CN110268247A - 单分子水平的蛋白质-蛋白质相互作用的测量 - Google Patents

单分子水平的蛋白质-蛋白质相互作用的测量 Download PDF

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Abstract

提供了用于表征至少一种蛋白质分子与可检测标记的探针的结合特征的方法。

Description

单分子水平的蛋白质-蛋白质相互作用的测量
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2017年1月30日提交的美国临时专利申请号62/452,231的优先权，该申请通过引用纳入本文用于所有目的。
背景
免疫测定是广泛采用的方法，用于确定生物样品和其他样品中分子的数量和/或存在。这些方法依赖于抗体和抗原之间的高度选择性相互作用。免疫测定的灵敏度是良好测定的关键性能指标，其受到测定平台的恒定和可变噪音源的影响。由检测元件，信号处理，分子散粒噪音，热噪音和约翰逊噪音引起的恒定噪音源将通过特定系统在特定强度下的任何测量来呈现(Woolley等，2015，Anal Bioanal Chem407：8605-8615)。然而，采用能够进行常规单分子检测的改进检测技术，检测抗体-抗原结合的仪器不再是定义免疫测定检测限的基本因素。可变噪音主要来自抗体的非特异性结合，其在免疫复合物形成的每个步骤中发生，具有不同的影响。虽然非靶物质的结合可能性低于分析物的特异性结合，但在低浓度的情况下，非特异性结合占整体信号的大部分(Jackson和Ekins，1986，JImmunological methods，87：13-20；Hassibi等，2007，J Applied Physics，102；Rissin等，2010 Nature Biotechnology 28：595-599；Schmidt等，2011 J Proteome Research 10：1316-1322；Chang等，2012，J immunological methods378：102-115)。免疫测定通常限于通过非特异性结合效应在纳摩尔至皮摩尔范围内的定量。
大多数市售可得的免疫测定依赖于将化学连接的荧光团用于抗体。将与测定平台结合的所有抗体的荧光强度(无论是通过特异性还是非特异性结合)经平均并求和处理以产生抗原浓度的估计值。减少非特异性结合噪音的最有效方法是使用高度特异性和高亲和力的抗体，使用阻断剂，并尽可能多地洗去非特异性结合的抗体。
现有技术的局限性在于它不能使用低亲和力或快解离速率的探针来研究单分子水平下的蛋白质-蛋白质相互作用。由于需要增强的灵敏度和特异度，需要补足或补充现有工具，例如表面等离子体共振(SPR)，2-D凝胶电泳和质谱(MS)。
发明概述
本发明提供了表征生物分子如蛋白质，以及检测单分子水平的结合对成员之间的结合特征的方法。其中，这些方法提供了区分探针与其抗原的特异性结合和探针与任何非靶抗原分子的非特异性结合的解决方案。
在一个实施方式中，一种表征至少一种蛋白质分子与可检测标记的探针的结合特征的方法，该方法包括：使蛋白质分子与可检测标记的探针接触，该探针显示出与蛋白质相关的快速解离速率结合特征，以在蛋白质分子和探针之间产生瞬时结合相互作用；通过对多个位置处的标记的探针进行单分子检测来检测瞬时相互作用，其中瞬时相互作用具有约10分钟至约1纳秒的观察到的停留时间；并且关联多个位置处的多个瞬时相互作用的相互作用频率，以确定蛋白质分子与探针的结合特征。
在一个实施方式中，蛋白质固定在表面上。
在一个实施方式中，固定的表面是玻璃，石英或塑料。
在一个实施方式中，使用亲水性自组装单层，亲水性聚合物刷，两性离子聚合物刷或腈涂层将蛋白质固定在表面上。
在一个实施方式中，表面用链霉亲和素包被，并且蛋白质使用生物素化的蛋白质而被固定在表面上。
在一个实施方式中，蛋白质以约2个分子至约1×106个分子/100μm2的表面密度固定。
在一个实施方式中，蛋白质以约2×102个分子至约8×105个分子/100μm2的表面密度固定。
在一个实施方式中，蛋白质以约2×103个分子至约6×104个分子/100μm2的表面密度固定。
在一个实施方式中，使多个位置处的多个瞬时相互作用的相互作用频率相关联允许分离蛋白质特异性信号与非特异性噪音。
在一个实施方式中，蛋白质特异性信号相互作用与非特异性噪音相互作用的比率大于或约为2。
在一个实施方式中，蛋白质特异性信号相互作用与非特异性噪音相互作用的比率大于或约为3。
在一个实施方式中，蛋白质特异性信号相互作用与非特异性噪音相互作用的比率大于或约为4。
在一个实施方式中，关联多个位置处的多个瞬态相互作用的相互作用频率测量多个位置处的结合事件(on-event)和解离事件(off-event)的总数。
在一个实施方式中，每个观察区域记录超过1000个瞬时相互作用。
在一个实施方式中，每个观察区域记录超过2000个瞬时相互作用。
在一个实施方式中，每个观察区域记录超过4000个瞬时相互作用。
在一个实施方式中，结合特征包括从多个位置处的蛋白质分子和探针之间的多个瞬时相互作用计算的统计度量。
在一个实施方式中，统计度量是由泊松统计，隐马尔可夫建模或边缘检测算法计算的。
在一个实施方式中，统计度量包括以下的一个或多个：
a.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的平均值；
b.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的中值；
c.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的标准偏差；
d.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的峰值；
e.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的形态；
f.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的平均值；
g.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的中值；
h.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的标准偏差；
i.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的峰值；或
j.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的形态。
附图说明
图1(A)显示IL-6抗体通过非特异性结合与点相互作用的热力学曲线。该点抗体的结合和解离事件总数为6。
图1(B)显示了IL-6抗体与表面上的IL-6分子相互作用的热力学曲线。该点上抗体的结合和解离事件总数为24，显著高于非特异性点的数量。
在图1(C)中，IL-6抗体与测定表面上的总共2900个单独位置相互作用并产生2900个单独的热力学曲线。其中，2500个曲线(非特异性结合群)显示IL-6抗体与它们相互作用的可能性低。对于这些点，总共观察到2-10个结合和解离事件。对于400个点的其余部分(特异性结合群体)，IL-6抗体主动寻求与它们的相互作用，这通过总共20-24个结合和解离事件来证明。该结果显示在测定表面上检测到400个靶分子。
发明详述I.
概念
在识别的讨论中经常出现两个术语。特异性度量免疫系统在不同抗原之间的区分程度。交叉反应性度量不同抗原对免疫系统而言的相似程度。
特异性定义了免疫识别的另一个维度。特异性是免疫应答在抗原变体之间的区分程度。一种简单的方法测量纯化的抗体或T细胞受体对不同抗原的相对结合亲和力。
当在中等严谨性下测量时，较低亲和力的结合通常可提供更高的特异性。这是因为低亲和力受体结合较少种类的抗原，因为条件限制了测定对低亲和力结合的灵敏度。因此，不同抗体或T细胞的相对特异性取决于亲和力和测量条件。
抗原与其抗体的结合特性及其对解离速率与总解离时间的影响如下所示。因此，不希望受理论束缚，据信快速解离速率抗体(或其他合适的结合伴侣)在这些应用中可能比慢解离速率抗体更合适。
Koff速率的示例
Koff对总解离的作用
K<sub>off</sub> 至90％解离的时间
0.1 23秒
1.E-02 3.8分钟
1.E-03 38分钟
1.E-04 16天
1.E-05 160天
本文描述了利用单分子检测技术最小化或消除非特异性结合或噪音的新颖且更灵敏的测定。该测定取决于测定表面/平台上抗体与所有分子(包括其同类抗原和其他分子)结合的概率。我们持续一段时间观察/测量抗体/探针与测定表面/平台上的每个单个分子的热力学相互作用。这种方法允许我们数字计算测定表面/平台上特异性抗原的数量(即使在存在更大量的非特异性结合事件的情况下)，因为预期特异性相互作用的热力学特征不同于非特特异性相互作用。这种非特异性噪音的最小化或消除导致低得多的定量限。
定义
如本文所用的“生物分子”包括可能需要检测(包括定量检测)的任何类型的生物分子，包括但不限于肽，蛋白质，核酸，糖，单糖和多糖，脂质，脂蛋白，全细胞等。
如本文所用的“结合对”包括一对分子，其中一个可以是探针而另一个可以是靶分子，该分子对的成员可以以不同的亲和力彼此结合或完全不结合。合适的结合对的示例包括但不限于核酸和核酸；蛋白质或肽和核酸；蛋白质或肽和蛋白质或肽；抗原和抗体；受体和配体，半抗原或多糖，互补核酸，药物化合物等。
本文使用的术语“检测”包括确定有限空间部分中靶蛋白或信号的存在，显现或事实，包括但不限于样品，蛋白质，生物分子，结合事件，反应混合物，分子复合物和底物。检测是指，涉及或关于靶蛋白或信号的数量，量或重量的测量(也称为定量)，其包括但不限于设计为确定靶标或信号的存在，不存在，量或比例的任何分析。检测还指，涉及或关于根据与另一靶标或信号的相对丰度来鉴定靶蛋白或信号的质量或类别。
“蛋白质”或“多肽”包括氨基酸残基的聚合物。这些术语也适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物。其中一个或多个氨基酸残基是不对应于任何天然存在的氨基酸的“非天然”氨基酸的氨基酸聚合物也包括在本文所用术语“蛋白质”和“多肽”中。
如本文所用的术语“靶标”或“靶分子”或蛋白质靶标包括感兴趣分析物。
术语“分析物”包括必须检测样品中其存在或不存在的蛋白质，物质，化合物或组分。分析物包括但不限于生物分子，特别是蛋白质或生物标志物。
本文所用术语“生物分子”表示与生物环境相关的物质化合物或组分，包括但不限于糖，氨基酸，肽，蛋白质，寡核苷酸，多核苷酸，多肽，有机分子，半抗原，表位，生物细胞，生物细胞的部分，维生素，激素等。
术语“生物标志物”表示与生物环境的特定状态相关的生物分子，包括但不限于细胞周期阶段，或健康和疾病状态。生物标志物的存在，不存在，减少，上调或下调与特定状态相关并且指示特定状态。
如本文所用术语“探针”包括与结合对中的另一分子(靶标)结合的分子，该探针分子可用于确定另一分子(即靶标)的存在或不存在。术语“探针”是包含结合剂和独特标记物(例如，信号传导部分)的物质。在一些实施方式中，探针的结合剂和信号传导部分在单个实体(例如，能够结合靶标的荧光分子)中实现。在某些情况下，探针可以非共价结合生物样品中的一个或多个蛋白质靶标。在某些情况下，探针可以特异性结合靶标。探针可以是结合对的任何成员，包括例如天然或修饰的肽，蛋白质(例如，抗体，亲和体或适体)，核酸(例如，多核苷酸，DNA或RNA)；多糖(例如凝集素，糖)，脂质，酶，酶底物或抑制剂，配体，受体，抗原，半抗原或合成核酸如DNA，RNA，小分子等。
如本文所用术语“探针类型”包括对具有相同探针特征的探针分子群进行唯一分类的描述符。
如本文所用术语“靶标类型”包括对具有相同靶标特征的靶分子群进行唯一分类的描述符。
如本文所用术语“探针组”包括选自一种或多种探针类型的分子群。
实施方式
使探针与具有固定的蛋白质的表面接触。在某些方面，探针与固定在表面上的许多不同蛋白质瞬时相互作用，在解结合之前长时间结合一些蛋白质，同时与其他蛋白质结合持续较短时间，以及完全不结合其他蛋白质。通过荧光显微镜(例如全内反射荧光(TIRF)显微镜)对表面处的瞬时结合事件进行成像。通过图像分析软件提取各个像素的时间跟踪数据，例如，揭示探针在某些点比在其他位置处驻留更长时间(结合)，或者揭示探针在某些点以不同于其他位置的频率结合。在某些情况下，可以根据待分析并且可用于检测的蛋白质样品选择合适的探针。例如，靶蛋白可包括受体，并且探针可包括配体。类似地，靶蛋白可包括抗体或抗体片段，并且探针可包括抗原。
对于本领域技术人员显而易见的是，以下等式Kd＝koff/kon优选表征瞬时结合。探针的瞬时结合的任何合适度量，包括Kd，koff等适于生成直方图。这些包括该等式Kd＝koff/kon的任何代理和处理。观察到的探针与靶标的结合事件的停留时间可以是约1纳秒至约10分钟或更长的时间范围。
结合频率可以通过在约1纳秒至约10分钟，1小时或甚至一天的时间范围内在特定点观察到的结合和解离事件的总数来测量。探针与表面上固定的生物分子的瞬时结合的不同模式可以通过停留时间和相互作用频率和/或其他参数(例如解离时间，信号强度等)的组合来描述。该结合的停留时间不同于可以操作实验装置的时间长度，其可以包括具有不同停留时间的许多结合事件。
探针
在某些实施方式中，探针是能够结合靶蛋白的物质。通常，探针包含信号传导部分，例如荧光团。探针可以是结合对的任何成员，包括例如天然或修饰的肽，蛋白质(例如，抗体，亲和体，纳米抗体或适体)，核酸(例如，多核苷酸，DNA或RNA)；多糖(例如凝集素，糖)，脂质，酶，酶底物或抑制剂，配体，受体，抗原，半抗原或合成核酸如DNA，RNA，小分子等。探针可以是，例如，有机或无机分子。
另外，探针可以由合成分子形成。(迭代原位点击化学产生抗体样蛋白质捕获剂(Iterative In Situ Click Chemistry Creates Antibody-like Protein-CaptureAgents)，H.D.Agnew等，Angew.Chem.Iht.Ed.2009，48，4944-4948.)(一珠-一复合肽文库的精确MALDI-TOF/TOF测序，应用于使用原位点击化学筛选鉴定多配体蛋白质亲和试剂(Accurate MALDI-TOF/TOF Sequencing of One-Bead-One-Compound Peptide Librarieswith Application to the Identification of Multiligand Protein Affinity AgentsUsing in Situ Click Chemistry Screening)，Su Seongi Lee等，Anal.Chem.，2010，82(2)，第672-679页)。
在某些方面，探针选自肽，小配体，小分子等的随机文库。在一个情况中，候选探针试剂可以是肽，多肽，肽模拟物，氨基酸，氨基酸类似物，糖类，脂肪酸，类固醇，嘌呤，嘧啶，其衍生物或结构类似物，多核苷酸和多核苷酸类似物。在某些情况下，探针组可以是同质的或异质的。也就是说，组可以包括相同的元件(一种探针类型的同质组)或不同的探针元件(选自多于一种探针类型的异质组)。换句话说，该组可以全部是一种分子类型，或不同分子类型。
在某些其他情况下，探针衍生自肽的随机文库，例如市售可得的那些，或使用本领域技术人员熟知的组合技术产生。优选地，探针组中的各个探针具有结合亲和力的谱，因此在组中存在弱结合亲和力(即对结合至表面的特异性靶标的低结合特征)和强结合探针(紧密结合靶标的探针)，以及中间结合亲和力。因此，探针以足够的多样性结合以产生“特征”。
在大多数情况下，各个探针将具有与其相关的独特标记物。在某些优选的情况中，信号传导部分如荧光团是共价连接的。合适的荧光团包括但不限于4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸根合茋-2，2′二磺酸、吖啶、吖啶异硫氰酸酯、5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3，5二磺酸酯、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、BODIPY、亮黄、香豆素和衍生物：香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)、花青染料、荧光桃红、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、5′，5″-二溴连苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)、7-二乙基氨基-3-(4′-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素二乙烯基三胺五乙酸酯、4，4′-二异硫氰根合二氢-茋-2，2′-二磺酸、4，4′-二异硫氰酸根合茋-2，2′-二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’-异硫氰酸酯(DABITC)、曙红、曙红异硫氰酸酯、赤藓红和衍生物：赤藓红B、赤藓红异硫氰酸酯、乙啶、荧光素和衍生物：5-羧基荧光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、QFITC、(XRITC)、荧胺、IR144、IR1446、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-甲基伞形酮、邻甲酚酞、硝基酪氨酸、副品红、酚红、B型藻红蛋白、邻苯二甲醛、芘和衍生物：芘、丁酸芘、琥珀酰亚胺基1-丁酸芘、量子点、反应红4(CibacronTM亮红3B-A)、若丹明和衍生物：6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基若丹明(R6G)、丽丝胺若丹明B磺酰氯若丹明(Rhod)、若丹明B、若丹明123、若丹明X异硫氰酸酯、磺基若丹明B、磺基若丹明101、磺基若丹明101的磺酰氯衍生物(德州红)、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、四甲基若丹明、四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC)、核黄素、玫红酸、铽螯合物衍生物、Cy 3、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7、IRD 700、IRD 800、拉由拉蓝(La Jolla Blue)、酞菁、萘酞菁ATT0647、和IRDye 680LT。
在其他情况下，其他荧光团适合使用。这些包括例如绿色荧光团(例如Cy3，FITC和俄勒冈绿)，其特征在于它们通常在515-540纳米波长范围内发射，以及红色荧光团(例如德州红，Cy5，和四甲基若丹明)，其特征在于它们通常在590-690纳米波长范围内发射。在一个优选的方面，高光稳定性硅-酞菁染料IRDye，700DX也可以高灵敏度和高光稳定性成像，其不仅因其光稳定性而且还因其高水溶性和蛋白质疏水(不粘)性质而著称。
在一个方面，探针选择标准可用于选择合适的探针。这些标准包括，例如，候选探针是否与裸测定表面相互作用过强。其他标准是候选探针是否仅与少数蛋白质相互作用，或者候选探针是否在时间尺度上与蛋白质相互作用太短而不能被光学系统取样，或者太长而不能在预定时期内记录多个事件。在某些方面，探针在结构上是多样的。肽相互作用的多样性的示例包括噬菌体展示，其中所选择的肽通常具有对实际目的而言过低的亲和力(Choi，S.J.等，Mol Cells，7(5)，575-81(1997))，以及通过在两个氨基酸上系统地改变肽序列工作筛选生物素肽模拟物(Schmidt，T.G.等，JMol Biol，255(5)，753-66(1996))。最近，已经描述了使用镧系元素(Eu，Tb，Dy和Sm)，螯合物用于免疫测定以产生发光，其显示更长的发射输出和更低的漂白敏感性(Hagan和Zuchner，Anal Bioanal Chem(2011)400：2847)。在本发明的测定中考虑了这种镧系元素标记的探针。类似地，也可以使用量子点和P点。
在一个实施方式中，来自样品的蛋白质以每100×100μm视场高达800,000个蛋白质分子的可分辨表面密度随机固定在表面上。应用荧光探针，并使用全内反射荧光(TIRF)显微镜对表面成像，以记录与各个固定化蛋白质瞬时结合的各个探针的影像。对于每个探针，从每个蛋白质位置记录的瞬时相互作用的痕迹获得瞬时时间的特征分布，测定时间为约10分钟至约一天。瞬时时间分布谱体现了探针对靶蛋白的整合亲和力。结合和解离事件的总数也用作探针与特定蛋白质位置结合的特征。低探针浓度使来自未结合探针的荧光背景最小化，同时仍然促进表面上的合理结合速率。低探针亲和力意味着快速解结合。因此，系统可记录多个结合-解离(瞬时)事件，以便在合理的测定时间内估计瞬时时间的分布。
在某些情况下，探针是肽，例如RGD肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)，其对整联蛋白有特异性。在其他情况下，探针是小分子，适体或抗体。
在某些实施方式中，探针以约1M至约0.001nM或甚至1pM，优选约1mM至约100mM，更优选约1μM至约100μM，最优选0.1nM至约5nM例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4或5nM的浓度存在。
在某些实施方式中，该技术提供了用于检测蛋白质或蛋白质的部分的检测复合物。与靶蛋白结合的可检测标记(例如荧光)的查询探针具有大于0.1分钟-1的动力学速率常数Koff和/或大于0.1分钟-1的动力学速率常数Kon。例如，在一些实施方式中，描述查询探针与靶蛋白的查询区域的结合以形成复合物的动力学速率常数Kon和/或描述复合物解离的动力学速率常数Koff是大于0.1分钟-1，例如，大于1分钟-1(例如，大于约0.002秒-1，大于约0.02秒-1)。在一些实施方式中，描述查询探针与靶蛋白的查询区域结合以形成复合物的动力学速率常数Kon和/或描述复合物解离的动力学速率常数Koff大于0.001秒-1，例如，大于0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7或8秒-1。
在某些实施方式中，可以使探针向基材的递送自动化。实验室中的高通量机器人电枢是常规的。
样品
样品可以是含有生物分子靶标的任何组合物。优选地，生物分子靶标是一种蛋白质或多种蛋白质。这些蛋白质包括但不限于多肽，肽，糖蛋白，脂蛋白，微生物多肽(例如，病毒，细菌或原生动物多肽)，抗体，酶，疾病标志物(例如多肽癌抗原)，细胞表面受体，激素受体，细胞因子，趋化因子，组织特异性抗原，或任何前述的片段。
样品包括细胞裂解物，组织，肿瘤，酶，活检样品，酵母，真菌，细菌，植物细胞，哺乳动物细胞，循环肿瘤细胞，生物战用剂或恐怖用剂等。样品的含量可以是已知的，经表征和鉴定的，或未知的，未表征的和未鉴定的。在许多情况下，样品含有或疑似含有一种或多种酶活性。在其他方面，样品可以是土壤修复样品。样品可以来自生物体或可以是人造的。样品可以是，例如，含有一种或多种已知量或具有已知活性的酶的样品。当探针是用于核酸测序的标记的核苷酸时，样品不是模板核酸。
在某些方面，生物样品包括正常(结肠，肺等)组织的组织切片，其可以与癌(结肠，肺等)组织的组织切片进行比较。其他正常组织包括乳房组织，前列腺组织，肾组织，皮肤，淋巴结等，并且可以与相同组织类型的癌组织进行比较。
蛋白质固定
在某些方面，基材或固体支持物包括任何固体或半固体材料，其中可以附连或掺入靶结合剂，例如多种蛋白质(例如，物理圈留，吸附等)或可以功能化以包括(例如，与……关联)靶标。合适的材料包括但不限于天然或合成聚合物，树脂，金属或硅酸盐。蛋白质可以以随机方式或有序阵列固定。
在某些优选的方面，本发明提供了各种不同的表面(例如玻璃，石英，塑料)或用于固定靶分子的捕获构造，用于单分子检测以便观察探针/靶标结合动力学。合适的化学物质可用于产生能够附连靶分子以进行单分子检测的不粘表面。本发明提供可检测的探针或可检测的靶标，使得检测在单分子水平上发生，以最大化动力学信息的确定，以获得“结合”和“解离”速率常数。尽管优选实施方式将诸如蛋白质的靶分子固定在表面上，但该方法也提供溶液中的靶分子。可以从外部调节结合伴侣之间的亲和力以优化亲和力信息。外部调节可以通过电场，磁场，能量场，压力场，洗涤步骤，对流流动，温度变化，pH变化，离子组成或强度变化等来完成。
在一个实施方式中，本发明提供了用于靶蛋白固定的耐用表面，其能够经受多次洗涤循环。在这方面，裸表面与荧光探针可忽略地相互作用，进而使背景荧光最小化，从而使“假阳性”信号最小化。在某些方面，可以使用封闭缓冲液，其优选不含蛋白质污染物。在某些优选的方面，表面是薄膜(例如＜30nm)，其使蛋白质保持在表面附近以获得最大的光学激发；最小多孔薄膜呈现平坦，紧凑的表面，以防止小探针扩散到薄膜中。在某些方面，基材表面具有低结合能力，这允许更好的单分子分辨率。某些表面改性描述于Harris等的美国专利公开号2009/0175765，并通过引用纳入本文。
在某些其他情况下，可以通过减去背景的时间谱来消除假阳性。该背景减法在消除假阳性和增加S/N方面是有效的。该过程也有利于检测限。
在一些实施方式中，合适的固相支持材料包括琼脂糖；纤维素；右旋糖酐；聚丙烯酰胺；聚苯乙烯；聚乙二醇；树脂；硅酸盐；二乙烯基苯；甲基丙烯酸酯；聚甲基丙烯酸酯；玻璃；陶瓷；纸；金属；聚丙烯酰吗啉化物；聚酰胺；聚(四氟乙烯)；聚乙烯；聚丙烯；聚(4-甲基丁烯)；聚(对苯二甲酸乙二醇酯)；人造丝；尼龙；聚(乙烯基丁酸酯)；聚偏二氟乙烯(PVDF)；硅酮；聚甲醛；醋酸纤维素；硝基纤维素或其组合。优选地，固体支持物中的材料或材料组合不会干扰探针和靶分子之间的结合。
在一个实施方式中，胺反应性表面上的固定的羧酸基团可用于通过胺偶联反应将蛋白质(例如，通过酰胺键)共价连接至基材。其他示例性反应性连接基团，例如肼，羟胺，硫醇，羧酸，环氧化物，三烷氧基硅烷，二烷氧基硅烷和氯硅烷可以连接到基材上，使得蛋白质可以与那些连接基团形成化学键以将它们固定在基材上。
在某些方面，蛋白质固定在一个或多个赖氨酸胺上。通常，蛋白质结构通常含有表面暴露的赖氨酸残基，因此可用于固定化学。如果蛋白质的氨基末端是表面暴露的，那么不含赖氨酸的蛋白质仍可通过胺化学固定。也可以使用其他固定化学，例如利用天冬氨酸和谷氨酸的酸侧链。
可以通过本文描述的方法检测和测量各种浓度的蛋白质。在生物样品中检测到浓度低于，例如100毫克/毫升(mg/ml)，10mg/ml，1mg/ml，100微克/毫升(μg/ml)，10μg/ml，1μg/ml，100纳克/毫升(ng/ml)，10ng/ml，1ng/ml，100皮克/毫升(pg/ml)，10pg/ml，1pg/ml，100飞克/毫升(fg/ml)，10fg/ml或1fg/ml的蛋白质，并且该浓度可被测量。事实上，在一个优选的方面，使用本发明的方法检测和表征单个蛋白质分子。
在某些方面，可以使用诸如亲水性自组装单层方法，亲水性聚合物刷方法，两性离子聚合物刷方法和腈涂层方法的方法将蛋白质固定在表面上。在一个方面，多种蛋白质以约2个蛋白质至约1.0×106个蛋白质/100μm×100μm的表面密度随机固定。在另一个方面，多种蛋白质以约2×102个蛋白质至约8.0×105个蛋白质/100μm×100μm的表面密度随机固定。在另一个方面，多种蛋白质以约2.0×103个蛋白质至约6.0×104个蛋白质/100μm×100μm的表面密度随机固定。在另一个方面，多种蛋白质以约2.0×103个蛋白质至约1.0×104个蛋白质/100μm×100μm的表面密度随机固定。
在一个实施方式中，使用亲水性自组装单层固定蛋白质分子。在表面钝化之前或同时将蛋白质附连到基材上。在这方面，一种合适的接头可从SoluLinK商购获得。靶蛋白质可以与赋予苯甲醛官能团的异双功能PEG接头(例如PEG-4)偶联。用例如腙官能团活化诸如玻璃的基材。此后，通过蛋白质苯甲醛和表面腙官能团之间的高度特异性的高效反应，蛋白质以低占据率(＜0.8面积％)附连于表面。通过蛋白质溶液浓度和反应时间控制蛋白质占据程度，然后通过蛋白质固定中使用的相同偶联化学，用单官能(苯甲醛)PEG链钝化未被占据的表面区域。
在另一个实施方式中，制备表面，其包括支持靶蛋白质的亲水基层。在某些方面，有效表面膜是聚合物“刷”，其直接在表面上由单体合成。合适的化学物质包括“Si-ATRP”(表面引发的原子转移聚合)，从水性醇溶液中产生窄尺寸分布的表面附连聚合物。可以使用形成聚丙烯酸刷的甲基丙烯酸甲酯衍生物。有大量甲基丙烯酸酯单体选择(例如西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))是市售且是合适的。替代单体包括，例如，设计用于低蛋白质吸附的设计者肽表面(Chelmowski，R.等，J Am Chem Soc，130(45)，14952-3(2008))。公开的Si-ATRP方案(Yao，Y.等，Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，66，233-239(2008)；Jones，D.M.，Huck，W.T.S.，Advanced Materials，13(16)，1256-1259(2001)；Tugulu，S.等，Biomacromolecules，6(3)，1602-7(2005)；Edmondson，S.等，Chem Soc Rev，33(1)，14-22(2004)；Ma，H.等，Langmuir，22(8)，3751-6(2006)；Vaisocherova，H.等，AnalChem，80(20)，7894-901(2008))遵循采用PEG甲基丙烯酸酯单体同时靶向20-50nm范围内的膜厚度。在某些方面，亲水性刷层按照公开的方法用胺衍生化用于蛋白质偶联(Yao，Y.等，Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，66，233-239(2008))，任选地随后是最后的钝化。
在另一个实施方式中，使用适用于本发明的两性离子聚合物刷固定蛋白质分子。在某些方面，有用的两性离子聚合物刷具有低的血清蛋白的非特异性蛋白质吸附(参见Vaisocherova和同事(Vaisocherova，H.等，Anal Chem，80(20)，7894-901(2008))。如其中所报道的，刷的厚度有15-20nm薄(该厚度可重现)，其将相互作用的探针定位在TIR光场的峰值能量区中。在某些方法中，使用直接将靶蛋白的赖氨酸与表面羧酸连接的方法(Vaisocherova，H.等，Anal Chem，80(20)，7894-901(2008))。
表面也可以用已知浓度的链霉亲和素包被，然后附连生物素标记的抗体或靶蛋白。链霉亲和素-生物素相互作用是非常高的亲和力相互作用并且可以用于固定靶蛋白。然后可以使用针对靶蛋白的另一种抗体来询问靶蛋白抗体相互作用。
固定在表面上的蛋白质在分析过程中保持附连。虽然优选的实施方式使用针对共价附连的化学物质，但吸附的(非共价的)蛋白质也是可接受的。为了评估固定，通过暴露于生物素标记的探针“a0”或“x0”来标记表面附连的链霉亲和素。调节蛋白质表面密度以确保至少90％的探针与蛋白质结合(即，比与裸露表面结合的背景高至少10倍)。在漂洗以去除未结合的探针后，以3分钟的间隔对表面成像数小时，以估计附连的探针的半衰期。在一种互补的方法中，将用染料共价预标记的链霉亲和素固定；这消除了关于生物素与固定的蛋白质解离的替代方法的担忧。如以前一样通过测定光漂白速率来统计地考虑染料光漂白的效果。
本文所述的本发明方法提供固定在基材上的蛋白质(或探针)。探针可包括能够与蛋白质结合或相互作用的任何物质。蛋白质可以共价，非共价结合探针或完全不与探针结合。探针可以是特异性结合蛋白质(例如抗PSA蛋白)的肿瘤探针(例如PSA)。可以固定在表面上的其他肿瘤相关蛋白质包括例如酪氨酸酶，MUC1，p53，CEA，pmel/gp100，ErbB-2，MAGE-A1，NY-ESO-1和TRP-2。
使用本发明可检测到的各种蛋白质，修饰方式和氨基酸。这些包括，例如，磷酸化修饰，糖基化，泛素化，甲基化，N-乙酰化，脂化，蛋白水解加工，GPI锚，二硫键，焦谷氨酸，硝基酪氨酸，酰化氨基酸，羟脯氨酸或硫酸化氨基酸。磷酸化氨基酸可以是，例如，磷酸丝氨酸，磷酸酪氨酸或磷酸苏氨酸。这些可以使用高亲和力或低亲和力的高特异性探针或低特异性探针检测。
其他修饰和蛋白质“表位”是本领域技术人员熟知的，或者可以使用众所周知的方法鉴定。表位发现系统的设计进展已经显著加速了表位发现过程，从而迅速得到结果。先进的系统，如ProImmune(www.proimmune.com)REVEALTM和ProVETM，可以比传统方法所预期的更快地产生结果。在某些情况下，探针结合蛋白质结构和构象。例如，某些探针识别和表征β-折叠，α-螺旋和蛋白质特征性的其他构象。使用本文的方法，可以进行蛋白质的“表位”作图。
检测
检测一组探针与靶蛋白质或多肽的结合包括检测直接或间接附连于至少一种探针的标记物。在某些优选的情况中，可以使用单分子检测方法检测探针与待鉴定的蛋白质或多肽之间的结合(或不存在结合)。
优选的实施方式采用单分子成像方法，其提供10倍至20-30nm的有效分辨率(Betzig，E.等，Science，313(5793)，1642-5(2006)；Folling，J.等，Nat Methods，5(11)，943-5(2008)；Hess，S.T.，Girirajan，T.P.，和Mason，M.D.，Biophys J，91(11)，4258-72(2006)；Huang，B.等，Science，319(5864)，810-3(2008)；Lord，S.J.等，J Am Chem Soc，130(29)，9204-5(2008))。超分辨率是2008年的技术(Hell，S.W.，Nat Methods，6(1)，24-32(2009)；Lippincott-Schwartz，J.和Manley，S.，Nat Methods，6(1)，21-3(2009))。其他单分子检测方法在Fuller等，Nature Biotechnology第27卷，第11期，2009年11月中进行了综述。这些方法依赖于各种手段来在填充密集填充视场的稀疏荧光团子集中随机地开启荧光。因此，在任何一个图像中仅检测到几个充分间隔的单个分子。通过将每个成像的衍射图案拟合到理论点扩散函数来计算子像素位置。精度通常为20-30nm，由海森堡极限设定，其中Δ是衍射最大值的宽度，并且m是检测到的光子数(Folling，J.等，Nat Methods，5(11)，943-5(2008))。在随后的图像中检测到不同的荧光团子集，其组成揭示了具有超分辨率的密集填充视场，和由此的典型蛋白质大小(10nm)。本发明提供与超分辨率成像的天然兼容性，因为在任何给定图像中仅检测到蛋白质的子集。不需要荧光团切换。通过在依赖于探针浓度的结合速率的时间上不同时刻仅与蛋白质子集结合的探针和结合相邻蛋白质的探针，在空间和时间上自然地解析该视场。通过对影像中重复的结合事件求和而获得的衍射图案用高光子计数m检测，其支持高精度定位蛋白质 在约30nm空间分辨率的优选实施方式中，以80％的分辨率固定一百万个蛋白质，允许分析800000个蛋白质。
本文定义的其中80％的蛋白质是可分辨的最大填充密度，仅在7900个总蛋白质在视场中产生6300个光学分辨的蛋白质的情况下发生。
全内反射荧光(TIRF)显微镜是本发明的优选检测装置。TIRF提供可用于观察在两种不同折射率的光学介质之间的界面处发生的荧光事件的光学效应。在这样的边界上，以大于临界角的角度行进的激发激光诱导的入射光经历全反射。全内反射光在界面上延伸到基材上的样品中，仅延伸几百纳米到低折射率的第二介质(例如，z方向)。该消逝场允许荧光激发。TIRF消逝场的激发体积向样品中延伸约100nm。检测在该激发体积内从探针的独特标记产生的光子。TIRF显微镜(TIRFM)用于捕获如本文所要求的高分辨率，高信噪比(S/N)系列的结合事件。单分子检测具有约1nm至约100nm，优选约5nm至约50nm，更优选约10nm至约40nm的空间分辨率。
单分子检测(SMD)允许高度多重化(例如，使用超分辨率计算成像，100万/100×100微米视场)。此外，SMD能够计数单个结合对并将计数与同时在许多单个分子上测量的动力学“结合”和“解离”速率以及生物学相关性相关联，从而允许用＜N个独特探针评估N种不同类型的靶标。此外，SMD允许测量动力学而没有基于集合的测定的平衡平均值的限制。可以使用各种检测方式，包括荧光，FRET，多光子，偏振，等离子体效应，AFM，力谱，荧光寿命，光散射，拉曼散射等。
在一个实施方式中，该方法通过利用蛋白质固定表面化学物质提供最小化探针与裸工作表面的背景结合，所述蛋白质固定表面化学物质提供支持靶蛋白质的共价附连的不粘膜。本发明的优选实施方式还提供瞬态相互作用测量的再现性。瞬时结合事件的背景通量优选限于小于0.05um-2s-1。静态结合事件的背景通量优选小于0.0005um-2s-1。蛋白质固定的半衰期通常大于5小时。通过瞬时结合以至少99％的置信度可再现地区分靶蛋白质。
在某些情况下，瞬时结合相互作用的特征在于速率常数的数学变换，例如自相关直方图，而不直接计算速率常数本身。可以使用统计矩阵，例如泊松统计，隐马尔可夫建模或边缘检测算法。此外，可采用统计矩阵，例如检测的探针与多个位置处的蛋白质分子重复的结合的瞬时事件的数量和停留时间的平均值，中值，峰值和标准偏差。
方法的用途和应用
本发明还可以使用高亲和力或低亲和力的高或低特异性探针检测诸如糖基化，泛素化，甲基化，N-乙酰化，脂化和蛋白水解加工的修饰。除蛋白质分析外，本发明还检测其他结合对，即脂质，核酸，无机分子，药物，环境分子(例如，爆炸物，毒素)。
疾病中的生物标志物。本发明允许比较病例和对照样品以鉴定与疾病状态相关的固定的蛋白质。然后纯化这些生物标志物蛋白质以确定它们的生物学特性。
环境中的生物标志物。通过本发明测定随时间收集的环境样品，以监测海洋，陆地和土壤环境的变化。可以将蛋白质与不断变化的生态系统组成相关联。
在某些实施方式中，本文描述的方法用于评估治疗对象的疾病的功效。这种评估包括，例如，通常在治疗开始之前从对象获得至少一种生物样品，以及在开始处理或治疗后的任何时间从对象获得至少一种生物样品。然后使用该方法评估治疗前和治疗后样品，以表征指示疾病的至少一种蛋白质或探针。通过比较每个样品中蛋白质或探针的量或变化来评估治疗的功效或成功。例如，开始治疗后获得的样品中蛋白质的量减少表明该疾病的治疗或处理是有效的。使用本文所述的方法确定在疾病治疗期间在对象中产生的蛋白质(例如抗体)的存在，例如，以确定对治疗的耐药性的发生或程度。
实施例
实施例1：生物样品：在1ml缺乏IL-6的人血清中掺入1、5、10、50、100、200、500、1000、5000或10000fg的IL-6，产生一组含不同浓度IL-6的样品。将1nM生物素化的高亲和力抗IL-6抗体(克隆C01，Bio-Rad SAC)与10μL每种掺有IL-6的血清样品混合。在室温下孵育30分钟以使抗体捕获IL-6分子。然后将抗原-抗体复合物提供给用链霉亲和素功能化的棱镜表面。在该过程中，IL-6分子固定在棱镜表面上。将Cy5或ATTO680-偶联的高解离速率IL-6抗体(克隆295.9，解离速率0.2，伯乐公司(Bio-Rad))以非饱和浓度(5μM)加至棱镜表面。给予短孵育时间(10分钟)以允许检测抗体和抗原之间的相互作用达到平衡。然后在高空间分辨率棱镜型TIRF显微镜下观察棱镜表面，该显微镜允许对至棱镜表面的约200nm内的单个分子进行荧光检测。使用EMCCD相机对相同视场(高达100μm×100μm)以2Hz的速率捕获一系列图像持续10分钟。数据的计算分析揭示了每个单分子在其特定位置的10分钟内荧光信号谱的图案。该谱反映了对该特定分子的抗体动力学指纹。抗体与其抗原的特异性结合的荧光谱将与任何非特异性相互作用(例如相互作用频率，结合时间等)显著不同。通过检查在视场中检测到的所有单分子的谱，真实/特异性信号与噪音分离并通过数字计数在TIRF棱镜表面上检测到多少抗原分子。
图1(A)显示IL-6抗体通过非特异性结合与斑点相互作用的热力学曲线。该点抗体的结合和解离事件总数为6。
图1(B)显示了IL-6抗体与表面上的IL-6分子相互作用的热力学曲线。该点上抗体的结合和解离事件总数为24，显著高于非特异性点的数量。
在图1(C)中，IL-6抗体与测定表面上的总共2900个单独位置相互作用并产生2900个单独的热力学曲线。其中，2500个曲线(非特异性结合群)显示IL-6抗体与它们相互作用的可能性低。对于这些点，总共观察到2-10个结合和解离事件。对于400个点的其余部分(特异性结合群体)，IL-6抗体主动寻求与它们的相互作用，这通过总共20-24个结合和解离事件来证明。该结果显示在测定表面上检测到400个靶分子。
本说明书引用的所有发表物和专利申请通过引用纳入本文，就好像各发表物或专利申请特定和单独地通过引用纳入本文那样。虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式详细描述了本发明，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以在不背离所附权利要求书的构思或范围的情况下作出某些改变和修改。

Claims (19)

1.一种用于表征至少一种蛋白质分子与可检测标记的探针的结合特征的方法，所述方法包括：
a.使蛋白质分子与可检测标记的探针接触，所述探针显示出与蛋白质相关的快速解离速率结合特征，以在蛋白质分子和探针之间产生瞬时结合相互作用；
b.通过对多个位置处的标记的探针进行单分子检测来检测瞬时相互作用，其中所述瞬时相互作用具有约10分钟至约1纳秒的观察到的停留时间；并且
c.关联多个位置处的多个瞬时相互作用的相互作用频率，以确定蛋白质分子与探针的结合特征。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质固定在表面上。
3.如权利要求2所述的方法，其中固定的表面是玻璃、石英或塑料。
4.如权利要求3所述的方法，其中使用亲水性自组装单层，亲水性聚合物刷，两性离子聚合物刷或腈涂层将蛋白质固定在表面上。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述表面用链霉亲和素包被，并且所述蛋白质使用生物素化的蛋白质被固定在表面上。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质以约2个分子至约1×106个分子/100μm2的表面密度固定。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质以约2×102个分子至约8×105个分子/100μm2的表面密度固定。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述蛋白质以约2×103个分子至约6×104个分子/100μm2的表面密度固定。
9.如权利要求1所述的方法，其中使多个位置处的多个瞬时相互作用的相互作用频率相关联允许分离蛋白质特异性信号与非特异性噪音。
10.如权利要求9所述的方法，其中蛋白质特异性信号相互作用与非特异性噪音相互作用的比率大于或约为2。
11.如权利要求10所述的方法，其中蛋白质特异性信号相互作用与非特异性噪音相互作用的比率大于或约为3。
12.如权利要求11所述的方法，其中蛋白质特异性信号相互作用与非特异性噪音相互作用的比率大于或约为4。
13.如权利要求1所述的方法，其中关联多个位置处的多个瞬态相互作用的相互作用频率测量多个位置处的结合和解离事件的总数。
14.如权利要求13所述的方法，其中每个观察区域记录超过1000个瞬时相互作用。
15.如权利要求14所述的方法，其中每个观察区域记录超过2000个瞬时相互作用。
16.如权利要求15所述的方法，其中每个观察区域记录超过4000个瞬时相互作用。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述结合特征包括从多个位置处的蛋白质分子和探针之间的多个瞬时相互作用计算的统计度量。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述统计度量是由泊松统计，隐马尔可夫建模或边缘检测算法计算的。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述统计度量包括以下的一个或多个：
a.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的平均值；
b.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的中值；
c.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的标准偏差；
d.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的峰值；
e.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的形态；
f.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的平均值；
g.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的中值；
h.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的标准偏差；
i.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的峰值；或
j.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的形态。
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