专利保护。伊万·佩特亚耶夫(2006，CN 101147064A)提及虽然TBA的方法原理简单实用，但是需要花费病患者2-3毫升的血清来测量，还要花费8-12个小时完成分析工作，所以公开了一种抗体酶的分析原理来替代MDA的测试分析，用于评价氧化损伤对血管内壁动脉粥样硬化状的损伤的情况。伊万·佩特亚耶夫(Ivan Petyaev)在其它二个专利的申请(2002，US7148028B2和2008，US7419657B2)中提交了对使用MDA水平的测定用于对动脉粥样硬化损伤评估的权利要求。关联于类似伊万·佩特亚耶夫(Ivan Petyaev)所申报专利涉及到的情形，还例如，即采用测定MDA的水平的方式来评价糖尿病、慢性肾病、神经系统疾病或者相关的并发症，心脑血管保健品、药物的保健、治疗效果的评估等状况已经有大量的公开信息(技术文献，专利，会议摘要)表述过，以及相关的用于可充分体现出这种实践方式所具有的优越性，即采用测定MDA的水平的方式评价上述病理、生理情形发展的状况中的有效性与临床意义方面，也有许多类似的文献发表公开提及到这一点。但是上述的表述中几乎都无一例外地指向的MDA的分析测试方法的实现是通过以下手段，包括：气相色谱，质谱，分光光度计，高效液相色谱，目测比色法等方法，没有任何涉及到本专利提出的微流芯片方式或者如何实施这种方式的细节，即采用生物芯片或Chip on Lab技术实现的例子与应用的权利要求。
关于对MDA的测试的方法硫代巴比妥酸(TBA)反应，该方法最广泛地用于研究脂质过氧化在实验室动物和人类与疾病。然而就其特异性方面常有技术层面的问题，因为TBA反应与多种化学物种产生粉红色的颜色。TBA与蔗糖，果糖和葡萄糖，嘧啶，2-脱氧核糖，和N-乙酰神经酸。胆红素，胆绿素，黄疸血清等干扰物质，都会增大MDA测定时的532nm的光吸收，但是对于尿样，唾液等限定的体液尤其是糖尿病人的尿样等限定的体液，主要的干扰物质是这些样本中的不确定的，而且含量比较大的葡萄糖的干扰，其它可能的干扰物质含量相对很低，而且通过简单地酸性的沉淀可以大大地去除这些干扰。对于早期糖尿病人尿糖阴性的大多数情况下，测试结果比较理想。
所引用的专利与文献：
Slatter DA，Bolton CH，Bailey AJ.The importance of lipidderived malondialdehyde in diabetesmellitus.Diabetologia 2000；43：550e7.
Del Rio D，Stewart AJ，Pellegrini N：A review of recent studies on malondialdehyde as toxic andbiological marker of oxidative stress.Nutr Metab Cardiovasc Dis 15：316-328，2005
Sevanian A，Hochstein P：Mechanisms and consequences of lipid peroxidation in biological systems.Ann.Rev Nutr 5：365-390，1985
Siu GM，Draper HH：Metabolism of malonaldehyde in vivo and in vitro.Lipids 17：349-355，1982Vicentini(2011)Association Among Microalbuminuria and Oxidative Stress
Biomarkers in Patients With Type 2 Diabetes
发明内容：本申请包括了如下的工作：分别使用了热压封接的方法制备了PMMA三明治结构芯片，以及如何将PMMA-PDMS，PDMS-玻璃芯片相互粘结制备微流芯片结构；也制备了可与之配套的反应载片、反应载体微珠，将部分反应底物固定到检测区的固相表面；接着用这样制作的微流芯片测定了PBS溶液里面的MDA的含量，正常人尿样的MDA含量，以及患有2型糖尿病病人的尿样的MDA的含量。
附图说明：
图1.丁字形状图案微流芯片。主干道是A到C的流道，宽度是450微米，从B到E到D的流道所采用用作模具的金属丝的直径是300微米。A孔的直径为8毫米。
图2.三明治结构微流芯片上盖板。大小为35毫米x25x1.5毫米。
图3.上吸式流道模具侧面图。
图4.上吸式流道模具俯视图。
图5.上吸式流道模具截面图。
图6.自吸式检测卡。
图7.自吸式检测卡上半部分，下半部分的结构图示。
图8.自吸式检测卡内部检测纸板。
图9.微流芯片组装的结构。在b的位置为离断的结构防止侧漏，a1，a2处用于搭接玻璃纤维素片形成检测区，c搭接上样孔处的样品垫，d为2个单独供电的加热电极。
图10.检测区涂层表面形貌。
图11.氧化铝溶胶凝胶涂层厚度与底物活性关系图示。
图12.PDMS微珠结构
图13.连接了荧光基团的微珠固定在凝胶表面。
图14.MDA含量检测标准曲线。
图15.随即抽样志愿者尿样MDA含量分布。
图16.2型糖尿病人并发症阳性和阴性病人尿样MDA含量分布。
图17.2型糖尿病人与随即抽样志愿者尿样MDA含量比较。
具体实施方式：
实施例1：制备PMMA三明治结构/双层结构芯片
用直径300微米和450微米的镍丝，也可以选择类似尺度的不锈钢丝，切为长度15毫米的段，固定在一个表面平整的不锈钢基座上，制成热压的模具。如图1所示的，形成一个丁字形状的图案，其中主干道是A到C的流道，宽度是450微米，从B到E到D的流道所采用用作模具的金属丝的直径是300微米。将模具固定到压力升降台的端部，控制恒温加热台的温度在106度，上下精确在0.5度的变动中，调节压力升降台的手柄，使模具水平面的方式与聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)料片相接，固定压力在0.6MPa，维持压力10分钟，关闭恒温加热平台自然降温到室温，脱出模具。转移热压成型的料片到打孔钻台，流道面为正面向上放置，分别在B，C，D，E位置钻出直径5毫米的穿透孔，A孔的直径为8毫米。在每一个孔内放置预处理好的玻纤测试纸片，用厚度1.5毫米的PMMA高透亮料片与热压成型的料片正面相接，反面与另外预先开孔的上盖板相接，形成三明治的结构。控制恒温加热室的温度在86度，上下精确在0.5度的变动中，调节内置的压力升降台的手柄，维持压力在0.075MPa大小的压力15分钟完成热压封接。将制成的三明治结构切割成35毫米x25毫米大小的结构；在较为复杂的双检测孔装置里面，在与对照的检测孔不同的检测孔的下方区域预留供安装加热电极，可以通过与这个装置配套使用的阅读器的一个GPIO引入3-6伏特0.1-1安培的电流供局部加热到30-80摄氏度的热区(图2)。
实施例2：制备含有液体上吸式流道的装置
用3D打印机制备如图3所示的结构，所用的材料是聚酰胺树脂材料(从Formlabs公司购买)，ABS材料也可以使用，但是相对粗糙一些，不锈钢的材料也是一个选择。固定在一个表面平整的塑料皿里面，制成浇注PDMS的模具。在后面的步骤里面，准确量取27g Dowconingsylgard 184硅胶，称量2.7gDowconingsylgard Curing agent混合，脱气，覆盖模具，让最顶面的深度大于1mm，70℃交联3小时，从模具里面移出整个结构，用去离子水清洗胶块，在合适的PET容器内加入上盖处理液，超声处理60分钟，用经过0.01uml滤膜过滤的压缩空气吹干上盖板，等离子发生器用空气等离子处理90秒，用0.25MP的压力封接底板与上盖板制成微流道结构(图4，图5)。最后一个步骤包括以下的处理方式：以无水乙醇为溶剂、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)为修饰试剂、醋酸为催化剂，采用浸泡法，对芯片流道内表面进行氨基硅烷化修饰。制备过程中浸泡时间、APTES的浓度比较合适的范围是0.1-5％(v/v)、pH值控制在4.8-5.6之间，处理的时间依据反应的温度控制在30分钟到5个小时，最后需要将处理后的装置在110度-120度的热板上聚合20-30分钟。这样处理后的装置可以在依靠装置上部的弹性气囊形成的负压条件下，将外面的液体上吸到流道中进行反应，气囊的体积优化后的大小在100-900微升之间。
实施例3：制备含有液体自吸式流道的装置
用注塑的工艺或者直接用3D打印的方式制备如图6所示的结构，所用的材料可以是各种适合注塑成型的材料，具体使用的是市售的聚乳酸粉末材料。注塑制备出上下两个零件(图7)，将图8的纤维素纸板(厚度为0.5毫米)安装在图7右侧图的下面底板的纸板槽中。其中图8的纸板在对应图7上下盖板的检测孔的位置有一个直径在3-6毫米的开孔，在这个位置用于安装玻璃纤维检测纸片，末端有一个预先沿着折叠线折叠的回折，在使用之前需要打开图7左侧零件末端的盖片，使这个纸片的回折暴露弹出来，用这个结构将测试样品的液体通过毛细作用牵引到测试装置中，在图8的3-6毫米的开孔的一边，还有一个1.5毫米开孔，用于和图7的结构匹配将检测纸板卡在装置中，不要发生随意的移动，这样的纸板在具体安装时下面承托一个PVC硬纸片，并在相应开孔的位置开孔。从这个位置到3-6毫米的开孔之间的纸板的区域预先经过如下的处理：首先配制40％DMSO溶液(v/v)，含有5％三氯乙酸(w/v)10毫升，在上述区域滴加10微升DMSO溶液，干燥，再次滴加10微升DMSO溶液，反复3次，不能将溶液吸收的外沿超过或者接触到图8中3-6毫米的开孔边缘的2毫米范围内。
实施例4：制备含加样孔以及相应流道的装置
制备图9所示的装置，其中流道的制备可以依据性价比选择纸流道或者PDMS流道。制作纸流道的步骤如下：使用纤维素纸板(厚度为0.5毫米)用切纸机制成图9流道的图案，其中在b的位置需要制成离断的结构，防止侧漏；a1，a2处用于搭接玻璃纤维素纸片形成检测区，c搭接上样孔处的样品垫，d为2个单独供电的加热电极。具体制备PDMS流道的步骤是；准确量取27g Dowconingsylgard 184硅胶，准确称量2.7g Dowconingsylgard Curing agent混合，脱气，覆盖金属流道模具，保持胶层深度在2.5-3.5mm，70℃交联3小时，切出芯片结构，用直径8mm的开孔器在相应位置开孔，制成样品孔和反应区孔；用直径4mm的开孔器在相应位置开孔，制成2个检测孔。用去离子水清洗胶块，超声处理60分钟，用经过0.01uml滤膜过滤的压缩空气吹干上盖板，连同处理好的PMMA底板一起放入等离子发生器用空气等离子处理90秒，用0.25MP的压力封接玻璃底板制成微流芯片。其中玻璃底板表面需要羟基化处理；具体为1、把玻璃切成35x25mm形状，放入盛有去离子水的烧杯中，切完后用封口膜封口；2、把步骤1中的烧杯超声处理10min；3、把步骤2中烧杯内的水倒掉，并再用去离子水冲洗2-3遍，洗完后把去离子水倒掉；4、向步骤3处理后的烧杯中加入适量乙醇(没过里面的玻璃片即可)，摇一下倒掉，然后再加入适量乙醇，超声处理10min；5、同步骤4，把乙醇换成丙酮；6、用N2将步骤5处理过的烧杯中的丙酮吹干；7、向经步骤6处理过的烧杯内加入H2SO4∶H2O2＝7∶3，先加H2SO4再加H2O2，加H2O2时要遍用玻璃棒搅拌遍加H2O2，这一步整个过程要带黄色橡胶手套；8、把加入硫酸和双氧水的烧杯放入到90-100℃的水浴或油浴中，加热1-2小时；9、待步骤8中浴液冷却致室温后，取出烧杯，将里面的酸液倒入指定的废液瓶中，不能倒在盛有有机溶液的废液瓶中，然后用去离子水冲洗烧杯内的玻璃片，同样冲后的酸液也倒在指定的废液瓶，直到烧杯内的去离子水成中性(用pH试纸测试)；10、用N2吹干经步骤9处理过的玻璃片，吹干后的玻璃片即可使用。
实施例5：制备反应载片
首先按照常规方法配制Al(i-PrO3)母液200毫升，分装后低温保存。具体为首先取2g(9.8mmol)的Al(i-PrO3)加入44.0mL(2.4mol)去离子水，室温下持续搅拌45-60min完全溶解，接着加入1.2mL(1.2mmol)的1M HCl后加热到90℃，反应10个小时，将反应完毕的混合物溶胶分装后低温保存。接下来再配制12mL氧化铝溶胶凝胶涂层液，具体成分为：50mM Tris-HCl(pH 7.0)，20mM CaCl2，120微升纳米金粒子(5-10nm，OD530＝1.0-3.0)以及2mL Al(i-PrO3)母液，取14厘米见方的AP40玻璃纤维纸一张，购自Millipore公司，所使用的玻纤纸的厚度为475um，重量105克/M2。均匀滴加所配制的12毫升凝胶液到纸片表面，待溶液完全吸附后，低温自然晾干，然后再在热板上120摄氏度处理20分钟。，在显微镜下看到的结构如图10。用打孔器制成直径5毫米的圆形片。
为了确定合适的涂层参数，又制备了的不同的系列玻纤载体纸片，具体的方法是：首先按照常规方法配制Al(i-PrO3)母液200毫升，分装保存。具体为首先取9.8mmol的Al(i-PrO3)加入2.4mol去离子水，室温下持续搅拌45-60min完全溶解，接着加入1.2mmol的1M HCl后加热到90℃，反应12个小时，将反应完毕的混合物溶胶分装后低温保存。
接下来再配制12mL氧化铝溶胶凝胶涂层液，具体成分为：50mM Tris-HCl(pH 7.0)，20mM CaCl2，120微升纳米金粒子(5-10nm，OD530＝1.0-3.0)以及具体到折合每一片玻纤纸片上的加载量为0.01，0.008，0.004，0.003，0.002，0.001微升的Al(i-PrO3)母液，分别取直径6毫米的玻纤纸片，所使用的玻纤纸的厚度为475um，重量105克/M2，均匀滴加所配制的凝胶液到纸片表面，待溶液完全吸附后，低温自然晾干，然后再在热板上120摄氏度处理20分钟。接下来，将前一个步骤制备好的载体片移入1毫升的离心管，对于每一个直径6毫米的圆形的处理好的载体片反复上样多轮20微升的PBS溶液，其中含有1毫克每毫升半胱氨酸，每一轮都在37度反应10分钟，然后加入10微升3mM DTDP室温反应30分钟加入100微升去离子水洗脱离心，读取在324nm的光吸收值。比较后确定在本实施例所披露的工艺条件下，选择涂层为80nm厚度比较稳定(图11)。
接下来的步骤包括了一些发生在载片上的巯基的还原，可以采取分步反应，也可以采取一步反应的策略。具体的操作步骤是在前面制备好的载体片取10片，移入到一个1毫升的离心管中，将离心管放置在一个250毫升的密闭的干燥器中，并放置4-5袋除氧型干燥剂，在离心管中加入200微升2％TBA，含有3微升的巯基乙醇，在干燥器中反应4-5小时，取出500rpm离心除去液体，干燥器中干燥后作为反应区的载片使用。
与前一个步骤类似的一个处理方法的调整为，取在前面制备好的载体片10片，移入到一个1毫升的离心管中，将离心管放置在一个250毫升的密闭的干燥器中，并放置4-5袋除氧型干燥剂，在离心管中加入200微升三氯乙酸(5％(w/v))/DMSO(40％(v/v))/去离子水(60％(v/v))，含有0.05μM MnCl2，在干燥器中干燥过夜后作为缓冲区的载片使用。
实施例6：制备反应载体微珠
首先第一个步骤是配制1％PVA分散液100毫升(pH 10.5，含0.1％SDS)；然后第二个步骤是配制PDMS胶液2毫升，具体为称量1.6毫升Sylgard 184 gel以及0.4毫升的Curing agent，混合充分后脱气30分钟，接下来的第三个步骤用30G的不锈钢注射器针头分散到首先配制好的PVA分散液中，控制包括分散液在内的整个系统的温度低于40度，搅拌速度为600转每分钟，胶液注入速度为20微升每分钟。最后待全部胶液分散到分散液后升高分散液的温度不低于80℃，500rpm持续搅拌聚合3个小时后3000转离心收集PDMS微珠(图12)，用步骤一制备的分散液淘洗3次保存。取出所制备的微珠一部分用95％的乙醇洗涤2次，然后移入500微升的甲醇(pH11.0)溶液，含有3％H2O2，以及0.1umol/L的MTS，37度反应30分钟；4000rpm离心弃去上清液，步骤一制备的分散液淘洗3次保存；接下来加入10微升3mM DTDP室温反应30分钟加入100微升去离子水洗脱离心收集上清液，读取在324nm的光吸收值。用以下公式计算固定到微珠表面的化合物所拥有的巯基的摩尔吸光系数。
Cysteine：Δε4-Thoil-Pyridone324＝(A324，30ulcys-A324，0ulcys)/(3.0×10-5M×1cm)
MTS：Δε4-Thoil-Pyridone324＝(A324，30ulcys-A324，0ulcys)/(3.0×10-5M×1cm)
MTSbeeds：Δε4-Thoil-Pyridone324＝(A324，30ulcys-A324，0ulcys)/(3.0×10-5M×1cm)
MTSchunck：Δε4-Thoil-Pyridone324＝(A324，30ucys-A324，0ulcys)/(3.0×10-5M×1cm)
接下来的步骤包括了一些发生在载片上的巯基的还原，可以采取分步反应，也可以采取一步反应的策略。完成前一个步骤后用FITC-GSH检查固定在微珠表面的巯基(图12)。具体的操作步骤是在前面制备好的载体片取10片，移入到一个1毫升的离心管中，将离心管放置在一个250毫升的密闭的干燥器中，并放置4-5袋除氧型干燥剂，在离心管中加入200微升2％TBA，含有3微升的巯基乙醇，在干燥器中反应4-5小时，取出500rpm离心除去液体，用1xPBS洗涤后使用。
实施例7：用微流芯片测定MDA的含量
任意选择一个在前面实施例中制备的微流芯片系统，具体的指定例如图9的一种结构说明后续的步骤，分别组装反应区，缓冲区，加样区后封合，制备这样的芯片40只供测试标准曲线以及志愿者提供的尿样；期中标准曲线的制备方法是：用1xPBS(pH7.25)作为溶剂配制MDA的标准液各1毫升，浓度分别为：0.0umol/L，1.5umol/L，4.0umol/L，8.0umol/L，16.0umol/L每次的测试方法都一样，具体是，在每一只芯片的上样孔加样70微升后，把芯片插入阅读器的插槽中读取数值，计算R2＝0.975(图14)。测定志愿者尿样的方法是：任意选择一个在前面实施例中制备的微流芯片系统，具体指定例如图7的一种结构说明后续的步骤，分别用前面实施例中制备的载片，结构等组装反应区，并在反应区所在的载片上添加折合到每一个载片的体积是5微升实施例6中制备的微珠到缓冲区，加样区后封合制备这样的芯片40只供测试标准曲线以及随即抽样的17名健康志愿者提供的尿样；期中标准曲线的制备方法是；用1xPBS(pH7.25)作为溶剂配制MDA的标准液各1毫升，浓度分别为；0.0umol/L，0.5umol/L，1.0umol/L，2.0umol/L，4.0umol/L，8.0umol/。每次的测试方法都一样，具体是，在每一只芯片的上样孔加样70微升后，把芯片插入阅读器的插槽中读取数值，正常人尿样的MDA浓度范围分布在0.71umol/L-2.96umol/L之间。
实施例8：用微流芯片测定2型糖尿病病人的MDA的含量
任意选择一个在前面实施例中制备的微流芯片系统，具体的指定例如图10的一种结构说明后续的步骤，分别组装反应区，缓冲区，加样区后封合，制备这样的芯片200只供测试标准曲线以及志愿者提供的尿样。对志愿者尿样的收集方法是：挑选20名确诊为2型糖尿病的病人，年龄分布在35周岁到55周岁之间，男性和女性的比例接近1∶1，其中10个人病历中没有任何1项关于以下的记录：1)视网膜水肿，视觉模糊；2)心律不齐，心电图异常，心梗历史；3)阳痿；4)动脉粥样硬化；5)有服用鱼油的习惯；6)牙齿脱落；7)下肢创伤和感染史；8)尿白蛋白或者尿糖阳性；9)晨间卧床心率>85次/分钟；10)夜尿明显增多，这10名病人组成complication(-)阴性组；另外10个人病历中至少有以上中的1项记录，这10名病人组成complication(+)阳性组。标准曲线的制备方法是：用1xPBS(pH7.25)作为溶剂配制MDA的标准液各1毫升，浓度分别为：0.0umol/L，1.0umol/L，2.0umol/L，4.0umol/L，8.0umol/。每次的测试方法都一样，具体是，在每一只芯片的上样孔加样75微升后，把芯片插入阅读器的插槽中读取数值。测试的结果为complication(-)阴性组MDA浓度为2.8 0.7umol/L，complication(+)阳性组MDA浓度为4.8 1.2umol/L(图16)。把complication(-)阴性组，complication(+)阳性组合并后的MDA浓度为3.8 1.4umol/L，与前面17名健康志愿者相比的结果1.8 0.8umol/L相比较直观显示为图17。

Claims (10)

1.本申请公开了可用于测定液体中丙二醛的方法，包括为此目的制备的PMMA三明治结构，PMMA-PDMS，PDMS-玻璃等微流芯片结构；也制备了可与之配套的反应基质、载体微珠，将反应底物固定到检测区的固相表面处理方法；用这样制作的微流芯片用于测定2型糖尿病病人尿样的丙二醛的含量。
2.权利要求1所涉及的是一种用于测定2型糖尿病人尿液丙二醛含量的微流芯片技术。
3.权利要求1所涉及的样品测试方法涉及到如何使用微流芯片测定尿液样品中丙二醛含量的技术路线。
4.根据权利要求1，权利要求2，权利要求3所述的，本申请提出的微流芯片技术路线区别于其它技术的特征在于被应用于2型糖尿病病人的尿液样品的丙二醛含量的检测。
5.根据权利要求4所述，微流芯片的材料包括PMMA，PDMS，玻璃，纳米金粒子等。
6.根据权利要求5所述，微流芯片的材料也可以是PMMA，PDMS，玻璃，纳米金粒子等的组合，不限于一种。
7.根据权利要求6所述，微流芯片结构部分的材料以及它们的组合中含有PDMS材料或者由PDMS制备的微珠等结构，以及玻璃或者由玻璃材料制备的玻璃纤维，以及纳米金粒子或者它们的组合，不限于一种。
8.根据权利要求8所述，装载于微流芯片中的最小的纳米金粒子的原子数为36，最大的粒子尺寸小于100纳米，其特征在于装载于微流芯片中的纳米金粒子可以为一种规格，也可以是多种规格的组合。
9.根据权利要求8所述，装载于微流芯片中的纳米金粒子与参与化学反应的至少一个必要的底物通过共价键的方式连接。
10.根据权利要求9所述，微流芯片里面所装载的纳米金粒子是通过凝胶-溶胶的涂层方式组装的，涂层的厚度在20纳米到100纳米的范围。
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