DE102018115136B3 - Fluoreszierende Partikel mit fluoreszierender Hülle aus einem molekular geprägtem Polymer für Zellanfärbungsanwendungen in der Zytometrie und Mikroskopie - Google Patents

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Abstract

Ein doppelt fluoreszierendes Partikel umfasst: einen Kern mit einer ersten Fluoreszenz sowie eine Hülle aus einem molekular geprägten Polymer (MGP) mit einer zweiten Fluoreszenz; wobei das MGP ein organisches Polymer mit Elementen ist, die aus der Gruppe bestehend aus C, H, O, N, P und S ausgewählt sind; wobei das MGP so ausgelegt ist, dass es gezielt an eine Zelloberflächenstruktur bindet; wobei die erste Fluoreszenz von einem Element erzeugt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Kohlenstoff-Nanopunkt, einem farbstoffdotierten Polymer, einer farbstoffdotierten stabilisierten Mizelle, einem Polymer mit Quantenpunktdotierung, einem Polymer mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion sowie einem Erdalkalimetallfluorid-Nanopartikel mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion; wobei die zweite Fluoreszenz von einem Element erzeugt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Farbstoff, einer molekularen Sonde, einem Indikator, einem Sondenmonomer, einem Indikatormonomer und einem Vernetzer; und wobei sich die erste und zweite Fluoreszenz zumindest durch eine Emissionswellenlänge und/oder durch eine Anregungswellenlänge unterscheiden.

Description

  • GEBIET UND HINTERGRUND
  • Die vorliegende Erfindung betrifft fluoreszenzbasierte Nachweisverfahren in der Zellbiologie und der medizinischen Diagnose zum schnellen und empfindlichen Nachweis bestimmter primärer Zellen und Zelllinien, z.B. Krebszellen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das gezielte Ansteuern und den Nachweis von Biomarkern auf lebenden und fixierten Zellen mittels Fluoreszenz unter Verwendung von molekular geprägten Polymeren (MGP).
  • Bekannte MGP-basierte Sensoren in der Bildgebung und Analyse betreffen beinahe ausschließlich Einzelsignalsysteme. Insbesondere in komplexen Proben werden Einzelsignalmessungen häufig von Konzentrationsänderungen oder einer inhomogenen Verteilung der Sensoren, instrumentellen Schwankungen und Umweltbedingungen beeinträchtigt, die eine quantitative Bestimmung behindern. Im Vergleich zur Einzelsignalausgabe ist eine ratiometrische oder Doppelsignalaufzeichnung unabhängig von Sensor- und Reagenzkonzentration und liefert eine intrinsische Korrektur zur Überwindung möglicher Einflüsse des Geräts und des Hintergrunds und ermöglicht somit eine eindeutige Erkennung gesuchter Zellen.
  • Bei aktuellen etablierten Verfahren werden die Magnetresonanztomographie (MRT) und Computertomographie (CT-Aufnahmen) für die in-vivo-Bildgebung von (Krebs-)Zellen verwendet. Für die in-vitro-Bildgebung von Einzelzellen werden üblicherweise die Durchflusszytometrie und histochemische Verfahren verwendet, bei denen Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert oder angefärbt werden. Bei derzeitigen mikroskopischen Verfahren werden zum Anfärben der Zelloberfläche fluoreszierende Polymerkügelchen verwendet, die spezifische Antikörper tragen (Stsiapura et al., 2004), oder fluoreszierende Polymerkerne, die funktionelle Gruppen tragen, die von Tumorzellen aufgenommen werden können (Holzapfel et al., 2005). Die fluoreszierenden Polymerkerne können Farbstoffe oder Quantenpunkte als fluoreszierende Einheiten enthalten (Stsiapura et al., 2004). Es sind auch Quantenpunkte verwendet worden, die mit Antikörpern markiert sind, die auf Zelloberflächen gerichtet sind (Ag et al., 2014). In der aktuellen Zytometrie werden fluoreszenzmarkierte Antikörper und Lektine zum Anfärben von Zelloberflächenelementen und die nachfolgende Isolierung der markierten Zellen verwendet (Long et al., 2010). Molekular geprägte Siliziumdioxid-Nanokügelchen mit eingebetteten Kohlenstoff-Nanopunkten (carbon nanodots, CND) wurden in einem Dopamin-Fluoreszenz-Optosensor eingesetzt (Mao et al., 2012). Mit nicht fluoreszierenden MGP-Schichten verbundene CND wurden als biokompatibles optisches Bildgebungshilfsmittel zum Nachweis von Krebs-Biomarkern mittels Sonden verwendet (Demir et al., 2018). Diese beiden Systeme basieren auf einem fluoreszierenden CND-Kern mit einer nicht fluoreszierenden MGP-Hülle und sind weiterhin Einzelsignal-Erfassungsverfahren. Ein mit CND dotierter Siliziumdioxidkern mit einer Hülle aus molekular geprägtem Siliziumdioxid (MGS) mit Quantenpunktdotierung (QP-Dotierung) ist bisher zum Nachweis von Fungiziden bei landwirtschaftlichen Analysen (Amjadi und Jalili, 2017) sowie zum Nachweis eines entzündungshemmenden Arzneimittels (Amjadi und Jalili, 2018) verwendet worden.
  • KURZDARSTELLUNG
  • Vor diesem Hintergrund wird gemäß einer Ausführungsform ein doppelt fluoreszierendes Partikel vorgeschlagen, wobei das Partikel umfasst: einen Kern mit einer ersten Fluoreszenz sowie eine Hülle aus einem molekular geprägten Polymer (MGP) mit einer zweiten Fluoreszenz, wobei das molekular geprägte Polymer ein organisches Polymer mit Elementen ist, die aus der Gruppe bestehend aus C, H, O, N, P und S ausgewählt sind; wobei das MGP so ausgelegt ist, dass es gezielt an eine Zelloberflächenstruktur bindet; wobei die erste Fluoreszenz von einem Element erzeugt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Kohlenstoff-Nanopunkt, einem farbstoffdotierten Polymer, einer farbstoffdotierten stabilisierten Mizelle, einem Polymer mit Quantenpunktdotierung, einem Polymer mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion sowie einem Erdalkalimetallfluorid-Nanopartikel mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion; wobei die zweite Fluoreszenz von einem Element erzeugt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Farbstoff, einer molekularen Sonde, einem Indikator, einem Sondenmonomer und einem Indikatormonomer; wobei sich die erste und zweite Fluoreszenz zumindest durch eine Emissionswellenlänge und/oder durch eine Anregungswellenlänge unterscheiden.
  • Des Weiteren ist ein Verfahren zum Suchen nach einer Zielzelle in einer Probe bereitgestellt, wobei die Zielzelle durch eine bestimmte Zelloberflächenstruktur gekennzeichnet ist, d.h. eine bestimmte Membranmarkerstruktur. Das vorgeschlagene Verfahren umfasst: Bereitstellen eines wie zuvor und weiter unten beschriebenen doppelt fluoreszierenden Partikels; Ermöglichen eines Kontakts zwischen dem doppelt fluoreszierenden Partikel und einer Vielzahl von Zellen aus der Probe, die möglicherweise eine Zelle mit der bestimmten Zelloberflächenstruktur aufweist; Nachweisen einer Zelle mit der bestimmten Zelloberflächenstruktur mit daran gebundenen doppelt fluoreszierenden Partikeln; und Feststellen eines Vorhandenseins der Zielzelle in der Probe.
  • Des Weiteren wird ein Verfahren zum Etablieren einer Zielzelllinie vorgeschlagen, wobei die Zellen der Zelllinie durch eine bestimmte Zelloberflächenstruktur gekennzeichnet sind, d.h. eine Membranmarkerstruktur, wobei das Verfahren ein Isolieren der Zielzelle, die mit dem zuvor und weiter unten beschriebenen Suchverfahren definiert wird, aus einer Mehrzahl von Zellen umfasst.
  • Des Weiteren wird eine Verwendung eines wie zuvor und weiter unten beschriebenen doppelt fluoreszierenden Partikels für die in-vitro-Erkennung und/oder -Kennzeichnung von zirkulierenden Tumorzellen in einer Blutprobe vorgeschlagen.
  • Des Weiteren wird eine Verwendung eines wie zuvor und weiter unten beschriebenen doppelt fluoreszierenden Partikels zum Erkennen einer Zelle, einer Zelllinie oder eines Hybridoms eingesetzt, wobei die Zelle, die Zelllinie und das Hybridom ein bestimmtes Immunglobulin oder ein bestimmtes Zytokin produziert.
  • Darüber hinaus wird ein Bildgebungsverfahren zur Krebserkennung in einem Gewebe vorgeschlagen, wobei das Bildgebungsverfahren ein Ermitteln eines Fluoreszenzverhältnisses an einem doppelt fluoreszierenden Partikel und ein Erzeugen eines Bilds des Gewebes umfasst, wobei Zellen des Gewebes mit einer Oberflächenstruktur, die von mindestens einem wie zuvor beschriebenen doppelt fluoreszierenden Partikel erkannt wird, vor einem Hintergrund des Bilds hervorgehoben werden.
  • Des Weiteren wird ein Zellsortierungsverfahren vorgeschlagen, wobei das Verfahren umfasst: Markieren einer Zelle mit dem zuvor vorgeschlagenen doppelt fluoreszierenden Partikel, Ermitteln eines Verhältnisses aus ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen; und Erfassen des Vorhandenseins einer Zelle, die mit dem doppelt fluoreszierenden Partikel markiert ist.
  • Figurenliste
  • Eine vollständige und nacharbeitbare Offenbarung der vorliegenden Erfindung, einschließlich der für einen Durchschnittsfachmann besten Ausführung derselben, ist insbesondere in der übrigen Beschreibung dargelegt und bezieht sich auf die zugehörigen Figuren.
    • 1 zeigt vereinfacht die Erzeugung eines doppelt fluoreszierenden Partikels gemäß Beispiel 1, d.h. den Syntheseweg hin zu und die Struktur von CND@SiO2@MGP.
    • 2 zeigt ein Fluoreszenzspektrum von CND in Ethanol.
    • 3 zeigt eine AFM-Aufnahme (engl.: tapping mode) von Kohlenstoff-Nanopunkten, die als Kerne für die doppelt fluoreszierenden Partikel verwendet worden sind.
    • 4 zeigt ein Fluoreszenzspektrum in Wasser (links) und eine TEM-Aufnahme (rechts) von CND@SiO2; Maßstabsleiste = 200 nm.
    • 5 zeigt das Fluoreszenzspektrum von CND-Kernen, die mit einer strukturellen SiO2-Hülle umhüllt wurden, wobei die Hülle zur Herstellung von Partikeln nach Beispiel 1 mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) modifiziert wurde.
    • 6 zeigt ein Fluoreszenzspektrum und das makroskopische Aussehen von CND@SiO2-RAFT.
    • 7 zeigt eine TEM-Aufnahme und das entsprechende EDX-Spektrum von CND@SiO2@MGP-Partikeln gemäß Beispiel 1.
    • 8 zeigt das zweifache Fluoreszenzsignal von CND@SiO2@MGP in Methanol (links) und das eines zweiten CND@SiO2@MGP in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen deprotonierter Sialinsäure in Chloroform (rechts).
    • 9 ist eine vereinfachte Darstellung des Verfahrens zum Erhalten von Partikeln mit einem fluoreszierenden Polystyrol-Kern/einer strukturellen Hülle aus Siliziumdioxid/einer fluoreszierenden MGP-Hülle (PS@SiO2@MGP) gemäß Beispiel 2.
    • 10 veranschaulicht die Partikelgröße (Polydispersität) und das Zeta-Potential von Kernen aus Polystyrol (PS), wie sie für doppelt fluoreszierende Partikel gemäß dem nachstehend beschriebenen Beispiel 2 verwendet werden.
    • 11 stellt eine TEM-Aufnahme repräsentativer Polystyrolkerne dar, wie sie für die Partikelherstellung verwendet werden.
    • 12 zeigt Fluoreszenzemissionsspektren (links) und eine mikroskopische Aufnahme (rechts) von farbstoffdotierten PS-Kernen.
    • 13 zeigt eine TEM-Aufnahme einer repräsentativen Charge von farbstoffdotierten PS-Kernen.
    • 14 zeigt links eine TEM-Aufnahme einer repräsentativen Charge von farbstoffdotierten PS@SiO2-Partikeln und rechts ein entsprechendes EDX-Spektrum.
    • 15 ist eine fotographische Aufnahme der mit einem RAFT-Mittel modifizierten PS@SiO2-APT, d.h. von PS@SiO2-RAFT-Partikeln.
    • 16 zeigt zwei TEM-Aufnahmen einer repräsentativen Charge von PS@SiO2@MGP-Partikeln.
    • 17 stellt eine Fluoreszenztitration von PS@SiO2@MGP dar, geprägt mit Sialinsäure (SS), nach Zugabe von zunehmenden Mengen von SS in Dimethylformamid.
    • 18 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der menschlichen Brustkrebszelllinie MDA-MB 231, angefärbt mit 150 µg/ml MGP-Partikeln.
    • 19 zeigt eine Fluoreszenzmikroskopie-/Phasenkontrastaufnahme muriner Makrophagenzellen (RAW 264.7), die mit 0,4 mg/ml SS-MGP inkubiert wurden.
    • 20 zeigt einen Vergleich von durchflusszytometrischen Messungen, die mit menschlichen Brustkrebszellen (MCF-7) nach der Markierung mit unterschiedlichen Chargen von doppelt fluoreszierenden Partikeln (SS-MGP und SS-UGP) erhalten wurden.
  • In der folgenden ausführlichen Beschreibung wird auf die beigefügten Figuren Bezug genommen, die einen Bestandteil davon bilden und in denen bestimmte Ausführungsformen und Merkmale der Erfindung zur Veranschaulichung dargestellt sind. Es versteht sich, dass weitere Ausführungsformen verwendet werden können und strukturelle oder logische Änderungen vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Die folgende ausführliche Beschreibung soll deshalb nicht einschränkend verstanden werden, und der Umfang der vorliegenden Erfindung ist durch die beigefügten Ansprüche definiert.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Die Verwendung des Worts „ein“, „eine“ oder „einer“ bei Verwendung in Verbindung mit dem Begriff „umfassend“ in den Ansprüchen und/oder der Beschreibung kann, bei Verwendung in dieser Beschreibung (zuvor und nachstehend) und den Ansprüchen, „ein“, „eine“ oder „einer“ bedeuten, entspricht jedoch auch der Bedeutung von „ein(e/r) oder mehrere“, „mindestens ein(e/r)“ und „ein(e/r) oder mehre als ein(e/r)“.
  • Die Verwendung des Worts „oder“ in den Ansprüchen wird bei Verwendung in dieser Beschreibung (zuvor und nachstehend) und den Ansprüchen in der Bedeutung „und/oder“ verwendet, sofern nicht ausdrücklich angegeben ist, dass es sich ausschließlich auf Alternativen bezieht oder sich die Alternativen gegenseitig ausschließen, obwohl die Offenbarung eine Definition unterstützt, die sich auf ausschließlich Alternativen sowie „und/oder“ bezieht.
  • Bei Verwendung in dieser Beschreibung (zuvor und nachstehend) und den Ansprüchen gibt das verwendete Wort „ungefähr“ vor einem Zahlenwert einen Bereich von Zahlenwerten an, die eine statistische Abweichung von dem angegebenen Zahlenwert um ± 5% umfassen, d.h. einschließen.
  • Bei Verwendung in dieser Beschreibung (zuvor und nachstehend) und den Ansprüchen sind die Wörter „umfassend“ (und jede beliebige Form von umfassend, beispielsweise „umfassen“ und „umfasst“), „aufweisend“ (und jede beliebige Form von aufweisend, beispielsweise „aufweisen“ und „aufweist“), „einschließend“ (und jede beliebige Form von einschließend, beispielsweise „einschließt“ und „einschließen“) oder „enthaltend“ (und jede beliebige Form von enthaltend, beispielsweise „enthält“ und „enthalten“) einbeziehend oder offen und schließen keine zusätzlichen, nicht aufgeführten Elemente oder Verfahrensschritte aus.
  • Bei Verwendung in dieser Beschreibung (zuvor und nachstehend) und den Ansprüchen soll der Begriff „Nanopartikel“ als üblicherweise einen festen Körper umfassend verstanden werden, der einen arithmetisch mittleren Durchmesser von zwischen 1 nm und 1000 nm aufweist. Die in der vorliegenden Erfindung und den Ansprüchen entweder als CND oder fertige Kern-Hülle-Partikel verwendeten Nanopartikel, die einen Kern und eine MGP-Hülle (oder möglicherweise eine strukturelle anorganische Schicht zwischen dem Kern und der MGP-Hülle) umfassen, umfassen üblicherweise Partikel mit einem mittleren Durchmesser ≤ 200 nm. Kerne beginnen vorzugsweise mit einem Durchmesser von 5 nm, siehe CND, und sollten üblicherweise bis zu 100 nm reichen, jedoch können auch Kerne mit bis zu 200 nm eingesetzt werden. Ein etabliertes Verfahren zum Bestimmen des Durchmessers solcher fester Körper ist z.B. die Elektronenmikroskopie, insbesondere Rasterelektronenmikroskopie oder Transmissionselektronenmikroskopie. Weitere Verfahren umfassen z.B. Lichtstreuung, insbesondere dynamische Lichtstreuung. Die letztgenannten Verfahren erfordern jedoch eine Festlegung des Brechungsindex des zugehörigen Feststoffs, der sich für Partikel unter 50 nm möglicherweise schwer angeben lässt, wodurch das Problem bei Verbundwerkstoffen/Hybriden wie organischen Partikeln mit farbstoffdotiertem PS und Siliziumdioxid-Hülle oder bei CND usw. noch stärker ausgeprägt ist. Bei der vorliegenden Verwendung bezieht sich deshalb die angegebene Partikelgröße auf mit der Elektronenmikroskopie erfasste Werte unter Verwendung der bei der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) oder der Rasterelektronenmikroskopie erzeugten Signale. Bei der Elektronenmikroskopie kann das durch Rückstreuelektronen erzeugte Signal, das z.B. mit einem RSE-Detektor eines marktüblichen Elektronenmikroskops erfasst wird, zum Bestimmen des Partikeldurchmessers und zum Berechnen eines entsprechenden Mittelwerts verwendet werden. Für die Transmissionselektronenmikroskopie wurde ein Raster-/Transmissionselektronenmikroskop Talos™ F200S (200 kV) von FEI verwendet.
  • Der Begriff „molekular geprägtes Polymer“ (MGP) betrifft gewöhnlich Polymernetzwerke, die quasi-anorganische Bausteine und/oder organische Bausteine umfassen, die aus den Elementen Kohlenstoff, Sauerstoff, Wasserstoff und möglicherweise Stickstoff, Phosphor und Schwefel bestehen, die in Gegenwart eines besonderen Templats erzeugt wurden. Rein anorganische MGP existieren eigentlich nicht, abgesehen von den allerersten Beispielen von vor etwa 100 Jahren (die damals jedoch noch nicht als „MGP“ bezeichnet wurden), in denen ausschließlich TEOS eingesetzt wurde, sodass das entstehende Polymer ausschließlich ein SiO2-Polymer war. Geprägte Siliziumdioxide sind heutzutage „quasi-anorganische“ MGP, da zumindest bisher stets unterschiedliche organisch modifizierte Silane als Monomer- und Vernetzereinheiten eingesetzt wurden.
  • Der Klarheit halber werden in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen molekular geprägte Siliziumdioxide als MGS statt MGP bezeichnet. Vor diesem Hintergrund sind die MGP laut Verwendung in dieser Beschreibung, diesen Zeichnungen und Ansprüchen so zu verstehen, dass sie ausschließlich organische Polymere umfassen, die üblicherweise ohne jegliche funktionelle Silane hergestellt werden. MGP sind im Allgemeinen stark vernetzte Polymere, die aus Monomeren und Vernetzern in Gegenwart eines Zielmoleküls als Templat hergestellt werden. Organische Polymere bestehen üblicherweise aus chemischen Elementen ausgewählt aus C, H, O, N, S und P. Nach Entfernung des Templatmoleküls bleibt in der Polymermatrix eine spezifische, dreidimensionale Erkennungsstelle oder ‚Tasche‘ erhalten, die hinsichtlich Größe, Form und spezifischer Interaktionssignatur komplementär zum Templatmolekül ist. MGP können somit eine starke Affinität zum Templatmolekül mit einer hohen Selektivität kombinieren, womit sie natürliche Rezeptoren wie Antikörper oder Substraterkennungsstellen von Enzymen nachahmen. Insbesondere durch die chemische und thermische Stabilität sind jedoch die MGP und MGS besser geeignet für viele Anwendungen als ihre natürlichen Analoga. Die Ausgangsmaterialien für MGP und MGS sind zudem oft in reichlicher Menge vorhanden und relativ günstig und die Herstellungszeiten liegen in der Größenordnung von Tagen statt Wochen oder Monaten, die üblicherweise zum Gewinnen von biologischen Hochleistungsrezeptoren notwendig sind. Zur Herstellung von MGP sind verschiedene Verfahren einschließlich radikalischer Polymerisation, Metathese und lebender Polymerisation, beispielsweise RAFT-Polymerisation (reversible addition-fragmentation chain transfer polymerisation) und metallkatalysierte ATRP-Polymerisation (atom transfer radical polymerization), gewählt worden.
  • Das MGP-Polymer beginnt mit dem Wachstum im Allgemeinen an der Oberfläche des Kerns (siehe Punkt 1.6 bis 1.8 und 2.6 bis 2.8 im Versuchsteil). Für gewöhnlich sind Aminogruppen an der Oberfläche des Kerns fixiert und ein sogenanntes RAFT-Mittel, das ein Aufpfropfen eines Polymers von einer Oberfläche aus ermöglicht.
  • Bei Verwendung in dieser Beschreibung (zuvor und nachstehend) und den Ansprüchen sind die Begriffe „Fluoreszenz“, „fluoreszierend“, „Fluoreszenzmessung“, „Fluoreszenzfarbstoff“, „fluoreszierendes Partikel“, „fluoreszierendes Ion“, „fluoreszierendes Monomer“, „fluoreszierendes Sondenmonomer“, „fluoreszierendes Indikatormonomer“, „fluoreszierender Vernetzer“, „fluoreszierender Sondenvernetzer“, „fluoreszierender Indikatorvernetzer“ sowie jeder beliebige hiermit zusammenhängende Begriff so zu verstehen, dass er eine optische Eigenschaft oder ihren Nachweis umfasst, z.B. eine Anregungswellenlänge, eine Emissionswellenlänge, eine Fluoreszenzintensität, eine Fluoreszenzquantenausbeute, eine Fluoreszenzlebensdauer oder -abnahme, eine Fluoreszenzlöschung oder ein Ausbleichen und/oder ein Verhältnis aus beliebigen ihrer Werte sowie seinen (ihren) Nachweis. Anders ausgedrückt, umfasst eine Fluoreszenz und eine Lumineszenz eine Anregung und eine Emission sowie eine Anregungswellenlänge (und/oder einen Anregungswellenlängenbereich) und eine Emissionswellenlänge (und/oder einen Emissionswellenlängenbereich).
  • Eine Fluoreszenz eines Elements, z.B. einer chemischen Substanz oder eines Ions, ist insbesondere üblicherweise durch eine Anregungswellenlänge (genauer gesagt, üblicherweise einen Anregungswellenlängenbereich) und eine Emissionswellenlänge (genauer gesagt, üblicherweise einen Emissionswellenlängenbereich) gekennzeichnet. Üblicherweise weist jeder der angegebenen Bereiche ein klar erkennbares Maximum auf. Dementsprechend umfasst eine hierin verwendete „erste Fluoreszenz“ eine „erste Anregungswellenlänge“ und einen „ersten Anregungswellenlängenbereich“ sowie eine „erste Emissionswellenlänge“ und einen „ersten Emissionswellenlängenbereich“. Fluoreszenzverhältnismessungen oder ratiometrische Fluoreszenzmessungen sind Messungen von zwei Fluoreszenzen von zwei fluoreszierenden Spezies, von denen eine üblicherweise unempfindlich gegenüber dem Analyten ist und die andere sich in Abhängigkeit von dem Vorhandensein des Analyten ändert, wodurch beide Fluoreszenzen im selben Anregungswellenlängenbereich oder in zwei unterschiedlichen Anregungswellenlängenbereichen angeregt werden können. Ihre Fluoreszenzemissionsbereiche müssen sich mindestens so stark unterscheiden, dass sich die Verkleinerung/Vergrößerung der analytempfindlichen Bande von der Emission der konstanten Bande unterscheiden lässt. Ratiometrische Messungen haben den Vorteil, dass Schwankungen der Intensität der Lichtquelle, Photodegradation oder Umweltveränderungen berücksichtigt werden können. Diese interne Referenzierung lässt die Analyse des analytabhängigen Signals viel zuverlässiger werden.
  • Fluoreszierende Elemente werden ausgewählt aus Kohlenstoff-Nanopunkten (CND), Quantenpunkten (QP) wie CdTe, CdSe, CdSe/ZnS und mit Mn dotiertem ZnS, Fluoreszenzfarbstoffen wie denen, die in Klasse 2 der nachstehenden Tabelle aufgeführt sind, Indikatorfarbstoffen wie denen, die in Klasse Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 3 in der nachstehenden Tabelle aufgeführt sind, fluoreszierenden molekularen Sonden wie denen, die in Klasse Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 3 dieser Tabelle angegeben sind, sowie Seltenerdmetallionen wie Cer (Ce), Europium (Eu), Gadolinium (Gd), Neodym (Nd), Scandium (Sc), Terbium (Tb), Ytterbium (Yb) und Yttrium (Y), Dysprosium (Dy), Samarium (Sm), Holmium (Ho), Erbium (Er), Thulium (Tm) und Praseodym (Pr) sowie in Klasse Nr. 2 der nachstehenden Tabelle angegebenen Substanzen.
  • Tabelle 1. Klassen von fluoreszierenden Elementen.
    Klasse Fluoreszierende Elemente
    Nr. 1 Rhodamin und Derivate
    Fluorescein und Derivate
    Styrylderivate
    Cyanin- und Polymethinderivate
    Pyridiniumderivate
    Pyrylium- und Thiopyryliumderivate
    Ruthenium-, Osmium- oder Iridiumkomplexe und -derivate
    Lumineszierende Komplexe von Seltenerdmetallen (beispielsweise
    Europium oder Terbium)
    Squarylium und Derivate
    Nr. 2 Cumarin und Derivate
    Dipyrromethen oder BODIPY und Derivate
    Pyrromethan und Derivate
    Benzofuran und Derivate
    Pyridinderivate
    Naphthalimid und Derivate
    Benzoxazol und Derivate
    Benzoxadiazol und Derivate
    Benzindol und Derivate
    DAPI und Derivate
    Stilben und Derivate
    Oxazin und Derivate
    Perylen und Derivate
    Azulen und Derivate
    Styrylbase-Derivate
    Phycoerythrin und Derivate
    Squarain und Derivate
    Porphyrin und Derivate
    Phthalocyanin und Derivate
    Phenazine und ihre Derivate
    Diphenylacetylen und seine Derivate
    Nr. 3 Kationische und anionische Derivate sämtlicher Farbstoffe in Nr. 2.
  • Zur Erzeugung der ersten Fluoreszenz, die den Kern kennzeichnet, können unterschiedliche Fluorophore eingesetzt werden. Kohlenstoff-Nanopunkte bieten vorteilhafterweise eine größenabhängige Photolumineszenzemission, eine ausgeprägte Lumineszenz und eine hohe Beständigkeit gegenüber Photobleichung. Sie haben Vorteile gegenüber Halbleiter-Quantenpunkten, beispielsweise niedrige Kosten, eine hohe Chemikalien- und Lichtstabilität sowie Biokompatibilität.
  • CND können folgendermaßen eingeteilt werden: blaue CND: Emission: 440 nm (Anregung bei 365 nm) Größe: ungefähr 5 nm; grüne CND: Emission: 518 nm (Anregung bei 365 nm) Größe: ungefähr 5 nm; gelbe CND: Emission: 547 nm (Anregung bei 470 nm) Größe: ungefähr 6 nm; rote CND: Emission: 610 nm (Anregung bei 520 nm) Größe: ungefähr 5 nm; rote CND: Emission: 720 nm (Anregung bei 580 nm) Größe: 5 nm. CND für die beschriebene Anwendung können aus all diesen entweder als reine Chargen oder kombiniert miteinander ausgewählt werden.
  • Die Lumineszenz von farbstoffdotierten Polymeren und farbstoffdotierten stabilisierten Mizellen hängt maßgeblich von dem beteiligten Farbstoff ab. Seine Fluoreszenz kann sowohl verstärkt als auch stabilisiert werden, wenn der Farbstoff in einer Hülle eingeschlossen ist, z.B. in Mizellen eingeschlossen ist. Hinsichtlich der Polymere mit Quantenpunktdotierung, Polymere mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion sowie Erdalkalimetallfluorid-Nanopartikeln mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion lässt sich feststellen, dass die jeweiligen Fluorophore so gewählt werden können, dass sie eine zuverlässige Unterscheidung zwischen ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen liefern. Die Anregungswellenlänge/der -bereich ist hierin nicht gleichermaßen wichtig wie die Emissionswellenlänge(n)/der bzw. die Emissionswellenlängenbereich(e). Üblicherweise können beide Emissionen, d.h. das Emissionssignal von der ersten Fluoreszenz (Kern) und das Emissionssignal von der zweiten Fluoreszenz (MGP-Hülle), mit ein und derselben Lichtquelle angeregt werden; im engen Sinne der ratiometrischen Messung wäre dies sogar der Idealfall. Aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften von fluoreszierenden Materialien lässt sich dies in der Realität jedoch schwer erreichen. Die Unterscheidung der beiden Emissionen hängt von der Art der Emission (z.B. Linienformen von Seltenerdmetallionen gegenüber breiteren Banden organischer Farbstoffe) und dem Wellenlängen-Auflösungsvermögen der Nachweisanordnung ab. Zytometer arbeiten oft mit recht schmalen Bandpassfiltern von 20 bis 30 nm, sodass ein derartiger Unterschied der Höchstwerte ausreichend sein wird, wenn die Halbwertsbreite der Bande < zweimal diesen Wert ist und sich die beiden Intensitäten nicht zu stark unterscheiden. Als allgemeine Regel gilt: Je stärker sich die beiden Intensitäten von Kern und Hülle unterscheiden, umso deutlicher getrennt werden die Banden sein, sodass eine schwache Bande immer noch mit angemessener Unsicherheit neben einer intensiven Bande erkannt werden kann.
  • Die zweite Fluoreszenz, durch die die MGP-Hülle gekennzeichnet ist, kann üblicherweise mit einem Indikator oder einem Sondenmolekül erzeugt werden, das in dem MGP aufgenommen ist. Bei der Aufnahme ist ein bloßes physikalisches Einschließen oder eine Adsorption im Vergleich zu einer kovalenten Bindung möglich. Die Begriffe „Sonde“ und „Indikator“ werden häufig synonym verwendet. „Molekulare Sonde“ (oder „molekularer Indikator“) bedeutet, dass die Sonden-/Indikatormoleküle nur sterisch in die Polymermatrix des molekular geprägten Polymers integriert (eingeschlossen) sind. Die Begriffe „Sondenmonomer“ sowie „Indikatormonomer“ jedoch bedeuten, dass diese Moleküle einen reaktionsfähigen Anker tragen, mit dem sie sich durch Polymerisation kovalent in die Polymermatrix einbinden lassen. Dies ist natürlich für gewöhnlich die stabilere und bevorzugte Variante, jedoch sind auch Indikatoren (Sonden) vorhanden, bei denen der Syntheseaufwand zum Erzeugen eines derartigen reaktionsfähigen Derivats (des Indikators/der Sonde) zu hoch ist und der Weg einer sterischen Einbindung in die Polymermatrix leichter erreichbar ist. Wie bereits zuvor erwähnt, kann es sich dabei auch um „fluoreszierende Sonden- oder fluoreszierende Indikatorvernetzer“ handeln.
  • Die technische Aufgabe der beschriebenen Ausführungsformen ist die Bereitstellung eines Mittels und eines Verfahrens zum Anfärben, d.h. Fluoreszenzmarkieren, lebender Zellen. Von besonderem Interesse sind dabei glykosylierte Proteine und glykosylierte Lipide, die als Tumormarker auf Krebszellen bekannt sind, deren Gegenwart optisch nachweisbar sein wird, z.B. mit einem Fluoreszenzsignal in der Mikroskopie und/oder Durchflusszytometrie. Für den angegebenen Zweck werden Partikel mit fluoreszierendem Kern und fluoreszierender MGP-Hülle vorgeschlagen, wie sie zuvor und nachstehend beschrieben sind. Diese Partikel weisen üblicherweise einen Durchmesser von unter 50 nm, insbesondere Durchmesser zwischen 20 und 40 nm auf. Die Dicke der Siliziumdioxidhülle beträgt üblicherweise 20 nm und kann durch Ändern der Hydrolysebedingungen angepasst werden. Die Dicke der MGP-Hülle beträgt ungefähr 10 nm und kann durch Ändern der Monomer- und Vernetzermenge und der Polymerisationsbedingungen angepasst werden. Die den fluoreszierenden Kern umgebende MGP-Hülle weist üblicherweise eine Dicke von ungefähr 10 nm auf. Die Hüllendicke kann angepasst werden. Eine Hüllendicke von über 10 nm ist jedoch problematisch: einerseits ist das zu erkennende Element an eine Zelloberfläche gebunden, d.h. kann nicht in die Polymermatrix diffundieren. Andererseits weist eine dicke Hülle homogen verteilte fluoreszierende Monomere auf, d.h. sie erzeugt ein Fluoreszenzsignal über die gesamte Dicke. Je mehr von den fluoreszierenden Monomeren in einem Bereich liegen, den die Zelloberflächenrückstände nicht erreichen können, umso stärker ist das Hintergrundsignal. Dies hängt natürlich stets vom Prägeverfahren ab, jedoch werden MGP derzeit unter Verwendung löslicher niedermolekularer Template wie SS erzeugt. Bisher wurde eine Art von Epitopprägung eingesetzt, bei der Hohlräume in der gesamten MGP-Hülle entstehen. Da lediglich die äußerste Schicht an die Zelloberfläche bindet, werden die Hüllendicken vorzugsweise dünn gehalten, am günstigsten ca. ≤ 10 nm. MGP können jedoch auch durch Prägen an der Zelloberfläche, z.B. an mit Formalin fixierten Zelloberflächen, erzeugt werden, wie es bei echten künstlichen Antikörpern der Fall wäre.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist ein doppelt fluoreszierendes Partikel vorgeschlagen, wobei das doppelt fluoreszierende Partikel umfasst:
    • - einen Kern mit einer ersten Fluoreszenz; und
    • - eine Hülle aus einem molekular geprägten Polymer (MGP) mit einer zweiten Fluoreszenz, wobei das molekular geprägte Polymer ein organisches Polymer mit Elementen ist, die aus der Gruppe bestehend aus C, H, O, N, P und S ausgewählt sind; und
    wobei das MGP so ausgelegt ist, dass es gezielt an eine Zelloberflächenstruktur bindet;
    wobei die erste Fluoreszenz von einem Element erzeugt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Kohlenstoff-Nanopunkt, einem farbstoffdotierten Polymer, einer farbstoffdotierten stabilisierten Mizelle, einem Polymer mit Quantenpunktdotierung, einem Polymer mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion sowie einem Erdalkalimetallfluorid-Nanopartikel mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion;
    wobei die zweite Fluoreszenz von einem Element erzeugt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Farbstoff, einer molekularen Sonde, einem Indikator, einem Sondenmonomer, einem Indikatormonomer und einem Vernetzer; und
    wobei sich die erste und zweite Fluoreszenz zumindest durch eine Emissionswellenlänge und/oder durch eine Anregungswellenlänge unterscheiden.
  • Die Begriffe „erste Fluoreszenz“ und „zweite Fluoreszenz“ umfassen hierin die Begriffe „erstes Fluoreszenzsignal“ und „erstes Lumineszenzsignal“ beziehungsweise „zweites Fluoreszenzsignal“ und „zweites Lumineszenzsignal“ oder entsprechen ihnen. Wie weiter unten ausführlicher erläutert ist, umfassen die „Fluoreszenz“ und „Lumineszenz“ eines Elements die Emission eines Lichts, dessen Intensität gemessen werden kann. Die gemessenen Werte können zum Berechnen eines Verhältnisses oder, nach einer geeigneten Kalibrierung, zum Berechnen einer Konzentration eines Farbstoff(partikel)s verwendet werden, das das Signal aussendet, oder einfach zur Sichtbarmachung eines bestimmten, mit dem Partikel markierten Objekts. Unter Verwendung eines Verhältnisses der ersten Fluoreszenz und der zweiten Fluoreszenz kann vorteilhafterweise die Zuverlässigkeit eines Messsignals erheblich verbessert werden, da das Verhältnis nicht z.B. von einer Intensität des Anregungslichts abhängt. Typische Messaufbauten umfassen Laser-/Laserdioden-Anregungsquellen in Mikroskopen und Zytometern. Können unterschiedliche Linien eines Einzellasers ausgewählt werden, tritt das Problem nicht auf. Wenn zwei verschiedene Laser verwendet werden müssen, kann ihr Verhalten/ihre Drift unterschiedlich sein, obwohl sie normalerweise recht ähnlich stabil und stabilisiert sind und über dieselbe Steuereinheit betrieben werden. Deshalb sind hier nicht die Laser das Problem, sondern vielmehr der Fokus: Wandern Partikel in den Laserfokus, ob in einer Probe unter dem Mikroskop oder im Zytometermesskanal, ergeben sich Intensitätsänderungen, die nicht auf eine Konzentrationsänderung, sondern einfach auf eine Defokussierung zurückzuführen sind. Durch die konstante Fluoreszenz eines Kerns können diese jedoch problemlos korrigiert werden. Die Mizellen können vorteilhafterweise wie z.B. von Jones et al. (2012) beschrieben erzeugt werden. Seltenerdmetallionen, die mit organischen Liganden verknüpft sein können, können einfach mittels Diffusion in die Polymermatrix aufgenommen werden, ähnlich wie die nachstehend beschriebenen Farbstoffe II. Die Polymerhülle, die das molekular geprägte Polymer umfasst, ermöglicht, dass das doppelt fluoreszierende Partikel an einer Zelloberflächenstruktur gebunden wird, die der Spezifität des molekular geprägten Polymers entspricht. (Eine) bestimmte Zelle(n) kann bzw. können somit gezielt markiert und erkannt oder gezählt werden, d.h. in einer Zellsortierungsvorrichtung.
  • Gemäß einer Ausführungsform umfasst das doppelt fluoreszierende Partikel ferner:
    • - eine SiO2oder TiO2 umfassende strukturelle Hülle, die den Kern umhüllt,
    wobei die Hülle aus einem molekular geprägten Polymer oben auf der strukturellen Hülle angeordnet ist.
  • Die anorganische Hülle ermöglicht vorteilhafterweise die Vergrößerung der Oberfläche des Kerns und die zweckmäßige Bereitstellung von z.B. reaktionsfähigen Gruppen, die von Silanen wie APTES getragen werden, zwecks Verankerung der folgenden MGP-Hülle. Für die anorganischen Emitter und CND stellt sie eine Konjugationsschicht dar, von der aus die MGP wachsen gelassen werden können. Bei dotierten Polymerkügelchen schützt sie zusätzlich den Polymerkern, sodass der Polymerkern während der weiteren synthetischen Anlagerung von Reagenzien und MGP nicht aufgelöst wird oder sich der sterisch eingebettete Farbstoff herauslöst. In einer biologischen Umgebung schützt sie den Kern auch vor Angriffen durch kleine Spezies, die die Fluoreszenz eines Kerns verändern könnten, beispielsweise Protonen (viele der anorganischen Kerne zeigen eine gewisse pH-Abhängigkeit ihrer Fluoreszenz).
  • Gemäß einer Ausführungsform liegt ein mit einem Elektronenmikroskop gemessener mittlerer arithmetischer Durchmesser des doppelt fluoreszierenden Partikels in einem ausgewählten Bereich zwischen 20 nm und weniger als 100 nm.
  • Durch Anpassen der Größe der Partikel kann vorteilhafterweise ihre Aufnahme durch Zellen gesteuert oder sogar ausgelöst werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist eine Dicke der Hülle aus einem molekular geprägten Polymer zwischen 2 nm und 25 nm, insbesondere zwischen 5 nm und 15 nm, vorzugsweise zwischen 5 nm und 10 nm ausgewählt.
  • Vorteile ergeben sich für ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis, wie erörtert, zum Beeinflussen der Dicke sind zuvor erörtert worden.
  • Gemäß einer Ausführungsform bindet das molekular geprägte Polymer der MGP-Hülle ein Glykan ausgewählt aus: N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac, menschliche Form der Sialinsäure (SS)), N-Glycolylneuraminsäure (Neu5Gc, tierische Form der Sialinsäure), Siaα2-6GalNAc (Sialyl-Tn), Siaα2-3Galβ 1-3GalNAc (Sialyl-T), Siaα 2,3 Galβ 1,4(Fuca 1,3)GlcNAc (Sialyl-LewisX) oder Sia2,3Galβ 1,3(Fucα 1,4) GlcNAc (Sialyl-LewisA), Siaα2,3-Galβ, Siaα 2,6-Galβ, Siaα2,3- N-Acetyllactosamin, Siaα2,6- N-Acetyllactosamin, GlcA2SO3 1,4-Glc2NSO3 oder GlcA2SO3 1,4-Glc2NSO36SO3, Neu5Acα2-3Neu5Acα oder eu5Acα2-6Neu5Aca. So ist beispielsweise Sialyl-Tn beschrieben als Neu5Acα2-6GalNAcα1-, Sialyl-T ist beschrieben als Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα; Sialyl-LewisA ist beschrieben als Neu5Acα2-3Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAcβ-, Sialyl-LewisX ist beschrieben als Neu5Acα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcβ-; Neu5Acα2-3Galβ, Neu5Acα2-6Galβ können ebenfalls zum molekularen Prägen verwendet werden.
  • Diese Strukturen liegen vorteilhafterweise an der Oberfläche von immunkompetenten Zellen in unterschiedlichen Differenzierungsstufen vor oder können einer Tumorzelle zugehörig sein.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird das molekular geprägte Polymer erzeugt durch eine Polymerisation von mindestens einer Art eines Monomers ausgewählt aus: Acrylamid, Vinylpyridin, N-Isopropylacrylamid, 2-Hydroxyethylmethacrylat, Methylmethacrylat, Benzylmethacrylat, Methacrylat, Methacrylamid, N,N'-Dimethylmethacrylamid, Trifluormethylacrylat, 2-Aminoethylmethacrylat, Vinylalkohol, Vinylimidazol, Vinylphenylboronsäure, aminosubstituierter Vinylphenylboronsäure, Vinylbenzaldehyd, Vinylanilin; mit einem Vernetzungsmittel ausgewählt aus: Ethylendimethacrylat, Ethylenglycoldimethacrylat, N,N'-Methylendiacrylamid, Divinylbenzol, Tetramethylendimethacrylat, Polyacrylsäure, einem bis(-Hydroxyethyl)sulfon, Trimethylolpropantrimethacrylat und Pentaerythritoltriacrylat.
  • Diese Monomere und Vernetzermoleküle sind vorteilhafterweise wasserlöslich oder in gemischten wässrigen Lösungen wie Wasser-Methanol-Mischungen oder Methanol löslich und lassen sich in Gegenwart der entsprechenden Templatmoleküle polymerisieren. Entsprechende Templatmoleküle umfassen üblicherweise Zuckersäuren, Glykane und Glycopeptide, die recht abhängig von den Lösungsmittelbedingungen sind. In gepufferten wässrigen Lösungen, die für die Polymerisation der angegebenen Monomere und Vernetzer verwendet werden können, behalten diese Zuckersäuren, Glykane und Glycopeptide vorteilhafterweise ihre ursprüngliche Struktur, d.h. es kann verhindert werden, dass sie denaturieren.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist das Seltenerdmetallion ausgewählt aus: Cer (Ce), Europium (Eu), Gadolinium (Gd), Neodym (Nd), Scandium (Sc), Terbium (Tb), Ytterbium (Yb) und Yttrium (Y), Dysprosium (Dy), Samarium (Sm), Holmium (Ho), Erbium (Er), Thulium (Tm) und Praseodym (Pr).
  • Diese Seltenerdmetallionen weisen vorteilhafterweise Fluoreszenzeigenschaften auf, die üblicherweise keine ungewöhnlichen optischen Filtereinstellungen erfordern. Anders ausgedrückt kann zum Anregen und Messen der jeweiligen Lumineszenz Standardlaborausrüstung verwendet werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Erdalkalimetallfluorid-Nanopartikel mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion ein Fluorid von Ca, Ba oder Sr; und das Seltenerdmetallion ist ausgewählt aus: Ce, Eu und Tb.
  • Die Erdalkalimetallfluorid-Nanopartikel mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion, wie sie z.B. von Ritter et al. (2017) beschrieben worden sind, weisen vorteilhafterweise üblicherweise eine Größe unter 5 nm auf, tragen an ihrer Oberfläche möglicherweise hydrophobe Liganden. Sie können in den Polymerkern entweder sterisch oder wie nachstehend unter Punkt 2.4 beschrieben aufgenommen sein. Diese Partikel sind bei Zimmertemperatur leicht zugänglich und sind zwischen 3 und 20 nm groß. Partikel dieser Größe können leicht in den Polymerkern aufgenommen werden. Eine genaue Anpassung der Lumineszenzeigenschaften kann vorteilhafterweise durch Veränderung des Ca-zu-Sr-Verhältnisses erzielt werden. Eine gemeinsame Dotierung mit Ce3+ und Tb3+ bewirkt einen starken Anstieg (>50-fach) der grünen Lumineszenzintensität aufgrund einer Energieübertragung Ce3+ --> Tb3+.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zum Suchen nach einer Zielzelle in einer Probe vorgeschlagen, wobei die Zielzelle durch eine Zelloberflächenstruktur gekennzeichnet ist, d.h. eine Membranmarkerstruktur, und das Verfahren umfasst:
    • - Bereitstellen eines doppelt fluoreszierenden Partikels laut Beschreibung in einer der Ausführungsformen zuvor;
    • - Ermöglichen eines Kontakts zwischen dem doppelt fluoreszierenden Partikel und einer Vielzahl von Zellen aus der Probe, die möglicherweise eine Zelle mit der Zelloberflächenstruktur (d.h. der Membranmarkerstruktur) umfasst;
    • - Nachweisen einer Zelle mit der Zelloberflächenstruktur (d.h. der Membranmarkerstruktur) mit daran gebundenen doppelt fluoreszierenden Partikeln;
    • - Ermitteln eines Vorhandenseins der Zielzelle in der Probe.
  • Zellsuchverfahren sind vorteilhafterweise eine typische Voraussetzung für viele praktisch bedeutsame Nachweisabläufe. Der Nachweis zirkulierender Tumorzellen, die Entstehung von Metastasen kann mittels Zellsuche erfasst werden. Aktuelle Verfahren zum Nachweis zirkulierender Tumorzellen sind nicht ausreichend und Glykanmarker werden aufgrund von schwachen Liganden nicht untersucht. Die doppelt fluoreszierenden Partikel weisen die tumorzellspezifischen Oberflächenstrukturen nach und ergänzen derzeitige Verfahren unter Verwendung von Antikörpern oder Farbstoffen für andere Biomarker.
  • Gemäß einer Ausführungsform umfasst der vorstehende Vorgang „Nachweisen der Zelle“ ein Messen eines Verhältnisses einer ersten Fluoreszenz und einer zweiten Fluoreszenz des doppelt fluoreszierenden Partikels.
  • Der Nachweis eines bestimmten Signalverhältnisses ist vorteilhafterweise ein gemeinsames Merkmal aller modernen Zellsortiergeräte (FACS-Scan). Insbesondere kann ein Verhältnis von Fluoreszenzemissionssignalen, die an unterschiedlichen Kanälen gemessen werden, zum Erkennen eines bestimmten Zelltyps verwendet werden. Die doppelt fluoreszierenden Partikel liefern nach der Bindung ein sehr empfindliches Signal, das problemlos mittels Durchflusszytometrie gemessen werden kann.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist die Zelloberflächenstruktur ein glykosyliertes Protein oder ein glykosyliertes Lipid.
  • Der Nachweis von Glycosidstrukturen und ihr Vergleich lässt vorteilhafterweise die Erkennung von Veränderungen der Glykosylierung als Biomarker für die Krebserkennung zu. Der Nachweis von Sialinsäure-Glycoprotein- und Sialinsäure-Glycolipid-Strukturen in Tumorgeweben und Normalkontrollen kann beispielsweise zum Überprüfen einer Diagnose oder zur Beurteilung der Wirksamkeit eines Wirkstoffs oder Arzneimittels verwendet werden. Mit doppelt fluoreszierenden und gegenüber Sialinsäure sehr spezifischen Partikeln erfolgt der Nachweis von Tumorzellen, die viel Sialinsäure exprimieren, problemlos durch Auswahl aus normalen Zellen, da diese meistens sehr wenig Sialinsäure exprimieren.
  • Gemäß einer Ausführungsform umfasst das vorstehende Verfahren ferner:
    • - Isolieren der Zielzelle.
  • Die moderne Biotechnologie und Tierzellkultur basiert üblicherweise auf Einzelzellen. Zum Isolieren einer Zielzelle zwecks Herstellung einer Zelllinie muss die Zielzelle zuerst erkannt werden. Diese Erkennung lässt sich unter Verwendung des vorgeschlagenen Verfahrens mit einer hohen Empfindlichkeit erreichen. Alle Zellen, die viel Sialinsäure exprimieren, könnten mit Hilfe von hochspezifischen fluoreszierenden Sialinsäure-spezifischen Nanopartikeln eingefangen und isoliert werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Etablieren einer Zielzelllinie vorgeschlagen, wobei die Zellen der Zielzelllinie durch eine Zelloberflächenstruktur gekennzeichnet sind, die auch als Membranmarkerstruktur bekannt ist. Üblicherweise umfasst die Zelloberflächenstruktur ein glykosyliertes Protein und/oder ein glykosyliertes Lipid, die in der Zellmembran der Zelle verankert sind. Das Verfahren umfasst ein Isolieren von mindestens einer einzelnen Zielzelle aus einer Mehrzahl von Zellen durch Anwenden des Suchverfahrens nach einer der zuvor beschriebenen Ausführungsformen und ihre Kultivierung.
  • Das Isolieren einer Zielzelle ermöglicht vorteilhafterweise ein Etablieren einer Zelllinie entweder zur Produktion eines bestimmten Biomoleküls (Antikörper, Wachstumsfaktor/Zytokin, Enzym....) oder zur Bereitstellung eines Zellmodells zwecks Untersuchung von Wirkungen eines Wirkstoffs (Arzneimittelforschung). Zur Untersuchung der Wirkung eines bestimmten Moleküls oder einer bestimmten Substanz ist die klonale Selektion von Zellen von Vorteil. Die fluoreszierenden Sialinsäure-spezifischen können als derartiges Hilfsmittel verwendet werden, um Zellen mit einer hohen Expression von Sialinsäure spezifisch abzutrennen.
  • Gemäß einer Ausführungsform in dem Herstellungsverfahren ist die Zielzelle eine ein bestimmtes Immunglobulin produzierende Zelle oder eine ein bestimmtes Zytokin produzierende Zelle.
  • Immunglobuline können vorteilhafterweise sowohl in Diagnose- als auch Therapieanwendungen eingesetzt werden. Zytokine können sowohl für die Stimulation bestimmter Zelllinien in einer Zellkultur, z.B. in der Biotechnologie, als auch zum Behandeln einer Krankheit verwendet werden. Zur Untersuchung einer bestimmten Zelllinie ist die klonale Selektion von Zellen von Vorteil. Die fluoreszierenden Sialinsäure-spezifischen können als derartiges Hilfsmittel verwendet werden, um Zellen mit einer hohen Expression von Sialinsäure spezifisch abzutrennen.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird eine Verwendung eines wie zuvor beschriebenen doppelt fluoreszierenden Partikels für die in-vitro-Erkennung und/oder - Kennzeichnung von zirkulierenden Tumorzellen in einer Blutprobe vorgeschlagen.
  • Ratiometrische Doppelsignalmessungen können vorteilhafterweise die Genauigkeit und Empfindlichkeit einer Untersuchung wirksam verbessern. Bei derartigen Messungen werden Intensitätsschwankungen aufgrund von Ausgangsleistungsschwankungen der Anregungsquelle, Defokussierungseffekten oder Photobleichung weitgehend vermieden.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird eine Verwendung eines wie zuvor beschriebenen doppelt fluoreszierenden Partikels zum Erkennen einer Zelle, einer Zelllinie oder eines Hybridoms vorgeschlagen, wobei die Zelle, die Zelllinie und das Hybridom ein bestimmtes Immunglobulin oder ein bestimmtes Zytokin produziert.
  • Vorteilhafterweise werden Zelllinien, insbesondere Hybridomzelllinien verwendet, um dauerhaft eine bestimmte Verbindung zu produzieren, die durch Biosynthese in der Zelle erzeugt und vorteilhafterweise in das Kulturmedium freigesetzt wird. Für die Verwendung von Zellen, Zelllinien oder Hybridomen ist die klonale Selektion von Zellen von Vorteil. Die fluoreszierenden Sialinsäure-spezifischen können als derartiges Hilfsmittel verwendet werden, um Zellen mit einer hohen Expression von Sialinsäure spezifisch abzutrennen.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist ein Bildgebungsverfahren für die Krebserkennung in einem Gewebe vorgeschlagen. Das vorgeschlagene Bildgebungsverfahren umfasst: Ermitteln eines Fluoreszenzverhältnisses an einem doppelt fluoreszierenden Partikel und Erzeugen eines Bilds des Gewebes, das Zellen umfasst, wobei Zellen mit einer Oberflächenstruktur, die von doppelt fluoreszierenden Partikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erkannt wird, vor einem Hintergrund des Bilds hervorgehoben werden.
  • Diese Aufnahmen können vorteilhafterweise zum Nachweis von Krebszellen im Gewebe verwendet werden. Ein Gewebe besteht normalerweise aus verschiedenen unterschiedlichen Arten von Zellen, sowohl normalen Zellen als auch dem interessierenden Tumor. Im Optimalfall exprimieren die Tumorzellen mehr Sialinsäure und können von den normalen Zellen unter Verwendung der doppelt fluoreszierenden Partikel aufgrund eines höheren Bindungsverhältnisses und gemessener Fluoreszenz unterschieden werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform umfasst in dem vorgeschlagenen Bildgebungsverfahren das Gewebe eine histologische Probe, die in vitro untersucht wird. Das Gewebe kann dabei z.B. mit einer Nadelbiopsie erhalten worden sein.
  • Bösartiges Gewebe kann vorteilhafterweise erkannt, ein Therapeutikum und/oder eine Therapie kann beurteilt und die Prognose für einen Patienten kann möglicherweise verbessert werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Zellsortierungsverfahren vorgeschlagen, wobei das Verfahren umfasst: Markieren einer Zelle mit dem zuvor vorgeschlagenen (und in einem der Ansprüche 1 bis 8 beschriebenen) doppelt fluoreszierenden Partikel, Ermitteln eines Verhältnisses aus ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen; und Erfassen des Vorhandenseins einer Zelle, die mit dem doppelt fluoreszierenden Partikel markiert ist. Das Zellsortierungsverfahren kann gegebenenfalls ein gezieltes Sammeln erfasster Zellen umfassen, wobei Zellen, die identische Partikel oder Partikelgruppen tragen, sortiert und/oder gesammelt werden.
  • Vorteilhafterweise können spezifische Zellen, z.B. Tumoren anzeigende Zellen, die in einer Blutprobe enthalten sind, zuverlässig nachgewiesen werden. Eine Diagnose kann somit überprüft oder mit einer Therapie für einen Patienten mit zirkulierenden Zellen eines bestimmten Typs begonnen werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist in dem vorgeschlagenen Zellsortierungsverfahren das molekular geprägte Polymer der Polymerhülle des doppelt fluoreszierenden Partikels so ausgelegt, dass es eine bestimmte Zelloberflächenstruktur erkennt, insbesondere ein glykosyliertes, in der Membran verankertes Molekül, z.B. eine CD-Struktur oder ein Tumormarker. Wie vom Fachmann in Erwägung gezogen werden kann, kann auch eine Kombination aus verschiedenen doppelt fluoreszierenden Partikeln verwendet werden, die unterschiedliche Kombinationen aus ersten und zweiten Fluoreszenzen umfassen, wobei jede Kombination durch eine bestimmte Spezifität der MGP-Hülle gekennzeichnet ist. Bestimmte Kombinationen von Zelloberflächenmarkern auf einer Zelle können so zuverlässig nachgewiesen werden. Die doppelt fluoreszierenden Partikel können gemeinsam mit anderen Markierungen oder Partikeln, z.B. in einem Multiplex-Assay, angewendet werden.
  • Üblicherweise sind glykosylierte Strukturen, z.B. Proteine oder Lipide, die z.B. ein Sialinsäurederivat umfassen, als Tumormarker bekannt. Ihr zuverlässiger Nachweis kann somit hilfreich sein. Sialinsäure ist ein Oberbegriff für die N- oder O-substituierten Derivate von Neuraminsäure, einem Monosaccharid mit einem Gerüst aus neun Kohlenstoffatomen. Es handelt sich auch um den Namen für den häufigsten Vertreter dieser Gruppe, N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac). Sialinsäuren sind in tierischen Geweben weitverbreitet anzutreffen und in geringerem Maße in weiteren Organismen, von Pflanzen und Pilzen hin zu Hefen und Bakterien, am häufigsten in Glykoproteinen und Gangliosiden, die am Ende von Zuckerketten vorhanden sind, die mit den Oberflächen von Zellen und löslichen Proteinen verbunden sind.
  • Jede der zuvor beschriebenen Ausführungsformen kann mit jeder beliebigen anderen Ausführungsform oder Ausführungsformen kombiniert werden, sofern nicht ausdrücklich etwas Gegenteiliges angegeben ist.
  • Doppelt fluoreszierende Reporterpartikel für den Nachweis von Tumormarkern, die einen fluoreszierenden Kern und eine anders fluoreszierende MGP-Hülle umfassen, ermöglichen ratiometrische Doppelsignalmessungen. Derartige Messungen können die Genauigkeit und Empfindlichkeit entsprechender Erfassungsanwendungen wirksam verbessern. Durch eine rationale Ausgestaltung neuer MGP-Sonden, z.B. mit einer schichtweisen Anordnung (elektrostatische schichtweise Abscheidung) oder mit Kern-Hülle-Strukturen, die zwei oder mehr Arten von Sondenmolekülen umfassen (die jeweils charakteristische Fluoreszenzeigenschaften aufweisen), können jeweils in unterschiedliche Bereiche der Kern-Hülle-Struktur eingebracht werden. Nach müheloser Kombination fluoreszierender MGP-Schichten auf fluoreszierenden Kernen können eine Erkennung auf MGP-Basis und Bildgebungssonden für bestimmte Anwendungen individuell angepasst werden. Diese Kern-Hülle-Partikel, d.h. doppelt fluoreszierenden Partikel, ermöglichen eine quantitative Multiplex-Erfassung von Zielmolekülen, die entweder von lebenden oder fixierten Zellen (und Geweben) exprimiert oder an Feststoffoberflächen befestigt sind. Die Zielmoleküle sind üblicherweise Biomoleküle wie Membranproteine oder -lipide. Die Biomoleküle umfassen vorzugsweise Oligosaccharide, die an bestimmten Aminosäureresten des Membranproteins oder an bestimmten Strukturen eines in der Membran verankerten Lipids befestigt sind. Die so an der Außenseite der Zellmembran verankerten Oligosaccharide sind für biologische Prozesse wie Zelladhäsion oder Zelle-Zelle-Wechselwirkungen von Bedeutung. Insbesondere spielen Glycosphingolipide eine wichtige Rolle bei der Onkogenese und Ontogenese und es ist daher wichtig, sie mit einer geeigneten Untersuchung zu überwachen.
  • Zu Anwendungen für die vorgeschlagenen doppelt fluoreszierenden Partikel in der Zellkultur und Krebsforschung gehören Untersuchungen sowohl zur Migration als auch zur Viabilität. Des Weiteren kann die immunhistochemische Markierung durch ausgeprägtere Selektivität und Empfindlichkeit verbessert werden, für die die doppelt fluoreszierenden Partikel in unterschiedlichen Multiplexformaten sorgen. In der Diagnose und Arzneimittelforschung lassen sich damit zirkulierende Tumorzellen nachweisen, d.h. metastasierende solide Tumore.
  • Anwendungen für die doppelt fluoreszierenden Partikel und darauf beruhende Bildgebungsverfahren sind sowohl für die klinische Praxis als auch die Arzneimittelforschung, z.B. unter Verwendung von Mausmodellen, und in der Zellkultur vorgeschlagen.
  • Multiplex-Assay mit farbkodierten Kügelchen zur Unterscheidung von Zellen, die unterschiedliche Biomarker exprimieren. Verbesserte Stabilität des Tumormarkernachweises, da sich MGP-Partikel im Vergleich zu Antikörpern leichter aufbewahren und handhaben lassen. Einfache Herstellung im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren zur Antikörperherstellung, insbesondere gegen glykosylierte Proteine.
  • Kleine (kleiner als 100 nm) zweifach emittierende (blau+gelb oder rot+gelb usw.) MGP-Sonden liefern in der Mikroskopie und Zytometrie helle Signale. Im Prinzip sind die vorgeschlagenen Partikel für Anwendungen mit sämtlichen üblichen Laser-/Laserdioden-Anregungswellenlängen und Emissionsfiltereinstellungen bestimmt, die bei marktüblichen Fluoreszenzmikroskopen und Zytometern gewöhnlich zur Verfügung stehen. Es lassen sich keine klaren Bevorzugungen angeben, denn wenn beispielsweise eine gemeinsame Anfärbung von Zellorganellen (siehe DAPI-Beispiel in 18 und 19) notwendig ist, können die optimalen Wellenlängenfenster der doppelt fluoreszierenden Partikel wieder andere sein als bei der Anwendung der Partikel allein.
  • Ein Hauptvorteil der vorgeschlagenen Ausführungsformen ist, dass ein neues Hilfsmittel für die Zellbiologie bereitgestellt wird.
  • 1 zeigt die Erzeugung eines doppelt fluoreszierenden Partikels, wie in Beispiel 1 beschrieben, d.h. ein Partikel, das einen Kern aus einem fluoreszierenden Kohlenstoff-Nanopunkt mit einer strukturellen Siliziumdioxid-Hülle umfasst, die von einer Hülle aus einem fluoreszierenden molekular geprägten Polymer (MGP) umhüllt ist. Ein derartiges Partikel ist im vorliegenden Dokument abgekürzt als CND@SiO2@MGP.
  • 2 zeigt des Weiteren ein repräsentatives Fluoreszenzspektrum von CND in Ethanol.
  • In 3 sind AFM-Aufnahmen von CND dargestellt, die für Kerne der CND@SiO2@MGP verwendet werden. Die CND wurden auf einem Siliziumwafer abgeschieden. Die hellen, ungefähr 5 nm hohen Punkte sind CND.
  • 4 zeigt das Fluoreszenzspektrum in Wasser (links) und eine TEM-Aufnahme (rechts) von CND@SiO2; Maßstabsleiste = 200 nm.
  • 5 zeigt ein von in Wasser suspendierten CND@SiO2-APT aufgenommenes Fluoreszenzspektrum.
  • 6 zeigt das Fluoreszenzspektrum (in Wasser) von CND@SiO2, die mit 4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanonsäure (CPBA) modifiziert wurden, um CND@SiO2-RAFT zu erhalten, wie für Beispiel 1 beschrieben ist. Die photographische Aufnahme von CND@SiO2-RAFT rechts zeigt die übliche rosa Farbe des RAFT-Mittels.
  • 7 zeigt eine TEM-Aufnahme einer repräsentativen Charge von dotierten CND@SiO2@MGP-Partikeln, geprägt mit SS. Das rechte Bild zeigt das entsprechende EDX-Spektrum.
  • 8 zeigt das zweifache Fluoreszenzsignal von CND@SiO2@MGP in Methanol (links) und das eines zweiten CND@SiO2@MGP in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen deprotonierter Sialinsäure in Chloroform (rechts).
  • 9 veranschaulicht den Syntheseweg hin zu und die Struktur von PS@SiO2@MGP, wie unter Beispiel 2 beschrieben ist, umfassend folgende Schritte: Polymerisieren von Styrol (1); Dotieren von Polystyrol (PS) mit Farbstoff (2); Beschichten von PS mit Siliziumdioxid (3); Einbringen von Amino- und RAFT-Gruppen in die Siliziumdioxid-Beschichtung (4) und Herstellen einer Schicht aus einem fluoreszierenden geprägten Polymer (5).
  • In 10 ist links die Größenverteilung für die Entstehung eines PS-Kerns für sechs verschiedene Wiederholungen von Reaktionslösungen nach 5,5 Stunden dargestellt. Das Diagramm rechts zeigt Zeta-Potential-Messungen von drei unterschiedlichen Chargen. Die Partikelgröße verschiedener Chargen von PS-Kernen sind insbesondere mittels dynamischer Lichtstreuung bestimmt worden, mittlerer Durchmesser 89,7 ± 21,1 nm. Der Polydispersitätsindex (PDI) betrug ≤ 0,04. Das rechte Diagramm zeigt entsprechende Zeta-Potentiale (Durchschnitt +52,7 mV), die die positive Oberflächen-Nettoladung der PS-Kerne angeben.
  • 11 zeigt eine TEM-Aufnahme repräsentativer Polystyrolkerne, wie sie für die Herstellung von Partikeln verwendet werden.
  • 12 insbesondere zeigt links die Fluoreszenzemissionsspektren von PS-Kernen, die mit Farbstoff II dotiert wurden, suspendiert in 0,5 %-iger Tensidlösung (Brij® L23), in Abhängigkeit von der Farbstoffkonzentration in der Dotierungslösung. Rechts ist eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von PS-Partikeln mit angegebenem unterschiedlichem Farbstoffgehalt gezeigt, aufgenommen mit einem Bandpassfilter 460 bis 495 nm bei der Anregung und einem Langpassfilter 510 nm bei der Emission.
  • 13 ist eine TEM-Aufnahme einer repräsentativen Charge von farbstoffdotierten PS-Kernen, d.h. PS-Partikeln, die wie nachstehend angegeben mit Farbstoff II dotiert wurden.
  • 14 zeigt links eine TEM-Aufnahme einer repräsentativen Charge von PS@ SiO2-Partikeln und rechts ein entsprechendes EDX-Spektrum.
  • 15 ist eine fotographische Aufnahme der mit einem RAFT-Mittel modifizierten PS@SiO2-APT, in der die typische rosa Farbe des RAFT-Mittels zu erkennen ist. Durch die Modifikation entstehen PS@SiO2-RAFT-Partikel.
  • 16 zeigt zwei repräsentative TEM-Aufnahmen von PS@SiO2@MGP-Partikeln, die sowohl einen fluoreszierenden Kern als auch eine fluoreszierende MGP-Schicht umfassen. Wie weiter unten beschrieben ist, wurde das MGP mit Sialinsäure (SS) als Templat erzeugt.
  • 17 stellt eine Fluoreszenztitration von PS@SiO2@MGP dar, geprägt mit Sialinsäure (SS), nach Zugabe von zunehmenden Mengen von SS in Dimethylformamid. In der Figur ist ein Anstieg der MGP-Fluoreszenz nach Zugabe von zunehmenden Mengen Sialinsäure zur Lösung zu erkennen.
  • 18 zeigt eine Monolage aus menschlichen Brustkrebszellen (MDA-MB 231). Nach Inkubation der Zellen mit 150 µg/ml MU MGP und anschließendem Waschen waren allem Anschein nach > 50 % der Zellen gezielt markiert. Die grüne Fluoreszenz stammt von den gebundenen Sialinsäure-spezifischen Teilchen. Die Kerne sind mit DAPI angefärbt, wodurch sie blau aussehen.
  • 19 zeigt eine Fluoreszenzmikroskopie-/Phasenkontrastaufnahme von Zellen der murinen Makrophagenzelllinie RAW 264.7, die mit 0,4 mg/ml BAM SS-MGP inkubiert wurden. Mausmakrophagenzellen RAW264.7 wurden in einem Röhrchen mit 0,4 mg/ml SSMGP inkubiert. Die ungebundenen SSMGP wurden direkt nach dem Anfärben mittels Zentrifugation bei einer geringeren Beschleunigung (20xg) „nach Größe getrennt“. Damit können viele ungebundene SSMGP zur Verbesserung der Probenanalyse entfernt werden. In diesem Fall wurden die RAW264.7 Zellen, die die SSMGP gebunden haben, vor der Analyse weiter in einer Schale kultiviert. Sie durften sich über Nacht anlagern und die gebundenen SSMGP wurden möglicherweise auch von den Makrophagen aufgenommen (siehe Aufnahme). Die Kerne sind mit DAPI angefärbt, wodurch sie blau aussehen. Die grüne Fluoreszenz stammt von den gebundenen und zu einem gewissen Teil aufgenommenen Sialinsäure-spezifischen Teilchen. Die Kerne sind mit DAPI angefärbt, wodurch sie blau aussehen.
  • 20 zeigt einen Vergleich von durchflusszytometrischen Messungen, die mit menschlichen Brustkrebszellen (MCF-7) nach der Markierung mit unterschiedlichen Chargen von doppelt fluoreszierenden Partikeln (SS-MGP und SS-UGP) erhalten wurden. Bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml ergab sich eine höhere prozentuale positive Anfärbung mit KIM0134d (BAM- SSMGP) im Vergleich zu KIM0134e (BAM-SSUGP); 13,5% bei BAM-SSMGP im Vergleich zu 8,2% bei BAM-SSUGP. Hier werden die SS-MGP verwendet, also wird SS als Ziel angesteuert. Die angefärbten Brustkrebszellen der Zelllinie MCF-7 wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Es werden mehrere verschiedene SSMGP-Chargen verwendet. B1=MU SSMGP mit der Konzentration 0,1 mg/ml; D2=BAM SSMGP mit 0,04 mg/ml (es wurde ermittelt, dass sie dieselben Ergebnisse wie MU SSMGP bei 0,1 mg/l liefern) sowie die Chargen KIM0134c, KIM0134d und KIM0134e. Bei der Konzentration 0,1 mg/ml ist zu erkennen, dass KIM0134d (SSMGP) im Vergleich zu KIM0134e (SSUGP) ein besseres Anfärbungsergebnis liefert.
  • Die beschriebenen Ausführungsformen sind in vielseitigen Anwendungsbereichen zum Nachweis unterschiedlicher Einzelzellen und Zellgruppen im Bereich Medizin, Biochemie und Lebensmitteldiagnostik einsetzbar. Zum Aufzeigen der Machbarkeit vorgeschlagener Ausführungsformen sind nachstehend einige Beispiele aufgeführt, in denen die verwendeten Laborverfahren und Materialien beschrieben sind.
  • PRAKTISCHE BEISPIELE
  • Beispiel 1:
  • Partikel mit fluoreszierendem Kohlenstoff-Nanopunkt-Kern/struktureller Siliziumdioxid-Hülle/fluoreszierender MGP-Hülle (CND@SiO2@MGP)
  • Materialien
  • Acetonitril, Toluol, Chloroform (alle wasserfrei), alle anderen Lösungsmittel (UV/VIS-Qualität), 4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanonsäure (CPBA), (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES), Ethylenglycoldimethacrylat (EGDMA), Zitronensäure, Triton X-100, Methacrylsäure-2-isocyanatoethylester, Tetrabutylammoniumhydroxid (TBA-OH) und Ethylendiamin wurden von Sigma Aldrich erworben. Ethylchloroformat und Butylhydroxytoluol (BHT) stammten von Fluka und Tetraethylorthosilicat (TEOS) und Ammoniak von Merck. Vinylbenzolboronsäure, 4-Chlor-7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol (NBD-Cl) und n-Hexanol wurden von Alfa Aesar erworben, 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril) (ABDV) von Wako. N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure, SS) wurde von Carl Roth erworben. Milli-Q-Wasser wurde mit einem Milli-Q-Wasserreinigungssystem (Millipore Synthesis A10) erhalten.
  • Geräte
  • 1H- und 13C-NMR-Spektren wurden mit den Spektrometern AV-400 und AVANCE III 500 von Bruker aufgezeichnet, Massenspektren wurden mit einem ToF-Massenspektrometer LCT Premier XE von Waters aufgenommen und TEM-Aufnahmen mit einem Transmissionselektronenmikroskop Talos™ F200S (200 kV) von FEI Co. Elementaranalysen wurden unter Verwendung eines Elementaranalysegeräts Euro EA durchgeführt. UV/VIS-Absorptionsspektren wurden mit einem Spektralphotometer Analytik Jena Specord 210 Plus aufgenommen. Kontinuierliche Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Spektrofluorometer FluoroMax-4P von Horiba Jobin-Yvon unter Verwendung von Standard-Quarzküvetten mit einer Weglänge von 10 mm durchgeführt.
  • Synthese von Sondenmonomer I
  • Synthese von 4-Amino-7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol
  • NBD-Cl (1 g, 5,01 mmol) wurde in 25 ml MeOH gelöst. Nach Zugabe von 3 ml Ammoniak (32 %) wurde die Mischung 2 h weiter gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel mit Aceton-Cyclohexan (3:1 - 1:1) zum Erhalten des Produkts in 0,54 g (60 %) als braunes Pulver, Schmelzpunkt 272-273 °C gereinigt. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ=8,46 (2H, d, J 8,0), 6,41 (2H, d, J 8,0). Elementaranalyse, berechnet (%) für C6H4N4O3: C, 40,01; H, 2,24; N, 31,10, gefunden: C, 40,23; H, 2,22; N, 30,84.
  • Synthese von (2-(3-(7-Nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-yl)ureido)ethylmethacrylat) (I).
  • 4-Amino-7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol (200 mg, 1,1 mmol) wurde in 10 ml trockenem THF gelöst. Nach Zugabe von 20 mg BHT (Butylhydroxytoluol) als Stabilisator wurde Methacrylsäure-2-isocyanatoethylester (257 mg, 1,7 mmol) zugegeben und die Mischung wurde 12 h lang weiter gerührt. Die Mischung wurde auf Kieselgel mit Aceton-Cyclohexan (5:1 - 2:1) gereinigt, als Ausbeute ergaben sich 294,8 mg eines gelben Pulvers aus I (siehe nachstehende ). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ=8,49 (1H, d, J 8,5), 8,18 (1H, d, J 8,5), 8,13 (1H), 6,11 (1H, t), 5,65 (1H, t) 5,58 (1H, t), 4,32 (2H, t, J 5,0), 3,63 (2H, q, J 5,0), 1,90 (3H, s). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ=166,02, 153,20, 144,86, 142,94, 136,33, 135,28, 127,04, 125,61, 108,93, 62,98, 37,97, 17,51. Elementaranalyse, berechnet (%) für C13H13N5O6: C, 46,57; H, 3,91; N, 20,89, gefunden: C, 46,69; H, 3,89; N, 20,68; HRMS (ESI-): m/z [M-H]- berechnet für C13H13N5O6: 334,0793, gefunden: 334,0790.
    Figure DE102018115136B3_0001
  • Synthese von Kohlenstoff-Nanopunkten (CND)
  • Zitronensäure (0,840 g) und Ethylendiamin (1072 µl) wurden in Milli-Q-Wasser (20 ml) gelöst. Nach Überführung in einen mit Polytetrafluorethylen) (Teflon) ausgekleideten Autoklaven (25 ml) wurde die Lösung 5 h lang auf 200 °C erwärmt. Nach der Reaktion wurden die Reaktoren auf Zimmertemperatur abgekühlt. Das Produkt, schwarzbraun und durchsichtig, wurde 24 h dialysiert, um die CND zu erhalten.
  • Siliziumdioxidbeschichtung von Partikeln mit einem Kohlenstoff-Nanopunkt-Kern (CND@SiO2)
  • Durch Mischen von 17,7 g Triton X-100, 77 ml Cyclohexan, 16 ml n-Hexanol und 3,4 ml Milli-Q-Wasser in einem 250 ml Glaskolben und 15 min Rühren wurde eine Wasser-in-Öl(WÖ)-Mikroemulsion hergestellt. Anschließend wurden 0,40 ml einer wässrigen Lösung aus CND (0,1 ml CND in 1 ml Milli-Q-Wasser bei pH=2) der Emulsion zugegeben und 5 min gerührt, mit anschließender Zugabe von 0,50 ml TEOS und weiteren 30 min Rühren. Die Hydrolyse von TEOS wurde durch Zugabe von 1,0 ml NF4OH eingeleitet und die Mischung wurde bei Zimmertemperatur 24 h gerührt. Nach abgeschlossener Siliziumdioxid-Beschichtung wurden zum Brechen der Mikroemulsion 50 ml Ethanol verwendet. Die mit Siliziumdioxid beschichteten Kohlenstoff-Nanopunkte (CND@SiO2) wurden nach viermaligem Waschen mit Ethanol und Trocknen in einem Vakuumofen isoliert.
  • Modifizierung mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (CND@SiO2-APT)
  • Zu einer Lösung aus 500 mg CND@SiO2 in 60 ml trockenem Toluol wurden 4 ml APTES zugegeben. Die Mischung wurde 30 min bei gleichzeitiger Erwärmung auf 120 °C unter Rückfluss entgast. Die Reaktion wurde 24 h unter Ar-Atmosphäre weiter gerührt. Nach abgeschlossener Reaktion wurden CND@SiO2-APT durch Zugabe von 20 ml Cyclohexan ausgefällt und dreimal mit Toluol gewaschen.
  • Modifizierung mit einem RAFT-Mittel (CND@SiO2-RAFT)
  • Zu einer Lösung aus 190 mg CPBA in 10 ml trockenem THF wurden 65 µl Ethylchloroformat und 94 µl Triethylamin gegeben und die Mischung wurde unter gleichzeitigem Rühren mit Ar gespült. Die Mischung wurde 40 min unter Ar-Atmosphäre bei -78 °C gehalten. In der Zwischenzeit wurden 0,8 g CND@SiO2-APT in 3,7 ml trockenem THF gelöst, mit Ar gespült und auf -10°C gehalten. Der CPBA-Mischung wurden abgekühlte CND@SiO2-APT unter Ar-Atmosphäre (mit einer Spritze) zugegeben und es wurde 24 h bei Zimmertemperatur weitergerührt. Die Nanopartikel (CND@SiO2-RAFT) wurden mit 46 ml Hexan ausgefällt und dreimal mit Aceton und zweimal mit THF gewaschen, bevor sie in einem Vakuumofen über Nacht getrocknet wurden.
  • Herstellung von Hüllen aus MGP und UGP auf CND@SiO2-RAFT (CND@SiO2@MGP; CND@SiO2@UGP)
  • Zu einer Lösung aus SS (1,325 mg) in 0,7 ml MeCN wurden 0,7 ml einer Tetrabutylammoniumhydroxid(TBA-OH)-Stammlösung (4,90 mg TBA-OH·x 30 H2O in 1,0 ml MeCN) zugegeben und 10 min beschallt. Anschließend wurden der SS-TBA-Mischung 200 µl Toluol zugegeben, mit anschließender Ultraschallbehandlung von 30 min und Verdampfung mit einem Vakuumkonzentrator (30 min bei 51 mbar, 1 h bei 0 mbar) bei Zimmertemperatur (Material A). Zu einer Lösung aus 21,44 µl 2-Aminoethylmethacrylathydrochlorid-Stammlösung (10 mg 2-Aminoethylmethacrylathydrochlorid in 40 µl Milli-Q-Wasser) wurden 2,4 mg Vinylbenzolboronsäure und 5,47 mg I in 8 ml MeOH und 122,88 µl EGDMA zugegeben und 15 min beschallt (Lösung B). Für die MGP-Beschichtung wurden 0,5 ml hergestelltes SS-TBA (Material A, erneut gelöst in 0,5 ml MeOH) zu 2,5 ml Lösung B in einem Glasfläschchen gegeben. Für die UGP-Beschichtung wurden lediglich 0,5 ml MeOH zu 2,5 ml Lösung B in einem zweiten Fläschchen gegeben. Anschließend wurden 2 × 150 mg CND@SiO2-RAFT in die MGP- und UGP-Fläschchen gegeben und 20 min beschallt. Nach 30 min Entgasung wurden 0,6 ml ABDV-Lösung (3,4 mg ABDV in 3 ml MeOH) in die MGP- und UGP-Fläschchen gegeben. Die Polymerisation wurde ausgelöst, als die Temperatur 50 °C erreichte, und es wurde über Nacht bei 500 U/min weitergerührt. CND@SiO2@MGP und CND@SiO2@UGP wurden nach dreimaligem Waschen mit 1,25 ml einer Lösung, die 80,9 % Methanol, 14,3 % Ameisensäure und 4,8 % Milli-Q-Wasser enthielt, für eine Stunde und Trocknen in einem Vakuumofen über Nacht isoliert. Die Abkürzung „UGP“ bezeichnet im vorliegenden Dokument Hüllen aus ungeprägtem Polymer, die als Kontrolle verwendet werden. Anders ausgedrückt erfolgt die Synthese auf dieselbe Weise wie für die MGP, abgesehen davon, dass das Templat fehlt.
  • Beispiel 2:
  • Partikel mit fluoreszierendem Polystyrol-Kern/struktureller Siliziumdioxid-Hülle/fluoreszierender MGP-Hülle (PSII@SiO2@MGP)
  • Materialien
  • Alle organischen Lösungsmittel wurden von Th. Geyer erworben und, sofern nicht anders angegeben, ohne weitere Reinigung verwendet. Styrol, 2,2'-Azobis(2-methylpropionamidin)dihydrochlorid (AIBA), (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES), Methacrylamid, Ethylenglycoldimethacrylat (EGDMA), 4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanonsäure, wasserfreies Tetrahydrofuran (THF), Dimethylformamid (DMF), Tetraethylorthosilicat (TEOS), Natriumdodecylbenzolsulfonat (SDS) und Salpetersäure wurden von Sigma Aldrich erworben. Triethylamin, Ameisensäure und Salzsäure wurden von Applichem erworben. Basisches Aluminiumoxid wurde von Acros Organics erworben, N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure, SS) von Carl Roth und Ethylchloroformat von Fluka. 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril) (ABDV) als Initiator wurde von Wako Chemicals erworben. L-Lysin wurde von J&K Chemicals erworben und Vinylbenzolboronsäure von ThermoFischer. Das Sondenmonomer I (2-(3-(7-Nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-yl)ureido)ethylmethacrylat) wurde wie in Abschnitt 1.1.3 beschrieben synthetisiert; Farbstoff II ((E)-7-(4-(Dimethylamino)styryl)-5,5-difluor-10-(8-hydroxychinolin-2-yl)-1,3,9-trimethyl-5H-dipyrrolo[1,2-c:1',2'-f] [1,3,2]diazaborinin-4-ium-5-uid) wurde gemäß Y.-H. Yu, A. B. Descalzo, et al., Chem. Asian J. 2006, 1, 176 synthetisiert. Milli-Q-Wasser stammte aus einem Reinigungssystem für ultrareines Milli-Q-Wasser (Millipore Synthesis A10).
  • Geräte
  • TEM-Messungen wurden mit einem Raster-/Transmissionselektronenmikroskop Talos™ F200S (200 kV) von FEI durchgeführt. Fluoreszenzspektren wurden mit einem Spektrofluorometer FluoroMax-4P von Horiba Jobin-Yvon mit Standard-Quarzküvetten mit einer Weglänge von 10 mm aufgezeichnet.
  • Synthese von Partikeln mit Polystyrolkern (PS)
  • Der Inhibitor wurde vom Styrol mittels Hindurchleiten durch eine Säule mit basischem Aluminiumoxid entfernt. 8,96 ml Milli-Q-Wasser wurden in ein Glasfläschchen mit Schraubverschluss und Septum gegeben und die Lösung wurde 10 min bei 75 °C mit 600 U/min bei gleichzeitiger Entgasung mit Argon gerührt. 0,05 ml inhibitorfreies Styrol wurde dem Glasfläschchen unter Verwendung einer Spritze in Argonatmosphäre zugegeben und es wurde weitere 10 min weitergerührt. In der Zwischenzeit wurden 6,3 mg AIBA in 1,575 ml Milli-Q-Wasser gelöst und 10 min lang mit Argon entgast, woraufhin der Wasser-Styrol-Mischung 1 ml mit einer Spritze zugegeben wurde. Die Reaktionsmischung wurde 5 h ruhengelassen und danach auf Zimmertemperatur abgekühlt. Die Partikel wurden mit einer 0,1 %-igen wässrigen SDS-Lösung ausgefällt, dreimal mit Milli-Q-Wasser gereinigt und in einem Vakuum getrocknet.
  • Farbstoffdotierung von Partikeln mit Polystyrolkern (PSII)
  • 500 mg PS-Partikel wurden in 10 ml Milli-Q-Wasser in einem Glasfläschchen mit einem Ultraschallbad dispergiert (Frequenz 37 Hz, Leistung 100%). 1300 µ1 der Stammlösung wurden in mehrere, in einem Halter platzierte 2-ml-Kunststofffläschchen pipettiert. Durch Lösen der jeweiligen Mengen Farbstoff II (siehe nachstehende ) wurden verschiedene Konzentrationen (im millimolaren Bereich) Dotierungslösung in THF hergestellt. Bei jedem Fläschchen, das eine Polystyrolsuspension enthielt, wurden 130 µl Farbstofflösung zugegeben und dasselbe Volumen THF wurde bei der Blindlösung zugegeben. Unmittelbar nach Zugabe der Farbstofflösung/THF wurden die Partikelsuspensionen für kurze Zeit in einem Vortexmischer geschüttelt, mit Folie abgedeckt und anschließend 30 min bei 40 U/min auf eine Rotationsplatte gestellt. Danach wurden die Partikel bei 10.000 U/min 5 min lang zentrifugiert, zweimal mit 1600 µl Milli-Q-Wasser und einmal mit 1600 µl EtOH (70%) gewaschen. Nach allen Waschvorgängen wurde der Überstand sorgfältig abgenommen. Die Partikel wurden dann in einem Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet.
    Figure DE102018115136B3_0002
  • Siliziumdioxidbeschichtung von Partikeln mit einem Kern aus farbstoffdotiertem Polystyrol (PSII@SiO2)
  • 1 ml einer 0,05 %-igen PSII-Suspension in Milli-Q-Wasser wurde mit 1,9 ml Milli-Q-Wasser in einem 2-ml-Kunststofffläschchen weiter verdünnt. 10 µl 1 M HNO3 wurden zugegeben, damit ein pH-Wert = 3 erhalten wurde, der mit einem pH-Indikatorpapier bestätigt wurde. Die Dispersion wurde 15 min bei 700 U/min bei 60°C gemischt, woraufhin 2,8 mg L-Lysin und 9 µl TEOS zugegeben wurden. Die Mischung wurde mit Folie abgedeckt und 6 h reagieren gelassen. Die entstehenden Partikel wurden dreimal in einem Wasser-Ethanol-Gemisch gereinigt und in einem Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet.
  • Modifizierung mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (PSII@SiO2-APT)
  • 100 mg PSII@SiO2 wurden in 4 ml reinem Ethanol dispergiert und es wurden 2 ml 9:1 Milli-Q:HCl zugegeben. Das Gemisch wurde 10 min beschallt und 10 min bei 8700 U/min zentrifugiert. Die Partikel wurden zweimal mit Ethanol gereinigt und in 2 ml Ethanol erneut dispergiert. 100 µL APTES wurden zugegeben und die Reaktion 24 h bei 40 °C und 700 U/min fortgesetzt. Die Partikel wurden dreimal in Ethanol gewaschen und 4 Stunden im Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet. Ein Ninhydrin-Test nach erfolgreicher Funktionalisierung mit APTES ergab eine Aminogruppendichte von 1,2 mmol g-1.
  • Modifizierung mit einem RAFT-Mittel (PSII@SiO2-RAFT)
  • 0,428 mmol RAFT-Mittel 4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanonsäure, 0,428 mmol Ethylchloroformat und 0,428 mmol Triethylamin wurden in 10 ml wasserfreiem THF gelöst und 40 Minuten in einem Flüssigstickstoff-Aceton-Bad bei -78 °C gehalten. Gleichzeitig wurden 100 mg PSII@SiO2-APT in einem Eisbad bei -10 °C gehalten. Danach wurde die THF-Lösung den Partikeln zugegeben und die Mischung über Nacht bei 700 U/min bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Partikel wurden in 60 ml Hexan ausgefällt, zweimal in THF gewaschen und in einem Vakuum getrocknet.
  • Herstellung von Hüllen aus MGP und UGP auf PSII@SiO2-RAFT (PSII@SiO2@SSMGP; PSII@SiO2@UGP)
  • 5,1383 mg Methacrylamid wurden in 40 µl DMF (Lösung A) gelöst. 2,4 mg Vinylbenzolboronsäure, 5,47 mg Sondenmonomer I (1), 21,44 µl Lösung A, 122,88 µl EGDMA und 8 mL DMF wurden gemischt und 15 min in einem Ultraschallbad beschallt (Lösung B). Lösung B wurde in 2 × 2,5 ml in braunen 4-ml-Glasfläschchen aufgeteilt; 0,5 ml DMF (Lösung C1 - UGP) wurde in ein Fläschchen gegeben und 0,5 ml SS-Stammlösung (Lösung C2 - SS-MGP) in ein weiteres Fläschchen. Die SS-Stammlösung wurde durch Lösen von 1,325 mg SS in 0,5 ml DMF mit Beschallung hergestellt. 2 × 50 mg PSII@SiO2-RAFT wurden in separate braune 4-ml-Glasfläschchen abgewogen. 2,54 ml Lösung C1 wurden in ein Fläschchen gegeben (UGP) und 2,54 ml Lösung C2 in ein anderes Fläschchen (SSMGP). Alle Suspensionen wurden 20 min in einem Ultraschallbad dispergiert und zwischendurch geschüttelt, damit eine Suspension entsteht. In der Zwischenzeit wurden 3,4 mg ABDV in 3 ml DMF gelöst und bis zum Einsatz mit Argon entgast. Die SSMGP- und UGP-Suspensionen wurden 20 min mit Argon entgast und anschließend wurden unter Inertgasatmosphäre 0,6 ml ABDV-Lösung in jedes Fläschchen gegeben. Die Proben wurden 22 h bei 500 U/min und 50 °C weiter gerührt. Die entstehenden Partikel wurden 1 min bei 6000 U/min zentrifugiert, anschließend mit 1,25 ml einer Lösung aus 80,9 % Methanol, 14,3 % Ameisensäure und 4,8 % Milli-Q-Wasser gewaschen. Die Suspension wurde 1 h bei 25 °C und 1000 U/min im Thermomixer belassen und die Partikel wurden danach 1 min bei 6000 U/min zentrifugiert. Der Waschvorgang wurde viermal wiederholt. Danach wurden 3,75 ml Methanol zugegeben und die Suspensionen blieben 30 min bei 40 U/min bei Zimmertemperatur im Rotator. Die Partikel wurden 1 min bei 6000 U/min zentrifugiert und im Vakuum getrocknet.
  • Charakterisierung von Partikeln
  • TEM-Messungen
  • 1 mg ml-1 Suspensionen aus PSII@SiO2@SSMGP und PSII@SiO2@UGP wurden hergestellt und 2 µl zwecks TEM-Messungen auf ein Gitter aufgebracht. Aufnahmen wurden mit der Software Image J analysiert.
  • Fluoreszenztitrationen
  • 0,05 mg ml-1 Suspensionen aus den farbstoffdotierten Partikeln wurden in Milli-Q-Wasser hergestellt und die Fluoreszenzspektren aufgezeichnet. 0,25 mg ml-1 Suspensionen der MGP- und UGP-Partikel wurden in DMF hergestellt; ebenso wurde eine 1 mM Lösung aus SS in DMF hergestellt. Größer werdende Volumina der 1 mM SS-Lösung wurden 2-ml-Suspensionen aus den MGP- und UGP-Partikeln zugegeben und die sich ergebenden Fluoreszenzspektren wurden aufgezeichnet. Δ F F o = F x − F 0 F o
    Figure DE102018115136B3_0003
    wurde für jedes Fluoreszenzspektrum der MGP und UGP berechnet (wobei Fx die maximale Fluoreszenzintensität für jedes Spektrum nach SS-Zugabe ist, während Fo die maximale Fluoreszenzintensität vor der Zugabe von SS ist). Der Prägefaktor wurde aus dem MGP:UGP-Verhältnis Δ F F o
    Figure DE102018115136B3_0004
    am Sättigungspunkt der Titration ermittelt.
  • Zellanfärbeprotokolle
  • Partikel mit fluoreszierendem Polystyrol-Kern/struktureller Siliziumdioxid-Hülle/fluoreszierender MGP-Hülle (PSII@SiO2@MGP)
  • Anfärbung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)
  • Nachfolgend werden für die Zellmarkierung (auch als Anfärben bezeichnet) in PBS verwendete Verfahrensschritte kurz beschrieben:
  • Zuerst wurde das Kulturmedium (aus einer T75-Flasche) entfernt und die Zellen wurden (mit 5 ml) PBS ohne Ca/Mg gespült. Anschließend wurden die Zellen in einer T75-Flasche mit 500 µl Trypsin/EDTA bedeckt. Die Zellen wurden 5 bis 10 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 5 ml Medium zugegeben und die Zellsuspension wurde einige Male in der Pipette angesaugt, damit sich verbliebene Bindungen und anhaftende Zellen lösen. Zum Zählen der mit Trypanblau angefärbten Zellen (50 µl Zellen+50 µl Trypanblau) wurde ein Hämozytometer (Bürker-Zellzählkammer) verwendet. 3×106 der Zellen wurden in ein 15-ml-Röhrchen überführt und 5 min bei 300×g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und die Zellpellets wurden zweimal mit 2 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in FACS-Röhrchen aufgeteilt (je Probe 1×106 Zellen) und der gesamte Überstand wurde mittels Zentrifuge 5 min lang bei 300×g abgenommen. Die Zellen wurden schließlich mit 100 µl jeder untersuchten MGP-Partikelkonzentration angefärbt und 60 min bei 4 °C inkubiert (ein Eis). Folgende Schritte umfassen: Zugeben ungefärbter 100 µl PBS; 0,1 mg ml-1 MGP-Partikel (Stammlösung 1 mg ml-1): 10 µL MGP-Partikel + 90 µl PBS; 0,2 mg ml-1 MGP-Partikel (Stammlösung 1 mg ml-1): 20 µl MGP-Partikel + 80 µl PBS; Waschen der Zellen mit 3×2 ml PBS.
  • Für durchflusszytometrische Untersuchungen wurden die Pellets in 300 µ1 PBS resuspendiert und mittels Durchflusszytometrie untersucht (z.B. mit einem Durchflusszytometer BD Accuri C6, BD, NJ, USA).
  • Für fluoreszenzmikroskopische oder digitale holographische Mikroskopieuntersuchungen wurden die Zellen durch Zugabe von 1 ml 4% Formaldehyd in PBS fixiert und 10 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Danach wurden die Zellen dreimal mit 2 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden die Pellets in 10 bis 20 µl PBS resuspendiert und 10 µl der Zellen wurden in die Bürker-Kammer gegeben und mikroskopisch analysiert.
  • Anfärben in Methanol:Wasser
  • Nachfolgend werden für die Zellmarkierung (auch als Anfärben bezeichnet) in MeOH:H2O verwendete Verfahrensschritte kurz beschrieben:
  • Zuerst werden die getrockneten Polymerpartikel in Methanol:Wasser (1:30, v/v) resuspendiert. Mittels Beschallung für 4+4 Minuten mit einem Ultraschallbad, z.B. einem VWR-Ultraschallreiniger, wurde eine Stammlösung mit 0,8 mg ml-1 hergestellt. Menschliche Prostatakrebszelllinien DU145 und PC-3 (LGC Standards, Teddington, Middlesex, UK) wurden in Flaschen mit DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) mit 10% FBS kultiviert und bei 37 °C mit 5% CO2 in 100% Feuchte inkubiert. Die Zellpassage erfolgte durch Waschen mit PBS, anschließend wurden die Zellen mit Erreichen der Konfluenz mit Trypsin/EDTA behandelt.
  • Für mikroskopische Untersuchungen wurden die Zellen in Zellkulturplatten mit 12 Vertiefungen, die mit runden Deckgläsern (Durchmesser 12 mm) versehen waren, kultiviert. 10.000 Zellen DU145 beziehungsweise 20.000 Zellen PC-3 wurden in 100 µ1 Zellsuspension angesetzt und auf jedes Deckglas pipettiert. Nach 3 h wurde 1 ml Zellkulturmedium zugegeben und die Zellen wurden bis zur Konfluenz mindestens 48 Stunden in 37 °C mit 5% CO2 in 100% Feuchte wachsen gelassen.
  • Jedes Deckglas mit konfluenten Zellen DU145 oder PC-3 wurde zweimal mit 2 ml PBS gewaschen und bei Zimmertemperatur 10 min in 1 ml 4% Formaldehyd fixiert. Zur Beendigung der Fixierung wurde das Formaldehyd aus jeder Vertiefung gesaugt und dreimal mit 2 ml PBS gewaschen.
  • Zwecks Behandlung mit Sialidase (Neuraminidase von Clostridium perfringens, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurden die Zellen DU145 mit DMEM gewaschen und 200 µl von 5 beziehungsweise 10 E ml-1 des Enzyms wurde den Zellen 60 min in 37 °C zugegeben. Eine Negativkontrolle mit ausschließlich 200 µl DMEM wurde behalten. Danach wurden die Zellen dreimal mit DMEM gewaschen. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit 2 ml Methanol:Wasser (1:30, vol/vol) gewaschen und mit MGP-Partikeln bei einer Konzentration von 20 µg ml-1 angefärbt.
  • Für Analysen mittels Fluoreszenzmikroskopie oder digitaler holographischer Mikroskopie: Die Zellen wurden zur MGP-Partikelanfärbung zuerst zweimal mit 2 ml Methanol:Wasser (1:30) gewaschen. Danach wurden 500 µl einer beschallten MGP-Suspension mit einer Konzentration von 80 µg ml-1 beziehungsweise 20 µg ml-1 in die Vertiefungen gegeben und eine Negativkontrolle mit ausschließlich 500 µl Methanol:Wasser (1:30) behalten. Die Zellen wurden 60 min in 37 °C mit MGP inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen dreimal mit 2 ml Methanol:Wasser (1:30, v/v) gewaschen und jedes runde Deckglas wurde für die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung mit einem Tropfen Eindeckmittel/Farbstoffstabilisator Prolong® Gold mit DAPI (Molecular Probes, USA) (umgedreht) auf einem Objektträger befestigt.
  • Für durchflusszytometrische Untersuchungen wurden 5 × 105 Zellen DU145 und PC3 zweimal mit 2 ml PBS gewaschen und bei Zimmertemperatur 20 min in 1 ml 4% Formaldehyd fixiert. Danach wurde das Formaldehyd aus den Zellen gesaugt und zweimal mit 2 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit 2 ml Methanol/Wasser (1:30) gewaschen und mit 500 µl beschallten MGP-Partikeln bei unterschiedlichen Konzentrationen (2,5, 5 und 10 µg ml-1) angefärbt und bei 37 °C in 60 min inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit 2 ml Methanol:Wasser (1:30) gewaschen und in 300 µl Methanol:Wasser resuspendiert und mit einem Durchflusszytometer (Accuri C6 Flow Cytometer, BD, NJ, USA) untersucht.
  • Zellviabilität von mit MGP-Partikeln inkubierten kultivierten Zelllinien
  • 4 × 104 Zellen in 80 µl Medium und 20 µl 1 mg ml-1, 0,8 mg ml-1, 0,4 mg ml-1 oder 0,2 mg ml-1 MGP-Partikel in Medium wurden in Platten mit 96 Vertiefungen 24 h, 48 h und 73 h in dreifacher Ausfertigung zusammen mit einer Referenzprobe, die 4 × 104 Zellen in 100 µl Medium enthielt, und einer Kontrolle mit 100 µ1 reinem Medium inkubiert.
  • Nach der Inkubation wurden 20 µl Assay-Lösung (CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, USA) zugegeben und die Proben wurden weitere 2 h inkubiert. Anschließend wurde die Extinktion bei 490 nm unter Verwendung eines PowerWave XS (Bio-tex, USA) gemessen.
  • Einige Aspekte der hierin beschriebenen Ausführungsformen können folgendermaßen zusammengefasst werden.
    1. 1. Vorgeschlagen ist ein Nanoobjekt mit fluoreszierendem Kern und fluoreszierender MGP-Hülle;
    2. 2. Vorgeschlagen ist ein Nanoobjekt mit fluoreszierendem Kern, struktureller Hülle und fluoreszierender MGP-Hülle;
    3. 3. Vorgeschlagen ist eine MGP-Sonde, die zur ratiometrischen Signalmessung ausgelegt ist;
    4. 4. Vorgeschlagen sind Doppelsignalsonden, die zum Binden an die Zelloberfläche und Anfärben (Markieren) geeignet sind;
    5. 5. Vorgeschlagen ist die Verwendung der vorstehenden Doppelsignalsonden für die Mikroskopie
    6. 6. Vorgeschlagen ist die Verwendung der Doppelsignalsonden für die Zytometrie, insbesondere für die Durchflusszytometrie;
    7. 7. Vorgeschlagen ist die Anpassung der Doppelsignalsonden für die zelluläre Aufnahme;
    8. 8. Vorgeschlagen ist die Anpassung der Doppelsignalsonden für eine Kombination aus Bindung an die Zelloberfläche, Zellanfärbung (Markieren) und zellulärer Aufnahme.
  • Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgeschlagenen Ausführungsformen gegenüber zuvor bekannten Partikeln, Herstellungsverfahren und Verwendungsverfahren die folgenden Vorteile bieten. Bestimmte Fortschritte hinsichtlich der aktuellen Mikroskopie/Zytometrie betreffen die Verwendung von zwei unterschiedlichen fluoreszierenden Reportereinheiten, die eine ratiometrische Messung ermöglichen und so für eine intrinsische Kalibrierung gegenüber derartigen Änderungen wie z.B. der Lichtintensität (Lampenleistung) sorgen. Im Gegensatz dazu zeichnen sich Partikel, wie sie von Stsiapura et al. (2004), Holzapfel et al. (2005) und Long et al. (2010) beschrieben sind, lediglich durch eine einzige Fluoreszenz aus und hängen somit sehr stark von einer gültigen Kalibrierung unter den aktuellen Messbedingungen ab.
  • Des Weiteren sorgen die vorgeschlagenen, mit einem MGP beschichteten Kern-Hülle-Nanopartikel für eine bessere Stabilität und Lebensdauer der MGP im Vergleich zu Antikörpern als Erkennungselementen, die z.B. von Stsiapura et al. (2004) und Long et al. (2010) verwendet wurden. Im Gegensatz zu Mao et al. (2012) und Demir et al. (2018) werden fluoreszierende Monomere in einem MGP verwendet. Sie ermöglichen eine direkte Signalgebung und inhärente Kalibrierung. Nanopartikel-Plattformen gewährleisten ausreichend kleine Sonden zur Markierung lebender Zellen, wobei die MGP-Schicht dünn genug ist, dass sie im Gegensatz zu Amjadi und Jalili (2017) eine beträchtliche Signaländerung erzeugt.
  • Darüber hinaus sind molekular geprägte (mesoporöse) Siliziumdioxide (MGS), wie sie Amjadi und Jalili (2018) beschreiben, weniger gut für die Aufnahme von speziell dafür vorgesehenen fluoreszierenden Indikatoren oder Sonden in die MGP-Hülle, d.h. MGS-Hülle, geeignet. Molekular geprägte Siliziumdioxide werden aus Silan-Vorläufern, für gewöhnlich TEOS oder TMOS (Tetraethylorthosilicat oder Tetramethylorthosilicat), in einer Sol-Gel-Reaktion hergestellt. Während der Ausbildung des Siliziumdioxidnetzwerks kondensieren die Alkoxygruppen der Vorläufer, setzen dabei Wasser frei und erzeugen freie Silanolgruppen (Si-OH). Diese Hydroxy-Spezies würden möglicherweise auf unerwünschte Weise mit den meisten der möglichen fluoreszierenden Monomere wechselwirken und mit dem angegebenen Templatmolekül um die Bindungsstellen konkurrieren. Eine gerichtete Prägung für eine festgelegte spektroskopische Reaktion ist somit kontrolliert nicht möglich.
  • Bislang beruhen somit sämtliche MGS auf Fluoreszenzlöschung: Das Templat/der Analyt, das bzw. der irgendwo in der Nähe der fluoreszierenden Einheit in der MGS-Matrix gebunden ist, kann mit dem Fluorophor wechselwirken und es löschen. Die Spezifität hängt somit wesentlich mit der Selektivität der Bindungshohlräume zusammen; z.B. können alle kleineren Spezies, die in den Hohlraum gelangen und möglicherweise mit dem Fluorophor über diese recht weit reichenden Kräfte zusammenwirken können, zur Löschung führen. Dementsprechend sind für viele derartige Systeme die nicht spezifischen Signale (falsch positive Ergebnisse) vergleichsweise hoch.
  • Wie beschrieben ist, umfasst ein typisches doppelt fluoreszierendes Partikel: einen Kern mit einer ersten Fluoreszenz sowie eine Hülle aus einem molekular geprägten Polymer (MGP) mit einer zweiten Fluoreszenz; wobei das MGP ein organisches Polymer mit Elementen ist, die aus der Gruppe bestehend aus C, H, O, N, P und S ausgewählt sind; wobei das MGP so ausgelegt ist, dass es gezielt an eine Zelloberflächenstruktur bindet; wobei die erste Fluoreszenz von einem Element erzeugt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Kohlenstoff-Nanopunkt, einem farbstoffdotierten Polymer, einer farbstoffdotierten stabilisierten Mizelle, einem Polymer mit Quantenpunktdotierung, einem Polymer mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion sowie einem Erdalkalimetallfluorid-Nanopartikel mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion; wobei die zweite Fluoreszenz von einem Element erzeugt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Farbstoff, einer molekularen Sonde, einem Indikator, einem Sondenmonomer, einem Indikatormonomer und einem Vernetzer; und wobei sich die erste und zweite Fluoreszenz zumindest durch eine Emissionswellenlänge und/oder durch eine Anregungswellenlänge unterscheiden.
  • Zusammenfassend dargestellt ist ein doppelt fluoreszierendes Partikel vorgeschlagen, das einen Kern umfasst, wobei der Kern eine erste Fluoreszenz aufweist, sowie eine Hülle aus einem molekular geprägten Polymer (MGP), wobei das MPG eine zweite Fluoreszenz aufweist, wobei das MGP ein organisches Polymer mit Elementen ist, die aus der Gruppe bestehend aus C, H, O, N, P und S ausgewählt sind; wobei das MGP so ausgelegt ist, dass es gezielt an eine Zelloberflächenstruktur bindet; wobei die erste Fluoreszenz von einem Element erzeugt wird, das ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend: einen Kohlenstoff-Nanopunkt, ein farbstoffdotiertes Polymer, eine farbstoffdotierte stabilisierte Mizelle, ein Polymer mit Quantenpunktdotierung, ein Polymer mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion sowie ein Erdalkalimetallfluorid-Nanopartikel mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion; wobei die zweite Fluoreszenz von einem Element erzeugt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Farbstoff, einer molekularen Sonde, einem Indikator, einem Sondenmonomer, einem Indikatormonomer und einem Vernetzer; und wobei sich die erste und zweite Fluoreszenz zumindest durch eine Emissionswellenlänge und/oder durch eine Anregungswellenlänge unterscheiden. Des Weiteren ist ein Verfahren zum Suchen nach einer Zielzelle in einer Probe vorgeschlagen, wobei die Zielzelle durch eine Zelloberflächenstruktur gekennzeichnet ist, die von dem MGP erkannt wird, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen eines beschriebenen doppelt fluoreszierenden Partikels; Ermöglichen eines Kontakts zwischen dem doppelt fluoreszierenden Partikel und einer Vielzahl von Zellen aus der Probe, wobei die Probe möglicherweise eine Zelle mit der Zelloberflächenstruktur umfasst; Nachweisen einer Zelle mit der Zelloberflächenstruktur mit daran gebundenen doppelt fluoreszierenden Partikeln; und Feststellen eines Vorhandenseins der Zielzelle in der Probe. Des Weiteren ist ein Verfahren zum Etablieren einer Zielzelllinie vorgeschlagen, wobei die Zellen der Zielzelllinie durch eine Zelloberflächenstruktur gekennzeichnet sind, wobei das Verfahren umfasst: Isolieren der Zielzelle, die mit dem vorgeschlagenen Suchverfahren definiert wird, aus einer Mehrzahl von Zellen, und Kultivieren der isolierten Zelle. Des Weiteren wird die Verwendung des vorgeschlagenen doppelt fluoreszierenden Partikels für die in-vitro-Erkennung und/oder -Kennzeichnung von zirkulierenden Tumorzellen in einer Blutprobe vorgeschlagen. Des Weiteren wird die Verwendung des vorgeschlagenen doppelt fluoreszierenden Partikels zum Erkennen einer Zelle, einer Zelllinie oder eines Hybridoms vorgeschlagen, die bzw. das ein bestimmtes Immunglobulin oder ein bestimmtes Zytokin produziert. Des Weiteren ist ein Bildgebungsverfahren zur Krebserkennung in einem Gewebe vorgeschlagen, umfassend: Ermitteln eines Fluoreszenzverhältnisses an einem doppelt fluoreszierenden Partikel und Erzeugen eines Bilds des Gewebes, wobei Zellen mit einer Oberflächenstruktur, die von vorgeschlagenen doppelt fluoreszierenden Partikeln erkannt wird, vor einem Hintergrund des Bilds hervorgehoben werden. Des Weiteren ist ein Zellsortierungsverfahren vorgeschlagen, das umfasst: Markieren einer Zelle mit dem vorgeschlagenen doppelt fluoreszierenden Partikel, Ermitteln eines Verhältnisses aus ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen; und Erfassen des Vorhandenseins einer Zelle, die mit dem doppelt fluoreszierenden Partikel markiert ist.
  • Die vorliegende Erfindung ist bezogen auf verschiedene veranschaulichende Ausführungsformen und Beispiele erläutert worden. Diese Ausführungsformen und Beispiele sollen den Umfang der Erfindung, der durch die Ansprüche und ihre Entsprechungen definiert ist, nicht einschränken. Wie für einen Fachmann ersichtlich ist, können die hierin beschriebenen Ausführungsformen ohne Abweichung vom Erfindungsumfang auf verschiedene Weise umgesetzt werden. Verschiedene in den Ausführungsformen beschriebenen Merkmale, Aspekte und Funktionen können mit anderen Ausführungsformen kombiniert werden.
  • Literaturhinweise
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  • Abkürzungen
    • ABDV
    = 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril)
    AFM
    = atomic force microscopy, Rasterkraftmikroskop
    AIBA
    = 2,2'-Azobis(2-methylpropionamidin)dihydrochlorid
    APS
    = Ammoniumpersulfat
    APTES
    = 3-(Aminopropyl)triethoxysilan
    ATRP
    = atom transfer radical polymerization
    BHT
    = Butylhydroxytoluol
    CND
    = Kohlenstoff-Nanopunkt
    CPBA
    = 4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanonsäure
    DMF
    = Dimethylformamid
    EDX
    = energy dispersive x-ray diffraction, energiedispersive Röntgenbeugung
    EGDMA
    = Ethylenglycoldimethacrylat
    MeOH
    = CH3OH, Methanol
    MeCN
    = CH3CN, Acetonitril
    MGP
    = molekular geprägtes Polymer
    MGS
    = molekular geprägtes Siliziumdioxid
    NBD-Cl
    = 4-Chlor-7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol
    UGP
    = ungeprägtes Polymer (Hülle auf Partikeln zur Hintergrundsignalkontrolle)
    PS
    = Polystyrol
    QD
    = Quantenpunkt
    RAFT
    = reversible addition-fragmentation chain transfer
    SS
    = N-Acetylneuraminsäure = Sialinsäure
    TBA-OH
    = Tetrabutylammoniumhydroxid
    TEM
    = Transmissionselektronenmikroskopie
    TEOS
    = Tetraethylorthosilicat
    TEMOS
    = Tetramethylorthosilicat
    THF
    = Tetrahydrofuran
    I
    = Fluoreszenzfarbstoff nach Formel ( ):
    Figure DE102018115136B3_0005
    II
    = Fluoreszenzfarbstoff nach Formel ( ):
    Figure DE102018115136B3_0006

Claims (19)

  1. Doppelt fluoreszierendes Partikel, umfassend: - einen Kern mit einer ersten Fluoreszenz; und - eine Hülle aus einem molekular geprägten Polymer mit einer zweiten Fluoreszenz, wobei das molekular geprägte Polymer ein organisches Polymer mit Elementen ist, die aus der Gruppe bestehend aus C, H, O, N, P und S ausgewählt sind; und wobei das molekular geprägte Polymer so ausgelegt ist, dass es gezielt an eine Zelloberflächenstruktur bindet; wobei die erste Fluoreszenz von einem Element erzeugt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Kohlenstoff-Nanopunkt, einem farbstoffdotierten Polymer, einer farbstoffdotierten stabilisierten Mizelle, einem Polymer mit Quantenpunktdotierung, einem Polymer mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion sowie einem Erdalkalimetallfluorid-Nanopartikel mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion; wobei die zweite Fluoreszenz von einem Element erzeugt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Farbstoff, einer molekularen Sonde, einem Indikator, einem Sondenmonomer, einem Indikatormonomer und einem Vernetzer; und wobei sich die erste und zweite Fluoreszenz zumindest durch eine Emissionswellenlänge und/oder durch eine Anregungswellenlänge unterscheiden.
  2. Doppelt fluoreszierendes Partikel nach Anspruch 1, ferner umfassend: - eine SiO2 oder TiO2 umfassende strukturelle Hülle, die den Kern umhüllt, wobei die Hülle aus einem molekular geprägten Polymer oben auf der strukturellen Hülle angeordnet ist.
  3. Doppelt fluoreszierendes Partikel nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein mit einem Elektronenmikroskop gemessener mittlerer arithmetischer Durchmesser des Partikels in einem ausgewählten Bereich zwischen 20 nm und weniger als 100 nm liegt.
  4. Doppelt fluoreszierendes Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine Dicke der Hülle aus einem molekular geprägten Polymer zwischen 2 nm und 25 nm, insbesondere zwischen 5 nm und 15 nm, vorzugsweise zwischen 5 nm und 10 nm ausgewählt ist.
  5. Doppelt fluoreszierendes Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das MGP ein Glykan bindet ausgewählt aus Siaα2-6GalNAc (Sialyl-Tn), Siaα2-3Galβ 1-3GalNAc (Sialyl-T), Siaα 2,3 Galβ 1,4 (Fuca 1,3)GlcNAc (Sialyl-LewisX) oder Sia2,3Galβ 1,3(Fucα 1,4) GlcNAc (Sialyl-LewisA), Siaα2,3-Galβ, Siaα 2,6-Galβ, Siaα2,3-N-Acetyllactosamin, Siaα2,6-N-Acetyllactosamin, N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac, menschliche Form von Sialinsäure (SS)), N-Glycolylneuraminsäure (Neu5Gc, tierische Form von Sialinsäure), GlcA2SO3 1,4-Glc2NSO3 oder GlcA2SO3 1,4-Glc2NSO36SO3.
  6. Doppelt fluoreszierendes Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das molekular geprägte Polymer erzeugt ist durch eine Polymerisation von mindestens einer Art eines Monomers ausgewählt aus: Acrylamid, Vinylpyridin, N-Isopropylacrylamid, 2-Hydroxyethylmethacrylat, Methylmethacrylat, Benzylmethacrylat, Methacrylat, Methacrylamid, N,N'-Dimethylmethacrylamid, Trifluormethylacrylat, 2-Aminoethylmethacrylat, Vinylalkohol, Vinylimidazol, Vinylphenylboronsäure, aminosubstituierter Vinylphenylboronsäure, Vinylbenzaldehyd, Vinylanilin; mit einem Vernetzungsmittel ausgewählt aus: Ethylendimethacrylat, Ethylenglycoldimethacrylat, N,N'-Methylendiacrylamid, Divinylbenzol, Tetramethylendimethacrylat, Polyacrylsäure, einem bis(-Hydroxyethyl)sulfon, Trimethylolpropantrimethacrylat und Pentaerythritoltriacrylat.
  7. Doppelt fluoreszierendes Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Seltenerdmetallion ausgewählt ist aus: Cer (Ce), Europium (Eu), Gadolinium (Gd), Neodym (Nd), Scandium (Sc), Terbium (Tb), Ytterbium (Yb) und Yttrium (Y), Dysprosium (Dy), Samarium (Sm), Holmium (Ho), Erbium (Er), Thulium (Tm) und Praseodym (Pr).
  8. Doppelt fluoreszierendes Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Erdalkalimetallfluorid-Nanopartikel mit Dotierung durch ein Seltenerdmetallion ein Fluorid von Ca, Ba oder Sr umfasst; und das Seltenerdmetallion ausgewählt ist aus: Ce, Eu und Tb.
  9. Verfahren zum Suchen nach einer Zielzelle in einer Probe, wobei die Zielzelle durch eine Zelloberflächenstruktur gekennzeichnet ist, wobei das Verfahren umfasst: - Bereitstellen eines doppelt fluoreszierenden Partikels nach einem der Ansprüche 1 bis 8; - Ermöglichen eines Kontakts zwischen dem doppelt fluoreszierenden Partikel und einer Vielzahl von Zellen aus der Probe, die möglicherweise eine Zelle mit der Zelloberflächenstruktur umfasst; - Nachweisen einer Zelle mit der Zelloberflächenstruktur mit daran gebundenen doppelt fluoreszierenden Partikeln; und - Ermitteln eines Vorhandenseins der Zielzelle in der Probe.
  10. Suchverfahren nach Anspruch 9, wobei das Nachweisen der Zelle ein Messen eines Verhältnisses einer ersten Fluoreszenz und einer zweiten Fluoreszenz des doppelt fluoreszierenden Partikels umfasst.
  11. Suchverfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Zelloberflächenstruktur ein glykosyliertes Protein oder ein glykosyliertes Lipid ist.
  12. Verfahren zum Etablieren einer Zielzelllinie, wobei die Zellen der Zielzelllinie durch eine Zelloberflächenstruktur gekennzeichnet sind, wobei das Verfahren umfasst: - Isolieren der Zielzelle, die mit dem Suchverfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 definiert wird, aus einer Mehrzahl von Zellen, und - Kultivieren der isolierten Zelle.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zielzelle eine ein bestimmtes Immunglobulin produzierende Zelle oder eine ein bestimmtes Zytokin produzierende Zelle ist.
  14. Verwendung eines doppelt fluoreszierenden Partikels nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die in-vitro-Erkennung und/oder -Kennzeichnung von zirkulierenden Tumorzellen in einer Blutprobe.
  15. Verwendung eines doppelt fluoreszierenden Partikels nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Erkennen einer Zelle, einer Zelllinie oder eines Hybridoms, die bzw. das ein bestimmtes Immunglobulin oder ein bestimmtes Zytokin produziert.
  16. Bildgebungsverfahren zur Krebserkennung in einem Gewebe, umfassend: Ermitteln eines Fluoreszenzverhältnisses an einem doppelt fluoreszierenden Partikel und Erzeugen eines Bilds des Gewebes, wobei Zellen mit einer Oberflächenstruktur, die von doppelt fluoreszierenden Partikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erkannt wird, vor einem Hintergrund des Bilds hervorgehoben werden.
  17. Bildgebungsverfahren nach Anspruch 16, wobei das Gewebe eine in vitro untersuchte histologische Probe umfasst, die z.B. mit einer Nadelbiopsie erhalten worden ist.
  18. Zellsortierungsverfahren, umfassend: Markieren einer Zelle mit dem doppelt fluoreszierenden Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, Ermitteln eines Verhältnisses aus ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen; und Erfassen des Vorhandenseins einer Zelle, die mit dem doppelt fluoreszierenden Partikel markiert ist.
  19. Zellsortierungsverfahren nach Anspruch 18, wobei das molekular geprägte Polymer der Polymerhülle des doppelt fluoreszierenden Partikels so ausgelegt ist, dass es eine Zelloberflächenstruktur erkennt, insbesondere ein glykosyliertes, in der Membran verankertes Molekül.
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