CN111961343A - 瞬时识别药物诱导hk-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

瞬时识别药物诱导hk-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种瞬时识别药物诱导HK‑2细胞损伤的阵列传感器的制备方法及其应用，其制备方法包括：将盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺加入缓冲液中，混匀搅拌，过滤透析得到猝灭效应优良的聚多巴胺‑聚乙烯亚胺共聚物载体；其可通过静电作用吸附三种不同发射波长的QDs并猝灭其荧光，形成多通道传感器。不同肾毒性药物作用于细胞，细胞膜表面物质改变，诱导传感器QDs游离，形成特征荧光指纹图谱，借助多元统计方法，快速识别药物损伤机制。基于药物损伤的时‑效关系，检测不同时间的荧光信号，绘制动态荧光指纹，进一步实现药物诱导肾细胞损伤的精准分型。该传感器为快速探究药物的肾毒性机制提供一种新工具和新方法。

Description

瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法及 其应用
技术领域
本发明属于生物传感领域，涉及瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法及其应用，具体是涉及一种基于荧光指纹图谱瞬时识别不同药物诱导HK-2细胞损伤的多通道传感器的制备方法及其应用。
背景技术
药源性肾损伤是指药物引起的肾脏结构或功能异常，主要表现为急性肾小管坏死，急性间质性肾炎和渗透性肾病。许多药物经肾脏代谢或排泄，容易蓄积在肾脏进而损伤肾小球，肾小管或肾基底膜。此外，部分药物能够引起短时间内双侧肾脏滤过功能急剧下降，使体内毒物蓄积，严重可能导致急性肾功能衰竭。研究表明，肾毒性药物导致19％-25％的重症患者中出现急性肾功能衰竭，很有可能导致慢性肾病或终末期肾病。不同肾毒性药物导致的肾损伤作用机制复杂，如氨基糖苷类药物可以通过损伤线粒体和溶酶体功能，干扰肾小管运输，造成肾小管细胞毒性反应，进而导致肾小管上皮细胞坏死；磺胺类抗生素本身或代谢产物易在肾内组织中形成结晶，沉积于远端肾小管管腔内，阻塞尿流，激发间质反应，引起起阻塞性肾病；免疫抑制剂类药物通过影响肾脏血管、血流动力学改变致肾脏缺血性损伤。因此，不同药物可通过不同作用途径导致肾功能的损伤，为临床肾损伤的诊断带来了巨大挑战，严重影响临床前安全评估和临床治疗，进一步阻碍了不同药物诱导肾毒性的精准治疗。
细胞是生物体结构和功能的基本单位。细胞膜是细胞的基本结构，不仅充当细胞屏障，而且发挥着物质转运，识别和传递信息的功能。细胞膜主要由脂质，蛋白质和糖类组成，其中碳水化合物可以与脂质或蛋白质结合形成糖脂或糖蛋白，这些糖脂或糖蛋白解离可诱导膜表面电荷的变化，因为这些膜成分包含氨基，羧基，羟基等。因此当细胞受到外部刺激时，细胞表面电荷会发生改变。因此，基于细胞表面电荷的变化，可为细胞水平上检测药物的毒副作用提供新的研究思路。即当细胞受到药物损伤时，细胞膜的表面微观物质将发生细微的变化，这种变化为识别药物诱导的肾细胞损伤提供了重要依据。
传统的方法由于仪器昂贵，操作繁琐，耗时，灵敏度低等弊端而受到限制，荧光指纹的方法不同于锁和钥匙的特异性识别，可用于识别分析物和受体之间的选择性结合。在这种识别模式中，分析物与受体的差异性信号响应取决于结合力的强弱，进而形成特征性的指纹图谱。因此，荧光指纹图谱仅通过几个传感器单元与大量分析物的共同作用，即可反映构成复杂混合物的总体变化，为探究药物诱导的肾细胞损伤提供了一种新工具和新方法。
发明内容
针对现有技术存在的繁琐耗时、灵敏度低、设备庞大、成本高等缺点，本发明提供了一种瞬时识别不同药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器的制备方法和应用，本发明制备的传感器制备简单，反应条件温和，且成本低廉，易于批量制备，将所构建的传感器加入到细胞中可瞬时得到响应结果。细胞损伤后，细胞膜表面化学物质改变，产生不同的荧光信号，可反映细胞不同的损伤状态，为快速识别不同药物作用机制提供一种新工具和新方法。
本发明的技术方案是：瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法，其具体操作步骤如下：
步骤(1.1)、PDA-PEI共聚物载体的制备：将盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺加入到Tris-HCl缓冲液中，在室温10-30℃下避光搅拌2-8h后过滤，置于透析袋透析24-36h；除去未反应的盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺，从而得到PDA-PEI共聚物载体；
步骤(1.2)、传感器的构建：将PDA-PEI共聚物载体与三种不同发射波长的QD(MPA@CdSe/ZnS)，QD(PEG-COOH@CdSe/ZnS)和QD(Cys@CdSe/ZnS)充分混合得到PDA-PEI/QDs传感器，所述的PDA-PEI/QDs传感器即为识别药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器。
进一步的，在步骤(1.1)中，所述盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺的质量比为1:1-1:10；作为最优，盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺的质量比为1:1，二者的浓度均为1mg/mL。
进一步的，在步骤(1.1)中，所述聚乙烯亚胺的重均分子量为600Da-10000Da(M.W.)。
进一步的，在步骤(1.2)中，所述传感器的构建中总反应体系为PBS:超纯水体积比1:1-1:10；
所述三种不同发射波长的QDs与PDA-PEI的终浓度比均为1:4-1:2，
作为最优，PBS(pH＝7.4):超纯水＝1:1(v/v)，QD的终浓度为5μg/mL，PDA-PEI的终浓度为200μg/mL；三个QDs的最佳激发波长均为230nm，其发射波长分别为515nm，580nm及640nm。
进一步的，瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法所制备的识别药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器。
进一步的，瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法所制备的识别药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器在制备监测HK-2细胞结构和功能的完整性、肾毒性药物的工具和试剂中的应用。
进一步的，瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法所制备的识别药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器在评价药物对细胞损伤的作用机制，不同药物损伤细胞的时效关系，筛选潜在肾毒性药物，区分不同药物损伤机制的工具和试剂中的应用。
进一步的，瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法的应用，所述应用的操作步骤为：将潜在毒性药物与细胞孵育后，药物可诱导细胞膜表面化学物质改变，加入所构建的传感器，230nm激发，收集480-680nm荧光信号，形成特征荧光指纹图谱，进而构建肾毒性药物的指纹图谱库；将毒性药物与细胞分别孵育0h，2h，4h，8h，12h，24h，随着孵育时间的增加，药物诱导细胞膜表面化学物质逐渐发生变化，加入所构建的传感器，根据不同时间点传感器荧光响应，绘制动态荧光指纹图谱；选取三个QDs分别为515nm、580nm及640nm发射波长的荧光值作为变量，借助多元统计分析方法，建立线性判别函数，定量识别不同药物诱导的细胞损伤；本发明传感器在药物毒性评价以及在药物损伤机制等方面具有广泛的应用。
本发明所述的多通道传感器在细胞活力监测中的应用，细胞为人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)；所用的药物均为肾毒性药物，包括非甾体抗炎药：萘普生、舒林酸、尼美舒利、吲哚美辛、双氯芬酸钠；抗结核药：异烟肼、利福平、对氨基水杨酸、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、L-环丝氨酸、硫酸链霉素、盐酸乙胺丁醇、吡嗪酰胺；抗肿瘤药：吴茱萸碱、紫杉醇、10-羟基喜树碱、氯氨布西、甲氨蝶呤二钠盐、盐酸阿糖胞苷、秋水仙碱、甲磺酸伊马替尼、氟尿嘧啶、卡铂、顺铂；免疫抑制剂：氢化可的松、硫唑嘌呤、环孢素、来氟洛米、链佐星；降压药：卡托普利、赖诺普利、依那普利、卡维地洛、双氢氯噻嗪、厄贝沙坦、替米沙坦、缬沙坦、坎地沙坦；抗生素：两性霉素B、阿昔洛韦、磷酸奥司他韦、利巴韦林、头孢克洛、制霉菌素、头孢噻吩酸、庆大霉素硫酸盐、多粘菌素B、多粘菌素E、新霉素硫酸盐。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种瞬时识别不同药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器制备及应用。本发明传感器制备方法简单，反应条件温和，且成本低廉、易于批量制备，而且采用单激发多发射的QDs作为荧光信号分子，构建三个信号通道，可初步识别不同类型药物对肾细胞的损伤；为进一步识别药物特有的损伤机制，给药孵育后，检测不同时间点的荧光信号，扩大变量，绘制药物损伤动态荧光指纹，实现药物对细胞损伤的精准分型。更重要的是，本发明应用范围极为广泛，不仅可用于监测细胞活力，也可用于药物毒性评价、药物作用机制等方面的研究。此外，本发明所构建的传感器瞬时响应、制备简单等特点为筛选潜在药物及识别不同药物作用机制提供了一种新工具和新方法。
本发明通过一步法制备得到猝灭效应良好的聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体，通过静电作用吸附QDs并猝灭其荧光，形成PDA-PEI/QDs传感器。传感器与细胞膜表面相互作用使QDs游离，瞬时产生荧光信号。当细胞损伤时，细胞膜表面化学物质改变，产生不同的荧光信号可反映细胞不同的损伤状态。本发明所制备的传感器在细胞活力监测，药物毒性评价和识别不同药物损伤机制等方面具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明的工作原理示意图；
图2为实施1得到的传感器的制备原理图；
图3为实施1制备得到的PDA-PEI载体溶液反应前后颜色变化图；
图4为实施1制备得到的PDA-PEI载体的透射电子显微镜图；
图5为实施1制备得到的PDA-PEI载体的紫外光谱图；
图6为实施1制备得到的PDA-PEI载体的红外光谱图；
图7为实施1制备得到的QDs的荧光光谱图；
图8为实施1制备所得的不同浓度的PDA-PEI载体对三种QDs的荧光猝灭图；
图9为实施1制备得到的不同浓度的PDA-PEI载体与三种QDs的荧光滴定图；
图10为实施1所得的传感器对不同药物诱导的细胞损伤的荧光响应示意图；
图11为实施1所得的传感器对不同药物诱导的细胞损伤的主成分分析(PCA)得分图；
图12为实施1所得的传感器对不同药物诱导的细胞损伤的线性判别分析(LDA)得分图；
图13为实施1所得的传感器在不同时间点对四类抗生素药物诱导的细胞损伤的PCA得分图；
图14为实施1所得的传感器在不同时间点对四类抗生素药物诱导的细胞损伤的LDA得分图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明：
如图1所述；瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法，其具体操作步骤如下：
步骤(1.1)、聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体的制备：将盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺加入到Tris-HCl缓冲液中，在室温10-30℃下避光搅拌2-8h后过滤，置于透析袋透析24-36h；除去未反应的盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺，从而得到PDA-PEI共聚物载体；
具体的，1、将100μL Tris-HCl(1M,pH＝7.4)缓冲液用超纯水稀释至10mL备用；
2、分别称取10mg盐酸多巴胺(DA·HCl)和10mg聚乙烯亚胺(PEI,M.W.600Da)，将二者加入到10mLTris-HCl缓冲液中，在室温10-30℃下磁力搅拌器上避光搅拌2-8h；
3、将上述溶液用0.22μm纤维素酯膜过滤，然后置于透析袋(分子量截止1000Da)透析24-36h以除去未反应的DA和PEI得到聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体；
步骤(1.2)、传感器的构建：将PDA-PEI共聚物载体与三种不同发射波长的QD(MPA@CdSe/ZnS)，QD(PEG-COOH@CdSe/ZnS)和QD(Cys@CdSe/ZnS)充分混合得到PDA-PEI/QDs传感器，所述的PDA-PEI/QDs传感器即为识别药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器。
进一步的，在步骤(1.1)中，所述盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺的质量比为1:1-1:10。
进一步的，在步骤(1.1)中，所述聚乙烯亚胺的重均分子量为600Da-10000Da(M.W.)；盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺的质量比为1:1，二者的浓度均为1mg/mL。
进一步的，在步骤(1.2)中，所述传感器的构建中总反应体系为PBS:超纯水体积比1:1-1:10；所述三种不同发射波长的QDs与PDA-PEI的终浓度比均为1:4-1:2，
作为最优，PBS(pH＝7.4):超纯水＝1:1(v/v)，QD的终浓度为5μg/mL，PDA-PEI的终浓度为200μg/mL；三个QDs的最佳激发波长均为230nm，其发射波长分别为515nm，580nm及640nm。
进一步的，瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法所制备的识别药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器。
进一步的，瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法所制备的识别药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器在制备监测HK-2细胞结构和功能的完整性、肾毒性药物的工具和试剂中的应用。
进一步的，瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法所制备的识别药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器在评价药物对细胞损伤的作用机制，不同药物损伤细胞的时效关系，筛选潜在肾毒性药物，区分不同药物损伤机制的工具和试剂中的应用。
进一步的，瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法的应用，所述应用的操作步骤为：将潜在毒性药物与细胞孵育后，药物可诱导细胞膜表面化学物质改变，加入所构建的传感器，230nm激发，收集480-680nm荧光信号，形成特征荧光指纹图谱，进而构建肾毒性药物的指纹图谱库；将毒性药物与细胞分别孵育0h，2h，4h，8h，12h，24h，随着孵育时间的增加，药物诱导细胞膜表面化学物质逐渐发生变化，加入所构建的传感器，根据不同时间点传感器荧光响应，绘制动态荧光指纹图谱；选取三个QDs分别为515nm、580nm及640nm发射波长的荧光值作为变量，借助多元统计分析方法，建立线性判别函数，定量识别不同药物诱导的细胞损伤；本发明传感器在药物毒性评价以及在药物损伤机制等方面具有广泛的应用。
本发明的原理阐述如下：
PDA-PEI共聚物载体的制备是通过DA在常氧条件下被氧化为多巴醌，再经过环化、氧化、重排反应形成邻二羟基吲哚，吲哚环自聚合形成PDA；加入的PEI通过迈克尔加成和席夫碱反应接枝到PDA上；此外PEI亦可促进DA均相聚合为PDA，形成具有良好猝灭效应的PDA-PEI共聚物。
HK-2细胞接板后，给药孵育24h，药物可诱导细胞膜表面的化学物质发生改变。弃去含药培养基，加入所构建的传感器，传感器与细胞膜表面化学物质相互作用使QDs游离，瞬时产生三个通道的荧光信号。当细胞损伤时，细胞膜表面化学物质改变，产生不同的荧光信号，形成独特的荧光指纹图谱，可通过荧光信号的变化反映细胞不同的损伤状态，进而识别不同药物诱导的细胞损伤(如图2所述)。
本发明所述的QD荧光光谱通过荧光酶标仪收集的。
具体的，本发明提供了一种基于细胞膜表面化学物质改变多通道瞬时响应的传感器，该传感器制备简单，反应条件温和，且成本低廉，易于批量制备。将所构建的传感器加入到细胞中可瞬时得到响应结果：细胞损伤后，细胞膜表面化学物质改变，可诱导传感器产生不同的荧光信号，根据传感器的荧光指纹可反映细胞不同的损伤状态，为药物筛选和识别不同药物损伤机制提供一种新策略。本发明应用范围极为广泛，不仅可用于药物毒性评价，也可根据药物与细胞膜的相互作用，在细胞活力监测、药物毒性筛选以及在药物作用机制等方面具有广泛的应用。
本发明构建的瞬时识别不同药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器为一种识别药物诱导细胞损伤传感器，其作用机制是基于不同药物诱导细胞膜的变化来反映细胞损伤状态的这种细胞膜上微观物质的变化可根据本发明所构建的多通道传感器的荧光信号来反映；瞬时识别是将传感器加入到96孔板中立刻读取荧光光谱即可得到结果，不需要传感器与细胞长时间孵育，即传感器加入细胞后，反应就可瞬时完成，实现快速检测。就细胞而言，所构建的传感器是一种识别细胞损伤的传感器；对药物而言，可初步验证药物对细胞的损伤是否通过改变细胞膜上的微观物质来诱导细胞损伤的。具体包括监测细胞膜结构和功能的完整性，评价细胞活力或药物毒性，探究药物对细胞损伤的作用机制。
以下实施例中，荧光图谱读取所用的荧光酶标仪型号为Thermo FisherScientific Oy 3001；紫外吸收数值读取所用的酶标仪型号为cary序列紫外可见分光光度计；红外光谱的测定所用的仪器型号为BRUKER-MPA；Zeta电位的测定采用Malvern Zetasizer-Nano Z instrument测得；PDA-PEI透射电子显微镜图是采用JEOLJEM-200CX仪器在加速电压为200kV测得；
实施例1
PDA-PEI/QDs传感器的构建以及合成成功的验证
1、PDA-PEI载体的制备
(1)、将100μL Tris-HCl(1M,pH＝7.4)缓冲液用超纯水稀释至10mL备用；
(2)、分别称取10mg盐酸多巴胺(DA·HCl)和10mg聚乙烯亚胺(PEI,M.W.600Da)，将二者加入到10mLTris-HCl缓冲液中，在室温10-30℃下磁力搅拌器上避光搅拌2-8h；
(3)、将上述溶液用0.22μm纤维素酯膜过滤，然后置于透析袋(分子量截止1000Da)透析24-36h以除去未反应的DA和PEI得到聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体；
在PDA-PEI制备过程中，通过反应前后的颜色变化，透射电子显微镜图，紫外光谱图和红外光谱图验证PDA-PEI载体的成功制备。
如图3所述，其为实施1制备得到的PDA-PEI载体的溶液反应前后颜色变化图；在反应前，DA溶液和PEI溶液均是澄清透明的，制备得到的PDA-PEI溶液变为棕褐色，表明PDA-PEI载体成功制备；
如图4所述，通过透射电子显微镜对所制备的PDA-PEI载体的形状进行表征，形成的PDA-PEI载体呈球形，大小均一，分布均匀，表明成功制备载体PDA-PEI即聚多巴胺-聚乙烯亚胺(PDA-PEI)共聚物载体。
如图5所述，其分别给出了DA、PEI和PDA-PEI共聚物载体的紫外光谱图；PDA-PEI共聚物载体在280nm和420nm处出现了特征峰，280nm处观察到的峰是DA的特征，而420nm附近的峰是DA的氧化产物多巴醌经分子内环化而得的多巴胺色素的特征峰，进一步验证PDA-PEI载体的成功制备；
如图6所述，其分别给出了PDA-PEI共聚物载体、DA和PEI的红外光谱图；在PDA-PEI的红外光谱中出现约1650cm-1的峰，是由C＝N振动引起，这样可以验证PDA-PEI的合成成功。
2、瞬时识别不同药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器：PDA-PEI/QDs传感器的构建：
将所制备的PDA-PEI共聚物载体与QDs置于振荡器上充分混合即得PDA-PEI/QDs传感器；传感器的构建方法中总反应体系为PBS(pH＝7.4):超纯水＝1:1(v/v)，QDs的终浓度为5μg/mL，PDA-PEI的终浓度为200μg/mL。
如图7所述，其分别给出了三个QDs的荧光图谱。三个量子点激发波长均为230nm，发射波长分别为515nm，580nm，640nm，且三个荧光光谱互不干扰，荧光强度较稳定。
如图8所述，其给出了不同浓度的PDA-PEI载体对三种QDs的荧光猝灭光谱图。三种QDs的峰彼此独立，当加入PDA-PEI载体时，荧光均出现一定程度的减弱，且随着PDA-PEI载体浓度的增大，荧光强度不断降低，最终三个通道的荧光均被猝灭，表明PDA-PEI共聚物载体的猝灭效应良好。
如图9所述，其给出了PDA-PEI共聚物载体对三种QDs的荧光滴定图；将不同浓度的PDA-PEI加入单一QD中，测量QD最佳发射波长的荧光强度，拟合一组相同结合位点的模型的最佳曲线。随着PDA-PEI载体浓度的增大，荧光强度不断降低，当PDA-PEI共聚物载体与QDs的浓度比超过25：1时，三个QD的荧光猝灭效率均超过80％，并最终到达平台期，表明PDA-PEI共聚物载体的猝灭性能良好。
下表是分别给出了通过拟合荧光滴定曲线确定的PDA-PEI共聚物载体与三种QD的结合常数；结合常数Ka:QD515>QD580>QD640，具体表现为QD515与PDA-PEI的结合常数为1.45×10(g/L)-13；QD580与PDA-PEI的结合常数为6.35×102(g/L)-1，QD640与PDA-PEI的结合常数为2.80×102(g/L)-1，QD515与PDA-PEI的结合力最强。不同量子点的结合常数存在明显差异，可识别不同细胞损伤状态；
表1：PDA-PEI载体与三种QDs的缔合常数对比表：
Figure BDA0002646090430000081
Figure BDA0002646090430000091
实施例2
给药(以异烟肼为例)，由经典MTT法得到IC50值：
1、传感器的制备过程和实施例1一致；
2、利用MTT法研究异烟肼对HK-2细胞的细胞毒性。包括以下步骤：
(1)、细胞接板：将HK-2细胞以每孔4×103密度接种到96孔板中，其中每孔加入200μL体积分数12.5％FBS的含NEAA的MEM基础培养基(边缘孔用无菌pH＝7.4的PBS填充)，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
(2)、给药：吸掉培养液后，分别加入200μL不同浓度梯度(0、0.1、0.2、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4mM)的异烟肼溶液(用不含FBS的MEM基础培养基溶解)于37℃孵育24h，倒置显微镜下观察细胞形态；
(3)、给MTT：孵育结束吸掉培养基后，在每个孔中分别加入200μL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液(5mg/mL的MTT储备液用不含FBS的培养基稀释10倍制得)，37℃下孵育4h；
(4)、给DMSO：吸掉MTT溶液，每孔加入150μL DMSO溶解Formazan晶体，振摇10min；
(5)、读值并计算：将96孔板放置在酶标仪上，分别读取每个孔中溶液在570nm波长处的吸光度值。计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(OD1-OD2)/(OD3-OD2)×100，其中OD1、OD2和OD3分别代表给药组的OD值，空白组的OD值和对照组的OD值。
(6)、绘图：以异烟肼给药浓度的Log C值为横坐标，以不同给药浓度对应的细胞活力为纵坐标，绘制曲线。
表2给出了由MTT法测得的50个药物的IC50值：
Figure BDA0002646090430000092
Figure BDA0002646090430000101
实施例3
以IC50为给药浓度(以异烟肼为例)；考察传感器对不同药物诱导的细胞损伤作用的识别
1、传感器的制备过程和实施例1一致；
2、识别不同药物对HK-2细胞的损伤机制；包括以下步骤：
(1)、细胞接板：将HK-2细胞以每孔4*103个细胞密度接种到96孔板中，其中每孔加入200μL体积分数12.5％FBS的韩NEAA的MEM基础培养基(边缘孔用无菌PH＝7.4的FBS填充)，在37℃，5％CO2培养箱中培养24H；
(2)、给药：吸掉培养液后，分别加入200μL浓度为IC50值的异烟肼溶液(用不含FBS的MEM基础培养基溶解)于37℃孵育24h，倒置显微镜下观察细胞形态；
(3)、给传感器：孵育结束后吸掉含药培养液后，每孔加入200μL的传感器。
(4)、读取荧光数值并计算：加入传感器后，立即将96孔板放置于荧光酶标仪上，设置激发波长为230nm，收集480-680nm荧光图谱，带宽为5nm，作为每类药物特有的荧光指纹图谱。
如图10所述，其给出了传感器对不同药物诱导的细胞损伤的荧光响应(ΔF)示意图；其中Atc代表抗生素，Atr代表抗肿瘤药物，Ime代表免疫抑制药，Nsa代表非甾体抗炎药，Pad代表普利类降压药，Oad代表其它类降压药，Atd代表抗结核药。分别将每一类药物与细胞作用后的三个通道(515nm，580nm和640nm)的荧光强度计算出均值，ΔF＝F2-F1，F1表示细胞不给药时与传感器作用后测得的荧光强度，F2表示细胞给药IC50时与传感器作用后测得的荧光强度。由于降压药中三个普利类降压药较特殊，将其单独作为一类药物进行区分。基于三个量子点的最佳发射波长的荧光值，借助多元统计学方法，可实现不同药物诱导HK-2细胞的基本识别。
如图11所述，其给出了传感器对不同药物诱导的细胞损伤的荧光响应的主成分分析(PCA)得分图；其中1代表抗生素，2代表抗肿瘤药物，3代表免疫抑制药，4代表非甾体抗炎药，5代表普利类降压药，6代表其它类降压药，7代表抗结核药。此图由SIMCA-P软件处理得到，主成分分析的方法可减少数据的维度来查找数据中的模式。由图11可知，经过分析，生成了两个标准因子(X1＝98.2％，X2＝1.4)，加和为99.6％，即这两个变量可以代表99.6％的数据量，准确度较高，并且这七类药物彼此之间基本能区分。其中一些药物存在交叉现象，如硫酸链霉素，异烟肼，盐酸乙胺丁醇，由于其本身既属于抗生素类药物，又是抗结核类药物，所以导致这两类在区分时存在交叉重叠现象。由分类结果可知，硫酸链霉素，异烟肼，盐酸乙胺丁醇与大部分抗生素类药物区分度较小，说明其作用机制与抗生素类药物相似。三种普利类降压药与其它类型降压药空间分布较远，区分度较大，表明普利类药物损伤HK-2细胞的机制有可能与其他降压药并不相同，所以将其作为特殊的一类进行区分。
如图12所述，其给出了传感器对不同药物诱导的细胞损伤的荧光响应的线性判别分析(LDA)得分图，其中，1代表抗生素，2代表抗肿瘤药物，3代表免疫抑制药，4代表非甾体抗炎药，5代表普利类降压药，6代表其它类降压药，7代表抗结核药；此图由SPSS软件处理得到，LDA可最大程度地提高类间差异与类内差异的比率，因此可以用于定量区分不同药物诱导的细胞损伤的荧光信号差异。经过分析，原始分析准确率90％，交互验证准确度84％；这项分析减少了训练矩阵的大小，在二维图中可视化响应模式线性组合。在该图中，每个点代表单个药物与细胞作用后对传感器的响应模式，七类药物基本能够区分。
实施例4
选取四类抗生素类药物：多粘菌素类(多粘菌素B、多粘菌素E)、β-内酰胺类(头孢克洛、头孢噻吩酸)、氨基糖苷类(庆大霉素硫酸盐、新霉素硫酸盐)及抗结核类(利福平、异烟肼、硫酸链霉素)。
以IC50为给药浓度(以异烟肼为例，考察不同时间点(0h，2h，4h，8h，12h，24h)传感器对四类药物诱导的细胞损伤作用机制的区分：
1、传感器的制备过程和实施例1一致；
2、区分不同时间点四类药物对HK-2细胞的损伤机制。包括以下步骤：
(1)、细胞接板：将HK-2细胞以每孔4*103个细胞密度接种到96孔板中，其中每孔加入200μL体积分数12.5％FBS的韩NEAA的MEM基础培养基(边缘孔用无菌PH＝7.4的FBS填充)，在37℃，5％CO2培养箱中培养24H；
(2)、给药：吸掉培养液后，分别加入200μL浓度为IC50值的异烟肼溶液(用不含FBS的MEM基础培养基溶解)于37℃孵育24h，倒置显微镜下观察细胞形态；
(3)、给传感器：分别在孵育0h，2h，4h，8h，12h，24h后吸掉含药培养液后，每孔加入200μL的传感器。
(4)、读取荧光数值并计算：加入传感器后，立即将96孔板放置于荧光酶标仪上，设置激发波长为230nm，收集480-680nm荧光图谱，带宽为5nm，作为每类药物特有的荧光指纹图谱。
如图13所述，其给出了传感器对不同时间点四类抗生素药物诱导的细胞损伤的荧光响应的PCA得分图；其中，1代表多粘菌素类，2代表β-内酰胺类，3代表氨基糖苷类，4代表抗结核药。此图由SIMCA-P软件处理得到，主成分分析的方法可减少数据的维度来查找数据中的模式。由图13可知，不同于50种药物的PCA，这种基于不同给药时间获取荧光响应，进而将原本的3个变量扩大为15个变量的方法，成功地把抗生素药物区分为四小类：氨基糖苷类、多粘菌素类、β-内酰胺类、抗结核类。经过分析，生成了两个标准因子(X1＝65.9％，X2＝23.4)，加和为89.3％，即这两个变量可以代表89.3％的数据量，准确度较高，并且这四类抗生素药物能被明显区分开，彼此之间不存在交叉重叠，区分度良好，说明这种扩大变量的方法能够实现药物诱导HK-2细胞损伤的精准识别。
如图14所述，其给出了传感器在不同时间点对四类抗生素药物诱导的细胞损伤的荧光响应的LDA得分图；其中，1代表多粘菌素类，2代表β-内酰胺类，3代表氨基糖苷类，4代表抗结核药；此图由SPSS软件处理得到，LDA可最大程度地提高类间差异与类内差异的比率，因此可以用于定量区分传感器与药物诱导的细胞损伤的荧光反应模式；经过分析，原始分析准确率100％，交互验证准确度100％。由图14可知，每个点代表单个药物与细胞作用后对传感器的响应模式，四类药物达到精准区分，验证了提升变量方法可实现药物诱导HK-2细胞损伤的精准识别。
综上所述，本发明采用单激发对应多发射的三个QD作为荧光信号分子，构建三个信号通道，可初步识别不同类型药物对肾细胞的损伤；为进一步识别药物损伤，给药孵育后，检测不同时间点的荧光信号，扩大变量，绘制药物损伤动态荧光指纹，实现药物对细胞损伤的精准分型。更重要的是，本发明应用范围极为广泛，不仅可用于监测细胞活力，也可用于药物毒性评价、药物作用机制等方面的研究。此外，本发明所构建的传感器瞬时响应、制备简单等特点为筛选潜在药物及识别不同药物损伤机制提供了一种新工具和新方法。本发明利用传感器与细胞膜的相互作用，传感器加入到含细胞的孔中即可立刻检测，检测时间1分钟，因此传感器不可能进入细胞内与细胞相互作用，而是直接与细胞表面相互作用，通过传感器荧光信号的变化反映细胞膜的变化。本发明构建的传感器是通过载体PDA-PEI(带正电)与QD(负电)通过静电作用结合，该传感器中的PDA-PEI载体可与细胞膜上带负电的结构域结合，而把带负电的QD竞争下去，实现荧光信号的变化。

Claims (8)

1.瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法，其特征在于，其具体操作步骤如下：
步骤(1.1)、PDA-PEI共聚物载体的制备：将盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺加入到Tris-HCl缓冲液中，在室温10-30℃下避光搅拌2-8h后过滤，置于透析袋透析24-36h；除去未反应的盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺，从而得到PDA-PEI共聚物载体；
步骤(1.2)、传感器的构建：将PDA-PEI共聚物载体与三种不同发射波长的QD(MPA@CdSe/ZnS)，QD(PEG-COOH@CdSe/ZnS)和QD(Cys@CdSe/ZnS)充分混合得到PDA-PEI/QDs传感器，所述的PDA-PEI/QDs传感器即为识别药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器。
2.根据权利要求1所述的瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法，其特征在于，在步骤(1.1)中，所述盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺的质量比为1:1-1:10。
3.根据权利要求1所述的瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法，其特征在于，在步骤(1.1)中，所述聚乙烯亚胺的重均分子量为600 Da-10000 Da。
4.根据权利要求1所述的瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法，其特征在于，在步骤(1.2)中，所述三种不同发射波长的QDs与PDA-PEI的终浓度比均为1:4-1:2，三个QDs激发波长均为230nm，其发射波长分别为515nm，580nm及640nm。
5.如权利要求1所述的瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法所制备的识别药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器。
6.如权利要求1所述的瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法所制备的识别药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器在制备监测HK-2细胞结构和功能的完整性、肾毒性药物的工具和试剂中的应用。
7.如权利要求1所述的瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法所制备的识别药物诱导的HK-2细胞损伤的多通道传感器在评价药物对细胞损伤的作用机制，不同药物损伤细胞的时效关系，筛选潜在肾毒性药物，区分不同药物损伤机制的工具和试剂中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的瞬时识别药物诱导HK-2细胞损伤的阵列传感器的制备方法的应用，其特征在于，所述应用的操作步骤为：将潜在毒性药物与细胞孵育后，药物可诱导细胞膜表面化学物质改变，加入所构建的传感器，230nm激发，收集480-680nm荧光信号，形成特征荧光指纹图谱，进而构建肾毒性药物的指纹图谱库；将毒性药物与细胞分别孵育0h，2h，4h，8h，12h，24h，随着孵育时间的增加，药物诱导细胞膜表面化学物质逐渐发生变化，加入所构建的传感器，根据不同时间点传感器荧光响应，绘制动态荧光指纹图谱；选取三个QDs分别为515nm、580nm及640nm发射波长的荧光值作为变量，借助多元统计分析方法，建立线性判别函数，定量识别不同药物诱导的细胞损伤。
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