CN110849847A - 一种细胞膜损伤快速响应传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种细胞膜损伤快速响应传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞膜损伤快速响应传感器及其制备方法和应用，该制备包括：将盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺加入到缓冲液中，搅拌后溶液过滤透析得到聚多巴胺‑聚乙烯亚胺共聚物载体；将聚多巴胺‑聚乙烯亚胺共聚物载体与PBS、超纯水、量子点充分混合即得细胞膜损伤快速响应传感器。本发明通过一步法制备得到猝灭效应良好的聚多巴胺‑聚乙烯亚胺共聚物载体，通过静电作用吸附量子点并猝灭其荧光，形成传感器，传感器与细胞膜表面相互作用使量子点游离，瞬时产生荧光信号，当细胞损伤时，细胞膜表面化学物质改变，产生不同的荧光信号可反映细胞不同的损伤状态，为高通量毒性/活性成分筛选提供一种新工具和新方法。

Description

一种细胞膜损伤快速响应传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物传感领域，具体涉及一种细胞膜损伤快速响应传感器的及其制备方法及和应用。
背景技术
细胞是生物体结构和功能的基本单位，细胞膜是细胞的基本结构形式，是大多数细胞活动发生的结构。细胞膜不仅提供简单的屏障，对于细胞的识别与黏附，物质合成分解与运输，信息传递过程也起着重要作用。
细胞膜主要由脂质、蛋白质及糖组成，糖与脂或蛋白质结合形成糖脂或糖蛋白。当药物与细胞相互作用时，药物可诱导细胞膜上膜蛋白、膜脂或膜上其他物质的改变，导致细胞膜结构发生细微变化进而影响细胞活性。因此，细胞膜表面化学物质的变化可反细胞活力，探究细胞膜表面化学物质的变化对于阐明药物作用机制和毒性效应具有深远的意义。目前，基于细胞膜表面化学物质的变化检测细胞活力的方法主要分为两类。一是直接探究细胞膜表面特定化学物质的变化：此类方法主要应用于整合素、唾液酸以及细胞膜上一些酶或受体(如ATP酶、唾液酸酶、菱形蛋白酶、磷脂酰丝氨酸、Fas受体等)等细胞膜表面化学物质的含量测定以反映细胞活力；另一类方法是通过测量细胞表面电荷的变化间接反映细胞膜表面化学物质的变化，该类方法主要利用荧光探针、膜片钳以及细胞电泳等测定细胞膜表面电荷的变化，进而反映细胞活力。上述两类方法需要使用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、细胞电泳仪等昂贵的仪器或蛋白免疫印迹法、免疫荧光法等进行定性/定量分析，耗时较长，检测成本较高，且对于操作人员的专业知识有较高要求。因此，亟待发展一种快速，简便，高灵敏，低成本的基于细胞膜表面化学物质变化的药物毒性检测的新方法。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的繁琐耗时、灵敏度低、设备庞大、成本高等缺点，本发明提供了一种细胞膜损伤快速响应传感器的及其制备方法及和应用，本发明制备的传感器制备简单，反应条件温和，且成本低廉，易于批量制备，将所构建的传感器加入到细胞中可瞬时得到响应结果：细胞损伤后，细胞膜表面化学物质改变，产生不同的荧光信号，可反映细胞不同的损伤状态，为高通量毒性/活性成分筛选提供一种新工具和新方法。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种细胞膜损伤快速响应传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体的制备：将盐酸多巴胺(DA·HCl)和聚乙烯亚胺(PEI)加入到缓冲液中，在室温下避光搅拌；将搅拌后溶液过滤，然后透析以除去未反应的盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺得到聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体；
(2)传感器的构建：将聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体与PBS、超纯水、量子点MPA@CdSe/ZnS(QA)充分混合即得PDA-PEI-QD传感器，即为细胞膜损伤快速响应传感器。
其中，所述聚乙烯亚胺分子量为600Da-10kDa(M.W.)范围，盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺的质量比为1:1-1:10。
作为优选，所述聚乙烯亚胺的分子量为600Da-10kDa(M.W.)，盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺的质量比为1:1，二者的浓度均为1mg/mL。
其中，所述传感器的构建中总反应体系为PBS:超纯水体积比1:1-1:10，QD量子点与PDA-PEI的终浓度比为1:4-2:4。作为选优，PBS(pH＝7.4):超纯水＝1:1(v/v)，QD量子点的终浓度为5μg/mL，PDA-PEI的终浓度为20μg/mL。保证QD终浓度/PDA-PEI终浓度＝1:4。
作为优选，所述制备方法为：
(1)将Tris-HCl缓冲液用超纯水稀释备用；
(2)分别取盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺，将二者加入到Tris-HCl缓冲液中，在室温下磁力搅拌器上避光搅拌2-3h；
(3)将上述溶液用纤维素酯膜过滤，然后置于透析袋透析24-36h以除去未反应的盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺得到聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体；
(4)将聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体与PBS、超纯水、QD量子点MPA@CdSe/ZnS于充分混合即得PDA-PEI-QD传感器即为细胞膜损伤快速响应传感器。
进一步地，所述制备方法为：
(1)将100μL Tris-HCl(1M,pH 7.4)缓冲液用超纯水稀释至10mL备用；
(2)分别称取10mg盐酸多巴胺(DA·HCl)和10mg聚乙烯亚胺(PEI,M.W.600Da)，将二者加入到10mL Tris-HCl缓冲液中，在室温下磁力搅拌器上避光搅拌2h；
(3)将上述溶液用0.22μm纤维素酯膜过滤，然后置于透析袋(分子量截止1000Da)透析24h以除去未反应的DA和PEI得到聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体；；
(4)将聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体与PBS(pH＝7.4)、超纯水、QD量子点MPA@CdSe/ZnS于充分混合即得PDA-PEI-QD传感器即为细胞膜损伤快速响应传感器。
本发明所述的细胞膜损伤快速响应传感器的制备方法所制备的细胞膜损伤快速响应传感器。
本发明所述的细胞膜损伤快速响应传感器的制备方法所制备的细胞膜损伤快速响应传感器在制备监测细胞膜结构和功能的完整性、评价细胞活力或药物毒性/活性的工具和试剂中的应用。
本发明的细胞膜损伤快速响应传感器的制备方法所制备的细胞膜损伤快速响应传感器在制备评价药物防治细胞膜损伤、筛选防护细胞损伤、分析中药疗效配伍改善细胞膜损伤或分析药物对细胞损伤的作用机制的工具和试剂中的应用。
其中，所述应用方法为：将潜在毒性药物与细胞孵育一定时间后，药物可诱导细胞膜表面化学物质改变，从而对细胞膜产生不同程度的损伤，加入所构建的传感器，根据传感器的荧光响应，快速检测药物对细胞的毒性；将毒性药物与细胞孵育造模后，药物对细胞膜产生不同程度的损伤，加入潜在的活性成分保护，根据传感器的荧光响应，快速筛选活性成分对细胞的保护。本发明传感器在细胞活力监测、药物毒性/活性评价以及在药物防治、疗效配伍、药物作用机理等方面具有广泛的应用。
本发明细胞膜损伤传感器在细胞活力监测中的应用，细胞为L-02细胞，所用的药物包括对乙酰氨基酚、萘普生、舒林酸、尼美舒利、异烟肼、利福平、对氨基水杨酸、L-环丝氨酸、硫酸链霉素、吡嗪酰胺、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺等。
本发明的原理阐述如下：
PDA-PEI共聚物载体的制备是由于DA在常氧条件下先被氧化为多巴醌，再经过环化、氧化、重排反应形成邻二羟基吲哚，吲哚环自聚合形成PDA；加入的PEI通过迈克尔加成和席夫碱反应接枝到PDA上，此外PEI亦可促进DA均相聚合为PDA，形成具有良好猝灭效应的PDA-PEI共聚物。
传感器的构建原理是正电荷的PDA-PEI通过静电吸附作用与带负电荷的QD结合形成PDA-PEI-QD传感器。由于PDA-PEI与QD间的荧光共振能量转移(FRET)效应，QD的荧光呈现一定程度的猝灭(图4)。
细胞接板后，给药孵育一定时间，药物可诱导细胞膜表面的化学物质发生改变。弃去含药培养基，加入所构建的传感器，传感器与细胞膜表面化学物质相互作用使QD游离，瞬时产生荧光信号。当细胞损伤时，细胞膜表面化学物质改变，产生不同的荧光信号，可通过荧光信号的变化反映细胞不同的损伤状态(图1)。
本发明所述的QD荧光数值是采用荧光酶标仪读取。
具体的，本发明提供了一种基于细胞膜损伤快速响应的传感器，该传感器制备简单，反应条件温和，且成本低廉，易于批量制备。将所构建的传感器加入到细胞中可瞬时得到响应结果：细胞损伤后，细胞膜表面化学物质改变，产生不同的荧光信号，可反映细胞不同的损伤状态，为高通量毒性/活性成分筛选提供一种新方法。本发明应用范围极为广泛，不仅可用于药物毒性评价，也可根据药物与细胞膜的相互作用，在药物活性评价、细胞活力监测、药物防治、疗效配伍和药物作用机理等方面具有广泛的应用。
本发明构建的细胞膜损伤快速响应传感器为一种细胞活力监测传感器，但其作用机制是基于细胞膜的变化来反映细胞活力的，而细胞膜上微观物质的变化可根据本发明所构建的传感器的荧光信号的差异来反映。而快速响应是将传感器加入到96孔板中立刻扫荧光就可得到结果，不需要传感器与细胞长时间孵育，即传感器加入细胞中后，反应就可瞬时完成，实现快速检测。就细胞而言，所构建的传感器是一种细胞活力监测传感器；就药物而言，可判断药物对细胞的作用疗效或机制是否通过改变细胞膜上的微观物质而起效，进而该传感器可判断药物对细胞的损伤/保护机制。具体包括的功能监测细胞膜结构和功能的完整性，细胞活力或药物毒性/活性评价，评价药物防治细胞膜损伤、中药疗效配伍改善细胞膜损伤或阐明药物对细胞损伤的作用机制。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供了一种细胞膜损伤快速响应传感器及其制备方法。本发明传感器制备方法简单，反应条件温和，且成本低廉、易于批量制备。将本发明制备的传感器加入到细胞中可瞬时得到荧光信号，该方法与经典细胞活力的测定方法MTT比较，可实现快速检测，即加入传感器后即可瞬时检测荧光，简便快速准确。更重要的是，本发明应用范围极为广泛，不仅可用于监测细胞活力，也可用于药物毒性/活性评价、药物防治、疗效配伍和药物作用机理等方面的研究。此外，本发明所构建的传感器瞬时响应、制备简单等特点为药物的高通量毒性/活性成分筛选提供了一种新工具和新方法。
本发明通过一步法制备得到猝灭效应良好的聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体，通过静电作用吸附量子点(QD)并猝灭其荧光，形成PDA-PEI-QD传感器。传感器与细胞膜表面相互作用使QD游离，瞬时产生荧光信号。当细胞损伤时，细胞膜表面化学物质改变，产生不同的荧光信号可反映细胞不同的损伤状态。本发明所制备的传感器在细胞活力监测和药物毒性/活性评价等方面具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明检测原理示意图；
图2为实施1制备得到的PDA-PEI载体溶液反应前后颜色变化图；
图3为实施1制备得到的PDA-PEI载体的透射电子显微镜图；
图4为实施1得到的传感器的制备原理图；
图5为实施1得到的传感器与细胞相互作用快速响应的荧光变化图；
图6为实施1制备得到的PDA-PEI、QD、PDA-PEI-QD传感器的荧光变化图；
图7为实施1制备得到的传感器的生物相容性图；
图8为实施1所得的传感器对对乙酰氨基酚细胞活力评估图与MTT的测量结果；
图9为实施1所得的传感器对萘普生细胞活力评估图与MTT的测量结果；
图10为实施1所得的传感器对舒林酸细胞活力评估图与MTT的测量结果；
图11为实施1所得的传感器对尼美舒利细胞活力评估图与MTT的测量结果；
图12为实施1所得的传感器对异烟肼细胞活力评估图与MTT的测量结果；
图13为实施1所得的传感器对利福平细胞活力评估图与MTT的测量结果；
图14为实施1所得的传感器对对氨基水杨酸细胞活力评估图与MTT的测量结果；
图15为实施1所得的传感器对L-环丝氨酸细胞活力评估图与MTT的测量结果；
图16为实施1所得的传感器对硫酸链霉素细胞活力评估图与MTT的测量结果；
图17为实施1所得的传感器对吡嗪酰胺细胞活力评估图与MTT的测量结果；
图18为实施1所得的传感器对乙硫异烟胺细胞活力评估图与MTT的测量结果；
图19为实施1所得的传感器对丙硫异烟胺细胞活力评估图与MTT的测量结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
以下实施例中，荧光数值读取所用的荧光酶标仪型号为Thermo FisherScientific Oy 3001；紫外吸收数值读取所用的酶标仪型号为美国BioTek公司；Zeta电位的测定采用Malvern Zeta sizer-Nano Z instrument测得；透射电子显微镜对PDA-PE的测定是采用JEOL JEM-200CX仪器在加速电压为200kV测得；盐酸多巴胺购自索莱宝科技有限公司；聚乙烯亚胺购自麦克林生化科技有限公司(M.W.600Da/1800Da/10kDa)；QD(MPA@CdSe/ZnS)购自星紫(上海)新材料技术开发有限公司；Tris-HCl(1M,pH 7.4)购自索莱宝科技有限公司；MTT粉末购自南京凯基生物科技发展有限公司。
实施例1
PDA-PEI-QD传感器的构建以及合成成功的验证
1、PDA-PEI载体的制备
(1)将100μL Tris-HCl(1M，pH 7.4)缓冲液用超纯水稀释至10mL备用；
(2)分别称取10mg的盐酸多巴胺(DA·HCl)粉末和10mg聚乙烯亚胺(PEI,M.W.600Da)，将二者加入到10mL Tris-HCl缓冲液中，在室温下磁力搅拌器上避光搅拌2h；
(3)将上述溶液用0.22μm纤维素酯膜过滤，然后置于透析袋(分子量截止1000Da)透析24h以除去未反应的DA和PEI，得到聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体；。
在PDA-PEI制备过程中，通过反应前后的颜色变化以及透射电子显微镜图验证PDA-PEI载体的成功制备。
图2给出了为实施1制备得到的PDA-PEI载体的溶液反应前后颜色变化图；图3是为实施1制备得到的PDA-PEI载体的透射电子显微镜图。由图2可知，在反应前，DA溶液和PEI溶液均是澄清透明的，PDA-PEI制成后溶液变为棕褐色，表明PDA-PEI载体成功制备。图3通过透射电子显微镜对所制备的PDA-PEI载体的形状进行表征，由图3可知，形成的PDA-PEI载体呈球形，大小均一，分布均匀，表明成功制备载体PDA-PEI即聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体。
2、细胞膜损伤快速响应传感器：PDA-PEI-QD传感器的构建
将所制备的PDA-PEI共聚物载体与PBS(pH＝7.4)、超纯水、QD于振荡器上充分混合即得PDA-PEI-QD传感器。传感器的构建方法中总反应体系为PBS(pH＝7.4):超纯水＝1:1(v/v)，QD的终浓度为5μg/mL，PDA-PEI的终浓度为20μg/mL。
图4给出了PDA-PEI-QD传感器的制备原理图。由图4可知，传感器的构建是正电荷的PDA-PEI载体通过静电吸附作用与带负电荷的QD结合形成PDA-PEI-QD传感器。由于PDA-PEI与QD间的FRET效应，QD的荧光被猝灭。
通过测量QD结合前后的荧光变化表征传感器的构建。图6给出了为实施1制备得到的PDA-PEI、QD、PDA-PEI-QD传感器的荧光变化图；由图6可知，QD的荧光强度为241.5±19.0，结合为PDA-PEI-QD传感器后，荧光强度变为9.3±0.24，表明结合后QD荧光被有效猝灭，PDA-PEI-QD传感器成功构建。
实施例2
传感器的生物相容性实验
1、传感器的制备过程和实施例1一致；
2、考察传感器对细胞的生物相容性，利用MTT法研究PDA-PEI载体、QD和传感器对L-02细胞的细胞毒性。包括以下步骤：
(1)细胞铺板：L-02细胞以每孔5×103个细胞接种96孔板中，其中每孔200μL含体积分数10％FBS的DMEM不完全高糖培养液(边缘孔用无菌pH＝7.4的PBS填充)，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
(2)给药：设置4个组别，对照组(只含PBS和水，含PBS(pH＝7.4):H2O＝1:1(v/v))、PDA-PEI组(终浓度为20μg/mL)、QD组(终浓度为5μg/mL)和传感器组(构建时对应的QD的终浓度为5μg/mL，PDA-PEI的终浓度为20μg/mL，实施例1)，4组的体系均为PBS(pH＝7.4):H2O＝1:1(v/v)。弃去培养液后，分别加入200μL PDA-PEI、QD和传感器，于37℃孵育20min；
(3)给MTT：孵育结束，吸掉培养基，在每个孔中分别加入200μL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液(5mg/mL的MTT储备液用不含FBS的培养基稀释10倍制得)，37℃下孵育4h；
(4)给DMSO：吸掉MTT溶液，每孔加入150μL DMSO溶解Formazan晶体，振摇10min；
(5)读值并计算：将96孔板放置在酶标仪上，分别读取每个孔中溶液在570nm和650nm波长处的吸光度值。将细胞活力评价为：细胞存活率(％)＝(OD1-OD2)/(OD3-OD2)×100，其中OD1、OD2和OD3分别代表给药组的OD值，空白组的OD值和对照组的OD值。
图7给出了PDA-PEI载体、QD和传感器与L-02细胞孵育后细胞活力值。
由图7可知，孵育20min后，对照组、PDA-PEI组、QD组和传感器组的细胞活力平均值分别为1.06±0.057、1.09±0.015、0.90±0.007、1.04±0.023，四组的细胞活力值均在80％以上，说明PDA-PEI载体、QD和传感器的细胞毒性低，生物相容性良好。
实施例3
给药对乙酰氨基酚，与经典MTT对比，考察传感器对细胞活力的评估
1、传感器的制备过程和实施例1一致；
2、利用MTT法研究对乙酰氨基酚对L-02细胞的细胞毒性。包括以下步骤：
(1)细胞铺板：将L-02细胞以每孔5×103个细胞接种96孔板中，其中每孔200μL含体积分数10％FBS的DMEM不完全高糖培养液(边缘孔用无菌pH＝7.4的PBS填充)，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
(2)给药：吸掉培养液后，分别加入200μL不同浓度梯度(0、2、5、10、20、30、50、80mM)的对乙酰氨基酚溶液(用不含FBS的不完全培养基溶解)于37℃孵育24h，倒置显微镜下观察细胞形态确保细胞生长状态良好；
(3)给MTT：孵育结束吸掉培养基后，在每个孔中分别加入200μL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液(5mg/mL的MTT储备液用不含FBS的培养基稀释10倍制得)，37℃下孵育4h；
(4)给DMSO：吸掉MTT溶液，每孔加入150μL DMSO溶解Formazan晶体，振摇10min；
(5)读值并计算：将96孔板放置在酶标仪上，分别读取每个孔中溶液在570nm和650nm波长处的吸光度值。将细胞活力评价为：细胞存活率(％)＝(OD1-OD2)/(OD3-OD2)×100，其中OD1、OD2和OD3分别代表给药组的OD值，空白组的OD值和对照组的OD值。
(6)绘图：以对乙酰氨基酚给药浓度的Log C值为横坐标，以不同给药浓度对应的细胞活力为纵坐标，绘制对乙酰氨基酚的细胞活力图。
图8A给出了利用MTT法测量对乙酰氨基酚的细胞活力图。
由图8A可知，随着对乙酰氨基酚给药浓度的增加，细胞损伤程度增加，细胞活力逐渐下降，计算得到对乙酰氨基酚的IC50＝21.57mM。
3、利用本发明所构建的传感器研究对乙酰氨基酚对L-02细胞的细胞毒性。包括以下步骤：
(1)细胞铺板：将L-02细胞以每孔5×103个细胞接种96孔板中，其中每孔200μL含体积分数10％FBS的DMEM不完全高糖培养液(边缘孔用无菌pH＝7.4的PBS填充)，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
(2)给药：吸掉培养液后，分别加入200μL不同浓度梯度(0、0.2、0.4、0.8、1、2、5、10、20、30、50、80mM)的对乙酰氨基酚溶液(用不含FBS的不完全培养基溶解)继续于37℃孵育24h，倒置显微镜下观察细胞形态确保细胞生长状态良好；
(3)给传感器：吸掉含药培养液后，每孔加入200μL的传感器。
(4)读取荧光数值并计算：加入传感器后，立即将96孔板放置于荧光酶标仪上，设置激发波长为230nm，发射波长为515nm，带宽为5nm，扫板获取传感器与细胞膜相互作用后释放QD的荧光数值。将细胞活力评价为：细胞存活率(％)＝(F1-F2)/(F3-F2)×100，其中F1代表给药组的荧光值，F2代表空白组的荧光值，F3代表对照组的荧光值。
(5)绘图：以对乙酰氨基酚给药浓度的Log C值为横坐标，以各种给药浓度对应的传感器测量的细胞活力为纵坐标，绘制对乙酰氨基酚的细胞活力图。
图8B给出了利用传感器探究对乙酰氨基酚给药后的细胞活力图。
由图8B可知，随着对乙酰氨基酚给药浓度的增加，细胞损伤程度增加，细胞活力下降，传感器测得的荧光数值随着细胞活力的下降呈下降趋势，即传感器的荧光变化与细胞活力的变化呈正相关关系。根据本发明所制备的传感器探究对乙酰氨基酚给药后的细胞活力为IC50＝21.08mM。
对乙酰氨基酚给药后，由MTT测得的IC50和由传感器评估的IC50基本一致，说明传感器的荧光变化是细胞活力的反映，并且可实现快速检测。
图5给出了传感器在加入细胞前和加入细胞后其荧光的瞬时响应变化图。
由图5可知，传感器在加入细胞前，有一定的荧光信号，加入到不同损伤细胞后，荧光信号立刻随着损伤程度的不同而发生变化，表明方法的快速响应。在加入到对照组(未给药APAP)细胞后，立刻测荧光，荧光信号有微弱的增加，这是因为对照组细胞的细胞表面物质与模型组相比，与传感器竞争量子点的能力更强，有更多量子点游离；而模型组(给药APAP的浓度为10mM和20mM)由于给药，细胞受到一定损伤，细胞表面化学物质发生改变，其与传感器竞争量子点的能力减小，故荧光信号减少。
实施例4
给药萘普生，与经典MTT对比，考察传感器对细胞活力的评估
给药萘普生后，用MTT法测量细胞活力，并应用本发明实施例1所构建的传感器进一步评估萘普生的细胞活力，所需的仪器、步骤与实施例3一致，只是给药类别由对乙酰氨基酚换为萘普生，给药浓度梯度设为0、0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、4、8、16、32mM。
图9A给出了利用MTT法测量萘普生的细胞活力图，图9B给出了传感器评估萘普生的细胞活力图。
由图9A可知，由MTT法得到的萘普生的IC50＝1.931mM，图9B可知，由传感器的荧光变化得到的萘普生的IC50＝1.988mM。二者所测得的萘普生的IC50基本一致，进一步说明传感器的荧光变化是细胞活力的反映。
实施例5
给药舒林酸，与经典MTT对比，考察传感器对细胞活力的评估
给药舒林酸后，用MTT法测量细胞活力，并应用本发明实施例1所构建的传感器进一步评估舒林酸的细胞活力，所需的仪器、步骤与实施例3一致，只是给药类别由对乙酰氨基酚换为舒林酸，使用MTT法测量的给药浓度梯度设为0、0.1、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128mM，使用本发明所构建方法的给药浓度梯度设为0、0.1、1、4、32、128mM。
图10A给出了利用MTT法测量舒林酸的细胞活力图，图10B给出了传感器评估舒林酸的细胞活力图。
由图10A可知，由MTT法得到的舒林酸的IC50＝3.011mM，图10B可知，由传感器的荧光变化得到的舒林酸的IC50＝4.537mM。二者所测得的舒林酸的IC50基本一致，进一步说明传感器的荧光变化是细胞活力的反映。
实施例6
给药尼美舒利，与经典MTT对比，考察传感器对细胞活力的评估
给药尼美舒利后，用MTT法测量细胞活力，并应用本发明实施例1所构建的传感器进一步评估尼美舒利的细胞活力，所需的仪器、步骤与实施例3一致，只是给药类别由对乙酰氨基酚换为尼美舒利，使用MTT法测量的给药浓度梯度设为0、0.1、0.5、1、4、8、32、64mM，使用本发明所构建方法的给药浓度梯度设为0、0.1、1、4、8、32、128mM。
图11A给出了利用MTT法测量尼美舒利的细胞活力图，图11B给出了传感器评估尼美舒利的细胞活力图。
由图11A可知，由MTT法得到的尼美舒利的IC50＝12.34mM，图11B可知，由传感器的荧光变化得到的尼美舒利的IC50＝21.13mM。二者所测得的尼美舒利的IC50相差不大，基本可说明传感器的荧光变化是细胞活力的反映。
实施例7
给药异烟肼，与经典MTT对比，考察传感器对细胞活力的评估
给药异烟肼后，用MTT法测量细胞活力，并应用本发明实施例1所构建的传感器进一步评估异烟肼的细胞活力，所需的仪器、步骤与实施例3一致，只是给药类别由对乙酰氨基酚换为异烟肼，给药浓度梯度设为0、0.08、0.2、0.4、1、2、5、10、25、50、125mM。
图12A给出了利用MTT法测量异烟肼的细胞活力图，图12B给出了传感器评估异烟肼的细胞活力图。
由图12A可知，由MTT法得到的异烟肼的IC50＝13.59mM，图12B可知，由传感器的荧光变化得到的异烟肼的IC50＝14.32mM。二者所测得的异烟肼的IC50基本一致，进一步说明传感器的荧光变化是细胞活力的反映。
实施例8
给药利福平，与经典MTT对比，考察传感器对细胞活力的评估
给药利福平后，用MTT法测量细胞活力，并应用本发明实施例1所构建的传感器进一步评估利福平的细胞活力，所需的仪器、步骤与实施例3一致，只是给药类别由对乙酰氨基酚换为利福平，给药浓度梯度设为0、0.04、0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、4、5mM。
图13A给出了利用MTT法测量利福平的细胞活力图，图13B给出了传感器评估利福平的细胞活力图。
由图13A可知，由MTT法得到的利福平的IC50＝0.5762mM，图13B可知，由传感器的荧光变化得到的利福平的IC50＝0.5720mM。二者所测得的利福平的IC50基本一致，进一步说明传感器的荧光变化是细胞活力的反映。
实施例9
给药对氨基水杨酸，与经典MTT对比，考察传感器对细胞活力的评估
给药对氨基水杨酸后，用MTT法测量细胞活力，并应用本发明实施例1所构建的传感器进一步评估对氨基水杨酸的细胞活力，所需的仪器、步骤与实施例3一致，只是给药类别由对乙酰氨基酚换为对氨基水杨酸，使用MTT法测量的给药浓度梯度设为0、0.08、0.4、2、5、10、20、30mM，使用本发明所构建方法的给药浓度梯度设为0、0.08、0.4、2、5、10、20、30、45mM。
图14A给出了利用MTT法测量对氨基水杨酸的细胞活力图，图14B给出了传感器评估对氨基水杨酸的细胞活力图。
由图14A可知，由MTT法得到的对氨基水杨酸的IC50＝9.875mM，图14B可知，由传感器的荧光变化得到的对氨基水杨酸的IC50＝16.06mM。二者所测得的对氨基水杨酸的IC50相差不大，基本可说明传感器的荧光变化是细胞活力的反映。
实施例10
给药L-环丝氨酸，与经典MTT对比，考察传感器对细胞活力的评估
给药L-环丝氨酸后，用MTT法测量细胞活力，并应用本发明实施例1所构建的传感器进一步评估L-环丝氨酸的细胞活力，所需的仪器、步骤与实施例3一致，只是给药类别由对乙酰氨基酚换为L-环丝氨酸，使用MTT法测量的给药浓度梯度设为0、0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、4、8、25、50、80mM，使用本发明所构建方法的给药浓度梯度设为0、0.001、0.01、0.1、1、2、4、8、25、80mM。
图15A给出了利用MTT法测量L-环丝氨酸的细胞活力图，图15B给出了传感器评估L-环丝氨酸的细胞活力图。
由图15A可知，由MTT法得到的L-环丝氨酸的IC50＝3.18mM，图15B可知，由传感器的荧光变化得到的L-环丝氨酸的IC50＝14.47mM。二者所测得的L-环丝氨酸的IC50相差不大，基本可说明传感器的荧光变化是细胞活力的反映。
实施例11
给药硫酸链霉素，与经典MTT对比，考察传感器对细胞活力的评估
给药硫酸链霉素后，用MTT法测量细胞活力，并应用本发明实施例1所构建的传感器进一步评估硫酸链霉素的细胞活力，所需的仪器、步骤与实施例3一致，只是给药类别由对乙酰氨基酚换为硫酸链霉素，使用MTT法测量的给药浓度梯度设为0、1、4、8、16、24、32、64、128、256、512mM，使用本发明所构建方法的给药浓度梯度设为0、1、5、10、25、128、512mM。
图16A给出了利用MTT法测量硫酸链霉素的细胞活力图，图16B给出了传感器评估硫酸链霉素的细胞活力图。
由图16A可知，由MTT法得到的硫酸链霉素的IC50＝50.53mM，图16B可知，由传感器的荧光变化得到的硫酸链霉素的IC50＝78.37mM。二者所测得的硫酸链霉素的IC50相差不大，基本可说明传感器的荧光变化是细胞活力的反映。
实施例12
给药吡嗪酰胺，与经典MTT对比，考察传感器对细胞活力的评估
给药吡嗪酰胺后，用MTT法测量细胞活力，并应用本发明实施例1所构建的传感器进一步评估吡嗪酰胺的细胞活力，所需的仪器、步骤与实施3一致，只是给药类别由对乙酰氨基酚换吡嗪酰胺，使用MTT法测量的给药浓度梯度设为0、0.05、0.5、1、5、10、20、50、100、150mM，使用本发明所构建方法的给药浓度梯度设为0、0.05、1、5、20、50、100、150、200mM。
图17A给出了利用MTT法测量吡嗪酰胺的细胞活力图，图17B给出了传感器评估吡嗪酰胺的细胞活力图。
由图17A可知，由MTT法得到的吡嗪酰胺的IC50＝65.13mM，图17B可知，由传感器的荧光变化得到的吡嗪酰胺的IC50＝66.37mM。二者所测得的吡嗪酰胺的IC50基本一致，进一步说明传感器的荧光变化是细胞活力的反映。
实施例13
给药乙硫异烟胺，与经典MTT对比，考察传感器对细胞活力的评估
给药乙硫异烟胺后，用MTT法测量细胞活力，并应用本发明实施例1所构建的传感器进一步评估乙硫异烟胺的细胞活力，所需的仪器、步骤与实施3一致，只是给药类别由对乙酰氨基酚换为乙硫异烟胺，使用MTT法测量的给药浓度梯度设为0、0.1、0.5、1、5、10、25、50mM，使用本发明所构建方法的给药浓度梯度设为0、0.1、1、2、4、8、12、16、32、64mM。
图18A给出了利用MTT法测量乙硫异烟胺的细胞活力图，图18B给出了传感器评估乙硫异烟胺的细胞活力图。
由图18A可知，由MTT法得到的乙硫异烟胺的IC50＝4.201mM，图18B可知，由传感器的荧光变化得到的乙硫异烟胺的IC50＝10.03mM。二者所测得的乙硫异烟胺的IC50相差不大，基本可说明传感器的荧光变化是细胞活力的反映。
实施例14
给药丙硫异烟胺，与经典MTT对比，考察传感器对细胞活力的评估
给药丙硫异烟胺后，用MTT法测量细胞活力，并应用本发明实施例1所构建的传感器进一步评估丙硫异烟胺的细胞活力，所需的仪器、步骤与实施例3一致，只是给药类别由对乙酰氨基酚换为丙硫异烟胺，使用MTT法测量的给药浓度梯度设为0、0.1、0.5、1、5、10、25、50mM，使用本发明所构建方法的给药浓度梯度设为0、0.1、1、2、4、8、12、16、32、64mM。
图19A给出了利用MTT法测量丙硫异烟胺的细胞活力图，图19B给出了传感器评估丙硫异烟胺的细胞活力图。
由图19A可知，由MTT法得到的丙硫异烟胺的IC50＝7.093mM，图19B可知，由传感器的荧光变化得到的丙硫异烟胺的IC50＝8.418mM。二者所测得的丙硫异烟胺的IC50基本一致，进一步说明传感器的荧光变化是细胞活力的反映。
综上所述，本发明对细胞活力的测定值与传统的MTT测量值相近，但比MTT耗时更短，这种瞬时响应的特点为药物的高通量毒性/活性成分筛选提供了一种新工具和新方法。此外，根据传感器与细胞膜的相互作用，本发明不仅可应用于细胞活力监测，还可在用于药物毒性/活性评价、药物防治、疗效配伍、药物作用机理等方面的研究。本发明利用传感器与细胞膜的相互作用，传感器加入到含细胞的孔中即可立刻检测，时间基本少于1分钟，因此传感器不可能进入细胞内与细胞相互作用，而是直接与细胞表面相互作用。通过传感器荧光信号的变化反映细胞膜的变化，再通过细胞膜的变化反映细胞活力的变化。本发明构建的传感器是通过载体PDA-PEI(带正电)与量子点(负电)通过正负电的静电作用结合，该传感器中的PDA-PEI载体可与细胞膜上带负电的结构域结合，而自身把带负电的量子点竞争下去，实现荧光信号的变化。
实施例15
实施例15与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺的质量比为1:10，聚乙烯亚胺(PEI,M.W.1800Da)或者采用聚乙烯亚胺(PEI,M.W.10k Da)，避光搅拌3h，透析36h；传感器的构建中总反应体系为PBS超纯水体积比1:10，QD量子点与PDA-PEI的终浓度比为2:4。

Claims (9)

1.一种细胞膜损伤快速响应传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体的制备：将盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺加入到缓冲液中，在室温下避光搅拌；将搅拌后溶液过滤，然后透析以除去未反应的盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺得到聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体；
(2)传感器的构建：将聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体与PBS、超纯水、量子点MPA@CdSe/ZnS(QD)充分混合即得PDA-PEI-QD传感器，即为细胞膜损伤快速响应传感器。
2.根据权利要求1所述的细胞膜损伤快速响应传感器的制备方法，其特征在于，所述盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺的质量比优选为1:1-1:10。
3.根据权利要求1所述的细胞膜损伤快速响应传感器的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的重均分子量为600Da-10kDa。
4.根据权利要求1所述的细胞膜损伤快速响应传感器的制备方法，其特征在于，所述传感器的构建中总反应体系为PBS与超纯水体积比1:1-1:10，QD量子点与PDA-PEI的终浓度比为1:4-2:4。
5.根据权利要求1所述的细胞膜损伤快速响应传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
(1)将Tris-HCl缓冲液用超纯水稀释备用；
(2)分别取盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺，将二者加入到Tris-HCl缓冲液中，在室温下磁力搅拌器上避光搅拌2-3h；
(3)将上述溶液用纤维素酯膜过滤，然后置于透析袋透析24-36h以除去未反应的盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺得到聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体；
(4)将聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体与PBS、超纯水、QD量子点MPA@CdSe/ZnS于充分混合即得PDA-PEI-QD传感器即为细胞膜损伤快速响应传感器。
6.一种权利要求1所述的细胞膜损伤快速响应传感器的制备方法所制备的细胞膜损伤快速响应传感器。
7.一种权利要求1所述的细胞膜损伤快速响应传感器的制备方法所制备的细胞膜损伤快速响应传感器在制备监测细胞膜结构和功能的完整性、评价细胞活力或药物毒性/活性的工具和试剂中的应用。
8.一种权利要求1所述的细胞膜损伤快速响应传感器的制备方法所制备的细胞膜损伤快速响应传感器在制备评价药物防治细胞膜损伤、筛选防护细胞损伤、分析中药疗效配伍改善细胞膜损伤或分析药物对细胞损伤的作用机制的工具和试剂中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述应用方法为：将潜在毒性药物与细胞孵育一定时间后，药物可诱导细胞膜表面化学物质改变，从而对细胞膜产生不同程度的损伤，加入所构建的传感器，根据传感器的荧光响应，快速检测药物对细胞的毒性；将毒性药物与细胞孵育造模后，药物对细胞膜产生不同程度的损伤，加入潜在的活性成分保护，根据传感器的荧光响应，快速筛选活性成分对细胞的保护。
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