CN110168368A - 病毒颗粒和病毒样颗粒的超敏感检测 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种定量和/或定性测定病毒颗粒的方法,该病毒颗粒包含至少一个捕获分子的结合位点和至少一个探针的结合位点,本发明还涉及用于实施所述方法的试剂盒,以及各种用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量和/或定性测定病毒颗粒的方法,所述病毒颗粒包含至少一个捕获分子的结合位点和至少一个探针的结合位点,还涉及用于实施所述方法的试剂盒,以及各种用途。
背景技术
病毒被定义为感染性颗粒,其只能在合适的宿主细胞内繁殖。病毒由核酸(DNA或RNA)、蛋白质构建,在某些情况下,还包含脂质。它们还包括感染细菌的噬菌体。由于它们都没有独立的复制能力或自身的新陈代谢机制,因此根据流行的观点,它们不能被归类为生物体。单个病毒颗粒由上述核酸和蛋白质外壳的基因组组成。有些还有另外的外壳。这种完整的感染性病毒颗粒代表病毒的细胞外形式,也称为病毒粒子。由于感染性病毒颗粒很小,根据物种其大小在15nm和300nm之间,所以迄今为止只知道少数的直接检测方法;大多数检测基于受感染细胞或受感染生物体的症状。当病原体(例如病毒颗粒)主动或被动地在生物体中穿透、保留并随后繁殖时,这通常被称为感染。如果宿主细胞可以归类为原核生物,则感染性病毒颗粒被称为噬菌体。
由于颗粒尺寸小,所以使用电子显微镜作为迄今为止仅有的直接检测病毒颗粒的方法。这涉及基于其作为颗粒的性质来检测病毒。除了合适设备的高成本之外,电子显微镜仅能够区分不同的病毒科,但不能确定相应的亚种。此外,样品必须是化学或物理固定的,结果是功能蛋白质不再可用或表位变性或掩蔽。此外,需要存在大量病毒颗粒。
根据现有技术,通过功能性的基于抗体或基于基因组的技术检测病毒或病毒组分,例如,基于PCR的病毒RNA或DNA的增殖以及通过杂交依赖性探针鉴定。
通过利用细胞病变效应的噬斑测定法检测功能性病毒。未登记灭活病毒或非感染性粒子。与病毒颗粒的量相比,基于基因组的技术更多地用于定量病毒RNA/DNA的量。
在Western印迹法中可以用抗体检测病毒蛋白的连续表位。
在强烈怀疑病毒感染的情况下以及当其他检测方法未能提供阳性结果时,使用PCR技术。该技术涉及通过使用病毒特异性引物的聚合酶链反应扩增基因组。在RNA病毒的情况下,需要通过逆转录酶将RNA转录成DNA。通过特异性探针杂交或通过扩增DNA的非特异性染色和凝胶电泳后的尺寸依赖性鉴定来检测扩增子。
基于PCR的方法必须费力地校准,其不是严格定量的并且非常容易受到污染,这可能导致假阳性结果。实际上,它们确定病毒DNA/RNA的存在,或者有时甚至仅确定其部分。另外,抑制PCR反应的样品组分可能导致假阴性结果。因此,在分析样品之前始终必须对样品进行纯化。
检测内源性抗病毒抗体的免疫测定通常只在感染后数周(诊断缺口)得到阳性结果。ELISA方法通常仅检测病毒的亚片段而不是完整颗粒的存在。
发明内容
本发明的一个目的是提供病毒颗粒的超灵敏检测。本发明的另一个目的是提供一种方法,该方法允许以尽可能少的量检测任何样品中的病毒颗粒和病毒样颗粒,因此甚至可以在任何样品中进行单独检测,特别是对于不可培养的病毒。因此,该方法可以检测病毒感染以及任何样品中的污染。
此外,本发明的意图在于不仅可以定性检测病毒颗粒,而且还可以定量和表征任何样品中的病毒颗粒。因此,本发明的意图在于首先确保颗粒数的直接和绝对定量,其次,确保对病毒颗粒的精确表征,从而使得分型成为可能。本发明的意图在于将该结果用于治疗以及诊断、差异诊断和/或病毒组装分析。
此外,本发明的意图还在于该方法还可确保检测蛋白质-蛋白质相互作用,即宿主-病毒相互作用。
本发明的意图在于以几个简单的步骤直接从任何样品进行检测,任何样品例如体外体液或尸检或活检材料、器官以及来自环境的样品,例如水样品、植物样品和土壤样品以及食品。
这些目的通过一种定量和/或定性测定病毒颗粒的方法来实现,所述病毒颗粒包含至少一个捕获分子的结合位点和至少一个探针的结合位点。所述方法包括以下步骤:
a)将捕获分子固定在底物上,
b)使病毒颗粒与捕获分子接触,
c)通过与捕获分子结合而将病毒颗粒固定在底物上,
d)使病毒颗粒与探针接触,以及
e)使探针与病毒颗粒结合,
其中,所述探针能够发射特定信号,且步骤b)和d)可以同时进行或d)在b)之前进行。
如果步骤b)和d)同时进行,则步骤c)和e)也因此同时进行。
在步骤b)之前进行步骤d)的另一变型中,在步骤c)中将用探针标记的病毒颗粒固定在底物上。因此,步骤e)也在步骤b)和c)之前进行。
在本发明的上下文中,“定量测定”是指首先确定病毒颗粒的浓度,因此也是确定它们存在与否。
优选地,定量测定还意味着对某些病毒类型的选择性定量。可以通过适当的探针控制这种定量。
在本发明的上下文中,“定性测定”是指病毒颗粒的表征,例如,形式的确定。
用一个或多个用于检测的探针标记病毒颗粒。在一个变型中,使用至少两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个探针。在另一变型中,使用两个,三个,四个,五个,六个,七个或更多个不同的探针。
探针含有分子或分子部分,其对病毒颗粒具有亲和力并识别病毒颗粒的结合位点并与之结合。另外,探针含有至少一个检测分子或分子部分,其与对病毒颗粒具有亲和力的分子或分子部分共价键合,并且可通过化学或物理方法检测和测量。
在一个替代方案中,探针可包含具有不同检测分子(或部分)的相同的亲和分子或分子部分。在另一个替代方案中,不同的亲和分子或分子部分可以与不同的检测分子或部分组合,或者,不同的亲和分子或部分可以与相同的检测分子或部分组合。也可以使用各种探针的混合物。
偶联到不同检测分子或分子部分的多种不同探针的使用首先增加了信号(相关信号)的特异性;其次,这使得能鉴定一种或多种特征不同的病毒颗粒。这允许对病毒颗粒进行选择性定量和表征。
在一个实施方式中,进行探针信号的空间分辨确定,即,空间分辨检测探针发射的信号。因此,本发明的这一实施方式排除了基于非空间分辨信号的方法,例如ELISA或夹心ELISA。这也包括类似ELISA的方法,即所有基于非空间分辨信号的方法,以及另外的基于“总”测量(,,Bulk“-Messungen)(换言之,集合测量)的方法;因此,无论检测是基于酶促显色反应,还是基于荧光或磁性或放射性标记的探针或抗体的检测,只要检测到的不是单个颗粒的信号,而是整个体积片段的信号,其包括所有免疫测定。
根据本发明的方法的特征还在于以下特征:
确定完整的、未破坏的病毒颗粒(即未破坏的病毒);确定所述颗粒和/或形式的数目;研究或分析单个颗粒,因此没有集合测量;确定和分析100个颗粒/μl或更低的低浓度;区别空白病毒外壳和除了外壳还包含其他组分(例如DNA、RNA、与外壳不同的蛋白质)的病毒颗粒。
然而,有利地是,高空间分辨率在检测中不是必需的。在根据本发明的方法的一个实施方式中,收集足够的数据点以允许针对背景信号检测病毒或病毒样颗粒,所述背景信号例如由仪器特异性噪声、其他非特异性信号或非特异性结合的探针引起的。以这种方式,读出与空间分辨事件(诸如呈现像素)一样多的值(读出值)。由于空间分辨率,每个事件是针对相应的背景确定的,因此优于没有空间分辨信号的ELISA方法。
在一个实施方案中,探针信号的空间分辨确定基于小体积元素(与样品体积相比)的研究,所述小体积元素在几飞升至低于一飞升的范围内,或在距捕获分子接触表面上方500nm,优选为300nm,特别优选为250nm,特别是200nm的高度上的体积区域内。
在本发明的上下文中,病毒颗粒选自包含病毒、病毒粒子、噬菌体及其部分或片段的组,或选自由它们组成的组。病毒样颗粒例如不能复制的病毒外壳、其部分或片段。在本发明的上下文中,术语病毒还包括病毒样颗粒,并且在每种情况下还包括病毒和/或病毒样颗粒的部分或片段。
在分类学上,病毒可以分为具有衣壳(即蛋白质外壳)的病毒,和具有脂质外壳的病毒,含有包埋的病毒蛋白质的脂质双层膜。在本发明的上下文中,根据本发明的所有病毒颗粒可以分成这样的效果:具有含有脂质的外壳或外壳部分的颗粒,和可能另外具有由蛋白质组成的外壳或外壳部分的颗粒,和仅具有由蛋白质组成的外壳或外壳部分的颗粒。
由于可以检测和分析单个颗粒,可以通过适当选择不同的捕获器和探针以在一个样品中平行地分析不同的病毒。因此,该方法也可用于鉴别诊断。
该方法不是在人体内和/或在人体上进行,而是离体进行,因此在体外进行。
根据本发明,病毒颗粒的部分或片段是含有至少两个结合位点的部分。
在一个实施方式中,底物的材料选自含有塑料、硅和二氧化硅的组或选自由它们组成的组。在优选的替代方案中,使用的底物是玻璃。
在本发明的另一个实施方式中,捕获分子与底物共价键合。
为此,在一个替代方案中使用的是具有亲水表面的底物。在一个替代方案中,这通过在步骤a)之前将亲水层施加到底物来实现。因此,捕获分子共价键合至底物或底物所负载的亲水层上。
亲水层是生物分子排斥层,意味着生物分子与底物的非特异性结合被最小化。捕获分子固定在所述层上,优选共价固定。针对病毒颗粒的特征,所述捕获分子具有亲和力。捕获分子可以全部相同,或者是不同捕获分子的混合物。在一个替代方案中,使用的捕获分子和探针是相同的分子;优选地,捕获分子不含有检测分子或分子部分。
在一个实施方式中,亲水层选自包含PEG、聚赖氨酸(优选聚-D-赖氨酸)和葡聚糖或其衍生物(优选羧甲基-葡聚糖(CMD))的组,或选自由它们组成的组。在本发明的上下文中的衍生物是在一些取代基中与母体化合物不同的化合物,对于根据本发明的方法而言,所述取代基是惰性的。
在一个实施方式中,在施加亲水层之前,首先将底物表面羟基化,然后用合适的化学基团,优选氨基进行官能化。在一个替代方案中,通过使底物与氨基硅烷,优选APTES(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)或乙醇胺接触来实现这种具有氨基的官能化。
为了制备用于包衣的底物,进行以下一个或多个步骤:
-在超声波浴或等离子体清洁器中清洗由玻璃或载玻片组成的底物,或者在5M NaOH中培养至少3小时,
-用水漂洗,然后在氮气下或在真空下干燥,
-浸入由比例为3:1的浓硫酸和过氧化氢组成的溶液中以活化羟基,
-用水漂洗至中性pH,然后用乙醇漂洗并在氮气氛下干燥,
-浸入含有3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(1-7%)的溶液中,优选在无水甲苯中,或乙醇胺溶液中,
-用丙酮或DMSO和水漂洗并在氮气氛下干燥。
在一个替代方案中,将底物在气相中与氨基硅烷、优选APTES接触;因此,任选预处理的底物用氨基硅烷进行气相沉积。
对于用葡聚糖、优选羧甲基-葡聚糖(CMD)进行包衣,将底物用CMD水溶液(浓度为10mg/ml或20mg/ml)和任选的N-乙基-N-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(200mM)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(50mM)培育,然后洗涤。
如上所述,在一个变型中,羧甲基-葡聚糖共价键合到首先被羟基化然后用胺基官能化的玻璃表面。
使用的底物也可以是微量滴定板,优选玻璃基板。由于在使用聚苯乙烯框架时不可能使用浓硫酸,所以在本发明的一个实施方式中,将玻璃表面活化,这种活化类似于Janissen等人在Colloids Surf B Biointerfaces(胶体表面B生物界面),2009,71(2),200–207中所述的方法。
捕获分子(优选共价地)固定在该亲水层上,其对待检测的病毒样或病毒颗粒的特征(例如蛋白质)具有亲和力。捕获分子可以全部相同,或者是不同捕获分子的混合物。
在本发明的一个实施方式中,任选地在通过EDC/NHS(分别为200和50mM)的混合物活化CMD包被的载体后,将捕获分子(优选抗体)固定在底物上。
可以使其上已没有结合捕获分子的剩余羧酸酯端基失活。为了使CMD间隔体上的所述羧酸酯端基失活,使用DMSO中的乙醇胺。在施加样品之前,任选地用PBS漂洗底物或载体。
将待测样品与如此制备的底物接触,并且如果需要,进行培养。要使用的待研究样品可以是内源性液体或组织。在本发明的一个实施方式中,样品选自脑脊髓液(CSF)、血液、血浆和尿液。然而,对象的食物和拭子也用作样品。样品可以用本领域技术人员已知的不同处理步骤来处理。
在本发明的一个实施方式中,将样品直接施加在底物(未包被的底物)上,任选地通过共价键结合在底物的任选活化的表面上。
在本发明的一个变型中,通过以下一种或多种方法预处理样品:
-加热样品,
-一次或多次冻融循环,
-机械破碎,
-样品均质化,
-用水或缓冲液稀释,
-用酶,例如蛋白酶、核酸酶、脂肪酶处理,
-离心,
-沉淀,
-与探针竞争以替代存在的任何抗体。
优选地,样品直接与底物接触和/或不经预处理。
可以通过洗涤步骤除去非特异性结合的物质。
在进一步的步骤中,用一种或多种用于进一步检测的探针标记固定的病毒样颗粒或病毒颗粒。如上所述,也可以根据本发明以不同的顺序进行各个步骤。
通过合适的洗涤步骤,除去未与病毒颗粒结合的过量探针。
在一个替代方案中,不去除所述过量探针。结果是,省略了最后的洗涤步骤,并且在病毒颗粒-探针复合物或键的解离方向上也没有平衡偏移。由于空间分辨检测,在评估中未登记过量探针,并且不会损害测量。
在一个变型中,除了固定在底物上之外,病毒颗粒-捕获分子复合物是化学固定的,即除了通过结合位点连接,病毒颗粒和捕获分子通过化学键、优选共价键彼此连接,这意味着防止了解离。
在一个替代方案中,除了固定在底物上之外,探针-病毒颗粒-捕获分子复合物是化学固定的,即除了通过结合位点连接,探针、病毒颗粒和捕获分子通过化学键、优选共价键彼此连接,这意味着防止了解离。
在另一个替代方案中,探针-病毒颗粒复合物是化学固定的,即除了通过结合位点连接,病毒颗粒和探针通过化学键,优选共价键彼此连接,这意味着防止了分离。然后将其固定在底物上。
在一个实施方式中,病毒颗粒的结合位点是表位,且捕获分子和/或探针是抗体或适体或其组合。在一个变型中,捕获分子和/或探针是抗体。在本发明的一个变型中,捕获分子和探针可以是相同的。
在本发明的一个实施方式中,捕获分子和探针不同。例如,使用不同的抗体作为捕获分子和探针。在本发明的另一个实施方式中,使用除任何(染料)标记之外的彼此相同的捕获分子和探针。在本发明的一个替代方案中,使用除任何(染料)标记之外彼此相同的各种探针。在本发明的其他替代方案中,使用至少两种或两种以上的不同的捕获分子和/或探针,该捕获分子和/或探针含有不同的抗体且任选地还具有不同的染料标记。
为了检测,探针的特征在于它们发射光学可检测的信号,该信号选自由荧光发射、生物发光发射和化学发光发射以及吸收组成的组。
因此,在一个替代方案中,探针用荧光染料标记。使用的荧光染料可以是本领域技术人员已知的染料。或者,也可以使用荧光生物分子、优选GFP(绿色荧光蛋白),其结合物和/或融合蛋白,以及量子点。
对于表面的后期质量控制,例如,捕获分子包衣的均匀性,可以使用以荧光染料标记的捕获分子。为此,优选使用不干扰检测的染料。结果可能是随后的结构检查以及测量结果的标准化。
通过表面成像(例如,激光显微术)检测固定且标记的病毒样或病毒颗粒。最高可能的空间分辨率确定了大量像素,因为可以伴随地对结构特征进行成像和分析,结果是可以增加测定的灵敏度和选择性。因此,相对于背景信号(例如,非特异性结合的探针)增加了特定信号。
优选使用共聚焦荧光显微镜、荧光相关光谱(FCS),特别是与互相关方法和激光扫描显微镜(LSM)结合进行检测。
在本发明的一个替代方案中,使用共聚焦激光扫描显微镜进行检测。
在本发明的一个实施方式中,为此目的使用激光聚焦,例如在激光扫描显微镜(LSM)或FCS(荧光相关光谱系统)中使用的激光聚焦,以及相应的超分辨率变体,例如,STED、PALM或SIM。
在另一个实施方式中,可以通过空间分辨荧光显微镜法,优选通过TIRF显微镜,以及其相应的超分辨率变体,例如STORM、dSTORM来实现检测。
因此,优选使用LSM和/或TIRF,特别优选使用TIRF用于检测。
与ELISA相比,这些方法产生与存在空间分辨事件(例如像素)一样多的读出值。根据不同探针的数目,这些信息甚至倍增。该倍增适用于任何检测事件并且导致信息增益,这是由于其公开了关于病毒样或病毒颗粒的其他性质(例如第二特征)。由于这种设置,针对任何事件可以增加信号的特异性。
可以选择探针从而使得单个病毒成分(例如单个外壳/衣壳蛋白质分子)的存在不影响测量结果。可以选择探针,以便可以确定任何单个病毒颗粒的病毒种类和亚种(血清型)。可以选择另外的探针,从而(例如通过DNA/RNA结合荧光团(EtBr、EtI))可以区分含DNA/RNA的病毒外壳和“空”病毒外壳。
为了评估,使用和检测的所有探针的空间分辨信息(例如荧光强度)都用于确定例如病毒样或病毒颗粒的数目、其大小及其特征。同时,例如,背景最小化算法和/或强度阈值也可用于进一步评估和用于模式识别。进一步的图像分析选项包括,例如,搜索局部强度最大值,以便从图像信息中获得检测到的病毒颗粒的数目。
为了使测定结果之间可以彼此比对(跨越迁移、时间和实验者),可以使用标准品(内部和/或外部)。
在本发明的一个实施方式中,如此使用的是标准品,尤其是在WO 2016/146093 A中描述的标准品。这些优选用作校准标准品和/或内标。根据本发明,用于此目的的是与病毒大小相对应的标准品,因此直径在10-500nm之间,优选直径为20-200nm。优选使用无机纳米颗粒作为基体,其中,根据WO 2016/146093 A中所述的方法将包含表位或由表位组成的病毒粒子外壳蛋白的部分与无机纳米颗粒结合。
在一个实施方式中,在以下步骤中制备这样的标准品:
A)提供具有待分析的病毒颗粒大小的无机纳米颗粒(10至500nm,优选20至200nm),
B)在纳米颗粒的表面上形成游离氨基或游离羧基,以使纳米颗粒表面官能化以形成胺基或羧基官能化的纳米颗粒,
C)
i)将马来酰亚胺基-间隔基-羧酸(Maleinimido-Spacer-)与步骤B)中的游离氨基结合,
或者
ii)将步骤B)中的游离羧基转化为NHS酯,
D)结合包含至少一个表位或由至少一个表位组成的外壳或外壳部分
i)通过在包含至少一个表位或由至少一个表位组成的外壳或外壳部分的自由端的巯基结合至马来酰亚胺基-间隔基-羧酸,
或者
ii)通过在包含至少一个表位或由至少一个表位组成的外壳或外壳部分的自由端的氨基结合至NHS酯。
如上所述的方法,其特征在于,在步骤A)中的合成,以制备二氧化硅纳米颗粒。
如上所述的方法,其特征在于,在步骤B)中用乙醇中的氨基丙基三乙氧基硅烷对表面进行硅烷化以形成游离氨基。
根据任意上述方法,其特征在于,在步骤B)中将氨基与琥珀酸酐反应以形成游离羧基。
根据任意上述方法,其中,马来酰亚胺基-间隔基-羧酸在步骤C)i)中与步骤B)的游离氨基结合之前转化为NHS酯。
根据任意上述方法,其特征在于,在步骤C)i)或步骤C)ii)之前,将来自步骤C)i)的马来酰亚胺基-间隔基-羧酸或来自步骤B)的游离羧基与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N-羟基琥珀酰亚胺反应以转化成NHS酯。
根据任意上述方法,其特征在于,在步骤D)ii)中将包含至少一个表位或由至少一个表位组成的外壳或外壳的部分的氨基与NHS酯共价键合。
根据任意上述方法,其特征在于,在进行步骤C)ii)之后将链霉亲和素分子排列在纳米颗粒的NHS酯上,并且在步骤D)之前将生物素基团排列在包含至少一个表位或由至少一个表位组成的外壳或外壳的部分上。
在本发明的一个实施方式中,使用根据本发明的方法可以获得的是悬浮液中病毒颗粒的数目而不使用校准标准或者外部或内部标准。为此,任选地首先制备的是连续稀释的病毒颗粒的浓度系列。使用根据本发明的方法分析所述系列。就此而言,在每个反应室中在不同位置(例如,在5×5个位置)连续记录的是在每种情况下在两个荧光通道中的两个图像(激发/发射=635/705nm和488/525nm)。对于两个通道,可以选择的是最大激光输出(100%),曝光时间为500ms且增益值是800。然后评估图像数据。为此,基于阴性对照确定每个通道的强度阈值。对于所述阈值,对每个通道的阴性对照的所有图像取平均值,并且确定的是高于其仅存在总像素(因此1000像素)的0.1%的强度值。在评估步骤中,首先对每个通道中的每个图像应用强度阈值,然后在两个值中将相同位置的图像相互比较。每个图像的计数仅是其中在两个通道中完全相同位置的像素高于通道的强度阈值的那些像素。最后,对各个反应室中的所有图像取平均像素数,然后,确定复制值的平均像素数的平均值,并规定了标准差。
在进一步的评估中,对于每个记录乘以的是来自其中获得荧光颜色通道的两个图像的每个对应像素的灰度值。基于具有几个像素(例如4个像素)的标准偏差的2D高斯函数(“imgaussfilt”),对得到的图像或灰度值矩阵进行平滑处理。接下来,基于函数“imregionalmax”确定局部最大值。高于阈值的局部最大值在此对应于颗粒数,该阈值对应于上面确定的阈值。以这种方式,确定每次记录的颗粒数,并对于相同浓度的反应室形成平均值。这意味着可以指定病毒颗粒的绝对数目。可以从实施例5和6中收集精确的描述。
本发明还提供了在不使用标准体,特别是不使用校准标准体或外部或内部标准体的情况下,确定悬浮液中病毒颗粒的绝对数目的方法。
本发明还提供了包含一种或多种以下组分的试剂盒:
任选地具有亲水表面的底物、捕获分子、探针、具有捕获分子的底物、溶液、缓冲液。
本发明的试剂盒的化合物和/或组分可以任选地与缓冲液和/或溶液一起包装在容器中。或者,一些组分可以包装在同一容器中。除此之外,或作为其替代方案,可以将一种或多种组分吸附到固体载体上,例如玻璃板、片或尼龙膜,或微量滴定板的孔。试剂盒可以进一步包含用于任何实施方式的试剂盒的使用说明。
在试剂盒的另一变型中,将上述捕获分子固定在底物上。此外,试剂盒可含有溶液和/或缓冲液。为了保护生物分子-排斥表面(例如葡聚糖表面)和/或固定在其上的捕获分子,可以用溶液或缓冲液覆盖它们。在一个替代方案中,溶液含有一种或多种杀菌剂,其增加表面的保质期。
本发明进一步提供了根据本发明的方法用于检测所有样品中的病毒颗粒和病毒样颗粒、用于病毒颗粒和病毒样颗粒的定量(滴度测定)、用于病毒感染的检测、用于检测病毒污染的用途,用于开发活性抗病毒成分、颗粒数的直接和绝对定量、治疗伴随诊断(目标参与)、病毒组装的分析、差异诊断、蛋白质-蛋白质相互作用检测(宿主/病毒)和/或病毒分类的用途。
本发明进一步提供了根据本发明的方法用于例如通过确定病毒颗粒或病毒样颗粒的滴度来监测传染病的治疗和监测和/或检查活性成分和/或治疗方法的功效的用途。这可用于临床测试和试验以及治疗监测。为此,根据本发明的方法测量样品并比较结果。
本发明进一步提供了根据本发明的方法用于测定活性成分对病毒的功效的用途,在该方法中,将样品的结果相互比较。样品是体液,在施用活性成分或进行处理方法之前和/或之后收集,或在之后的不同时间点收集。根据本发明,将结果与未经受活性成分和/或处理方法的对照进行比较。基于结果选择活性成分和/或其剂量和/或治疗方法。
本发明还提供了根据本发明的方法用于确定人是否包括在临床试验中的用途。为此,根据本发明的方法测量样品,并且参考极限值做出决定。
具体实施方式
实施例:
实施例1
在含有384个反应室(RC)的市售3D NHS微量滴定板(PolyAn GmbH)中进行该实验。用以下抗体包被微量滴定板的RC:克隆抗-gp8-E1(产品#ABIN793840,批号#77410,antibodies-online.com)作为捕获分子(15μl;在100mM MES中10μg/ml,pH=4.7;培养过夜)。此后,对RC进行洗涤程序,洗涤程序由在每种情况下使用含有0.1%吐温20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和PBS进行三次洗涤和抽吸(absaugen)构成。在下一步骤中,将RC用50μl的Smartblock(Candor Bioscience GmbH)在室温(RT)下进行包被1小时,并在此时间过后再次进行上述洗涤程序。此后,在RC中装载15μl的在人EDTA血浆中连续稀释的样品一式四份,并在室温下培养。在培养过夜后,使用洗涤程序洗涤RC,将RC吸干并加载检测抗体。在每种情况下用一种类型的荧光染料标记检测抗体。用荧光染料CF488标记抗体RL-ph1(产品#LS-C146750,LifeSpan BioScience),并用荧光染料CF633标记抗体LRL-ph2标记(产品#LS-C146751,批号#76955,LifeSpan BioScience)。将检测抗体一起稀释在PBS中,以使每种抗体的最终浓度为1.25ng/ml。每个RC加载15μl的抗体溶液并在室温下培养1小时。经过这段时间后,将板用含有0.1%吐温20的PBS洗涤5次,并用PBS洗涤5次。完全吸干后,用20μl的水填充RC,用膜将板密封。
在具有100x油浸物镜的TIRF显微镜(Leica)中进行测量。为此目的,用浸渍油大量涂覆微量滴定板的玻璃基底,并将板引入显微镜的自动化阶段。之后,对于每个RC在5×5位置连续记录的是在每种情况下在两个荧光通道中的两个图像(激发/发射=635/705nm和488/525nm)。对于两个通道,可以选择的是最大激光输出(100%),曝光时间为500ms且增益值是1300。然后评估图像数据。
对于此分析,首先使用800的二次ROI。这意味着在评估中不包括在每种情况下每个图像每侧的最外面100个像素,这意味着1000×1000像素的图像产生800×800像素的图像。在下一步骤中,基于阴性对照确定每个通道的强度阈值。对于所述阈值,对于每个通道的阴性对照的所有图像取平均值,并且确定的是高于其仅存在总像素(因此640像素)的0.1%的强度值。在评估步骤中,首先对每个通道中的每个图像应用强度阈值,然后在两个值中将相同位置的图像相互比较。每个图像的计数仅是其中在两个通道中完全相同位置的像素高于通道的强度阈值的那些像素。最后,对各个RC中的所有图像取平均像素数,然后,确定了复制值的平均像素数的平均值,并规定了标准差。
其结果汇总在图1中。
图1显示出在阴性的人EDTA血浆中连续稀释的M13噬菌体(Ph.D.-7Phage DisplayLibrary;产品#E8102L,批号#0061005,New England BioLabs)的系列浓度。该图显示了在5个对数稀释步骤上测量信号与M13噬菌体浓度之间的线性关系以及与背景相关的最低浓度的可区分性。
实施例2:
与实施例1类似地进行实验,其结果汇总在图2中,不同之处在于在TRIS缓冲盐水中而不是在人血浆中稀释噬菌体。这也产生了不同的强度阈值,然而,使用相同的规则确定(0.1%的阴性对照)强度阈值。类似于实施例1进行评估。
实施例3:
其显示了使用Hoechst染色剂测量后的噬菌体。
对于该实验,使用含有384个反应室(RC)的市售的微量滴定板(Greiner Bio-one;Sensoplate Plus)。首先,构建微量滴定板的表面。为此目的,将板放入干燥器中,在该干燥器中放置含有5%的APTES的甲苯的碗。将该干燥器充满氩气并培养1小时。此后,取出碗,并将板在真空下干燥2小时。将20μl的2mM的SC-PEG-CM(MW 3400;Laysan Bio)在去离子水中的溶液在填充到干板的反应室中,并培养4小时。在培养后,将RC用水洗涤三次,然后用20μl的200mM的EDC水溶液(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺;Sigma)和50mM的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺,Sigma)水溶液在每种情况下培养30分钟。用去离子水将板再次洗涤三次。此后,用克隆抗-gp8-E1(产品#ABIN793840,批号#77410,antibodies-online.com)抗体作为捕获分子(20μl;在PBS中10μg/ml,1小时)将RC包被。此后,用洗涤程序处理RC,在每种情况下,洗涤程序由用含有0.1%吐温20的TBS和TBS三次洗涤和完全抽吸构成。在下一步骤中,在室温(RT)下用50μl的Smartblock(Candor Bioscience GmbH)将RC包被过夜,并且这段时间过后,再次使用三(羟甲基)氨基甲烷缓冲盐水(TBS;pH=7.4)进行洗涤并完全抽吸三次。将样品依次在含有染料Hoechst染色剂(1μg·ml-1)的三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲液中稀释,并培养1小时。此后,在每种情况下将15μl的样品一式三份加载到RC中并在室温下培养1小时。培养后,用TBS洗涤RC三次,且经过这段时间后,用TBS洗涤板3次。完全抽吸后,用20μl的TBS填充RC,用膜将板密封。
在具有100x油浸物镜的TIRF显微镜(Leica)中进行测量。为此目的,用浸渍油大量涂覆微量滴定板的玻璃底物,并将板引入显微镜的自动化阶段。之后,对于每个RC在5×5位置连续记录的是在荧光通道中的一个图像(激发/发射=405/450nm)。选择的是最大激光输出(100%),曝光时间为500ms且增益值是800。然后评估图像数据。对于通道,强度阈值设置为4000灰度级。在评估步骤中,首先对每个通道中的每个图像应用强度阈值,然后在两个值中将相同位置的图像相互比较。每个图像的计数仅是其中在两个通道中完全相同位置的像素高于通道的强度阈值的那些像素。最后,对各个RC中的所有图像取平均像素数,然后,确定了复制值的平均像素数的平均值,并规定了标准差。
其结果汇总在图3中。
图3示出了在含有Hoechst染色剂的TBS中连续稀释的M13噬菌体(Ph.D.-7PhageDisplay Library;产品#E8102L,批号#0061005,New England BioLabs)的系列浓度。该图显示了M13噬菌体在5个对数稀释步骤(10^9-10^5)上的浓度依赖性关系,并且最后两个浓度步骤不再能与背景区分开。
可清楚地显示的是Hoechst染色剂作为病毒测定中与DNA和RNA粘附的染料对病毒颗粒染色的适用性。因此,可以检测完整的病毒,或区分空外壳与含DNA和/或RNA的外壳。
实施例4:
图4示出了使用染色剂进行测量后的图3中的噬菌体。将来自实施例3的微孔板的RC用TBS洗涤三次,并与检测抗体、用CF488荧光染料标记的1.25μg/ml的RL-ph1(产品#LS-C146750,LifeSpan BioScience)和用CF633荧光染料标记的1.25μg/ml的LRL-ph2(产品#LS-C146751,批号#76955,LifeSpan BioScience)培养1小时。用TBS洗涤三次后,用具有100x油浸物镜的TIRF显微镜(Leica)测量样品。为此目的,用浸渍油大量涂覆微量滴定板的玻璃基底,并将板引入显微镜的自动化阶段。之后,对于每个RC在5×5位置连续记录的是在每种情况下在两个荧光通道中的两个图像(激发/发射=635/705nm和488/525nm)。对于两个通道,可以选择的是最大激光输出(100%),曝光时间为500ms且增益值是800。然后评估图像数据。为此目的,基于阴性对照确定每个通道的强度阈值。对于所述阈值,对每个通道的阴性对照的所有图像取平均值,并且确定的是高于其仅存在总像素(因此1000像素)的0.1%的强度值。在评估步骤中,首先对每个通道中的每个图像应用强度阈值,然后在两个值中将相同位置的图像相互比较。每个图像的计数仅是其中在两个通道中完全相同位置的像素高于通道的强度阈值的那些像素。最后,对各个RC中的所有图像取平均像素数,然后,确定了复制值的平均像素数的平均值,并规定了标准差。
该实验显示出M13噬菌体在4个对数稀释步骤(10^6-10^3)上的浓度依赖性关系。它表明随后用荧光标记的抗体染色是可行的。此外,实验表明,具有PEG包衣的微量滴定板具有与培养时间较短的3D NHS板的情况大致相同的灵敏度(参见图2)。
实施例5:
在含有384个反应室(RC)的市售3D NHS微量滴定板(PolyAn GmbH)中进行该实验。用抗-VSV-G抗体P5D4(Sigma)作为捕获分子(15μl;在100mM的MES中的10μg/ml,pH=4.7;过夜)将微量滴定板的RC包被。此后,用洗涤程序处理RC,在每种情况下,洗涤程序由用含有0.1%的吐温20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和PBS三次洗涤和完全抽吸构成。在下一步骤中,在室温(RT)下用50μl的Smartblock(Candor Bioscience GmbH)将RC包被持续1小时,经过这段时间后,再次使用三(羟甲基)氨基甲烷缓冲盐水(TBS;pH=7.4)进行洗涤并完全抽吸三次。接着将样品在三(羟甲基)氨基甲烷-缓冲盐水(TBS)中培养1小时。此后,在每种情况下将15μl的样品一式三份加载到RC中并在室温下培养1小时。在培养后,使用TBS对RC进行洗涤并完全抽吸三次,并与15μl检测抗体混合。在每种情况下用一种类型的荧光染料标记检测抗体。在每种情况下,用CF488和CF633标记抗-VSV-G抗体P5D4(Sigma)。将检测抗体一起稀释在TBS中,以使每种抗体的最终浓度为1.25ng/ml。每个RC加载15μl的抗体溶液并在室温下培养1h。经过这段时间后,将板用TBS洗涤3次。完全抽吸后,用20μl的TBS填充RC,用膜将板密封。
在具有100x油浸物镜的TIRF显微镜(Leica)中进行测量。为此目的,用浸渍油大量涂覆微量滴定板的玻璃基底,并将板引入显微镜的自动化阶段。之后,对于每个RC在5×5位置上连续记录的是在每种情况下在两个荧光通道中的两个图像(激发/发射=635/705nm和488/525nm)。对于两个通道,可以选择的是最大激光输出(100%),曝光时间为500ms且增益值是800。然后评估图像数据。为此目的,基于阴性对照确定每个通道的强度阈值。对于所述阈值,对每个通道的阴性对照的所有图像取平均值,并且确定的是高于其仅存在总像素(因此1000像素)的0.1%的强度值。在评估步骤中,首先对每个通道中的每个图像应用强度阈值,然后在两个值中将相同位置的图像相互比较。每个图像的计数仅是其中在两个通道中完全相同位置的像素高于通道的强度阈值的那些像素。最后,对各个RC中的所有图像取平均像素数,然后,确定了复制值的平均像素数的平均值,并规定了标准差。
其结果汇总在图5中。
图5示出了在TBS中稀释的来自细胞培养基的HIV安全菌株(对于生物合成,参见JMol Biol.2017年4月21日;429(8):1171-1191.doi:10.1016/j.jmb.2017.03.015.,其在脂质膜中含有VSV糖蛋白)的连续稀释的病毒颗粒的浓度系列。该图显示了在3个对数稀释步骤上测量信号与病毒颗粒的浓度之间的线性关系以及与背景相关的最低浓度的可区分性。由于此处涉及具有脂质外壳的病毒颗粒,因此根据本发明的方法可用于分析该分类群。
实施例6:
图6示出了在从图5的数据的各个稀释步骤每μm2的病毒颗粒的数目。这种对数据替代的评估允许病毒颗粒的绝对计数,因此是独立于标准体的。对于该评估,对于每个记录乘以的是来自其中获得荧光颜色通道的两个图像的每个对应像素的灰度值。基于具有4个像素的标准偏差的2D高斯函数(“imgaussfilt”)对得到的图像或灰度值矩阵进行平滑处理。接下来,基于函数“imregionalmax”确定局部最大值。高于阈值的局部最大值在此对应于颗粒数,该阈值对应于在图5中确定的阈值。以这种方式,确定每次记录的颗粒数,并最终对于相同浓度的RC形成平均值。
Claims (15)
1.一种定量和/或定性测定病毒颗粒的方法,所述病毒颗粒包含至少一个捕获分子的结合位点和至少一个探针的结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)将捕获分子固定在底物上,
b)使病毒颗粒与捕获分子接触,
c)通过与捕获分子结合而将所述病毒颗粒固定在所述底物上,
d)使所述病毒颗粒与探针接触,以及
e)使所述探针与所述病毒颗粒结合,
其中,所述探针能够发射特定信号,且步骤b)和d)可以同时进行或d)在b)之前进行。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,进行所述探针信号的空间分辨确定。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述病毒颗粒选自包含病毒、病毒粒子、噬菌体及其部分或片段的组,或选自由它们组成的组。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述底物由塑料、硅或二氧化硅、优选玻璃组成。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤a)之前所述底物具有亲水表面。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,在步骤a)之前将亲水层施加到所述底物上。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述亲水层选自包含PEG、聚赖氨酸和葡聚糖或其衍生物的组,或选自由它们组成的组。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,在施加亲水层之前,将所述底物羟基化并用反应性基团(氨基)将其官能化。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,通过将所述底物与APTES(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)或乙醇胺接触来实现氨基官能化。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,将所述底物在气相中与APTES接触。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述捕获分子与所述底物或包衣共价键合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述病毒颗粒的结合位点是表位,且所述捕获分子和探针是抗体或适体或其组合。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述探针用荧光染料标记。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,通过空间分辨荧光显微镜法来实现检测。
15.一种用于进行根据权利要求1-14中任一项所述方法的试剂盒,其包含一种或多种以下组分:任选具有亲水表面的底物、捕获分子、探针、具有捕获分子的底物、溶液、缓冲液。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190823 |
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